CN101586134B

CN101586134B - 球形颗粒细菌纤维素及其制备方法与专用培养基

Info

Publication number: CN101586134B
Application number: CN2009100878975A
Authority: CN
Inventors: 刘四新; 李从发
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2029-06-25
Also published as: CN101586134A

Abstract

本发明公开了一种球形颗粒细菌纤维素及其制备方法与专用培养基。本发明提供的培养基，包括碳源、氮源、无机盐，生长因子，还包括体积百分比为0％-80％的椰子水和浓度为1-30g/L的碳源。本发明提供的球形细菌纤维素的制备方法，是将细菌纤维素的生产菌置于上述的培养基中进行振荡发酵、或者发酵罐通气培养。本发明的球形细菌纤维素可直接应用在食品加工中而不需切割操作。振荡发酵所需营养少，又适于进行发酵罐通气培养，污染机率小，产物收获率高，而且纤维素产物不是传统的膜片状、而是全新的球粒状、刺球状、或者星花状，收获、漂洗容易，特别是不需额外的切割操作，球粒大小可根据发酵条件和时间调控。

Description

球形颗粒细菌纤维素及其制备方法与专用培养基

技术领域

本发明涉及食品工业领域，特别涉及球形颗粒细菌纤维素及其制备方法与专用培养基。

背景技术

细菌纤维素因其极高的纯度和独特的性质而具有广泛的商业应用价值。尤其是它具有高持水性，高结晶度，高弹性模量，较高的胶体强度，较低的固形物含量，因而在食品工业中常被用作填充剂、分散剂、稳定剂、增稠剂、赋形剂和质地改良剂等(Kongruang S.Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum strainsfrom agricultural waste products[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2008，148(1-3)：245-56.)。由于它主要成分是纤维素，又被认定为安全可靠的GRAS级(Kent RA，Stephens RS，Westland JA.Bacterial cellulose fiber provides an alternative for thickening and coating[J].Food Technology，1991，45(6)：108-110.)的食品基料，添加到食品中特别符合饮食消费的潮流，又具有防便秘、清肠胃、降低胆固醇、排毒养颜等保健功效，而且口感还特别爽滑、脆嫩、细腻而富有弹性，因而在日本、韩国、美国、中国和东南亚国家被广泛用作食品的配料而畅销不衰(Jagannath A，Kalaiselvan A，Manjunatha SS，et al.The effect of pH，sucrose andammonium sulphate concentrations on the production of bacterial cellulose (Nata-de-coco)by Acetobacter xylinum[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24(11)：2593-2599)。目前国际国内食品工业对细菌纤维素的需求量很大，而且呈不断上升趋势。

在食品工业领域应用的细菌纤维素，大多是以浅盘在静置培养条件下发酵生产的，产物呈几毫米至几厘米厚的凝胶状膜片，根据拟应用的食品的不同而切成各种不同规格的小立方块。在国内这种产品称椰纤果(在我国农业行业标准中此名作为法定标准名称(赵松林等.NY/T 1522-2007椰子产品椰纤果[S].北京：中国农业科技出版社，2008)、椰果、高纤椰果、纳塔，在国际市场上称nata、nata de coco。虽然这种静置培养方式生产的纤维素产量较高，但培养基需要的营养成分也较全面、较丰富，浅盘发酵又特别容易污染杂菌，生产效率较低。在国内，细菌纤维素的发酵生产(产物在行业内又称椰纤果片)已远远满足不了食品工业的需要，每年必须从国外大量进口压缩的粗制椰纤果片，在国内再进行切割加工而后销售给各类食品加工企业。之所以如此，除了海南椰子水资源紧缺外，浅盘发酵的工艺简单、粗放，培养基的分装、接种、发酵都是作坊式操作，杂菌污染率高(刘四新，李从发，丁振刚等.纳塔生产中污染真菌的分离与控制[J].热带作物学报，2004，25(3)：89-93)、收获率偏低，致使生产成本偏高，这是目前制约行业发展的瓶颈；此外，生产占地面积大，劳动强度大，机械化程度低，生产效率低，也是重要原因。因此开发一种对椰子水资源依赖性低、机械化、自动化程度高，生产性能稳定，安全卫生，又能大规模推广应用的生产技术迫在眉睫。

目前未见专门生产球形颗粒凝胶纤维素的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供球形颗粒细菌纤维素及其制备方法与专用培养基。

本发明提供的制备球形颗粒细菌纤维素的培养基，包括碳源、氮源、无机盐，生长因子，还包括体积百分比为0％-80％的椰子水。

椰子水在上述培养基中的体积百分比优选为20％-60％，更优选的体积百分比为为20％-40％。椰子水在培养基中浓度超过60％，则细菌纤维素有少量不规则团块出现，超过80％，则呈球形的细菌纤维素较少；浓度低于10％，则细菌纤维素产量不高。

上述培养基中的碳源可以是1-50g/L的蔗糖，优选是浓度为10-30g/L的蔗糖。

上述培养基中的氮源可为2-4g/L的(NH₄)₂SO₄；无机盐可包括浓度为2-4g/L的KH₂PO₄，浓度为0.1-0.3g/L的MgSO₄·7H₂O；所述培养基中的生长因子是浓度为0.3-1.2g/L的酵母粉，优选是浓度为0.3-0.8g/L的酵母粉。

所述1L的培养基可由以下组分组成：10-20g的蔗糖，200ml-400ml的椰子水，2-4g的(NH₄)₂SO₄，2-4g的KH₂PO₄，0.1-0.3g的MgSO₄·7H₂O和0.3-1.2g的酵母粉，其余为水，培养基的pH范围为3.5-6.5。

所述1L的培养基可具体优选为由以下组分组成：15g的蔗糖，400ml的椰子水，3g的(NH₄)₂SO₄，3g的KH₂PO₄，0.2g的MgSO₄·7H₂O和0.5g的酵母粉，其余为水，培养基的pH范围优选为4.0-5.5。

为了生产上尽量缓解椰子水使用的紧张局势，可以用果蔬汁部分替代椰子水，因此，所述培养基还包括50-200g/L的果蔬汁，优选果蔬汁是浓度为50-150g/L，所述果蔬汁可为橘子汁、橙汁、苹果汁、菠萝汁、木瓜汁和土豆汁中的至少一种，更优选是100g/L的菠萝汁。其中，果蔬汁的浓度是果实可食部分的质量与培养基最终体积的比例或者是去皮土豆的质量与培养基最终体积的比例。

所述1L的培养基可由以下组分组成：10-20g的蔗糖，200ml-400ml的椰子水，100-300ml的菠萝汁，该100-300ml的菠萝汁中含50-150g菠萝的可食部分，2-4g的(NH₄)₂SO₄，2-4g的KH₂PO₄，0.1-0.3g的MgSO₄·7H₂O和0.3-1.2g的酵母粉，其余为水。培养基的pH范围为3.5-6.5。

所述1L的培养基具体可优选为由以下组分组成：15g的蔗糖，200ml的椰子水，200ml的菠萝汁，该200ml的菠萝汁含100g菠萝的可食部分，3g的(NH₄)₂SO₄，3g的KH₂PO₄，0.2g的MgSO₄·7H₂O和0.5g的酵母粉，其余为水。培养基的pH范围优选为4.0-5.5。

本发明提供的球形颗粒细菌纤维素的制备方法，是将细菌纤维素的生产菌接种于上述培养基中进行振荡发酵。

按照常规方法，也可将细菌纤维素的生产菌接种于含有上述培养基的发酵罐中，进行通气培养。

所述细菌纤维素的生产菌可选自醋酸杆菌属(Acetobacter)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)中的至少一个菌株，优选是葡糖酸醋杆菌属的木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)的菌株，或者是醋杆菌属的木醋杆菌(Acetobacterxylinum)的菌株。

所述发酵用的培养基的深度应不小于1.9cm，优选是3.4cm-4.0cm；所述发酵用的培养基在500ml的三角瓶中的装液量是150-300ml，优选是200-250ml；500ml三角瓶中培养基的装液量小于150ml时，虽然通气状况很好，产率也高，但不利于球形纤维素的形成；大于150ml时，粒形较好。若使用更大容量的三角瓶，如1000ml的，装液量可以多于400ml，若使用气升式发酵罐，只要通气量相应增大，液层深度可加大，装液量也可增多。

所述旋转振荡的振荡幅度为30mm，转速为90-210r/min，优选是120-180r/min，更优选是150r/min。转速过低和过高均会导致细菌纤维素呈团块状而得不到均匀的球形颗粒。

按照上述方法制备的均匀小块状、绒球状、刺球状、星状、或放射状的颗粒形特征的细菌纤维素也属于本发明的保护范围之内。

本发明的另一目的在于提供球形颗粒细菌纤维素在食品工业中的应用。

摇瓶发酵生产球形细菌纤维素的最佳发酵条件：15g/L蔗糖，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，酵母粉0.5g/L，40％椰子水，500ml三角瓶装200ml发酵液(液高3.4cm)，初始pH4.5，150r/min，30℃培养10d。

当然，也可用菠萝汁部分代替椰子水，最佳发酵条件为：15g/L蔗糖，(NH₄)₂SO₄3g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，酵母粉0.5g/L，20％椰子水，100g/L菠萝汁(菠萝汁的浓度是菠萝可食部分的质量与培养基最终体积的比例)，500ml三角瓶装200ml发酵液(液高3.4cm)，初始pH4.5，150r/min，30℃培养10d。在此条件下，可获得粒形均匀

产量较高(3.15g/L)的球形细菌纤维素。

通过全程振荡发酵生产这种球粒形特征的纤维素，机械化、自动化程度更高，比静置法更简化工艺、节省工时、又安全卫生。球粒形纤维素是一种持水性更高的凝胶，将其添加到食品和饮料中，比静置法生产的膜片状纤维素经切割加工后形成的小立方体块更爽滑、圆润、外形更新颖独特、填充性更好，并且可以直接添加，是一种完全新型的食品加工配料，可以满足消费者多元化的需求。

振荡发酵所需营养少，又可以进行发酵罐通气培养，污染机率小，产物收获率高，而且纤维素产物不是传统的膜片状、而是全新的球粒状、刺球状、或者星花状(图2)，收获、漂洗容易，特别是不需额外的切割操作，颗粒大小可根据发酵条件和时间调控。因此，振荡发酵生产用作食品工业配料的球形纤维素的实际效益比静置发酵的高。

附图说明

图1为发酵培养基中，椰子水含量为20％(体积百分比)，蔗糖浓度为15g/L、培养时间为7d时的球形纤维素图片。

图2为发酵培养基中，蔗糖浓度为15g/L时，而椰子水含量在10％(体积百分比)、培养时间为5d时的星形纤维素图片。

图3为发酵培养基中，蔗糖浓度为15g/L时，而椰子水含量为40％(体积百分比)、培养时间为10d时的球形纤维素图片。

图4为发酵培养基中，蔗糖浓度为15g/L时，椰子水含量为20％(体积百分比)，果蔬汁为50g/L土豆的土豆汁时的球形纤维素图片。

图5为500ml三角瓶中装50ml发酵培养基，摇床转速为120r/min时的纤维素凝胶图片。

图6为500ml三角瓶中装200ml发酵培养基，摇床转速为210r/min时的纤维素凝胶图片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

所用菌株、试剂、斜面培养基和液体种子培养基分别如下：

菌株：木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)，购自中科院微生物所，菌株号CGMCC1.1812；

木糖葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株号accc10215。

椰子水：市售八成熟椰子，去椰衣、破壳取椰子水备用。

各种果蔬汁：橘子、橙子、苹果、菠萝、木瓜和土豆均为市售。水果分别取可食部分加与可食部分相同质量的水打浆，过滤、榨汁备用；土豆去皮、切块后加三倍于去皮土豆质量的水煮汁，八层纱布过滤，备用。

蔗糖：市售一级白砂糖。

斜面培养基：蔗糖20g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，酵母粉1g/L，椰子水0.8L/L，琼脂20-22g/L，以冰醋酸调节pH5.0，121℃灭菌15min。灭菌方式下同。

液体种子培养基：酵母粉0.5g/L，pH4.5，不加琼脂，其余同斜面培养基。

发酵基础培养基：先不加蔗糖、椰子水和琼脂，酵母粉0.5g/L，pH4.5，其余成分同斜面培养基。具体发酵培养基是在发酵基础培养基的基础上进行筛选得到的培养基。

实施例1、球形颗粒细菌纤维素的制备

一、发酵培养基的最佳组分及含量的确定

将斜面培养基上的保藏菌株CGMCC1.1812在新鲜的斜面培养基上活化1-2代。由于该菌细胞在斜面培养时易被纤维素产物包裹而使菌苔粘连成片，故转接斜面时宜断续地划线接种，不要连续划线，以防菌苔粘连不易转接。然后接入一小片菌苔于20ml液体种子培养基(100ml三角瓶，以透气封口膜封口)中，30℃、120r/min下振荡培养20-24h，制成种子培养液。

然后将种子液按4％-5％(避免接入纤维丝)接入液体发酵培养基中进行各种条件试验，在500ml三角瓶中装150ml(以透气封口膜封口)，30℃、120r/min振荡培养7-10d，收获纤维素凝胶、测定其干重。每处理设三次重复，取平均值。

细菌纤维素产量的测定(薛璐，杨谦.醋杆菌产纤维素发酵培养基的优化[J].食品科学，2004，25(11)：213-215.)：收获细菌纤维素凝胶后，用流水反复漂洗、沥于，将其置于0.1mol/L NaOH溶液中，100℃处理20min以除去菌体，再以去离子水和0.5％醋酸溶液连续洗涤至pH中性。最后在80-85℃下干燥至恒重后称重。纤维素产量记为(干重)g/L培养基。

1、不同蔗糖添加量的影响

发酵培养基：在前述发酵基础培养基中添加终浓度是20％(体积百分比)的椰子水，还添加不同终浓度(5、10、15、20、25、30g/L)的蔗糖，121℃灭菌15min。将种子培养液接种至发酵培养基后振荡培养7d，以考察蔗糖浓度对球形纤维素产量和粒形的影响。

结果见表1，随着蔗糖浓度的增加，纤维素产量亦增加，浓度超过20g/L时，单位质量蔗糖的纤维素产率下降。就纤维素球形特征而言，蔗糖低于15g/L时，纤维素呈星形颗粒或丝状；浓度越高，纤维素合成速率越快，就越容易出现不规则团块，而形成较大团块后氧气的传递速率受限制，结果纤维素产率反而呈下降趋势。可见，碳源营养越丰富，纤维素合成速度越快，在摇瓶时也越易形成不规则的团块。因此蔗糖可选浓度为1-30g/L，为了获得产率高、外形规则、均匀的球形纤维素，可以选择添加终浓度为10-30g/L的蔗糖较合适。更优选终浓度为15g/L(图1)，此时球形凝胶占总凝胶的90％(质量百分比)。

表1不同蔗糖浓度对球形细菌纤维素生产的影响

2、不同椰子水添加量的影响

发酵培养基：在发酵基础培养基中添加终浓度为15g/L的蔗糖，还添加终浓度为为0、20％、40％、60％、80％和100％(体积百分比)的椰子水，121℃灭菌15min。接种后振荡培养10d，以考察椰子水添加比例对球形纤维素产量和粒径的影响。

椰子水由于富含氨基酸、维生素、矿物质以及生长激素，最先在原产地菲律宾都是应用椰子水以静置法生产nata de coco，由于产率高，世界各地生产椰子的地区也大多习惯使用椰子水作发酵基质。比如在泰国，由于椰子水充足，一般使用90％-100％椰子水，静置发酵7d，纤维素膜厚度达4cm以上，相当于我国静置发酵14-20d的产量水平。在海南，椰子加工产业是食品工业的支柱之一，由于椰子加工企业多，椰子资源紧缺，每年需从越南等国进口上亿个椰子果，因此椰子水相对不足，淡季时椰子水添加量仅为10％-20％，由于营养的相对不足，不能使菌种迅速发挥菌株优势而抑制杂菌，这可能是目前椰纤果静置发酵生产中污染频繁、生产效率偏低的原因之一。

在本发明中，椰子水添加量反而不能太高(表2)。从纤维素球形特征而言，椰子水添加量达60％(体积百分比)时产物中就有不规则团块出现，当椰子水浓度达80％(体积百分比)时，产物中的球形凝胶仅为少量，而在40％(体积百分比)时凝胶大多为球形、刺球形，在20％以下时为星形(图2)或丝状，椰子水浓度低于10％(体积百分比)时，则产量比较低。这也说明在营养丰富时振荡培养，纤维素产物不易形成规则颗粒状，而是呈不规则的团块状，可见，要生产球粒形纤维素，培养基营养成分不宜太丰富，综合考虑产量和粒形，椰子水用量以40％(体积百分比)为宜(图3)，此时球形或椭球形凝胶占总凝胶的90％(质量百分比)以上。

表2不同椰子水添加量对球形细菌纤维素生产的影响

3、添加果蔬汁的影响

为了在生产上尽量缓解椰子水使用的紧张局势，有必要寻找能够部分取代椰子水的其他果蔬原料。

在发酵基础培养基中添加终浓度为15g/L的蔗糖、终浓度为20％(体积百分比)的椰子水，再分别添加终浓度为50-200g/L的果蔬汁，如橘子汁、橙汁、苹果汁、菠萝汁、木瓜汁或土豆汁。该果蔬汁的体积占培养基的最终体积的10％-30％。以冰醋酸调节pH至4.5，振荡培养10d，考察果蔬汁对球形纤维素产量和粒形的影响。

其中，果蔬汁的浓度是果实可食部分的质量与培养基最终体积的比例或者是去皮土豆的质量与培养基最终体积的比例。

结果如表3所示，添加各种浓度的果蔬汁对球形纤维素产量的提高并不显著，但对均匀粒形的形成有促进作用，如添加50g/L土豆汁，虽然产量低于对照组，但粒形特别好，粒径分布十分均匀(图4)，综合考虑产量和粒形，选择终浓度为100g/L菠萝汁与20％(体积百分比)椰子水的组合较合适，此时产物全部为球形纤维素颗粒。

表3.各种果蔬汁对球形细菌纤维素生产的影响

通过以上实验可知，最佳发酵培养基A：蔗糖15g/L，椰子水40％(体积百分比)，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，酵母粉0.5g/L，pH为4.5。或者最佳发酵培养基B：蔗糖15g/L，椰子水20％(体积百分比)，100g/L菠萝汁(菠萝汁的浓度是菠萝可食部分的质量与培养基最终体积的比例)，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，酵母粉0.5g/L，pH为4.5。

二、球形细菌纤维素制备方法的确定

培养基的装瓶量和振荡速度决定着液体的通气状况，而通气状况对菌株的纤维素合成量和纤维素的球形特征有重要影响。在实验室水平上设计了相同容器、相同转速、不同装液量和相同容器、相同装液量、不同转速的试验，以考察通气状况的影响效果。

1.不同装液量的影响

将上述步骤一中已确定好的最佳发酵培养基B往500ml三角瓶中分别装50、100、150、200、250、300和350ml，此时培养基的深度分别为1.3、1.8、2.6、3.4、4.0、4.7和5.5cm，然后接入种子液，120r/min，振荡培养10d，以考察装液量和液层深度(即通气状况)对球形纤维素产量和粒形的影响。

结果表明，在转速一定时，装液量150ml以上时，粒形较好，其中装液量200ml(液高3.4cm)和250ml(液高4.0cm)和300mL(液高4.7cm)时，都可得到粒径均匀、球形完整、球粒比例高的纤维素凝胶。但由于是确定转速，装液量太多(如250mL以上)，单位体积培养基的纤维素产物得率却不高；反之，装液量太少，虽然通气好，产率也高，但却不利于球形纤维素的形成，而只能形成团块状(图5)，本发明中在120r/min的转速下，发酵用的培养基在500ml的三角瓶中的装液量是100-300ml，优选是200-250ml。也即所述发酵用的培养基的深度应是不小于1.9cm；优选是2.6cm-4.7cm；更优选是3.4cm-4.0cm，此时球形凝胶颗粒占产物的95％(质量百分比)。

因此，如果加大液层深度，如采用发酵罐培养，只要提高通气量，也可以获得产量高、颗粒外形好的纤维素凝胶。

表4不同装液量对球形细菌纤维素生产的影响

2.不同转速的影响

将步骤一确定的最佳发酵培养基B 200ml装进500ml三角瓶中(此时液层深度3.2cm)，然后接入种子液，分别以90、120、150、180、210r/min的转速振荡，振荡幅度为30mm，培养10d，以考察摇床转速对球形纤维素产量和粒形的影响。

结果表明(表5)，在装液量一定时，随着转速增高，纤维素产量也增大，但转速达到210r/min时产量反而有所下降。可能是因为转速过快，菌株的纤维素合成能力受到剪切力影响之故。转速过快也不利于形成球形均匀的纤维素凝胶(图6)。转速低时一方面产量低，而且产物多为团块状，原因可能是低转速下非牛顿流体运动引起发酵液黏度增大，使得纤维素凝胶容易纠结成团。所以，在一定液层深度(3.2cm)下振荡发酵时培养基的转速90-210r/min；优选是120-180r/min；更优选是150r/min，此时球形凝胶颗粒占产物的95％(质量百分比)。

表5不同转速对球形细菌纤维素生产的影响

通过实验证明，利用最佳发酵培养基A制备球形细菌纤维素的方法(装液量和转速)与利用最佳发酵培养基B制备球形细菌纤维素的方法一致。

实施例2、球形颗粒细菌纤维素的制备

本实施例与实施例1的区别在于所用菌株换成菌株accc10215，其余试验条件完全相同。

实验证明：最佳发酵培养基是蔗糖15g/L，椰子水40％(体积百分比)，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，酵母粉0.5g/L，pH为4.5。

或者最佳发酵培养基：蔗糖15g/L，椰子水20％(体积百分比)，100g/L菠萝汁(菠萝汁的浓度是菠萝可食部分的质量与培养基最终体积的比例)，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，酵母粉0.5g/L，pH为4.5。

将菌株accc10215接种至本实施例的两种最佳发酵培养基分别进行振荡发酵，结果发现：在120r/min的转速下，发酵用的培养基在500ml的三角瓶中的装液量是100-350ml，优选是200-250ml。此时球形凝胶颗粒占产物的90％(质量百分比)。

当500ml的三角瓶中的装液量为200ml时，振荡发酵时培养基的转速为是120-180r/min。优选是150r/min，此时球形凝胶颗粒占产物的95％(质量百分比)。

Claims

1.球形颗粒细菌纤维素的制备方法，是将木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)CGMCC1.1812接种于培养基中进行振荡发酵；所述发酵培养时培养基的振荡旋转的振荡幅度为30mm，转速为150r/min；所述培养基每升由以下组分组成：15g的蔗糖，200ml的椰子水，200ml菠萝汁，3g的(NH₄)₂SO₄，3g的KH₂PO₄，0.2g的MgSO₄·7H₂O和0.5g的酵母粉，其余为水；所述200ml菠萝汁含100g菠萝的可食部分；所述培养基的pH为4.5。