CN102010472A - 一种抗d-二聚体单克隆抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗D-二聚体单克隆抗体，所述抗体的轻链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。所述的抗体是由保藏号为：CCTCC NO.C201060的杂交瘤细胞株6B8D11H12分泌产生。本发明的抗D-二聚体单克隆抗体可应用于D-二聚体的各种检测试剂盒的制备中。使用本发明的单克隆抗体和胶体金免疫层析法制备的D-二聚体检测试剂盒，不仅使检测灵敏度达到96.08％，检测特异度达到94.79％，检测准确度达到95.67％，而且能使Kappa检验值达到0.901，远大于0.75，与临床诊断具有较高的诊断一致性，可用于临床上对血栓性疾病的辅助诊断。

Description

一种抗D-二聚体单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明涉及一种抗D-二聚体单克隆抗体及其用途，属于生物技术领域。

背景技术

D-二聚体是交联纤维蛋白经纤溶酶作用后的终末产物。在凝血过程中，凝血酶在水解纤维蛋白原后，即相继释放出纤维蛋白肽A(FPA)和肽B(FPB)，剩余部分为可溶性纤维蛋白单体(SFM)，在转行酰胺酶作用下，SFM转变为纤维蛋白，继而血液凝固，其过程是经过一系列交联后完成，此后形成的纤维蛋白性质稳定，一般不溶解，但可被纤溶酶所降解，交联纤维蛋白在纤溶酶降解过程中逐渐生成若干种多聚体，D-二聚体即是其特异的产物之一，其分子量为184000～202000。在病理状态下，凝血与纤溶的动态平衡遭到破坏，凝血倾向增强，从而纤维蛋白降解产物增加，导致D-二聚体含量增加。D-二聚体水平的增高，表明体内有纤维蛋白血栓形成和纤溶发生，所以临床上可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物。

D-二聚体的检测对多种疾病的诊断及治疗有重要的价值。尤其可在无症状的高危患者中对深静脉血栓(DVT)进行早期筛选；与肺泡-动脉氧分压差(A-aDO2)联合检测可作为排除诊断肺栓塞的首选筛选试验。此外还可辅助诊断肝脏疾病；对脑梗死进行诊断及预后判断；鉴别恶性肿瘤，其他能够引起D-二聚体升高的因素还有：创伤性的骨折、严重感染、稳定性冠心病、重症感染、儿童过敏性紫癜(HSP)急性期、脓毒血症、结节病等。

目前，对D-二聚体的检测方法主要有：1)ELISA法：Rylatt首先以提纯的D-二聚体作为抗原，免疫小鼠后获得多株抗D-二聚体的单克隆抗体，然后应用ELISA试验测定其中D-二聚体含量，其灵敏度达到10ng/ml，称为ELISA检测法。其敏感性高，能定量，但操作繁琐。2)胶乳凝集法：是目前应用最广泛的D-二聚体检测法。将获得的单抗包被于乳胶颗粒(Latex)上，当血中D-二聚体与Latex发生抗原抗体反应时，致敏的Latex发生凝集，测得其含量，为Latex检测法。本法精确度低，只能定性，适应于急诊。3)发色底物法：该方法敏感性好、准确性高，可单人份标本迅速检测，但成本过高。

采用胶体金标记技术的免疫层析法具有方便、快捷、试剂易于保存等优点，已被广泛应用于免疫的各个领域，但胶体金免疫层析法的使用关键要解决其特异性、灵敏度及准确性的问题，这都需要选用具有高度特异性和高亲和力的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种高度特异性的抗D-二聚体单克隆抗体及其在胶体金免疫层析法制备的D-二聚体检测试剂盒中的应用，以实现利用胶体金免疫层析法能快速、准确、高灵敏度检测D-二聚体的目的。

本发明所提供的抗D-二聚体单克隆抗体，其特征在于：其轻链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。

所述的抗D-二聚体单克隆抗体，是由保藏号为：CCTCC NO.C201060的杂交瘤细胞株6B8D11H12分泌产生。

所述的杂交瘤细胞株是以D-二聚体为免疫源，小鼠为免疫对象，通过免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备悬液，并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得。

所述的抗D-二聚体单克隆抗体，属于IgG亚型。

所述的抗D-二聚体单克隆抗体的腹水效价为1∶10⁶。

本发明的抗D-二聚体单克隆抗体不仅可以与D-二聚体高度特异性结合，而且灵敏度高、稳定性好，可通过本领域技术人员所公知的的方法，制备成D-二聚体的各种检测试剂盒。尤其是，应用本发明的抗D-二聚体单克隆抗体和胶体金免疫层析法制备的D-二聚体检测试剂盒，不仅可以快速、简捷检测人血清、血浆或全血标本中的D-二聚体，不仅使检测灵敏度达到96.08％，检测特异度达到94.79％，检测准确度达到95.67％，而且能使Kappa检验值达到0.901，远大于0.75，与临床诊断具有较高的诊断一致性，可用于临床上对血栓性疾病的辅助诊断。

附图说明

图1为5’RACE产物电泳图，其中1号为轻链结果，2号为重链结果，M为DNA Marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：抗D-二聚体单克隆抗体的制备

一、动物免疫

取雌性6～8周龄的BALB/c小鼠，首次免疫用浓度为5mg/ml的D-二聚体纯品，经腹腔和四肢腋下注射，总量1ml；每隔2周以同样的方法加强免疫1次，共免疫3次，末次免疫后的第4天，从经三次免疫后小鼠眼球采血，离心分离血清，用ELISA法选出效价高的小鼠准备融合。

二、杂交瘤细胞系的制备

将完成免疫过程的小鼠准备取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，在融合前一天制备饲养细胞；融合时无菌下取小鼠脾细胞，与SP2/0细胞以10∶1混合，以50％PEG介导融合，离心后重悬于HAT选择性培养基中，接种于含有饲养细胞的96孔微孔板中，置37℃、5％CO₂培养箱培养，融合后第3d、第5d、第7d用HAT培养液半量换液，两周后换用HT培养液。

观察杂交瘤细胞的生长情况，等克隆长至孔底面积的1/3～1/2，取培养上清液，用ELISA法进行抗体检测，筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养，直到克隆化细胞抗体阳性率为100％，选出高分泌特异性细胞株(即ELISA效价在1∶10⁶以上的阳性克隆)，此时可将阳性克隆细胞进一步扩大培养。将杂交瘤细胞经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，定期收集上清，用筛选抗体的方法测定上清中的抗体，直至细胞系能稳定分泌单克隆抗体。

三、单克隆抗体的制备和纯化

选用成年BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡，1～2周后收集生长状态良好的单克隆杂交瘤细胞株6B8D11H12【该细胞株已在设置于中国武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期为：2010年7月1日，保藏号为：CCTCC NO.C201060】，每只腹腔注射1ml。接种2周左右的小鼠腹部可见明显膨大，以颈椎脱臼法处死后打开腹腔，取出腹水。离心后吸取上清，用硫酸铵沉淀后，再用DEAE离子交换柱纯化，用PH5.6、20mM的醋酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液。再用亲和层析纯化法(蛋白A-Sepharose4B柱)继续纯化，上样条件：样品和蛋白A-Sepharose4B柱用PH8.2、1.0M的Tris缓冲液平衡后再上样。洗脱条件：用PH3.0、50mM的甘氨酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，制得特异的单克隆抗体。

四、单克隆抗体的腹水效价及鉴定

取小鼠腹水抗体，用筛选抗体的方法测定效价为1∶10⁶，亚型鉴定为IgG型。

实施例2：单克隆抗体的特异性鉴定

材料：纤维蛋白原及其碎片X、Y、D、E和血浆。

方法：采用ELISA法检测，以D-二聚体为阳性对照。

结果：显示纤维蛋白原及其碎片X、Y、D、E和血浆均为阴性。

说明：本发明的抗D-二聚体单克隆抗体对D-二聚体有高度特异性。

实施例3：单克隆抗体的可变区序列的克隆与测序

采用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，快速扩增cDNA末端)技术，从分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株6B8D11H12中克隆功能性抗体的可变区序列。其步骤可简述为：由一个反义的基因特异性引物(GSP1)来合成cDNA第一链，cDNA第一链纯化后，利用末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal deoxynucleotidy transferase，TdT)在cDNA的3’末端加上一个合成的同聚核苷酸锚定序列。利用第二个巢式基因特异性引物(GSP2)和一个与同聚核苷酸尾巴可以退火的锚定引物来扩增cDNA。具体实验过程如下：

材料：

-由杂交瘤细胞株6B8D11H12分泌产生的抗D-二聚体单克隆抗体

-大肠杆菌Top10菌株

-pGEM-T Easy克隆载体

引物设计：

根据免疫球蛋白基因的特点，设计两套分别对应Ig和Kappa恒定区的基因特异性引物GSP1、GSP2，引物序列如下：

pRace-H-GSP1：GTCCACCKYGGTSYTGCTGGCYGGGTG

pRace-H-GSP2：GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC

pRace-K-GSP1：ACTTGACATTGATGTCTTTG

pRace-K-GSP2：CACGACTGAGGCACCTCCAGATG

克隆过程：

A、第一链合成

以总RNA为模板，以GSP1为引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。具体步骤如下：

1)在一个0.5ml的微量离心管中加入以下组分：

GSP1     2.5ml

总RNA    1～5μg

补充经DEPC处理的水至总体积为15.5μl，混匀。

2)70℃变性10min，冰浴1min，短暂离心后依次加入以下组分：

10*PCR buffer    2.5μl

25mM MgCl₂       2.5μl

10mM dNTP mix    1.0μl

0.1M DTT         2.5μl。

3)混匀，短暂离心后置42℃1min。

4)在反应体系中加入1μl SuperScriptTMII RT(Invitrogen公司)，轻轻混匀后置42℃反应50min。

5)反转录结束后置70℃、15min以终止反应。

6)离心10～20秒后置于37℃。

7)加入1μl RNase mix，轻轻混匀后置于37℃反应30min。

8)将反应管取出置冰上备用。

B、DNA纯化

使用QIAGEN公司QIAquick PCR纯化试剂盒。

1)加5倍体积于反转录体系的PB缓冲液于反转录反应管中，混匀。

2)将QIAquick离心柱置于2ml收集管中，把样品加入离心柱，13000rpm离心60秒。

3)弃去液体，将离心柱放回原来的收集管中，加入0.75ml PE缓冲液于QIAquick离心柱，13000rpm离心60秒。

4)弃去液体，将QIAquick离心柱放回原来的收集管，13000rpm离心60秒。

5)将QIAquick离心柱置于一干净的1.5ml离心管，在QIAquick膜中央加入30μl EB缓冲液，静置1min后，13000rpm离心60秒。

C、cDNA加尾

1)在一个0.5ml的微量离心管中一次加入以下组分：

DEPC处理的水        6.5μl

5*tailing buffer    5.0μl

2mM dCTP            2.5μl

纯化的cDNA          10.0μl，混匀。

2)将反应管置94℃维持3min后，冰浴1min，短暂离心后置冰上。

3)加入1μl TdT，混匀后置37℃反应10min。

4)将反应管置于65℃中作用30min终止反应，离心后置于冰上备用。

D、PCR

在一个0.2ml的PCR薄壁管中加入以下组分：

灭菌水           31.5μl

10*PCR Buffer    5.0μl

25mM MgCl₂       3.0μl

10mM dNTP mix    1.0μl

GSP2(10pmol/μl) 2.0μl

AAP(10pmol/μl)    2.0μl

dC-tailed cDNA     5.0μl

Tag酶              0.5μl

合计               50.0μl

混匀后置PCR仪中进行反应。

E、PCR产物电泳纯化

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示：其中1号为轻链结果，在约450bp处有一特异性条带；2号为重链结果，在约500bp处有一特异性条带。

F、使用Promega公司的pGEM-T Easy试剂盒，将PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体，转化大肠杆菌Top10(Invitrogen公司)具体过程为：

1)轻链和重链PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，分别回收450bp和500bp的条带，最终定容于20μl体积的灭菌水中；

2)在一个0.5ml的微量离心管中，加入以下组分：

2*连接缓冲液   5μl

pGEM-T Easy    50ng(1μl)

PCR产物        25ng(3μl)

T4连接酶       1μl

混匀后室温连接2小时或者4℃连接16小时以上。

3)转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素和IPTG、X-GAL的LB平板上，37℃培养12小时左右。

G、测定所克隆的PCR产物的碱基序列

各选取至少5个质粒测定其所含的PCR产物的碱基序列。

H、根据碱基序列与氨基酸编码序列的相应关系，分析PCR产物的阅读框架，确定相应可变区的氨基酸序列，其轻链和重链的序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。根据免疫球蛋白基因的特点验证其为抗体序列。

实施例4：本发明的抗D-二聚体单克隆抗体的应用

采用本领域技术人员所公知的胶体金免疫层析法，制作D-二聚体快速检测试剂盒，在体外定性检测人血清、血浆或全血标本中的D-二聚体，用于临床上辅助诊断血栓性疾病。

一、检测原理

采用胶体金标记的免疫层析技术，标本中的D-二聚体与检测区包被的抗D-二聚体单克隆抗体结合，当D-二聚体浓度超过检测限时，在检测区会形成一条色带，无D-二聚体的标本在检测区不会形成色带；而质控区则始终会出现红色色带，以提示检测结果正确有效。

二、检测方法

A、标本收集及准备

1)采用标准实验室程序收集血清、血浆或全血标本。

2)避免热灭活标本，以防止出现溶血或蛋白变性。

3)全血标本采集：使用肝素或EDTA为抗凝剂，收集血液标本，由于D-二聚体在全血或血清标本中很不稳定，全血或血清标本应在采集后4小时内用于检测。

4)血浆/血清标本采集：将全血标本离心以获得血清或血浆标本，如果标本不能马上用于检测，置2～8℃保存24小时，如果不能在24小时内进行检测，需置-20℃或更低温度下保存。【注意：标本在检测前需平衡至室温。】

B、操作步骤

1)实验前将所需物质及标本平衡至室温。然后撕开铝箔袋，从中取出检测板，放在水平的表面上。

2)用移液器加80μl标本(或用吸管滴加2滴标本)于样品孔中。

3)15分钟内观察结果。【注意：若为D-二聚体含量低的标本，显色时间可能会超过15分钟。】

三、结果判定

1)阳性：15分钟内出现两条色带时，结果判为阳性。

2)阴性：如果检测区不出现色带，而在质控区出现一条色带，结果判为阴性。

3)无效：如果质控区不出现色带，结果判为无效，必须使用新检测板重新检测标本。

四、临床应用结果

为评价本发明的D-二聚体快速检测试剂盒在临床上应用于对血栓性疾病进行辅助诊断的适用性与准确性，在上海市中西医结合医院进行了临床研究，从临床中选出300例样本作为研究对象。入选对象以血栓性疾病的患者为主，也包括少部分非血栓性疾病的就诊患者。采用美国Inverness公司的D-二聚体检测试剂盒(免疫荧光法)进行对比研究，依据检测结果将样本分为病例组和对照组。同时用本发明的试剂盒对这些样本进行检测，比较检测结果，并进行统计分析，实验结果见表1所示。

表1应用本发明的检测试剂盒的临床对比研究结果

由表1结果表明：本发明的试剂盒的检测灵敏度达到96.08％，检测特异度达到94.79％，准确度达到95.67％，能适用于在临床对血栓性疾病进行辅助诊断。

另外，Kappa检验值为0.901，远大于0.75，说明本发明的试剂盒与临床诊断具有较高的诊断一致性。

Claims (8)

1.一种抗D-二聚体单克隆抗体，其特征在于：其轻链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的抗D-二聚体单克隆抗体，其特征在于：所述的抗D-二聚体单克隆抗体是由保藏号为：CCTCC NO.C201060的杂交瘤细胞株6B8D11H12分泌产生。

3.根据权利要求2所述的抗D-二聚体单克隆抗体，其特征在于：所述的杂交瘤细胞株是以D-二聚体为免疫源，小鼠为免疫对象，通过免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备悬液，并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得。

4.根据权利要求1所述的抗D-二聚体单克隆抗体，其特征在于：所述的抗D-二聚体单克隆抗体属于IgG亚型。

5.根据权利要求1所述的抗D-二聚体单克隆抗体，其特征在于：所述的抗D-二聚体单克隆抗体的腹水效价为1∶10⁶。

6.一种权利要求1所述的抗D-二聚体单克隆抗体的应用，其特征在于：用于D-二聚体检测试剂盒的制备。

7.根据权利要求6所述的抗D-二聚体单克隆抗体的应用，其特征在于：用于胶体金免疫层析法制备的D-二聚体检测试剂盒。

8.根据权利要求7所述的抗D-二聚体单克隆抗体的应用，其特征在于：用于临床上对血栓性疾病的辅助诊断。

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