CN102010470B - 一种抗ⅳ型胶原单克隆抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗IV型胶原单克隆抗体，所述抗体的轻链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。所述的抗体是由保藏号为：CCTCC NO.C201057的杂交瘤细胞株2D8F9H12分泌产生。本发明的抗IV型胶原单克隆抗体可应用于IV型胶原的各种检测试剂盒的制备中。使用本发明的单克隆抗体和双抗体夹心固相酶联免疫法制备的IV型胶原检测试剂盒，不仅可以定量检测人血清中IV型胶原的含量，而且具有高灵敏度、准确性和较高的诊断一致性，可用于临床上对肝纤维化的辅助诊断。

Description

一种抗Ⅳ型胶原单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明涉及一种抗IV型胶原单克隆抗体及其用途，属于生物技术领域。

背景技术

IV型胶原(Collagen Type IV，简写为CIV)是由分子交联形成的一种网状结构，它有两个末端，7s胶原组分为IV型胶原氨基末端的四聚体，NC1为IV型胶原羧基末端的二聚体，均参与寡聚体的形成。IV型胶原是肝基底膜的主要成分，存在于肝门静脉血管区，中央静脉周围，沿着窦状隙分布。

IV型胶原在合成代谢过程中不需去除端肽而沉积于细胞外基质，故血中IV型胶原的含量升高可能反映了肝血窦基底膜的更新率加快。基础和临床研究均发现血清IV型胶原水平和肝纤维化及门脉高压程度密切相关，与肝脏炎症活动关系较小。正常肝脏的肝窦周围无完整的基底膜结构。肝纤维化时，Disse氏腔内形成基底膜。此时，肝组织及血清中IV型胶原含量亦相应增加，且IV型胶原含量与肝纤维化程度呈正相关。因此，测定血清中IV型胶原含量是辅助诊断肝纤维化的一个重要指标。

肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，由于细胞外基质的形成和降解的平衡失调，导致肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程。临床上对肝纤维化的诊断方法主要有肝组织病理学诊断、影像学检查及血清学诊断。血清学诊断是研究最广泛的肝纤维化诊断方法，其最常用的肝纤维化指标有透明质酸、层粘蛋白、III型前胶原氨基末端肽、IV型胶原等。这些血清学指标的高低与肝纤维化严重程度密切相关，因而可用于诊断肝纤维化。血清化验的优点是取材方便、容易复查，如果能定期检查(如每半年或一年)则可以根据这些指标是升高或降低的总趋势来了解肝脏纤维化的发展变化情况，也能大致了解抗纤维化的治疗的临床效果。

除了对肝纤维化进行辅助诊断，血清IV型胶原是判断糖尿病早期肾损害或肾小球纤维化程度的有用指标；同时对探讨肺结核发生肺纤维化的早期诊断、以及发病机理的研究等也具有重要意义。

临床检测IV型胶原一般采用放射免疫分析方法、固相酶联免疫方法或时间分辨荧光免疫分析方法。放射免疫分析法存在操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等问题；时间分辨荧光免疫分析方法需要用稀有金属进行标记；化学发光仅能一次发光且易受环境干扰；酶联免疫方法特异性好和灵敏性高、操作简便、试剂稳定、对环境没有污染威胁。

基于双抗体夹心法原理的固相酶联免疫法(ELISA)是检测抗原最常用的方法，在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成″夹心复合物″。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应(hook effect)，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。但用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

发明内容

本发明的目的是提供一种高亲和力的抗IV型胶原单克隆抗体及其在双抗体夹心固相酶联免疫法制备的检测试剂盒中的应用，以克服此类试剂容易产生的钩状效应，提高对IV型胶原的检测灵敏度和准确性。

本发明所提供的抗IV型胶原单克隆抗体，其特征在于：其轻链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。

所述的抗IV型胶原单克隆抗体，是由保藏号为：CCTCC NO.C201057的杂交瘤细胞株2D8F9H12分泌产生。

所述的杂交瘤细胞株是以IV型胶原为免疫源，小鼠为免疫对象，通过免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备悬液，并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得。

所述的抗IV型胶原单克隆抗体，属于IgG亚型。

所述的抗IV型胶原单克隆抗体的腹水效价为1∶10⁶。

本发明的抗IV型胶原单克隆抗体可以与IV型胶原高度特异性结合，可通过本领域技术人员所公知的的方法，制备成IV型胶原的各种检测试剂盒。尤其是，应用本发明的抗IV型胶原单克隆抗体和双抗体夹心固相酶联免疫法制备的IV型胶原检测试剂盒，不仅可以定量检测人血清中IV型胶原的含量，使检测灵敏度能达到11.774ng/ml，检测准确性在0.9至1.1之间，剂量-反应曲线的线性在0.997以上，批内不精密度小于10％，批间不精密度小于15％，而且与对比检测试剂配对T检验P值＞0.05，与对比检测试剂相关性r(Pearson Correlation)＞0.90、P(Sig.(2-tailed))＜0.01，具有较高的诊断一致性，可用于临床上对肝纤维化的辅助诊断。

附图说明

图1为5RACE产物电泳图，其中1号为轻链结果，2号为重链结果，M为DNA Marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：抗IV型胶原单克隆抗体的制备

一、动物免疫

取雌性6～8周龄的BALB/c小鼠，首次免疫用浓度为5mg/ml的IV型胶原纯品，经腹腔和四肢腋下注射，总量1ml。每隔2周以同样的方法加强免疫1次，共免疫3次，末次免疫后的第4天，从经三次免疫后小鼠眼球采血，离心分离血清，用ELISA法选出效价高的小鼠准备融合。

二、杂交瘤细胞系的制备

完成免疫过程的小鼠准备取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，在融合前一天制备饲养细胞。融合时无菌下取小鼠脾细胞，与SP2/0细胞以10∶1混合，以50％PEG介导融合，离心后重悬于HAT选择性培养基中，接种于含有饲养细胞的96孔微孔板中，置37℃、5％CO₂培养箱培养，融合后第3d、第5d、第7d用HAT培养液半量换液，两周后换用HT培养液。

观察杂交瘤细胞的生长情况，等克隆长至孔底面积的1/3～1/2，取培养上清液，用ELISA法进行抗体检测，筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养，直到克隆化细胞抗体阳性率为100％，选出高分泌特异性细胞株(即ELISA效价在1∶10⁶以上的阳性克隆)，此时可将阳性克隆细胞进一步扩大培养。将杂交瘤细胞经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，定期收集上清，用筛选抗体的方法测定上清中的抗体，直至细胞系能稳定分泌单克隆抗体。

三、单克隆抗体的制备和纯化

选用成年BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡，1～2周后收集生长状态良好的单克隆杂交瘤细胞株2D8F9H12【该细胞株已在设置于中国武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期为：2010年7月1日，保藏号为：CCTCC NO.C201057】，每只腹腔注射1ml。接种2周左右的小鼠腹部可见明显膨大，以颈椎脱臼法处死后打开腹腔，取出腹水。离心后吸取上清，用硫酸铵沉淀后，再用DEAE离子交换柱纯化，用PH5.6，20mM的醋酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液。再用亲和层析纯化法(蛋白A-Sepharose4B柱)继续纯化，上样条件：样品和蛋白A-Sepharose4B柱用PH8.2，1.0M的Tris缓冲液平衡后再上样。洗脱条件：用PH3.0，50mM的甘氨酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，制得特异的单克隆抗体。

四、单克隆抗体的腹水效价及鉴定

取小鼠腹水抗体，用筛选抗体的方法测定效价为1∶10⁶，亚型鉴定为IgG型。

实施例2：单克隆抗体的特异性鉴定

材料：透明质酸、层粘蛋白、III型前胶原氨基末端肽、III型胶原、硫酸软骨素。

方法：采用ELISA法检测，以IV型胶原为阳性对照。

结果：显示透明质酸、层粘蛋白、III型前胶原氨基末端肽、III型胶原、硫酸软骨素均为阴性。

说明：本发明的抗IV型胶原单克隆抗体对IV型胶原具有高度特异性。

实施例3：单克隆抗体的可变区序列的克隆与测序

采用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，快速扩增cDNA末端)技术，从分泌抗IV型胶原单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D8F9H12中克隆功能性抗体的可变区序列。其步骤可简述为：由一个反义的基因特异性引物(GSP1)来合成cDNA第一链，cDNA第一链纯化后，利用末端脱氧核苷酸转移酶(Terminaldeoxynucleotidy transferase，TdT)在cDNA的3’末端加上一个合成的同聚核苷酸锚定序列。利用第二个巢式基因特异性引物(GSP2)和一个与同聚核苷酸尾巴可以退火的锚定引物来扩增cDNA。具体实验过程如下：

材料：

-由杂交瘤细胞株2D8F9H12分泌产生的抗IV型胶原单克隆抗体

-大肠杆菌Top10菌株

-pGEM-T Easy克隆载体

引物设计：

根据免疫球蛋白基因的特点，设计两套分别对应Ig和Kappa恒定区的基因特异性引物GSP1、GSP2，引物序列如下：

pRace-H-GSP1：GTCCACCKYGGTSYTGCTGGCYGGGTG

pRace-H-GSP2：GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC

pRace-K-GSP1：ACTTGACATTGATGTCTTTG

pRace-K-GSP2：CACGACTGAGGCACCTCCAGATG

克隆过程：

A、第一链合成

以总RNA为模板，以GSP1为引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。具体步骤如下：

1)在一个0.5ml的微量离心管中加入以下组分：

GSP1     2.5ml

总RNA    1～5μg

补充经DEPC处理的水至总体积为15.5μl，混匀。

2)70℃变性10min，冰浴1min，短暂离心后依次加入以下组分：

10*PCR buffer    2.5μl

25mM MgCl₂       2.5μl

10mM dNTP mix    1.0μl

0.1M DTT         2.5μl。

3)混匀，短暂离心后置42℃1min。

4)在反应体系中加入1μl SuperScriptTMII RT(Invitrogen公司)，轻轻混匀后置42℃反应50min。

5)反转录结束后置70℃、15min以终止反应。

6)离心10～20秒后置于37℃。

7)加入1μl RNase mix，轻轻混匀后置于37℃反应30min。

8)将反应管取出置冰上备用。

B、DNA纯化

使用QIAGEN公司QIAquick PCR纯化试剂盒。

1)加5倍体积于反转录体系的PB缓冲液于反转录反应管中，混匀。

2)将QIAquick离心柱置于2ml收集管中，把样品加入离心柱，13000rpm离心60秒。

3)弃去液体，将离心柱放回原来的收集管中，加入0.75ml PE缓冲液于QIAquick离心柱，13000rpm离心60秒。

4)弃去液体，将QIAquick离心柱放回原来的收集管，13000rpm离心60秒。

5)将QIAquick离心柱置于一干净的1.5ml离心管，在QIAquick膜中央加入30μl EB缓冲液，静置1min后，13000rpm离心60秒。

C、cDNA加尾

1)在一个0.5ml的微量离心管中一次加入以下组分：

DEPC处理的水        6.5μl

5*tailing buffer    5.0μl

2mM dCTP            2.5μl

纯化的cDNA          10.0μl，混匀。

2)将反应管置94℃维持3min后，冰浴1min，短暂离心后置冰上。

3)加入1μl TdT，混匀后置37℃反应10min。

4)将反应管置于65℃中作用30min终止反应，离心后置于冰上备用。

D、PCR

在一个0.2ml的PCR薄壁管中加入以下组分：

灭菌水           31.5μl

10*PCR Buffer    5.0μl

25mM MgCl₂       3.0μl

10mM dNTP mix    1.0μl

GSP2(10pmol/μl) 2.0μl

AAP(10pmol/μl)  2.0μl

dC-tailed cDNA   5.0μl

Tag酶            0.5μl

合计             50.0μl

混匀后置PCR仪中进行反应。

E、PCR产物电泳纯化

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示：其中1号为轻链结果，在约420bp处有一特异性条带；2号为重链结果，在约440bp处有一特异性条带。

F、使用Promega公司的pGEM-T Easy试剂盒，将PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体，转化大肠杆菌Top10(Invitrogen公司)具体过程为：

1)轻链和重链PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，分别回收420bp和440bp的条带，最终定容于20μl体积的灭菌水中；

2)在一个0.5ml的微量离心管中，加入以下组分：

2*连接缓冲液   5μl

pGEM-T Easy    50ng(1μl)

PCR产物        25ng(3μl)

T4连接酶       1μl

混匀后室温连接2小时或者4℃连接16小时以上。

3)转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素和IPTG、X-GAL的LB平板上，37℃培养12小时左右。

G、测定所克隆的PCR产物的碱基序列

各选取至少5个质粒测定其所含的PCR产物的碱基序列。

H、根据碱基序列与氨基酸编码序列的相应关系，分析PCR产物的阅读框架，确定相应可变区的氨基酸序列，其轻链和重链的序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。根据免疫球蛋白基因的特点验证其为抗体序列。

实施例4：本发明的抗IV型胶原单克隆抗体的应用

采用本领域技术人员所公知的基于双抗体夹心法原理的固相酶联免疫技术，制作IV型胶原检测试剂盒，在体外定量检测人血清中的IV型胶原的含量，用于临床上辅助诊断肝纤维化疾病。

一、检测原理

采用基于双抗体夹心法原理的固相酶联免疫方法(ELISA)。微孔内包被抗IV型胶原的单克隆抗体，将标准品或待测标本加入微孔中进行温育，在温育过程中，标本中的IV型胶原与单克隆抗体结合形成复合物。洗涤除掉未结合的物质，再加入辣根过氧化物酶标记的抗IV型胶原单克隆抗体进行温育，则酶标记单克隆抗体与微孔内的复合物形成抗体-抗原-抗体复合物。洗涤除去未结合的物质，加底物显色。颜色的强弱反映了结合的酶标抗体的量。它与标本中的IV型胶原的浓度成正比。终止反应后，用酶标仪在450nm读吸光度，其值与标本中的IV型胶原浓度成正比。根据所测定的标准品的吸光度绘制标准曲线，待测标本中的IV型胶原浓度值即可从标准曲线上获得。

二、检测方法

A、试剂配制

1)配制洗涤液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按1∶20比例稀释，得到洗涤液备用。

2)准备标准品：用标准品稀释液将标准品原液(2000ng/ml)倍比稀释，得到浓度为1000ng/ml，500ng/ml，250ng/ml，125ng/ml，62ng/ml的标准品。

B、操作步骤

1)根据实验用量，取出相应数量的板条，其余板条放回密封袋中，于2～8℃下密封保存。

2)将取出的微孔中的液体弃去，用洗涤液洗涤2次，洗涤完毕后，将微孔板在吸水纸上拍干。

3)在相应的微孔中分别加入已倍比稀释的IV型胶原标准品或被测血清标本100μl；另取1孔加入100μl标准品稀释液(则该孔IV型胶原浓度为0ng/ml)。37℃温箱中温育反应90分钟。

4)弃去微孔中液体，用洗涤液洗涤4～5次，洗涤完毕后，将微孔板在吸水纸上拍干。

5)每孔加入酶标抗体100μl，37℃温箱中反应45分钟。

6)弃去微孔中液体，用洗涤液洗涤4～5次，洗涤完毕后，将微孔板在吸水纸上拍干。

7)每孔加底物液A，底物液B各1滴，避光37℃反应10分钟。

8)每孔加终止液一滴终止反应，在终止反应后15分钟内于酶标仪450nm处测定各孔O.D值。

C、标准曲线的绘制

以450nm处的O.D.值为纵座标，IV型胶原的浓度为横座标，根据标准品的浓度及相应的实际O.D.值制得标准曲线。

D、结果计算

根据被测血清标本在450nm处的实际O.D.值，在标准曲线上求得其相对应的IV型胶原浓度(ng/ml)。

三、结果判定

正常参考值范围30～140ng/ml。

选取125例正常个体作为参考人群进行检测，采用百分位数法确定参考值范围。以可信度95％为正常值范围，计算单测上限P95。

四、临床应用结果

为评价IV型胶原检测试剂盒(酶联免疫法)在临床上应用于定量测定人血清中IV型胶原含量的适用性与准确性，在湖北省中医院从临床中选出200例样本作为研究对象进行检测，研究对象分为肝纤维化患者组和正常对照组，其中肝纤维化患者组88例，包括慢性肝炎，脂肪肝，自身免疫性肝病病人，正常对照组112例，包括正常人和部分无症状的就诊患者。采用与日本第一化学的IV型胶原定量检测试剂盒(免疫比浊法)作为参比的方法。比较检测结果，并进行统计分析，实验结果见表1所示。

表1本发明的检测试剂盒的临床应用结果

由表1结果可说明：

应用本发明的抗IV型胶原单克隆抗体和基于双抗体夹心法原理的固相酶联免疫技术制备的IV型胶原检测试剂盒，对IV型胶原检测具有较好的灵敏度，较高的准确性、批内不精密度和批间不精密度，且剂量-反应曲线的线性也能较好的拟合。统计分析结果也表明该方法与现有产品具有较好的诊断一致性。此外，肝纤维化患者组和正常对照组间IV型胶原检测结果存在显著差异，表明IV型胶原检测试剂盒能很好的区分肝纤维化患者及正常人，检测结果与临床印证良好，可适用于在临床上对肝纤维化进行辅助诊断。

Claims (7)

1.一种抗IV型胶原单克隆抗体，其特征在于：其轻链可变区的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链可变区的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的抗IV型胶原单克隆抗体，其特征在于：所述的抗IV型胶原单克隆抗体是由保藏号为：CCTCC NO.C201057的杂交瘤细胞株2D8F9H12分泌产生。

3.根据权利要求1所述的抗IV型胶原单克隆抗体，其特征在于：所述的抗IV型胶原单克隆抗体属于IgG亚型。

4.根据权利要求1所述的抗IV型胶原单克隆抗体，其特征在于：所述的抗IV型胶原单克隆抗体的腹水效价为1∶106。

5.一种权利要求1所述的抗IV型胶原单克隆抗体的应用，其特征在于：用于IV型胶原检测试剂盒的制备。

6.根据权利要求5所述的抗IV型胶原单克隆抗体的应用，其特征在于：所述的IV型胶原检测试剂盒是双抗体夹心固相酶联免疫法检测试剂盒。

7.根据权利要求6所述的抗IV型胶原单克隆抗体的应用，其特征在于：所述的IV型胶原检测试剂盒用于临床上对肝纤维化疾病的辅助诊断。

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