CN102008573B - 清肺止咳平喘口服液有效成分检测方法 - Google Patents
清肺止咳平喘口服液有效成分检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是一种清肺止咳平喘口服液的质量检测方法，通过对色谱条件的优选及供试品、对照品制备方法的试验，建立了制剂中主要药效成分盐酸麻黄碱含量的高效液相色谱分析方法；通过对色谱分离系统的优化，展开剂配比的调整、硅胶板及显色剂、显色条件的选择，建立了制剂中麻黄、甘草、桑叶的薄层色谱鉴别方法，通过方法学试验研究表明：所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，通过对制剂中有效成分的定性鉴别及定量控制，确保药效成分的稳定性，有利于生产过程的质量控制。是为患者提供安全、有效的治疗呼吸系统疾病的药物的有力保障。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域，特别是一种清肺止咳平喘口服液有效成分检测的方法。
背景技术
慢性支气管炎是一种常见的慢性非特异性呼吸系统疾病,主要临床特征为反复发作的咳嗽、咳痰或伴有喘息。慢支发病率高, 多见于 4 0岁以上的中老年人，病情反复,可并发阻塞性肺气肿,甚至肺动脉高压、肺原性心脏病,严重影响患者的劳动能力和生活质量。该病在正常人群中的发病率4％，50岁以上的发病率则可升高为16％，年龄越大，发病率越高，严重危害人们的健康。
西医治疗慢支主要是选用地塞米松、庆大霉素、糜蛋白酶、肝素等超声雾化，注射抗生素稀释痰液，但是长期使用有可能出现呼吸道出血，肾功能损害等不良反应。对于慢性支气管炎的防治，历来为中医药界较为重视的研究课题。
中医辨证认为：慢支主要是久咳不已，反复发作，导致肺、脾、肾三脏功能失调所致。急性发作期以痰热证为主，慢性迁延期以痰湿证为多。
清肺止咳平喘口服液的处方为：
麻黄 135g 石膏 405g 桑叶 135g 苦杏仁 135g 甘草 90g
辅料：蔗糖200g；苯甲酸3g；枸橼酸适量。
清肺止咳平喘平喘口服液处方由传统著名方剂麻杏石甘汤加减而成，麻杏石甘汤具有配伍严谨、药味精练的特点，其主要功效为辛凉宣泄、清肺平喘。主治中医太阳病。太阳病是外感病的初期阶段证候，症状表现于自头部顶背及全身肌表，由于风寒之邪外袭、营卫失和、经气不利、阳气抗邪于表，从而病邪侵袭反肺，肺气失宣、肺卫功能失调，导致恶寒发热、烦躁口咳、喘促气逆、咳嗽痰盛。
清肺止咳平喘口服液在麻杏石甘汤组方的基础上，增加桑叶。其选药组方要点概述如下：本方主治病症是由风热袭肺、或风寒郁而化热、壅遏于肺所致。肺中热盛、气逆津伤，所以有汗而身热不解、喘逆气急、口渴喜饮、脉滑而数，方用麻黄为君，能宣肺而泄邪热，是“火郁发之”之义，但其性温，故配伍辛大寒之石膏为臣药，用量倍于麻黄，使宣肺而不助热，清肺而不留邪，肺气肃降有权、喘急可平，是相知为用。桑叶疏散风热、清肺润燥，以助解表宣肺之力，与石膏同为臣药。杏仁降肺气，而平喘咳，用为佐药，助麻黄、石膏、桑叶清肺平喘。甘草既能益气和中，又与石膏合而生津治咳，更能调和于寒温宣降之间，所以为佐、使药。综观全方，配伍严谨、相互为用，达到宣肺清热、平喘止咳之功效，从而该药主治功用确切肯定。
清肺止咳平喘口服液用于治疗慢性支气管炎急性发作（风邪化热壅肺证），我们进行了以先声咳喘宁口服液为阳性对照的清肺止咳平喘口服液用于治疗慢性支气管炎急性发作（风邪化热壅肺症）的Ⅱ期、Ⅲ期临床试验。Ⅱ期临床试验结果表明：以先声咳喘宁口服液为阳性对照组，清肺止咳平喘口服液为试验组，两组治疗前后各访视点气管炎症状体征积分和中医症候积分均明显下降，两组差别比较无统计学意义。各症状评分治疗后均明显下降，但各症状评分下降值两组差别比较均无统计学意义。Ⅲ期临床试验结果表明：先声咳喘宁口服液为阳性对照组，以清肺止咳平喘口服液为试验组，两组治疗后各访视点气管炎症状体征积分和中医证候积分均明显下降，第3天和第5天试验组下降程度优于对照组，两组所有症状治疗后均明显改善，其中，对咳嗽、咯痰、喘息、干啰音4个症状的改善在第3天和第5天试验组均不同程度地优于对照组。通过对不良事件分析，本次试验无不良事件发生。本结果表明试验药物安全性良好。
因此，清肺止咳平喘口服液治疗慢性支气管炎疗效确切，安全性良好。可以避免慢性支气管炎急性发作期使用广谱抗生素，易导致二重感染或产生耐药菌株；避免应用强的镇咳剂，如可待因等。以免抑制中枢及加重呼吸道阻塞和炎症，导致病情恶化等。
中药制剂成分复杂，药效成分的鉴别、含量检测方法的建立是新药研发的重要工作，是制剂质量控制的关键内容，在检测手段上从传统的光度法、滴定法、理化鉴别法转变为现在的薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、指纹图谱法等。
发明内容
本发明的目的是提供一种清肺止咳平喘口服液有效成分检测方法。
本发明的目的按照下述方案实现：
清肺止咳平喘口服液有效成分检测方法，包括有效成分含量检测和主要成份鉴别检测，其中有效成分检测以盐酸麻黄碱含量为指标，成分鉴别选择麻黄、桑叶、甘草为检测对象；
所述有效成分含量检测采用高效液相色谱法测定制剂中盐酸麻黄碱含量，其色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%磷酸溶液5：95为流动相；检测波长为207nm，理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000；
有效成分含量检测对照品溶液的制备方法为：精密称取盐酸麻黄碱对照品15mg，置50ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加入0.25g/10ml高碘酸溶液1ml、0.25mol/L氢氧化钠溶液2.5ml，摇匀，放置30分钟，用0.5mol/L盐酸溶液调节pH值至7，加流动相至刻度，摇匀，即得；
有效成分含量检测供试品溶液的制备方法：精密量取口服液10ml，加5mol/L氢氧化钠溶液120ml，摇匀，加氯化钠7.5g，超声处理30分钟，静置冷却，再加入水50ml，蒸馏，用预先盛有0.5mol/L盐酸溶液5ml的100ml量瓶收集蒸馏液近95ml，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加入0.25g/10ml高碘酸溶液1ml、0.25mol/L氢氧化钠溶液2.5ml，摇匀，放置30分钟，用0.5mol/L盐酸溶液调节pH值至7，加流动相至刻度，摇匀，即得；
成分鉴别采用薄层色谱法，先制备样品溶液和对照药材溶液，两种溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，比对显色情况；
所述麻黄药效成分的鉴别方法为：取口服液5ml，加浓氨溶液0.5ml，再加乙醚40ml超声提取30分钟，取乙醚层，60℃水浴挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；取麻黄对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液；另取盐酸麻黄碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含1.5mg的溶液，作为对照品溶液，吸取上述三种溶液各6μl，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材，对照品色谱相应的位置上，如显相同颜色的斑点，则制剂中麻黄药效成分麻黄碱存在。
所述甘草药效成分的鉴别方法为：取口服液5ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液，另取甘草对照药材1g，加乙醇回流30分钟提取2次，每次30ml，合并乙醇提取液，蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照药材溶液，吸取供试品溶液，对照药材溶液各5μl，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，如显相同颜色的斑点，则制剂中甘草药效成分甘草酸存在。
所述桑叶成分的鉴别方法为：取口服液5ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取桑叶对照药材2g，用乙醇回流提取2次，每次30 ml、30分钟，合并乙醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照药材溶液；吸取上述两种溶液各7.5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，喷以1 %三氯化铝乙醇溶液，在紫外灯（365nm）下观察，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，如显相同颜色的荧光斑点，则制剂中桑叶药效成分存在。
本发明通过试验研究建立了薄层色谱法和高效液相色谱法测定制剂的药效成分，实现了对新药制剂清肺止咳平喘口服液的定性及定量的产品检测，确保药效成分的稳定性，并有利于生产过程的质量控制。为患者提供安全、有效的治疗呼吸系统疾病的药物提供保障。
本发明的特点主要是：通过对色谱条件的优选、供试品、对照品制备方法的试验，建立了制剂中主要药效成分盐酸麻黄碱含量的高效液相色谱分析方法，通过方法学试验研究表明：准确度试验的平均回收率为：97.75%，相对标准偏差RSD:2.28%；精密度试验的RSD:0.78%；线性关系良好，相关系数γ=0.9999；专属性试验考察无阴性干扰。试验证明所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，可以有效的控制最终制剂产品质量。
具体实施方式
制剂中主要药效成分盐酸麻黄碱含量测定：采用高效液相色谱法， 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%磷酸溶液（5：95）为流动相；检测波长为207nm。理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备 精密称取盐酸麻黄碱对照品15mg，置50ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加入高碘酸溶液（0.25g→10ml）1ml、0.25mol/L氢氧化钠溶液2.5ml，摇匀，放置30分钟，用0.5mol/L盐酸溶液调节pH值至7，加流动相至刻度，摇匀，即得（每1ml含盐酸麻黄碱12μg）。
供试品溶液的制备 精密量取本品10ml，加5mol/L氢氧化钠溶液120ml，摇匀，加氯化钠7.5g，超声处理(功率120W,频率40kHz)30分钟，静置冷却，再加入水50ml，蒸馏，用预先盛有0.5mol/L盐酸溶液5ml的100ml量瓶收集蒸馏液近95ml，加水至刻度，摇匀。精密量取5ml，置25ml量瓶中，照对照品溶液的制备项下的方法，自“加入高碘酸溶液” 起，至“加流动相至刻度”，依法操作，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定。本发明每10ml含麻黄以盐酸麻黄碱（C10H15NO.HCl）计，不得少于0.50mg。
成分鉴别：
1、麻黄鉴别：取本品5ml，加浓氨溶液0.5ml，再加乙醚40ml超声提取(功率120W,频率40kHz)30分钟，取乙醚层，60℃水浴挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取麻黄对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液。另取盐酸麻黄碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含1.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各6μl，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（20：5：0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材，对照品色谱相应的位置上，如显相同颜色的斑点，则制剂中麻黄药效成分麻黄碱存在。
2、甘草鉴别：取本品5ml，加乙酸乙酯振摇提取2次（30ml，30ml），合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1g，加乙醇回流30分钟提取2次，每次30ml，合并乙醇提取液，蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照药材溶液。吸取供试品溶液，对照药材溶液各5μl，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15：1：1：2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，如显相同颜色的斑点，则制剂中甘草药效成分甘草酸存在。
3、桑叶鉴别：取本品5ml，加乙酸乙酯振摇提取2次（30ml，30ml），合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取桑叶对照药材2g，用乙醇回流提取2次，每次30 ml、30分钟，合并乙醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照药材溶液。吸取上述两种溶液各7.5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5：2：1）的上层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，喷以1 %三氯化铝乙醇溶液，在紫外灯（365nm）下观察。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，如显相同颜色的荧光斑点，则制剂中桑叶药效成分存在。
Claims (4)
1.清肺止咳平喘口服液有效成分的检测方法，包括有效成分含量检测和主要成份鉴别检测，其中有效成分含量检测以盐酸麻黄碱含量为指标，成分鉴别选择麻黄、桑叶、甘草为检测对象；有效成分含量检测采用高效液相色谱法测定制剂中盐酸麻黄碱含量，其色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%磷酸溶液5：95为流动相；检测波长为207nm，理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000；有效成分含量检测中对照品溶液的制备方法为：精密称取盐酸麻黄碱对照品15mg，置50ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加入0.25g/10ml高碘酸溶液1ml、0.25mol/L氢氧化钠溶液2.5ml，摇匀，放置30分钟，用0.5mol/L盐酸溶液调节pH值至7，加流动相至刻度，摇匀，即得；有效成分含量检测中供试品溶液的制备方法：精密量取口服液10ml，加5mol/L氢氧化钠溶液120ml，摇匀，加氯化钠7.5g，超声处理30分钟，静置冷却，再加入水50ml，蒸馏，用预先盛有0.5mol/L盐酸溶液5ml的100ml量瓶收集蒸馏液近95ml，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加入0.25g/10ml高碘酸溶液1ml、0.25mol/L氢氧化钠溶液2.5ml，摇匀，放置30分钟，用0.5mol/L盐酸溶液调节pH值至7，加流动相至刻度，摇匀，即得；
其中所述清肺止咳平喘口服液由如下原料制成：
麻黄 135g 石膏 405g 桑叶 135g 苦杏仁 135g 甘草 90g
辅料：蔗糖200g 苯甲酸3g 枸橼酸适量。
2.如权利要求1所述的清肺止咳平喘口服液有效成分检测方法，其特征在于麻黄药效成分的鉴别方法为：取口服液5ml，加浓氨溶液0.5ml，再加乙醚40ml超声提取30分钟，取乙醚层，60℃水浴挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；取麻黄对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液；另取盐酸麻黄碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含1.5mg的溶液，作为对照品溶液，吸取上述三种溶液各6μl，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材，对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3.如权利要求1所述的清肺止咳平喘口服液有效成分检测方法，其特征在于甘草药效成分的鉴别方法为：取口服液5ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液，另取甘草对照药材1g，加乙醇回流30分钟提取2次，每次30ml，合并乙醇提取液，蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照药材溶液，吸取供试品溶液，对照药材溶液各5μl，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
4.如权利要求1所述的清肺止咳平喘口服液有效成分检测方法，其特征在于桑叶成分的鉴别方法为：取口服液5ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取桑叶对照药材2g，用乙醇回流提取2次，每次30 ml、30分钟，合并乙醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照药材溶液；吸取上述两种溶液各7.5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，喷以1 %三氯化铝乙醇溶液，在紫外灯365nm下观察，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
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