CN102030825B

CN102030825B - 一种抗肌钙蛋白i单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN102030825B
Application number: CN201010516899A
Authority: CN
Inventors: 黄桂民; 周季余; 黄波
Original assignee: SHANGHAI BEIXI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI BEIXI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2010-10-22
Filing date: 2010-10-22
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2030-10-22
Also published as: CN102030825A

Abstract

本发明公开了一种抗肌钙蛋白I单克隆抗体，所述抗体的轻链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。所述的抗体是由保藏号为：CCTCC NO.C201059的杂交瘤细胞株5G9A10E3分泌产生。本发明的抗肌钙蛋白I单克隆抗体可应用于肌钙蛋白I的各种检测试剂盒的制备中。使用本发明的单克隆抗体和胶体金免疫层析法制备的检测试剂盒，不仅使检测灵敏度达到97.74％，检测特异度达到94.74％，检测准确度达到96.72％，而且使Kappa检验值达到0.927，远大于0.75，与临床诊断具有较高的诊断一致性，可用于临床上对急性心肌梗塞疾病的辅助诊断。

Description

一种抗肌钙蛋白I单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明涉及一种抗肌钙蛋白I单克隆抗体及其用途，属于生物技术领域。

背景技术

心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌中所特有的蛋白标志物，分子量为22.5kD。在心脏内，TnI与TnC和TnT一起组成肌钙蛋白复合物，当心肌收缩与舒张时，该复合物在细胞间钙信号的传播中起枢纽作用。早期心肌损伤的生化指标主要限于肌红蛋白和CK-MB。然而不仅CK-MB血中存在的时间较短(1～4天)，而且CK-MB在骨骼肌及大脑中也存有，当骨骼肌及大脑损伤，CK-MB都会有显著升高。90年代以来，对肌钙蛋白的大量临床研究表明，肌钙蛋白具有心肌损伤的高度的特异性和敏感性。美国临床化学学会(NACB)及国际检测医学联合会(TFCC)建议：心肌肌钙蛋白是检测心肌损伤的新的标志物；中国检验学会推荐由心肌肌钙蛋白逐步取代CK-MB成为检出心肌损伤的新标准。

心肌肌钙蛋白I检测的临床应用：

(1)心肌梗死(MI)是冠状动脉闭塞，血流中断，部分心肌因严重的持续性缺血而发生局部坏死。cTnI的心脏特异性，及其在心脏受损后的快速及长时期的升高反应，决定了cTnI是一种诊断心肌损伤性疾病，特别是诊断心肌梗死的最佳指标。(2)不稳定型心绞痛(UA)是一组介于稳定型心绞痛和急性心肌梗死之间的急性冠状动脉缺血综合征。粥样化硬块破裂诱发非闭塞性血栓形成，由于血栓性物质造成冠状动脉小分支的栓塞，就可能引起心肌细胞的缺血性损伤，cTnI血液浓度的监测能为微小心肌损伤提供最敏感和最特异的诊断。(3)急性心衰患者血液中的cTnI可有不同程度的升高，提示cTnI可作为急性心衰患者心肌损害的敏感的生化指标。(4)心脏压力增大导致的心内膜下损伤，如充血性心衰高血压所至的左心室肥大或者代偿性心动过速时血液动力学改变(如休克病人)及肺栓塞引起的右心室损伤均可在血液中检测到cTnI的升高。(5)心肌炎的诊断与CK-MB活性相比，患心肌炎时，因cTnI相对较高的血清检测值和较长的升高时间，使cTnI具有较高的检测敏感性。短暂性心肌炎症也可引起心肌损伤。(6)手术损伤评估：术后心肌梗死是术后常见的死亡原因，病死率高达36％～70％，然而诊断却很困难，因为手术病人常处于麻醉和镇静状态，不能主动提示心肌梗死症状。Adams等人利用cTnI判断血管和脊柱外科手术中的心肌梗死，认为手术病人，心脏标志物cTnI的升高预示着心肌损伤的存在。标志物水平越高，损伤程度越大。(7)窒息新生儿心肌损伤判断：新生儿窒息是新生儿死亡的主要原因之一，因窒息缺氧导致心肌损伤已日益受到重视。1997年美国Hirsch等通过检测儿童血清cTnI，证实了儿童心肌损伤时应用cTnI检测的价值。

采用胶体金标记技术的免疫层析法具有方便、快捷、试剂易于保存等优点，已被广泛应用于免疫的各个领域，但胶体金免疫层析法的使用关键要解决其特异性、灵敏度及准确性的问题，这都需要选用具有高度特异性和高亲和力的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种高度特异性的抗肌钙蛋白I单克隆抗体及其在胶体金免疫层析法制备的肌钙蛋白I检测试剂盒中的应用，以实现利用胶体金免疫层析法能快速、准确、高灵敏度检测肌钙蛋白I的目的。

本发明所提供的抗肌钙蛋白I单克隆抗体，其特征在于：其轻链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。

所述的抗肌钙蛋白I单克隆抗体，是由保藏号为：CCTCC NO.C201059的杂交瘤细胞株5G9A10E3分泌产生。

所述的杂交瘤细胞株是以肌钙蛋白I为免疫源，小鼠为免疫对象，通过免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备悬液，并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得。

所述的抗肌钙蛋白I单克隆抗体，属于IgG亚型。

所述的抗肌钙蛋白I单克隆抗体的腹水效价为1∶10⁶。

本发明的抗肌钙蛋白I单克隆抗体不仅可以与肌钙蛋白I高度特异性结合，而且灵敏度高、稳定性好，可通过本领域技术人员所公知的的方法，制备成肌钙蛋白I的各种检测试剂盒。尤其是，应用本发明的抗肌钙蛋白I单克隆抗体和胶体金免疫层析法制备的肌钙蛋白I的检测试剂盒，不仅可以快速、简捷检测人血清、血浆或全血标本中的肌钙蛋白I，使检测灵敏度达到97.74％，检测特异度达到94.74％，检测准确度达到96.72％，而且能使Kappa检验值达到0.927，远大于0.75，与临床诊断具有较高的诊断一致性，可用于临床上对急性心肌梗塞疾病的辅助诊断。

附图说明

图1为5RACE产物电泳图，其中1号为轻链结果，2号为重链结果，M为DNA Marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：抗肌钙蛋白I单克隆抗体的制备

一、动物免疫

取雌性6～8周龄的BALB/c小鼠，首次免疫用浓度为5mg/ml的肌钙蛋白I纯品，经腹腔和四肢腋下注射，总量1ml；每隔2周以同样的方法加强免疫1次，共免疫3次，末次免疫后的第4天，从经三次免疫后小鼠眼球采血，离心分离血清，用ELISA法选出效价高的小鼠准备融合。

二、杂交瘤细胞系的制备

将完成免疫过程的小鼠准备取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，在融合前一天制备饲养细胞；融合时无菌下取小鼠脾细胞，与SP2/0细胞以10∶1混合，以50％PEG介导融合，离心后重悬于HAT选择性培养基中，接种于含有饲养细胞的96孔微孔板中，置37℃、5％CO₂培养箱培养，融合后第3d、第5d、第7d用HAT培养液半量换液，两周后换用HT培养液。

观察杂交瘤细胞的生长情况，等克隆长至孔底面积的1/3～1/2，取培养上清液，用ELISA法进行抗体检测，筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养，直到克隆化细胞抗体阳性率为100％，选出高分泌特异性细胞株(即ELISA效价在1∶10⁶以上的阳性克隆)，此时可将阳性克隆细胞进一步扩大培养。将杂交瘤细胞经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，定期收集上清，用筛选抗体的方法测定上清中的抗体，直至细胞系能稳定分泌单克隆抗体。

三、单克隆抗体的制备和纯化

选用成年BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡，1～2周后收集生长状态良好的单克隆杂交瘤细胞株5G9A10E3【该细胞株已在设置于中国武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期为：2010年7月1日，保藏号为：CCTCC NO.C201059】，每只腹腔注射1ml。接种2周左右的小鼠腹部可见明显膨大，以颈椎脱臼法处死后打开腹腔，取出腹水。离心后吸取上清，用硫酸铵沉淀后，再用DEAE离子交换柱纯化，用PH5.6、20mM的醋酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液。再用亲和层析纯化法(蛋白A-Sepharose4B柱)继续纯化，上样条件：样品和蛋白A-Sepharose4B柱用PH8.2、1.0M的Tris缓冲液平衡后再上样。洗脱条件：用PH3.0、50mM的甘氨酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，制得特异的单克隆抗体。

四、单克隆抗体的腹水效价及鉴定

取小鼠腹水抗体，用筛选抗体的方法测定效价为1∶10⁶，亚型鉴定为IgG型。刘世国等通过常规单抗杂交瘤细胞技术也获得了抗肌钙蛋白I单克隆抗体，其效价为1∶32000；杨能运用此技术获得的抗肌钙蛋白I单克隆抗体的效价为1∶16000，本发明的单克隆抗体的效价远高于现有技术。

实施例2：单克隆抗体的特异性鉴定

材料：肌钙蛋白C、肌钙蛋白T、肌红蛋白、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)。

方法：采用ELISA法检测，以肌钙蛋白I为阳性对照。

结果：显示肌钙蛋白C、肌钙蛋白T、肌红蛋白、肌酸激酶MB(CKMB)均为阴性。

说明：本发明的抗肌钙蛋白I单克隆抗体对肌钙蛋白I有高度特异性。

实施例3：单克隆抗体的可变区序列的克隆与测序

采用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，快速扩增cDNA末端)技术，从分泌抗肌钙蛋白I单克隆抗体的杂交瘤细胞株5G9A10E3中克隆功能性抗体的可变区序列。其步骤可简述为：由一个反义的基因特异性引物(GSP1)来合成cDNA第一链，cDNA第一链纯化后，利用末端脱氧核苷酸转移酶(Terminaldeoxynucleotidy transferase，TdT)在cDNA的3’末端加上一个合成的同聚核苷酸锚定序列。利用第二个巢式基因特异性引物(GSP2)和一个与同聚核苷酸尾巴可以退火的锚定引物来扩增cDNA。具体实验过程如下：

材料：

-由杂交瘤细胞株5G9A10E3分泌产生的抗肌钙蛋白I单克隆抗体

-大肠杆菌Top10菌株

-pGEM-T Easy克隆载体

引物设计：

根据免疫球蛋白基因的特点，设计两套分别对应Ig和Kappa恒定区的基因特异性引物GSP1、GSP2，引物序列如下：

pRace-H-GSP1：GTCCACCKYGGTSYTGCTGGCYGGGTG

pRace-H-GSP2：GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC

pRace-K-GSP1：ACTTGACATTGATGTCTTTG

pRace-K-GSP2：CACGACTGAGGCACCTCCAGATG

克隆过程：

A、第一链合成

以总RNA为模板，以GSP1为引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。具体步骤如下：

1)在一个0.5ml的微量离心管中加入以下组分：

GSP1 2.5ml

总RNA 1～5μg

补充经DEPC处理的水至总体积为15.5μl，混匀。

2)70℃变性10min，冰浴1min，短暂离心后依次加入以下组分：

10*PCR buffer 2.5μl

25mM MgCl₂ 2.5μl

10mM dNTP mix 1.0μl

0.1M DTT 2.5μl。

3)混匀，短暂离心后置42℃1min。

4)在反应体系中加入1μl SuperScriptTMII RT(Invitrogen公司)，轻轻混匀后置42℃反应50min。

5)反转录结束后置70℃、15min以终止反应。

6)离心10～20秒后置于37℃。

7)加入1μl RNase mix，轻轻混匀后置于37℃反应30min。

8)将反应管取出置冰上备用。

B、DNA纯化

使用QIAGEN公司QIAquick PCR纯化试剂盒。

1)加5倍体积于反转录体系的PB缓冲液于反转录反应管中，混匀。

2)将QIAquick离心柱置于2ml收集管中，把样品加入离心柱，13000rpm离心60秒。

3)弃去液体，将离心柱放回原来的收集管中，加入0.75ml PE缓冲液于QIAquick离心柱，13000rpm离心60秒。

4)弃去液体，将QIAquick离心柱放回原来的收集管，13000rpm离心60秒。

5)将QIAquick离心柱置于一干净的1.5ml离心管，在QIAquick膜中央加入30μl EB缓冲液，静置1min后，13000rpm离心60秒。

C、cDNA加尾

1)在一个0.5ml的微量离心管中一次加入以下组分：

DEPC处理的水 6.5μl

5*tailing buffer 5.0μl

2mM dCTP 2.5μl

纯化的cDNA 10.0μl，混匀。

2)将反应管置94℃维持3min后，冰浴1min，短暂离心后置冰上。

3)加入1μl TdT，混匀后置37℃反应10min。

4)将反应管置于65℃中作用30min终止反应，离心后置于冰上备用。

D、PCR

在一个0.2ml的PCR薄壁管中加入以下组分：

灭菌水 31.5μl

10*PCR Buffer 5.0μl

25mM MgCl₂ 3.0μl

10mM dNTP mix 1.0μl

GSP2(10pmol/μl) 2.0μl

AAP(10pmol/μl) 2.0μl

dC-tailed cDNA 5.0μl

Tag酶 0.5μl

合计 50.0μl

混匀后置PCR仪中进行反应。

E、PCR产物电泳纯化

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示：其中1号为轻链结果，在约440bp处有一特异性条带；2号为重链结果，在约470bp处有一特异性条带。

F、使用Promega公司的pGEM-T Easy试剂盒，将PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体，转化大肠杆菌Top10(Invitrogen公司)具体过程为：

1)轻链和重链PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，分别回收440bp和470bp的条带，最终定容于20μl体积的灭菌水中；

2)在一个0.5ml的微量离心管中，加入以下组分：

2*连接缓冲液 5μl

pGEM-T Easy 50ng(1μl)

PCR产物 25ng(3μl)

T4连接酶 1μl

混匀后室温连接2小时或者4℃连接16小时以上。

3)转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素和IPTG、X-GAL的LB平板上，37℃培养12小时左右。

G、测定所克隆的PCR产物的碱基序列

各选取至少5个质粒测定其所含的PCR产物的碱基序列。

H、根据碱基序列与氨基酸编码序列的相应关系，分析PCR产物的阅读框架，确定相应可变区的氨基酸序列，其轻链和重链的序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。根据免疫球蛋白基因的特点验证其为抗体序列。

实施例4：本发明的抗肌钙蛋白I单克隆抗体的应用

采用本领域技术人员所公知的胶体金免疫层析法，制作肌钙蛋白I快速检测试剂盒，在体外定性检测人血清、血浆或全血标本中的肌钙蛋白I，用于临床上辅助诊断急性心肌梗塞(AMI)疾病。

一、检测原理

采用胶体金标记的免疫层析技术，标本中的cTnI与检测区包被的抗cTnI抗体结合，当cTnI浓度超过检测限时，在检测区会形成一条色带，无cTnI的标本在检测区不会形成色带。而质控区则始终会出现红色色带，以提示检测结果正确有效。

二、检测方法

A、标本收集及准备

1)采用标准实验室程序收集血清、血浆或全血标本。

2)避免热灭活标本，以防止出现溶血或蛋白变性。

3)全血标本采集：使用肝素或EDTA为抗凝剂，收集血液标本，由于肌钙蛋白I在全血或血清标本中很不稳定，全血或血清标本应在采集后4小时内用于检测。

4)血浆/血清标本采集：将全血标本离心以获得血清或血浆标本，如果标本不能马上用于检测，置2～8℃保存24小时，如果不能在24小时内进行检测，需置-20℃或更低温度下保存。【注意：标本在检测前需平衡至室温。】

B、操作步骤

1)实验前将所需物质及标本平衡至室温。然后撕开铝箔袋，从中取出检测板，放在水平的表面上。

2)用移液器加80μl标本(或用吸管滴加2滴标本)于样品孔中。

3)15分钟内观察结果。【注意：若为肌钙蛋白I含量低的标本，显色时间可能会超过15分钟。】

三、结果判定

1)阳性：15分钟内出现两条色带时，结果判为阳性。

2)阴性：如果检测区不出现色带，而在质控区出现一条色带，结果判为阴性。

3)无效：如果质控区不出现色带，结果判为无效，必须使用新检测板重新检测标本。

四、临床应用结果

为评价本发明的肌钙蛋白I快速检测试剂盒在临床上应用于对急性心肌梗塞(AMI)疾病进行辅助诊断的适用性与准确性，在浙江大学医学院第一附属医院从临床中选出335例样本作为研究对象。入选对象以表现出急性心肌梗塞症状的患者为主，也包括少部分无明显急性心肌梗塞症状的就诊患者。采用美国贝克曼库尔特公司的肌钙蛋白I检测试剂盒对入选样本进行检测，依据检测结果将样本分为病例组和对照组。同时用本发明的试剂盒对这些样本进行检测，比较检测结果，并进行统计分析，实验结果见表1所示。

表1应用本发明的检测试剂盒的临床对比研究结果

由表1结果表明：本发明的试剂盒的检测灵敏度达到97.74％，检测特异度达到94.74％，准确度达到96.72％，能适用于在临床对急性心肌梗塞疾病进行辅助诊断。

另外，Kappa检验值为0.927，远大于0.75，说明本发明的试剂盒与临床诊断具有较高的诊断一致性。

Claims

1.一种抗肌钙蛋白I单克隆抗体，其特征在于：其轻链可变区的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链可变区的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的抗肌钙蛋白I单克隆抗体，其特征在于：所述的抗肌钙蛋白I单克隆抗体是由保藏号为：CCTCC NO.C201059的杂交瘤细胞株5G9A10E3分泌产生。

3.根据权利要求1所述的抗肌钙蛋白I单克隆抗体，其特征在于：所述的抗肌钙蛋白I单克隆抗体属于IgG亚型。

4.根据权利要求1所述的抗肌钙蛋白I单克隆抗体，其特征在于：所述的抗肌钙蛋白I单克隆抗体的腹水效价为1∶10⁶。

5.一种权利要求1所述的抗肌钙蛋白I单克隆抗体的应用，其特征在于：用于肌钙蛋白I检测试剂盒的制备。

6.根据权利要求5所述的抗肌钙蛋白I单克隆抗体的应用，其特征在于：所述的肌钙蛋白I检测试剂盒是胶体金免疫层析法检测试剂盒。

7.根据权利要求6所述的抗肌钙蛋白I单克隆抗体的应用，其特征在于：所述的肌钙蛋白I检测试剂盒用于临床上对急性心肌梗塞疾病的辅助诊断。