CN101979636A - 一种球形细菌纤维素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种球形细菌纤维素的制备方法，将活化好的菌种置于种子培养基中进行摇床震荡培养得到种子溶液；将培养好的种子溶液接入发酵培养基中，采用动态培养3～10d，得到颗粒均匀的球形细菌纤维素。本发明采用动态培养模式有效降低了培养过程中的能耗，可实现调控颗粒粒径大小且能满足食品加工、药物缓释、生物标记等领域应用的球形细菌纤维素，符合食品加工、生物医学领域的使用要求，具有过程简单易行、操作方便、无污染、成本低等特点，为球形细菌纤维素的工业化生产提供一条有效途径。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种球形细菌纤维素的制备方法，具体地说是以动态培养得到一种粒径分布均匀的球形细菌纤维素的方法。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial Cellulose，BC)作为一种优良的生物材料，具有其独特的物理、化学性能：BC具有天然的三维纳米网络结构；高抗张强度和弹性模量；高亲水性，良好的透气、吸水、透水性能，非凡的持水性和高湿强度。它口感脆滑，富有弹性，咀嚼性好，高温处理仍能保持原有的品质，现已广泛应用于果冻、罐头、饮料等食品加工领域。长期食用有促进肠胃蠕动，防止便秘等作用。它所含的食物热量很低，因此作为减肥功能性食品也非常流行。另外，大量研究表明细菌纤维素具有良好的体内、体外生物相容性和良好的生物可降解性，这使得细菌纤维素本身可以应用于生物医用领域。
目前，细菌纤维素的培养大多是以浅盘静态培养为主，得到的细菌纤维素膜再经过切割制成不同的形状，应用于不同的领域。而球形细菌纤维素的培养虽然早有报道，但由于存在培养周期较长、连续型动态培养费用较高、球形颗粒粒径不均匀等问题一直没有得到工业化应用。如Czaja等人采用连续机械搅拌动态培养法在Schramm-Hestrin培养液中得到颗粒粒径在10mm以内的球形细菌纤维素。(Structural investigations of microbial cellulose produced in stationary and agitated culture[J].Cellulose，2004，11：403-411.)
中国专利CN101586134A公布了一种以椰子水、蔬果汁等作为专用培养基，采用连续型震荡培养制备球形细菌纤维素的方法，制备得到的球形细菌纤维素的形状(球粒状、刺球状、星花状)可以根据发酵条件和时间进行调控，但此方法对培养基要求较为苛刻，其主要原料易受到季节等因素影响，不利于工业化生产。中国专利CN101705222A公布了一种以连续型动态培养制备细菌纤维素微球用于酶固定的方法，但应用此方法制备较大粒径的球形细菌纤维素难度较大。
发明内容
本发明的目的是提供一种球形细菌纤维素的制备方法，其以动态培养为主，采用多种培养方式相结合的模式，可实现对颗粒粒径进行调控，培养基简单易得，不受季节因素影响，不含任何有毒溶剂，制备过程简单易行、操作方便、无污染、成本低；可广泛应用于食品加工、药物缓释、生物标记等领域。
本发明所采用的技术方案：
一种球形细菌纤维素的制备方法，将活化好的菌种置于种子培养基中在28～35℃、80～250rpm，摇床震荡培养12～36h，得到种子溶液；将培养好的种子溶液接入发酵培养基中，采用动态培养3～10d，得到颗粒均匀的球形细菌纤维素。所述种子培养基是每升水中加入葡萄糖30～100g、碳酸钙0.1～1g、酵母膏0.1～1g。所述发酵培养基是每升水中加入葡萄糖30～100g、磷酸氢二钠1～4g、磷酸二氢钾1～4g、酵母膏1～5g、蛋白胨1～5g、明胶0～30g。
所述菌种是木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或二种以上。
所述发酵培养基占培养容器体积的50～70％。培养基占培养容器的体积必须在合理的范围内，过高时动态培养易使培养基外泄，造成浪费甚至污染培养体系；过低时动态培养不能使培养基产生内部湍流，影响球形颗粒的形成。
所述发酵培养的温度是28～35℃。发酵温度的控制可以影响培养基粘度和细菌纤维素的生产速率。一般在发酵培养前期采用较低的培养温度，有助于形成细菌纤维素微球。当细菌纤维素微球形成后可提高培养温度，有助于细菌纤维素快速生产，得到颗粒粒径较大的球形细菌纤维素。不同培养时间的控制可以得到不同颗粒粒径的球形细菌纤维素，时间较短时，制得的颗粒粒径较小。
所述动态培养的方式为摇床震荡、机械搅拌或循环水。
所述摇床震荡的频率为80～250rpm。
所述机械搅拌的频率为100～500rpm。
所述循环水的整体流速为0.01～0.1m/s。
所述的球形细菌纤维素颗粒粒径为0.01～3cm。
在发酵培养基中加入明胶可以有效的提高培养基体系的粘度，以保证制得的球形细菌纤维素颗粒的均匀性，影响球形细菌纤维素的颗粒粒径。另外，明胶中可以溶解少量的食用添加剂、缓释药物或生物标记物，使得加入物质能够均匀分布在制得的球形细菌纤维素中，以满足球形细菌纤维素在不同领域的应用。同时明胶的加入起到了表面活性剂的作用，当含有明胶的发酵培养基在受到外力搅拌时可以生成更多大小均匀的气泡，使种子溶液中的细菌均匀分布在气泡的周围，有利于球形细菌纤维素的生成。类似的表面活性剂也可为海藻酸钠、果胶酸钠、壳聚糖、甘油脂肪酸脂、蔗糖脂肪酸酯等。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)种子培养基、发酵培养基简单易得，不受季节因素影响，不含任何有毒溶剂，不会带来环境污染以及生态危机等问题，符合食品加工、生物医学领域的使用要求。
(2)以动态培养为主，可将多种培养模式进行结合，采用快慢结合、动静结合，有效降低了培养过程中的能耗，使球形细菌纤维素的工业化生产成为可能。
(3)过程简单易行、操作方便、无污染、成本低；通过简单改变制备条件可以实现调控颗粒粒径大小的目的。得到一种能够满足食品加工、药物缓释、生物标记等领域应用的球形细菌纤维素。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例一
(1)球形细菌纤维素由木醋杆菌制备，将活化好的菌种置于种子培养基中在28℃，80rpm，摇床震荡培养36h，得到种子溶液。种子培养基为每升水中加入葡萄糖100g、碳酸钙0.1g、酵母膏0.1g。
(2)将培养好的种子溶液接入发酵培养基中，采用动态培养3d，得到颗粒均匀的球形细菌纤维素。发酵培养基为每升水中加入葡萄糖30g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾1g、酵母膏1g、蛋白胨1g、明胶30g。发酵培养基占培养容器体积的50％，发酵培养温度28℃。发酵培养采用的动态方法为持续摇床震荡，摇床震荡频率为250rpm。
(3)经发酵培养得到的细菌纤维素经过分离提纯，除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，制得的球形细菌纤维素颗粒平均粒径为0.01cm。
实施例二
(1)球形细菌纤维素由根瘤菌属制备，将活化好的菌种置于种子培养基中在30℃，100rpm，摇床震荡培养12h，得到种子溶液。种子培养基为每升水中加入葡萄糖30g、碳酸钙1g、酵母膏1g。
(2)将培养好的种子溶液接入发酵培养基中，采用动态培养5d，得到颗粒均匀的球形细菌纤维素。发酵培养基为每升水中加入葡萄糖100g、磷酸氢二钠4g、磷酸二氢钾4g、酵母膏5g、蛋白胨5g、20g明胶。发酵培养基占培养容器体积的70％，发酵培养温度30℃。发酵培养采用的动态方法为间歇摇床震荡，摇床震荡频率为80rpm。
(3)经发酵培养得到的细菌纤维素经过分离提纯，除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，制得的球形细菌纤维素颗粒平均粒径为0.1cm。
实施例三
(1)球形细菌纤维素由八叠球菌属制备，将活化好的菌种置于种子培养基中在35℃，250rpm，摇床震荡培养24h，得到种子溶液。种子培养基为每升水中加入葡萄糖50g、碳酸钙0.5g、酵母膏0.2g。
(2)将培养好的种子溶液接入发酵培养基中，采用动态培养7d，得到颗粒均匀的球形细菌纤维素。发酵培养基为每升水中加入葡萄糖50g、磷酸氢二钠0.2g、磷酸二氢钾0.2g、酵母膏0.2g、蛋白胨0.2g、明胶1g。发酵培养基占培养容器体积的60％，发酵培养温度35℃。发酵培养采用的动态方法为持续机械搅拌，机械搅拌频率为100rpm。
(3)经发酵培养得到的细菌纤维素经过分离提纯，除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，制得的球形细菌纤维素颗粒平均粒径为0.5cm。
实施例四
(1)球形细菌纤维素由假单胞菌属制备，将活化好的菌种置于种子培养基中在32℃，150rpm，摇床震荡培养36h，得到种子溶液。种子培养基为每升水中加入葡萄糖70g、碳酸钙0.7g、酵母膏0.5g。
(2)将培养好的种子溶液接入发酵培养基中，采用动态培养7d，得到颗粒均匀的球形细菌纤维素。发酵培养基为每升水中加入葡萄糖70g、磷酸氢二钠3g、磷酸二氢钾3g、酵母膏3g、蛋白胨3g、1g明胶。发酵培养基占培养容器体积的50％，发酵培养温度32℃。发酵培养采用的动态方法为间歇机械搅拌，机械搅拌频率为500rpm。
(3)经发酵培养得到的细菌纤维素经过分离提纯，除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，制得的球形细菌纤维素颗粒平均粒径为0.05cm。
实施例五
(1)球形细菌纤维素由无色杆菌属制备，将活化好的菌种置于种子培养基中在33℃，200rpm，摇床震荡培养12h，得到种子溶液。种子培养基为每升水中加入葡萄糖90g、碳酸钙0.2g、酵母膏0.7g。
(2)将培养好的种子溶液接入发酵培养基中，采用动态培养9d，得到颗粒均匀的球形细菌纤维素。发酵培养基为每升水中加入葡萄糖80g、磷酸氢二钠3g、磷酸二氢钾2g、酵母膏2g、蛋白胨5g、明胶0.5g。发酵培养基占培养容器体积的70％，发酵培养温度34℃。发酵培养采用的动态方法为持续循环水，循环水法整体流速为0.01m/s。
(3)经发酵培养得到的细菌纤维素经过分离提纯，除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，制得的球形细菌纤维素颗粒平均粒径为1cm。
实施例六
(1)球形细菌纤维素由产碱菌属制备，将活化好的菌种置于种子培养基中在34℃，220rpm，摇床震荡培养24h，得到种子溶液。种子培养基为每升水中加入葡萄糖100g、碳酸钙0.3g、酵母膏0.3g。
(2)将培养好的种子溶液接入发酵培养基中，采用动态培养10d，得到颗粒均匀的球形细菌纤维素。发酵培养基为每升水中加入葡萄糖100g、磷酸氢二钠4g、磷酸二氢钾1g、酵母膏5g、蛋白胨5g、明胶25g。发酵培养基占培养容器体积的50％，发酵培养温度33℃。发酵培养采用的动态方法为间歇循环水，循环水法整体流速为0.1m/s。
(3)经发酵培养得到的细菌纤维素经过分离提纯，除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，制得的球形细菌纤维素颗粒平均粒径为3cm。
实施例七
(1)球形细菌纤维素由气杆菌属制备，将活化好的菌种置于种子培养基中在29℃，90rpm，摇床震荡培养36h，得到种子溶液。种子培养基为每升水中加入7g葡萄糖，0.9g碳酸钙，0.9g酵母膏。
(2)将培养好的种子溶液接入发酵培养基中，采用动态培养10d，得到颗粒均匀的球形细菌纤维素。发酵培养基为每升水中加入葡萄糖90g、磷酸氢二钠2g、磷酸二氢钾1g、酵母膏5g、蛋白胨5g、明胶15g。发酵培养基占培养容器体积的60％，发酵培养温度29℃。发酵培养采用的动态方法为持续摇床震荡，摇床震荡频率为200rpm。
(3)经发酵培养得到的细菌纤维素经过分离提纯，除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，制得的球形细菌纤维素颗粒平均粒径为2.5cm。
实施例八
(1)球形细菌纤维素由固氮菌属制备，将活化好的菌种置于种子培养基中在31℃，250rpm，摇床震荡培养12h，得到种子溶液。种子培养基为每升水中加入葡萄糖50g、碳酸钙8g、酵母膏8g。
(2)将培养好的种子溶液接入发酵培养基中，采用动态培养3d，得到颗粒均匀的球形细菌纤维素。发酵培养基为每升水中加入葡萄糖60g、磷酸氢二钠2g、磷酸二氢钾4g、酵母膏3g、蛋白胨5g。发酵培养基占培养容器体积的70％，发酵培养温度31℃。发酵培养采用的动态方法为间歇循环水，循环水法整体流速为0.05m/s。
(3)经发酵培养得到的细菌纤维素经过分离提纯，除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，制得的球形细菌纤维素颗粒平均粒径为0.02cm。
Claims (9)
1.一种球形细菌纤维素的制备方法，其特征是将活化好的菌种置于种子培养基中在28～35℃、80～250rpm，摇床震荡培养12～36h，得到种子溶液；将培养好的种子溶液接入发酵培养基中，采用动态培养3～10d，得到颗粒均匀的球形细菌纤维素；所述种子培养基是每升水中加入葡萄糖30～100g、碳酸钙0.1～1g、酵母膏0.1～1g；所述发酵培养基是每升水中加入匍萄糖30～100g、磷酸氢二钠1～4g、磷酸二氢钾1～4g、酵母膏1～5g、蛋白胨1～5g、明胶0～30g。
2.根据权利要求1所述的球形细菌纤维素的制备方法，其特征在于：所述菌种是木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或二种以上。
3.根据权利要求1所述的球形细菌纤维素的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基占培养容器体积的50～70％。
4.根据权利要求1所述的球形细菌纤维素的制备方法，其特征在于：所述发酵培养的温度是28～35℃。
5.根据权利要求1所述的球形细菌纤维素的制备方法，其特征在于：所述动态培养的方式为摇床震荡、机械搅拌或循环水。
6.根据权利要求5所述的球形细菌纤维素的制备方法，其特征在于：所述摇床震荡的频率为80～250rpm。
7.根据权利要求5所述的球形细菌纤维素的制备方法，其特征在于：所述机械搅拌的频率为100～500rpm。
8.根据权利要求5所述的球形细菌纤维素的制备方法，其特征在于：所述循环水的整体流速为0.01～0.1m/s。
9.根据权利要求1所述的球形细菌纤维素的制备方法，其特征在于：所述的球形细菌纤维素颗粒粒径为0.01～3cm。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20110223 Assignee: Hainan Yeguo Foods Co., Ltd. Assignor: Zhong Chunyan Contract record no.: 2017460000007 Denomination of invention: Method for preparing spherical bacterial cellulose Granted publication date: 20130320 License type: Common License Record date: 20170519 |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |