CN115038779A - 用于在发酵培养基中培养丝状真菌的方法 - Google Patents

Abstract

提供了培养丝状真菌的方法，其中丝状真菌在空气和发酵培养基的胶体中生长。与先前的方法所能实现的相比，该方法导致丝状真菌的生长更快且更多产。还提供了通过该方法产生的生物垫和用于该方法的空气培养基胶体。

Description

用于在发酵培养基中培养丝状真菌的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年12月10日提交的美国临时专利申请62/946,404的权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明总体上涉及用于培养丝状真菌的方法，尤其涉及在生长培养基和空气或另一种由用户定义的气氛的胶体之中或之上培养丝状真菌的方法，另一种由用户定义的气氛为例如具有受控含量的氧气或其他成分以促进真菌生长的气氛。

发明背景

过去已经利用丝状真菌作为有价值的微生物工厂，但通常需要大量的基础设施和/或设备、能源需求、昂贵的试剂和/或大量人力资源。众所周知，丝状真菌具有地球上所有微生物中最大的代谢多样性，包括产生广泛的有机酸、酶、激素、脂质、真菌毒素、维生素、色素、重组异源蛋白、和其他感兴趣的小分子(例如药用化合物如抗生素、抗真菌剂和抗癌药)的能力，以及降解土壤中许多类型的顽固性材料(如木质纤维素和腐殖质)的能力。

虽然广泛使用，但通过深层发酵的生产仍然存在重大挑战，包括重要因素如由于氧气供应受限和搅拌产生的过度剪切力导致的生长受限。因为氧气在水中的溶解度通常约为每升8毫克，所以在水下培养物的快速生长过程中氧气很容易耗尽。因此，需要使用复杂、昂贵且耗能的曝气和搅拌系统进行连续曝气，以维持高生长速度。丝状真菌的培养更具挑战性，因为丝状形态赋予了进一步抑制溶液中的氧转移的非牛顿流变行为。随着培养物密度的增加，对培养物曝气和混合所需的能量呈非线性增加，因此对密集培养物曝气所需的能量非常高。对于许多丝状物种，培养物的剧烈搅拌和曝气对菌丝生长有害，因此会显著降低生长速率。丝状微生物深层发酵面临的这些和其他挑战需要创新的解决方案，以有效利用这些生物在资源受限的环境中(例如在航天器或空间站上或在挑战性的陆地环境中)应用的益处。

最近，在培养丝状真菌的系统和方法的开发方面取得了一些重大进展，这些系统和方法不需要对液体培养物进行主动曝气或搅拌，特别是在产生具有显著抗张强度的生物垫时。然而，即使在这些较新的方法和系统中，真菌的氧气利用仍然是一个挑战。此外，不希望受任何特定理论的限制，据信真菌/原料界面的表面积也可能是这些应用中丝状真菌生长的限制因素。

因此，本领域需要用于在发酵培养基中培养丝状真菌的系统和方法，以克服深层发酵的这些和其他缺点。与先前的系统和方法相比，此类系统和方法进一步有利的是为真菌提供更大的氧气可用性和/或与原料接触的表面积。

发明概述

本发明的一个方面是提供在发酵培养基中培养丝状真菌的方法，包括(a)对发酵培养基曝气以提供空气-培养基胶体(AMC)；(b)在AMC之中或之上培养丝状真菌以形成丝状真菌的生物质。

在实施方案中，AMC可以用作将丝状真菌与周围环境隔离的独立生物反应器系统，从而提供不需要环境控制的真菌生长系统。

在实施方案中，AMC可以包含胶凝剂、粘度调节剂和/或保湿剂或其他降低水活性的组分。

在实施方案中，AMC可以包含丝状真菌的接种物。

在实施方案中，该方法可以进一步包括用丝状真菌的接种物接种AMC。

在实施方案中，AMC可以包含稳定剂。稳定剂可以但不必须包括黄原胶。AMC中发酵培养基与稳定剂的质量比可以但不必须在约100:1和约1,000:1之间。稳定剂可以但不必须选自多糖胶(例如黄原胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、魔芋根胶)、阴离子表面活性剂(例如羧酸盐、磷酸酯、硫酸酯、磺酸酯)、阳离子表面活性剂(例如伯胺、仲胺、或叔胺、季铵盐)、鲸蜡硬脂醇聚醚20、纤维素、二乙酰酒石酸甘油单酯和甘油二酯(DATEM)、甘油二酯、乳化蜡、甘油单硬脂酸酯、卵磷脂、甘油单酯、芥末、非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、肥皂、磷酸钠、硬脂酰乳酸钠、两性离子表面活性剂、皂苷、淀粉、变性淀粉、植物蛋白表面活性剂(例如大豆分离蛋白、豌豆分离蛋白)、动物蛋白表面活性剂(例如酪蛋白、乳清蛋白分离物)、微粒、二氧化硅及其组合和混合物。

在实施方案中，AMC中空气的体积分数可以在约0.05和约0.95之间、在约0.1和约0.9之间、在约0.2和约0.8之间、在约0.3和约0.7之间、在约0.4和约0.6之间或约0.5。

在实施方案中，AMC可以是在至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天或至少约30天稳定的泡沫。

在实施方案中，丝状真菌可以属于选自下组的目：黑粉菌目(Ustilaginales)、红菇目(Russulales)、多孔菌目(Polyporales)、伞菌目(Agaricales)、盘菌目(Pezizales)和肉座菌目(Hypocreales)。

在实施方案中，丝状真菌可以属于选自下组的科：黑粉菌科(Ustilaginaceae)、猴头菌科(Hericiaceae)、多孔菌科(Polyporaceae)、灰树花孔菌科(Grifolaceae)、离褶伞科(Lyophyllaceae)、球盖菇科(Strophariaceae)、马勃科(Lycoperdaceae)、伞菌科(Agaricaceae)、侧耳科(Pleurotaceae)、膨瑚菌科(Physalacriaceae)、小皮伞科(Omphalotaceae)、块菌科(Tuberaceae)、羊肚菌科(Morchellaceae)、绣球菌科(Sparassidaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)和虫草菌科(Cordycipitaceae)。

在实施方案中，丝状真菌可以属于选自下组的物种：茭白黑粉菌(Ustilagoesculenta)、猴头菌(Hericulum erinaceus)、宽鳞多孔菌(Polyporous squamosus)、灰树花(Grifola fondosa)、斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)、榆干玉蕈(Hypsizygusulmarius)、香杏丽蘑(Calocybe gambosa)、光帽鳞伞(Pholiota nameko)、大秃马勃(Calvatia gigantea)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、皱环球盖菇(Strophariarugosoannulata)、砖红垂幕菇(Hypholoma lateritium)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、侧耳(Pleurotus ostreatus)、白松露(Tuber borchii)、羊肚菌(Morchella esculenta)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)、梯棱羊肚菌(Morchella importuna)、绣球菌(Sparassiscrispa)、丝状镰刀菌(Fusarium venenatum)、MK7ATCC登记保藏号PTA-10698、肋状皱盘菌(Disciotis venosa)和蛹虫草(Cordyceps militaris)。

在实施方案中，该方法可以进一步包括，在步骤(b)之前或期间，将食品级或食品安全添加剂添加到AMC中。

本发明的另一个方面是提供丝状真菌生物垫，其通过本文所述的方法产生。

在实施方案中，生物垫可以具有以下特性中的至少一种：(a)至少约1.75mm的厚度；(b)每平方米AMC顶表面积至少约295克的质量；(c)至少约0.20g/cm³的干密度；(d)至少约255kPa的抗张强度；(e)干燥时至少约47wt％的碳水化合物含量。

本发明的另一个方面是提供丝状真菌生物垫，其具有以下特性中的至少一种：(a)至少约1.75mm的厚度；(b)每平方米AMC顶表面积至少约295克的质量；(c)至少约0.20g/cm³的干密度；(d)至少约255kPa的抗张强度；(e)干燥时至少约47wt％的碳水化合物含量。

在实施方案中，如本文所述的生物垫可以包含稳定剂。

在实施方案中，如本文所述的生物因素可以包含食品级或食品安全添加剂。

本发明的另一个方面是提供一种食品，其包含如本文所述的生物垫的至少一部分。

本发明的另一个方面是提供一种结构材料，其包含如本文所述的生物垫的至少一部分。

本发明的另一个方面是提供一种纺织材料，其包含如本文所述的生物垫的至少一部分。

本发明的另一个方面是提供一种空气培养基胶体(AMC)，其包含发酵培养基；和空气，其胶状地分散在整个发酵培养基中。

在实施方案中，AMC可以进一步包含稳定剂。

出于进一步公开和符合适用的书面描述和实施要求的目的，以下参考文献通过整体引用并入本文：

Elka S.Basheva等人,“Unique properties of bubbles and foam filmsstabilized by HFBII hydrophobin,”27(6)Langmuir 2382(Feb.2011)。

Graeme P.Boswell和Fordyce A.Davidson,“Modelling hyphal networks,”26(1)Fungal Biology Reviews 30(Apr.2012)。

Andrew R.Cox等人,“Exceptional stability of food foams using class IIhydrophobin HFBII,”23(2)Food Hydrocolloids 366(Mar.2009)。

Monika S.Fischer和N.Louise Glass,“Communicate and fuse:howfilamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network,”10Frontiers in Microbiology 619(Mar.2019)。

Luke Heaton等人,“Analysis of fungal networks,”26(1)Fungal BiologyReviews 12(Apr.2012)。

尽管已经说明和描述了本发明的特定实施方案和应用，但是应当理解，本发明不限于本文描述的精确配置和组分。在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对本文公开的本发明的方法和系统的布置、操作和细节进行对本领域技术人员显而易见的各种修改、改变和变化。因此，重要的是，权利要求被视为包括任何此类等效结构，只要它们不背离本发明的精神和范围。

本发明的优点将从本文所含有的公开内容中显而易见。

如本文所用，“至少一个”、“一个或多个”和“和/或”是开放式表达，它们在操作上是合取的和析取的。例如，“A、B和C中的至少一个”、“A、B或C中的至少一个”、“A、B和C中的一个或多个”、“A、B或C的一个或多个”和“A、B和/或C”是指单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、或A、B和C一起。

应当注意，术语“一”或“一个”实体是指该实体中的一个或多个。因此，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。还应注意，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。

本文所述的实施方案和配置既不是完整的也不是详尽的。如将理解的，本发明的其他实施方案可以单独或组合地利用上文阐述或下文详细描述的一个或多个特征。

附图简要说明

图1说明了根据本发明的实施方案在空气培养基胶体(AMC)上生长的四个丝状真菌样品，以及在非胶体生长培养基上生长的两个丝状真菌样品。

图2说明了根据本发明的实施方案其中在AMC上生长丝状真菌的两个托盘，以及其中在标准非乳化生长培养基上生长丝状真菌的一个托盘。

图3是常规表面发酵和AMC发酵的比较生长图。

图4和图5分别是表面发酵和AMC发酵真菌试样的蛋白质测定。

图6A和图6B分别是网状基质在收获其上生长的真菌生物垫之前的俯视图和仰视图。

图7是图6A和图6B的网状基质在生物垫收获之后的视图。

图8是显示在AMC和常规液体表面发酵(LSF)培养基中碳浓度和/或碳氮比对生物垫厚度的影响的图。

图9是显示在AMC和常规LSF培养基中碳浓度和/或碳氮比对生物垫面积产量的影响的图。

图10是显示在AMC和常规LSF培养基中碳浓度和/或碳氮比对生物垫密度的影响的图。

图11是显示在AMC和常规LSF培养基中碳浓度和/或碳氮比对生物垫抗张强度的影响的图。

图12是显示在AMC和常规LSF培养基中碳浓度和/或碳氮比对生物垫断裂应变的影响的图。

图13A至图13D是分别显示在AMC和常规LSF培养基中碳浓度和/或碳氮比对生物垫灰分、碳水化合物、脂肪和蛋白质含量的影响的图。

图14是显示用于制备AMC的混合技术/装置对生物垫厚度的影响的图。

图15A和图15B是分别显示用于制备AMC的混合技术/装置对生物垫面积产量和密度的影响的图。

图16是显示用于制备AMC的混合技术/装置对生物垫抗张强度的影响的图。

图17是显示用于制备AMC的混合技术/装置对生物垫断裂应变的影响的图。

图18是显示AMC增稠剂对生物垫厚度的影响的图。

图19A和19B分别是显示AMC增稠剂对生物垫面积产量和密度的影响的图。

图20是显示AMC增稠剂对生物垫抗张强度的影响的图。

图21是显示AMC增稠剂对生物垫断裂应变的影响的图。

图22A是在含有15wt％果糖的常规液体表面发酵培养基上生长的生物垫的5μm横截面放大40倍的光学显微镜图像。

图22B、图22C和图22D是在含有15wt％果糖的常规液体表面发酵培养基上生长的生物垫的5μm横截面的底部(中间侧)、中间和顶部(菌丝侧)部分放大100倍的光学显微镜图像。

图23A是在含有15wt％果糖的AMC培养基上生长的生物垫的5μm横截面放大40倍的光学显微镜图像。

图23B、图23C和图23D是在含有15wt％果糖的AMC培养基上生长的生物垫的5μm横截面的底部(中间侧)、中间和顶部(菌丝侧)部分放大100倍的光学显微镜图像。

发明详述

如本文所用，术语“生物质”是指由以交织或相互啮合的方式生长以产生连贯的丝状真菌团的菌丝体形成的丝状真菌结构。

如本文所用，术语“生物垫”是指具有明显均匀的厚度和相对大的表面积与厚度比的丝状真菌结构。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“胶体”是指其中一种物质(“分散相”)的颗粒分散在不同物质(“分散介质”)的整个体积中的混合物，例如分散相可以包含或由微观气泡、颗粒等组成。在本文中具体标识胶体的分散相和分散介质的情况下，它们用连字符隔开，其中首先标识分散相，例如本文提及的“空气-培养基胶体”是指其中空气是分散相并且培养基(例如发酵培养基或生长培养基)是分散介质的胶体。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“乳液”是指其中分散相和分散介质均为液体的胶体。如本文所用的术语，乳液的实例包括但不限于胶乳、洗剂、蛋黄酱和牛奶的脂肪部分。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“泡沫”是指其中分散相为气体且分散介质为液体的胶体。如本文所用的术语，泡沫的实例包括但不限于剃须膏和搅打奶油。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“凝胶”是指其中分散相为液体且分散介质为固体的胶体。如本文所用的术语，凝胶的实例包括但不限于琼脂、明胶和果冻。在本发明的实施方案中，多糖凝胶形式的AMC可以通过例如二价和一价离子交联、自组装、纤维排列、共价交联、非离子交联和/或溶剂去除交联来制备。AMC凝胶可以干燥，在一些实施方案中冷冻干燥以用于储存或运输，然后再水合以备后用。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“液体气溶胶”是指其中分散相为液体且分散介质为气体的胶体。如本文所用的术语，液体气溶胶的实例包括但不限于云、冷凝、雾、发胶和薄雾。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“溶胶”是指其中分散相为固体且分散介质为液体的胶体。如本文所用的术语，溶胶的实例包括但不限于血液、有色墨水和牛奶的蛋白质部分。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“固体气溶胶”是指其中分散相为固体且分散介质为气体的胶体。如本文所用的术语，固体气溶胶的实例包括但不限于大气微粒、冰云和烟雾。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“固体泡沫”是指其中分散相为气体且分散介质为固体的胶体。如本文所用的术语，固体泡沫的实例包括但不限于气凝胶、浮石和聚苯乙烯泡沫塑料。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“固溶胶”是指其中分散相和分散介质均为固体的胶体。如本文所用的术语，固体溶胶的实例包括但不限于蔓越莓玻璃。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“稳定性”是指在指定时间间隔后由泡沫保持的泡沫的初始体积的比例。作为非限制性实例，具有五升初始体积和14天后四升体积的泡沫因此在14天内具有80％的稳定性。除非另有说明，如本文所用的术语，“稳定”泡沫是在指定时间间隔后具有至少50％稳定性的泡沫。

本发明通过在空气培养基胶体(AMC)之上或之中培养丝状真菌来提供丝状真菌的快速且多产的生长，其中空气分散在发酵培养基或生长培养基中。通常，为AMC提供稳定剂以提高AMC的泡沫稳定性，从而在较长时间内保持AMC增加的体积。在实施方案中，AMC是通过对发酵培养基曝气形成的，并且可以任选地包括其他组分或特征，例如多糖改良剂或真菌接种物，以提供甚至进一步改善的真菌生长特性。物理上，AMC是通常稳定的、富含空气的胶体，在实施方案中其可以是泡沫。

在AMC之上或之中培养的丝状真菌可用于多种应用中的任一种。作为第一个非限制性实例，AMC的使用可以包括在用于在表面发酵系统或过程中接种的发酵策略中。作为第二个非限制性实例，AMC的使用可以包括在用于在固体底物发酵系统或过程中接种的发酵策略中。作为第三个非限制性实例，AMC可用于“膜”发酵系统，例如，如PCT申请公开2019/046480中所公开和描述的，或没有膜的过程；在这些实施方案中，AMC本身可以代替膜。作为第四个非限制性实例，AMC可用于发酵“托盘”或其他类似容器中，用于在AMC的表面和/或其中的空气/培养基界面上形成生物垫。

应当明确理解，根据本发明的方法和系统产生的真菌生物质可以具有任何合适的几何形状，并且可以选择发酵容器、表面或容器以向AMC和/或真菌生物质提供期望的几何形状。作为非限制性实例，在容器或表面之上或之中进行发酵的情况下，可以产生丝状真菌的生物垫。作为进一步的非限制性实例，AMC可被喷涂、浸涂、“涂漆”或以其他方式涂覆在基质或支架(例如疏水屏)的表面上，由此真菌生物质可以类似于基质或支架的形状或图案的形状或图案生长，并且基质或支架的形状可以预先选择(例如立方体、球形等)以提供相应的期望真菌几何形状。

与通过培养丝状真菌的常规方法和系统所能实现的相比，本发明的方法和系统提供了丝状真菌更快速和多产的生长。不希望受任何特定理论的限制，据信在实施方案中，本发明的方法和系统的这种益处可能是作为AMC与丝状真菌产生的疏水蛋白相互作用的结果来实现的。疏水蛋白是小的、富含半胱氨酸的蛋白质，由许多种类的丝状真菌天然表达，并在亲水/疏水界面(如水/空气界面)上自组装成疏水双层。真菌然后可以穿透亲水/疏水界面。例如，在常规的表面发酵中，疏水蛋白可以在液体原料和周围气氛之间的界面上形成双层，然后被真菌组织(主要位于界面的空气侧)穿透以到达液体原料。据信在本发明的实践中，含有显著体积分数的空气的AMC极大地增加了空气/培养基界面的有效表面积，因此该面积可以使得疏水蛋白自组装并使得真菌的渗透能够到达生长培养基。换句话说，与常规表面发酵过程中的常规原料相比，AMC具有更大的有效表面积，可以在其上进行表面发酵。

本发明的方法和系统特别适用于产生丝状真菌作为食物来源。具体来说，AMC的使用可以使培养的丝状真菌生长得更快和更多产，而不需要可能对所得真菌的安全性、营养状况或味道产生负面影响的生长促进剂或其他添加剂。同时，AMC和/或丝状真菌可以包含食品级或食品安全的添加剂和成分；作为非限制性实例，AMC可以包含食品级或食品安全泡沫稳定剂，例如黄原胶，其在食用后无害，因此如果在发酵过程中被真菌吸收，不会对消费者构成风险。丝状真菌的营养特征、味道或其他特性也可以通过包括任何一种或多种不同的食品级或食品安全添加剂来提高或增强，如(作为非限制性实例)富集具有某些维生素、矿物质或其他营养物的AMC。

可以理解，可以控制或调节AMC的各种参数以提供期望的丝状真菌生长曲线。作为第一个非限制性实例，可以选择分散在一定体积的发酵培养基中的空气的相对量、分布、气泡大小等以提供期望的泡沫结构，这可以影响如本文所述的丝状真菌的生长。作为第二个非限制性实例，可选择作为AMC的一部分提供的任选泡沫稳定剂的组成和量以提供期望的泡沫随时间稳定性曲线。作为第三个非限制性实例，可选择作为AMC的一部分提供的任选表面活性剂的组成和量，以在AMC内的空气、AMC内的液体发酵培养基和丝状真菌的任意两种之间提供期望的表面张力或界面张力；表面活性剂的使用还可以帮助驱动、定义和/或增强AMC、丝状真菌和/或发酵过程的各种其他特性，包括但不限于丝状真菌接种物在AMC的气泡之上或之中的行为、与AMC中的成核颗粒相关的能量、和/或最终的泡沫尺寸或体积。通常，然后可以控制或调整AMC和更一般地胶体的任何属性或化学或物理性质，其可以影响AMC和/或布置在其中或其上的丝状真菌的表面行为，以提供丝状真菌的期望生长曲线。

在本发明的方法和系统中感兴趣的AMC的一个化学和/或物理特性是存在于AMC中的泡沫稳定剂或表面活性剂的表面活性。具体而言，如果存在，可以基于发酵培养基中的泡沫稳定剂或表面活性剂的表面活性来选择和提供适当量的泡沫稳定剂或表面活性剂，以提供AMC的期望表面张力。适用于本发明的泡沫稳定剂和表面活性剂的非限制性实例包括多糖胶(例如黄原胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、魔芋根胶)、阴离子表面活性剂(例如羧酸盐、磷酸酯、硫酸酯、磺酸酯)、阳离子表面活性剂(例如伯胺、仲胺、或叔胺、季铵盐)、鲸蜡硬脂醇聚醚20、纤维素、二乙酰酒石酸甘油单酯和甘油二酯(DATEM)、甘油二酯、乳化蜡、甘油单硬脂酸酯、卵磷脂、甘油单酯、芥末、非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、肥皂、磷酸钠、硬脂酰乳酸钠、两性离子表面活性剂、皂苷、淀粉、变性淀粉、植物蛋白表面活性剂(例如大豆分离蛋白、豌豆分离蛋白)、动物蛋白表面活性剂(例如酪蛋白、乳清蛋白分离物)、微粒、二氧化硅及其组合和混合物。

在本发明的实践中，稳定剂和表面活性剂在AMC中的存在量通常在约0.1wt％和约2.5wt％之间，或可选地在从0.1wt％和2.5wt％之间的任何重量百分比的十分之一和约任何其他重量百分比的十分之一的任何范围内。作为非限制性实例，稳定剂和表面活性剂可以以以下量存在于AMC中：至少约0.1wt％、至少约0.2wt％、至少约0.3wt％、至少约0.4wt％、至少约0.5wt％、至少约0.6wt％、至少约0.7wt％、至少约0.8wt％、至少约0.9wt％、至少约1.0wt％、至少约1.1wt％、至少约1.2wt％、至少约1.3wt％、至少约1.4wt％、至少约1.5wt％、至少约1.6wt％、至少约1.7wt％、至少约1.8wt％、至少约1.9wt％、至少约2.0wt％、至少约2.1wt％、至少约2.2wt％、至少约2.3wt％或至少约2.4wt％。作为进一步的非限制性实例，稳定剂和表面活性剂可以以下量存在于AMC中：不超过约2.5wt％、不超过约2.4wt％、不超过约2.3wt％、不超过约2.2wt％、不超过约2.1wt％、不超过约2.0wt％、不超过约1.9wt％、不超过约1.8wt％、不超过约1.7wt％、不超过约1.6wt％、不超过约1.5wt％、不超过约1.4wt％、不超过约1.3wt％、不超过约1.2wt％、不超过约1.1wt％、不超过约1.0wt％、不超过约0.9wt％、不超过约0.8wt％、不超过约0.7wt％、不超过约0.6wt％、不超过约0.5wt％、不超过约0.4wt％、不超过约0.3wt％或不超过约0.2wt％。

在本发明的方法和系统中感兴趣的AMC的另一个化学和/或物理特性是当AMC作为泡沫提供时AMC的稳定性。尽管在文献中已知并描述了用于评估泡沫稳定性的各种测定法，但确定泡沫稳定性的最简单方法包括在两个(或更多)时间点简单地测量相同容器中泡沫的上表面的高度。泡沫的稳定性可以使泡沫在配制后能够储存和/或运输很长一段时间，为本发明的方法和系统提供又一个有利的益处。在一些实施方案中，当AMC为泡沫时，其在1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周或2周内具有至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％的稳定性。

在本发明的方法和系统中感兴趣的AMC的另一个化学和/或物理特性是当AMC作为泡沫提供时AMC的质地。具体而言，可以选择和/或设计泡沫的体积、泡孔结构、膨胀度、气体分数、填充几何形状、界面几何形状和其他类似特征中的任何一种或多种以提供对丝状真菌生长的期望效果，如可以是分散介质的各种性质，如水活性、离子强度、渗透压等。特别地，泡沫状AMC的这些和其他特征可能影响可用于发酵的AMC的有效表面积，如本公开全文所述，其对丝状真菌的所得产量具有显著影响。

在本发明的方法和系统中感兴趣的AMC的另一个化学和/或物理特性是当AMC作为泡沫提供时AMC的粘度和稳定性之间的关系。在许多应用中，如当过程运作需要倾倒、泵送、储存和/或运输AMC时，通常可能期望在不增加AMC粘度的情况下增加泡沫状AMC的稳定性。期望的稳定性和期望的粘度的选择反过来又会影响所提供的泡沫稳定剂、表面活性剂、增稠剂等的选择和/或用量。

在本发明的方法和系统中感兴趣的AMC的又一个化学和/或物理特性是发酵培养基中的碳氮摩尔比。作为非限制性实例，发酵培养基中的碳氮摩尔比可以是至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、或至少约25、或约10和约25之间、或在10和25之间的约任何整数和约任何其他整数之间的范围内。在一些实施方案中，发酵培养基中的碳氮摩尔比可以优选地在约12和约20之间。

可以通过任何合适的方式以选择的曝气速率和时间向本发明的AMC曝气，或以其他方式使空气或任何其他气体分散在其中，以向AMC提供期望的空气分数和/或泡沫稳定性。作为第一个非限制性实例，在用于形成AMC的发酵培养基的体积相对较小的情况下，可以使用浸入式搅拌器或类似装置；典型的家用浸入式搅拌器通常包括两个或多个高速旋转(至少约12,000rpm)的叶片，因此非常适合给液体发酵培养基曝气。作为第二个非限制性实例，泡沫形式的AMC可以通过用静态混合头对液体生长培养基曝气，和/或通过使用搅拌器、立式混合器等搅打液体生长培养基来生成。作为第三个非限制性实例，当用于形成AMC的发酵培养基的体积较大或期望更精确的曝气时，可以使用工业曝气设备如大容量和/或高剪切混合器(具有或不具有空气起泡器)或者施加正压或负压的设施。用于形成AMC的其他装置、方法和系统，如静态和动态混合头、起泡、刮板式热交换器、挤压、压差方法等的使用，均被明确考虑并且在本发明的范围内。出于各种原因，可能期望对曝气进行控制，包括但不限于为AMC提供期望的气室尺寸；不希望受任何特定理论的限制，据信在气室尺寸和粘度之间存在正相关(即，较小的气室导致较低的粘度，较大的气泡导致较高的粘度)并且在气室尺寸和泡沫稳定性之间存在负相关(即较小的气室导致较高的泡沫稳定性，较大的气室导致较低的泡沫稳定性)。

在本发明的实践中，丝状真菌在AMC之上或之中的接种和培养可以在任何合适的发酵容器中进行。通常，可以选择发酵容器的高度、横截面积和/或体积以提供对AMC和/或发酵过程的期望效果。作为非限制性实例，并且不希望受任何特定理论的限制，在其他条件不变的情况下，更大体积的AMC可以导致更高的泡沫稳定性(或等效地，更低的体积损失率或泡沫的“排水”)；这可能是毛细管作用对抗重力以保持AMC处于泡沫状态的结果。泡沫稳定性也可能取决于泡沫的排水或歧化速率，这可能由胶体界面表面的稳定性和拉普拉斯压差(气泡尺寸和尺寸分布)驱动。

在AMC以泡沫形式提供的实施方案中，泡沫的内部物理结构，即气室的排列和分隔气室的液膜网络可被认为是“支架”，生物质或生物质的一部分可以在其上粘附和生长。因此，在一些实施方案中，该“支架”的结构可以是特别重要的考虑因素，并且可以选择泡沫内的气室或气泡的尺寸以及其他泡沫参数以提供期望的支架结构。用于从发酵培养基形成AMC的曝气过程的特征可以在考虑到这些或其他泡沫特征的情况下进行调整，特别是为了提供期望的生长模式、分布或速率，例如通过本发明的培养方法产生的真菌生物质的面积或质量的预选倍增率。

AMC的表面或体积内的静电和/或离子力也可以对AMC在期望的应用或培养的丝状真菌的生长的适用性提供显著影响。作为第一个非限制性实例，泡沫状AMC的某些性质，包括但不限于泡沫的厚度，可以至少部分地取决于AMC和/或其中所含的泡沫稳定剂或增稠剂的pH。作为第二个非限制性实例，膜的静电分离压力可以影响泡沫表面上的力和上拉液体发酵培养基的毛细力之间的平衡，从而影响泡沫表面某些类型膜的形成和组成。作为第三个非限制性实例，空气/泡沫界面处的电化学相互作用可以促进或抑制真菌生长或粘附。作为第四个非限制性实例，AMC中使用的泡沫稳定剂或表面活性剂的等电点可能对AMC和/或丝状真菌具有额外的化学和/或物理影响。

AMC的应用

应明确理解，根据本发明的AMC可以适当地与用于培养丝状真菌的已知方法和系统结合使用。作为非限制性实例，AMC可以用作膜发酵过程和/或“生物反应器”中的原料。另外地和/或可选地，AMC可以用于任何合适的发酵容器，包括但不限于织物、膜、筛网、板、托盘、大桶和其他容器。特别地，在本发明的实施方案的实践中，具有以下孔径的筛网可以适当地具有应用到其上的AMC：至多约0.25毫米、至多约0.5毫米、至多约0.75毫米、至多约1毫米、至多约1.25毫米、至多约1.5毫米、至多约1.75毫米、至多约2毫米、至多约3毫米、至多约4毫米、至多约5毫米、至多约6毫米、至多约7毫米、至多约8毫米、至多约9毫米、或至多约10毫米。

本发明的AMC的一个优点是它们可以以适合于允许它们被“涂漆”或以其他方式涂覆在基质或支架的表面上的粘度提供，因此不需要提供具有用于容纳AMC的内腔的容器。事实上，本发明人已经成功地用AMC和在其上培养的丝状真菌涂覆垂直布置的筛网，从而不仅提供了期望的形状，而且提供了期望的真菌生长空间方向。在一些实施方案中，本发明的高粘度AMC可以采取例如喷雾泡沫的形式，该形式可以由用户施加到期望的培养表面。

与本发明的AMC一起使用的反应器和容器可以设计为AMC提供某些预定的物理参数，从而用于培养或发酵过程。此类物理参数包括但不限于在本公开全文中描述的物理参数。

本发明的方法和系统的一个有利应用是用于产生丝状真菌生物质，该生物质作为非限制性实例可用作食品、结构材料或纺织品。此外，本发明的方法和系统可用于产生期望的丝状真菌代谢产物。作为非限制性实例，可利用根据本发明在AMC之上或之中培养丝状真菌的方法和系统来刺激有机酸、抗生素、酶、激素、脂类、真菌毒素、维生素、色素、丝状菌重组异源蛋白中的任何一种或多种的产生。在常见的丝状真菌代谢物中，可能特别期望通过这些方法合成的是赤霉酸，其具有许多重要的园艺用途，包括但不限于使用发芽刺激剂、葡萄种植中的增产激素、樱桃中的生长复制剂、以及促进无核果实生长的柑橘类水果作物的补充剂。根据本发明培养的丝状真菌产生的代谢物可以包括生长相关代谢物和非生长相关代谢物。在一些实施方案中，可任选地通过研磨固体基质并将研磨的固体基质在发酵前或发酵过程中添加至AMC来刺激期望代谢物的产生。

通过本文公开的方法和系统产生的生物垫可用于多种应用。作为第一个非限制性实例，根据本发明产生的生物垫可通过本领域技术人员已知的任何一种或多种方法转化为食品，例如PCT申请公开2019/046480和2020/176758中所公开的。通常，根据本发明产生的生物垫可以作为大颗粒或细丝形式(例如用于制造肉类模拟食品)、细颗粒形式(例如用于制造面粉)、颗粒的液体分散体形式(例如制造牛奶模拟食品)或任何其他合适的形式引入到食品中。因此，由根据本文公开的方法和系统产生的丝状真菌生物垫制成的食品，随后通过任何一种或多种已知的方法和系统转化为食品，都在本公开的范围内。

作为第二个非限制性实例，根据本发明产生的生物垫可以通过本领域技术人员已知的任何一种或多种方法转化为结构材料如建筑材料，例如美国专利9,555,395和9,951,307中所公开的。通常，根据本发明产生的生物垫可以通过与木质纤维素材料或生长培养基结合，或通过任何其他合适的方式引入到结构材料中。因此，由根据本文公开的方法和系统产生的丝状真菌生物垫制成的结构材料，随后通过任何一种或多种已知的方法和系统转化为结构材料，都在本公开的范围内。

作为第三个非限制性实例，根据本发明产生的生物垫可以通过任何一种或多种合适的方法转化为纺织品如皮革模拟纺织品。最典型地，此类方法可包括使聚合物和/或交联剂的溶液渗入生物垫(其可以任选地预先、同时或随后减小尺寸)，然后固化生物垫以去除溶剂，但在大多数通常情况下，根据本发明产生的生物垫可以通过任何合适的改变生物垫的化学或物理性质的方法(例如通过交联、与聚合物或其他结构增强材料结合等)转化为纺织品，以提供期望的材料或机械性能。因此，由根据本文公开的方法和系统产生的丝状真菌生物垫制成的纺织品，随后通过任何一种或多种合适的方法和系统转化为纺织品，都在本公开的范围内。

真菌生物质的生长和微结构

在本发明方法的实践中，可以产生具有期望生长特性的真菌生物质，在许多情况下其对应于真菌生物质的期望化学或物理结构，特别是物理微观结构。作为第一个非限制性实例，在整个生物质中具有期望AMC成分空间分布的生物质可以通过本文公开的方法产生。作为第二个非限制性实例，真菌接种物在整个AMC中的期望空间分布可以通过本文公开的方法来实现(这反过来又可以导致具有期望物理特性的生物质的产生)。作为第三个非限制性实例，菌丝网络成核和/或发育的期望模式可以通过本文公开的方法，特别是通过修改或调整特定AMC和/或接种物特性来实现。作为第四个非限制性实例，具有空间变化的物理组成的生物质，例如具有特定真菌组织浓度的空间变化的生物质，可以通过本文公开的方法产生。作为第五个非限制性实例，具有空间变化的化学组成或行为的生物质，例如在呼吸速率、蛋白质含量、营养物(例如碳或氮)利用等方面具有空间变化的生物质，可以通过本文公开的方法产生。作为第六个非限制性实例，具有期望代谢特性(例如预先选择的代谢效率、增加或减少的所选代谢物的产生等)的生物质，可以通过本文公开的方法产生。作为第七个非限制性实例，具有期望的二氧化碳产生速率或分布的生物质可以通过本文公开的方法产生。作为第八个非限制性实例，通过本文公开的方法的生物质的产生可以有效地分成不同的阶段，例如初始成核、成核位点的组合、薄粘性膜的演化、生物质的垂直生长、不同生物质层的演化和生长等(这反过来又可以导致具有期望物理特性的生物质的产生)。作为第九个非限制性实例，具有与作为食品的丝状真菌的与消费者相关的期望特性(例如生物质(干)密度、转化效率、营养物、味道、视觉外观、香气、蛋白质结合、真菌毒素含量等)的生物质，可以通过本文公开的方法产生；在一些实施方案中，生物垫的干密度可以是至少约0.19g/cm³、至少约0.20g/cm³、至少约0.21g/cm³或至少约0.22g/cm³。作为第十个非限制性实例，具有期望湿密度的生物质可以通过本文公开的方法产生，这可以提高生物质在期望应用中的适用性(例如作为食品、作为纺织材料等)和/或提高生物质后续加工的便利性。

在一些实施方案中，尤其是其中AMC以泡沫形式提供的那些实施方案中，在收获生物垫之后，丝状真菌的细胞可以保持优先隔离在泡沫中，而真菌细丝粘附到泡沫状AMC内的气泡表面。这在例如可以随后加工AMC以从AMC内的气泡的表面获得更多生物质的应用中可能是有利的或期望的。

在一些实施方案中，丝状真菌生物垫在AMC上的生长可导致生物垫具有减少的或最小化的小分生孢子含量和/或增加的或最大化的真菌菌丝含量。作为非限制性实例，小分生孢子可占根据本发明产生的丝状真菌生物垫的少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％或少于约2％。作为进一步的非限制性实例，真菌菌丝可占根据本发明产生的丝状真菌生物垫的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％。不希望受任何特定理论的限制，据信具有增加的或最大化的真菌菌丝含量的丝状真菌生物垫可能特别有用或适用于某些应用，例如在纺织材料中，由于这种增加的或最大化的菌丝含量导致的材料或机械性能(例如增加抗张强度)。

AMC泡沫的流变学和结构

本文所述的本发明的方法和系统可用于产生具有期望物理和机械性能的AMC，特别是产生具有期望流变学和相关特性的AMC泡沫。作为第一个非限制性实例，分散在整个AMC中的气室的特性，例如空隙率、气泡尺寸、气泡尺寸分布、气泡形状和气泡表面积可以根据本发明来表征和控制。作为第二个非限制性实例，AMC的降解特性，例如作为时间函数的泡沫稳定性、泡沫的化学降解途径以及作为时间函数的与真菌接种物的物理相互作用可以根据本发明来表征和控制，特别是通过使用不同的AMC化学物质和真菌接种物种类和加载速率。作为第三个非限制性实例，AMC的流体特性，例如粘度、流变学、幂定律或宾汉塑性行为可以根据本发明来表征和控制，特别是通过控制AMC的气体分数。作为第四个非限制性实例，AMC的工作特性，例如剪切稀化或剪切增稠特性可以根据本发明来表征和控制。作为第五个非限制性实例，AMC的化学或物理行为随时间的变化可以根据本发明来表征和控制，特别是通过改变真菌接种物的加载速率。作为第六个非限制性实例，泡沫稳定剂和表面活性剂的作用，例如疏水蛋白和黄原胶的作用可以根据本发明来表征和控制。作为第七个非限制性实例，其他添加剂例如营养补充剂的影响，可以根据本发明来表征和控制。作为第八个非限制性实例，泡沫形成机制的影响，例如静态填料、转子/定子形成和空气诱导的影响可以根据本发明来表征和控制。

其他加工注意事项、优势和益处

在许多实施方案中，可能期望在本发明的AMC中包括起泡剂、泡沫稳定剂、表面活性剂等。如本公开全文所述，黄原胶是非常常用的泡沫稳定剂，可安全用于食品级应用。然而，许多其他树胶、发泡剂、泡沫稳定剂、表面活性剂、增稠剂等在本领域中是已知的和已描述的，并且可以适当地用于本发明的实践中。在实施方案中，这些添加剂可以对AMC的稳定性和其他参数具有不同的影响，并且可以被选择以适用于特定应用。可适用于在本发明的实践中使用的发泡剂、泡沫稳定剂和/或表面活性剂的实例包括但不限于阴离子表面活性剂(例如羧酸盐、磷酸酯、硫酸酯、磺酸酯)、阳离子表面活性剂(例如伯胺、仲胺、或叔胺、季铵盐)、鲸蜡硬脂醇聚醚20、纤维素、二乙酰酒石酸甘油单酯和甘油二酯(DATEM)、甘油二酯、乳化蜡、卵磷脂、甘油单酯、芥末、非离子表面活性剂(例如氧化胺、乙氧基化物、多羟基化合物的脂肪酸酯、氧化膦、亚砜)、聚山梨醇酯20、肥皂、磷酸钠、硬脂酰乳酸钠、两性离子表面活性剂、皂苷、淀粉、变性淀粉和来自植物和动物来源的蛋白质分离物。

在实施方案中，可以提供两种或更多种稳定剂、表面活性剂、增稠剂等，并且在一些情况下可以具有对泡沫稳定性的协同作用，其大于它们单独作用的简单相加外推所预测的作用。特别地，当黄原胶与半乳甘露聚糖(例如瓜尔胶、刺槐豆胶)和/或葡甘露聚糖(例如魔芋胶)聚合物组合使用时，本发明人已经发现可以在黄原胶添加率仅为发酵培养基的0.025wt％的情况下产生稳定的泡沫。这些实施方案的AMC可以表现出剪切稀化(例如，在较高剪切速率下的较低粘度)和热稀化(例如，在较高温度下的较低粘度)，这可能是本发明的某些应用中期望的。

可以选择发酵培养基的化学组成本身以实现真菌生物质的期望生长速率、组成等。特别是发酵培养基中的碳源的身份，例如果糖可能对生长曲线、碳利用率等结果具有显著影响。

在实施方案中，发酵培养基可以是或包含含有碳源和氮源的原料，特别可以是或包含适用于生物反应器发酵过程的原料。合适的碳源是糖类(例如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、日本稀有糖等)、糖醇(例如甘油、多元醇等)、淀粉(例如玉米淀粉等)、淀粉衍生物(例如麦芽糖糊精、环糊精、葡萄糖浆、水解产物和变性淀粉)、淀粉水解产物、氢化淀粉水解产物(HSH；例如氢化葡萄糖浆、麦芽糖醇糖浆、山梨糖醇糖浆等)、木质纤维素浆或原料(例如甜菜浆、农业浆、木材浆、干酒糟、啤酒厂废弃物等)、玉米浆、酸乳清、甜乳清、乳清、小麦浸泡液、碳水化合物、食物废弃物、橄榄油加工废料、木质纤维素材料的水解产物、玉米湿磨产品(例如碳精制糖浆、脱盐糖浆、酶转化糖浆等)和/或它们的组合。原料可以是废弃物产品，例如天然存在的尿液和/或粪便、食物废弃物、植物材料、工业废弃物如甘油，以及废弃物副产品、淀粉和/或淀粉水解的副产品、酸乳清、糖醇和/或其组合。也可以使用合成或制造的废弃物替代物如替代人尿。植物材料原料通常是木质纤维素。木质纤维素原料的一些实例是农作物残留物(例如小麦秸秆、大麦秸秆、稻草、小谷物秸秆、玉米秸秆、玉米纤维(例如玉米纤维胶(CFG))、干酒糟(DDG)、玉米麸质粉(CGM)、柳枝稷、甜菜浆、棕榈油生产产生的废液、干草苜蓿、甘蔗渣)、非农业生物质(例如藻类生物质、蓝藻生物质、城市树木残渣)、森林产品和工业残渣(例如软木一级/二级轧机残渣、硬软木一级/二级轧机残渣、再生纸浆污泥)、含木质纤维素的废弃物(例如新闻纸、废纸、酿造谷物、用过的橡胶轮胎(URT)、城市有机废弃物和副产品、庭园废弃物和副产品、临床有机废弃物和副产品、以及在生物燃料(例如加工的藻类生物质、甘油)生产过程中产生的废弃物和副产品、以及它们的组合。

AMC可以任选地进一步包含一种或多种盐。在许多真菌培养和发酵过程中，通常使用盐如硝酸铵来提高真菌的代谢活性和/或生长速率。这些和其他盐可以用于本发明的AMC中的类似目的。

AMC可以任选地进一步包含一种或多种其他食品级添加剂。这些添加剂可以用于多种目的中的任何一种，从改变胶体的物理行为到改变所得生物质的味道或营养成分。

通常，任何适合在现有技术的方法和系统中培养和发酵的丝状真菌同样可以用于本发明的实践。此类真菌包括但不限于丝状镰刀菌、羊肚菌、珍珠菇和其他适合人类作为食物食用的蘑菇。更普遍的是，丝状真菌可以属于选自下组的目：黑粉菌目(Ustilaginales)、红菇目(Russulales)、多孔菌目(Polyporales)、伞菌目(Agaricales)、盘菌目(Pezizales)和肉座菌目(Hypocreales)；可以属于选自下组的科：黑粉菌科(Ustilaginaceae)、猴头菌科(Hericiaceae)、多孔菌科(Polyporaceae)、灰树花孔菌科(Grifolaceae)、离褶伞科(Lyophyllaceae)、球盖菇科(Strophariaceae)、马勃科(Lycoperdaceae)、伞菌科(Agaricaceae)、侧耳科(Pleurotaceae)、膨瑚菌科(Physalacriaceae)、小皮伞科(Omphalotaceae)、块菌科(Tuberaceae)、羊肚菌科(Morchellaceae)、绣球菌科(Sparassidaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)和虫草菌科(Cordycipitaceae)；可以属于选自下组的物种：茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)、猴头菌(Hericulum erinaceus)、宽鳞多孔菌(Polyporous squamosus)、灰树花(Grifola fondosa)、斑玉蕈(Hypsizygusmarmoreus)、榆干玉蕈(Hypsizygus ulmarius)、香杏丽蘑(Calocybe gambosa)、光帽鳞伞(Pholiota nameko)、大秃马勃(Calvatia gigantea)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、皱环球盖菇(Stropharia rugosoannulata)、砖红垂幕菇(Hypholoma lateritium)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、侧耳(Pleurotus ostreatus)、白松露(Tuber borchii)、羊肚菌(Morchella esculenta)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)、梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)、绣球菌(Sparassis crispa)、丝状镰刀菌(Fusarium venenatum，MK7 ATCC登记保藏号PTA-10698)、肋状皱盘菌(Disciotis venosa)和蛹虫草(Cordyceps militaris)。应特别理解的是，当在AMC之中或之上培养时，真菌接种物相对于在常规生长培养基培养时行为可以相同，或者当在AMC之中或之上培养时，接种物相对于在常规生长培养基培养时可以具有额外或替代的有利或有益的行为特征；这些特征包括但不一定限于聚集行为、增长模式或速率等。同样可以选择生长表面上的接种物的空间分布以提供对真菌生长模式、AMC泡沫形态或结构等的期望效果。

在实施方案中，AMC可以作为另一生长表面上的层或涂层提供。此类额外的和/或替代的生长表面包括但不一定限于固体表面、合成网、木质纤维素材料如棉花等。

如本公开全文所述，可以修改、选择和/或调整AMC的电化学性质以改善或控制丝状真菌的生长曲线。可以根据本发明修改、选择和/或调整的AMC的电化学性质的实例包括电导率和zeta电位。

在本发明的实践中，AMC一旦产生，在丝状真菌的发酵期间可能会或可能不会主动曝气。在实施方案中，关于在发酵期间是否以及在什么条件下对AMC主动曝气的决定可以由设备和资源可用性和待产生的生物质的期望特性以及其他考虑因素驱动。同样，取决于这些和其他考虑，泡沫稳定剂(例如黄原胶)、表面活性剂和其他添加剂可以或可以不用于本发明的AMC中。

在本发明的实践中一个重要的考虑因素是空气转移到、穿过和/或通过发酵表面的方式和速率。具体而言，通过在AMC之中或之上培养丝状真菌，本发明增加了可用于活性发酵的有效表面积。因此发酵可以在例如AMC内的气泡、气室或气穴的表面上进行；换句话说，在先前的发酵过程通常将发酵限制在“2D”或平面区域(即空气/培养基界面或表面)的情况下，本发明允许发酵培养基的空间范围或体积的更大部分的“3D”发酵。因此，本发明有效地改进了天然真菌生长过程，而不需要剪切或主动曝气，特别是当考虑通过分散在整个AMC中的气泡、气室或气穴的空气扩散时。在实施方案中，所得真菌网络的3D结构和孔隙率可以允许增加的或调整的气氛扩散速率或气氛通过真菌网络的渗透速率。

相对于用于生产丝状真菌生物质的先前的方法和系统，本发明的方法和系统具有各种优点和益处。本发明的第一个非限制性优点和/或益处是在最初形成AMC之后不需要对液体发酵培养基进行主动曝气或搅拌；特别是，在其他发酵过程通常是主要依赖于被动(而不是主动)氧转移的需氧过程的情况下，本发明以更稳定和可控的方式增加空气与培养基的比例，从而允许空气交换的精确调节。本发明的第二个非限制性优点和/或益处是将真菌生物质原位聚集成单个粘合垫，使得垫具有显著的抗张强度以使得容易收获。本发明的第三个非限制性优点和/或益处是本发明的方法和系统有效地产生纹理化生物质，其可用于多种产品，例如食品、生物塑料、生物燃料、营养补充剂和各种药物的表达平台。本发明的第四个非限制性优点和/或益处是显著减少产生每千克生物质的水消耗和其他残余废弃物，特别是关于发酵培养基本身的废弃物。本发明的第五个非限制性优点和/或益处是更快速的生物质产生；根据本发明，粘性生物垫可在短短十八小时内产生。本发明的第六个非限制性优点和/或益处是增加生物垫中的生物质密度。本发明的第七个非限制性优点和/或益处是本发明的方法和系统可用于产生多种丝状真菌包括嗜极端生物中的任何一种的生物质，从而允许选择对于期望的应用具有特异性优势的丝状真菌。本发明的第八个非限制性优点和/或益处是改进的可扩展性，允许直接调整或修改生产能力和速率而不影响本发明的方法和系统的生产率。本发明的第九个非限制性优点和/或益处是能够利用多种富含碳和/或氮的基质，包括在太空任务或自然灾害期间产生的那些，作为用于丝状真菌的培养和产生的生产性发酵培养基。

在一些实施方案中，本发明的方法可以产生以下的“面积产量”(本文定义为生物垫在其上生长的AMC的每顶部表面积的生物垫质量)：至少约0.5kg/m²、至少约0.6kg/m²、至少约0.7kg/m²、至少约0.8kg/m²、至少约0.9kg/m²、至少约1.0kg/m²、至少约1.1kg/m²、至少约1.2kg/m²、至少约1.3kg/m²、至少约1.4kg/m²、至少约1.5kg/m²、至少约1.6kg/m²、至少约1.7kg/m²、至少约1.8kg/m²、至少约1.9kg/m²、或至少约2.0kg/m²。在特定实施方案中，当稳定剂以至少约0.1wt％、至少约0.2wt％、至少约0.3wt％、至少约0.4wt％、至少约0.5wt％、或至少约0.6wt％的量使用时，可以实现这样的产量，特别是当稳定剂包含黄原胶时。在特定实施方案中，当发酵培养基中的碳氮摩尔比在约10和约23之间、或在约11和约22之间、或在约12和21之间、或在约13和约21之间、或在约14和约19之间、或在约15和约18之间、或在约16和约17之间时，可以实现这样的产量。在特定实施方案中，当AMC的粘度不超过约12,000cP、或不超过约11,000cP、或不超过约10,000cP、或不超过约9,000cP、或不超过约8,000cP、或不超过约7,000cP时，可以实现这样的产量。

在一些实施方案中，本发明的方法可以产生具有以下干质量密度的生物垫：至少约0.15g/cm³、至少约0.16g/cm³、至少约0.17g/cm³、至少约0.18g/cm³、至少约0.19g/cm³、至少约0.20g/cm³、至少约0.21g/cm³、或至少约0.22g/cm³。在特定实施方案中，当稳定剂以至少约0.1wt％、至少约0.2wt％、至少约0.3wt％、至少约0.4wt％、至少约0.5wt％、或至少约0.6wt％的量使用时，可以实现这样的密度，特别是当稳定剂包含黄原胶时。在特定实施方案中，当发酵培养基中的碳氮摩尔比在约10和约23之间、或在约11和约22之间、或在约12和21之间、或在约13和约21之间、或在约14和约19之间、或在约15和约18之间、或在约16和约17之间时，可以实现这样的密度。在特定实施方案中，当AMC的粘度不超过约12,000cP、或不超过约11,000cP、或不超过约10,000cP、或不超过约9,000cP、或不超过约8,000cP、或不超过约7,000cP时，可以实现这样的密度。

在一些实施方案中，本发明的方法可以产生在煮沸之前或之后具有以下抗张强度的生物垫：至少约255kPa、至少约260kPa、至少约265kPa、至少约270kPa、至少约270kPa、至少约275kPa、至少约280kPa、至少约285kPa、至少约290kPa、至少约295kPa、或至少约300kPa。在特定实施方案中，当稳定剂以至少约0.1wt％、至少约0.2wt％、至少约0.3wt％、至少约0.4wt％、至少约0.5wt％、或至少约0.6wt％的量使用时，可以实现这样的抗张强度，特别是当稳定剂包含黄原胶时。在特定实施方案中，当发酵培养基中的碳氮摩尔比在约10和约23之间、或在约11和约22之间、或在约12和21之间、或在约13和约21之间、或在约14和约19之间、或在约15和约18之间、或在约16和约17之间时，可以实现这样的抗张强度。在特定实施方案中，当AMC的粘度不超过约12,000cP、或不超过约11,000cP、或不超过约10,000cP、或不超过约9,000cP、或不超过约8,000cP、或不超过约7,000cP时，可以实现这样的抗张强度。

在一些实施方案中，本发明的方法可以产生具有以下厚度的生物垫：至少约1.75mm、至少约1.80mm、至少约1.85mm、至少约1.90mm、至少约1.95mm、至少约2.00mm、至少约2.05mm、至少约2.10mm、至少约2.15mm、至少约2.20mm、至少约2.25mm、或至少约2.30mm。在特定实施方案中，当稳定剂以至少约0.1wt％、至少约0.2wt％、至少约0.3wt％、至少约0.4wt％、至少约0.5wt％、或至少约0.6wt％的量使用时，可以实现这样的厚度，特别是当稳定剂包含黄原胶时。在特定实施方案中，当发酵培养基中的碳氮摩尔比在约10和约23之间、或在约11和约22之间、或在约12和21之间、或在约13和约21之间、或在约14和约19之间、或在约15和约18之间、或在约16和约17之间时，可以实现这样的厚度。在特定实施方案中，当AMC的粘度不超过约12,000cP、或不超过约11,000cP、或不超过约10,000cP、或不超过约9,000cP、或不超过约8,000cP、或不超过约7,000cP时，可以实现这样的厚度。

应当明确理解，虽然本发明一般被描述为利用液体发酵培养基中的空气胶体，但是除了或代替空气，任何适用于真菌培养或生长过程的气体都可以分散在泡沫中。实际上，在实施方案中，可以选择待分散在泡沫中的气体以通过非限制性实例的方式实现使用空气无法实现的所得真菌生物质的化学或物理组成。

参考以下说明性的、非限制性的实施例进一步描述本发明。

实施例1

该实施例说明了泡沫稳定剂在本发明的AMC中的用途，并证明通过使用泡沫稳定剂可以实现显著提高的生物质产量和减少的托盘废弃物。

通过对一定体积的标准接种MK102发酵培养基进行曝气制备六种AMC，其组成(基于九升总培养基)定义在表1中，使用典型的家用浸入式搅拌器(12000rpm)15秒，然后将200mL曝气发酵培养基倒入表面积为0.02m²的玻璃托盘中。六种制备的AMC中的四种含有最高达0.4wt％的食品级黄原胶作为稳定剂。

表1

观察到所有的AMC都是可倾倒的、自流平的，并且足够无粘性，可以使用标准设备泵送。包含0.1wt％或更少的黄原胶的AMC不会形成稳定的泡沫，而包含大于0.1wt％的黄原胶的AMC会形成在实验期间保持稳定的基本均匀的泡沫。还发现含有黄原胶的AMC表现出连续相凝胶化和剪切稀化，在搅拌或泵送时表现为流体，但在静止时表现为凝胶。

将MK7 ATCC登录保藏号PTA-10698的接种物引入每种AMC的表面，将含有AMC的六个托盘置于培养箱中并培养四天。在四天的培养期后，收获丝状真菌的生物垫，并通过蒸煮(使真菌失活)和压制(除去水分)进行处理。测量了垫的各种参数；结果在表2中给出。

表2

所有生物垫都具有可接受的颜色、气味和抗张强度。

图1是获得的生物垫的图像(从左到右，从上到下：样品#6、样品#3、样品#1、样品#2、样品#5、样品#4)。如表1和图1所示，与不稳定泡沫相比，产生的稳定泡沫形式的AMC显著提高了生物垫的产量。

图2是其中培养对照样品(上)、样品#4(左下)和样品#5(右下)的托盘图像。如图2所示，对于在稳定的泡沫AMC上生长的样品，发酵后留在托盘中的发酵培养基(即“托盘废弃物”)的比例大大减少。这与稳定的AMC为发酵提供更大的有效表面积并因此发酵培养基对丝状真菌更容易利用的假设是一致的。不希望受任何特定理论的限制，据信这种更大的有效表面积通过允许丝状真菌将生长培养基中更大比例的营养物转化为生物质，从而增加了生物垫，减少了托盘废弃物。AMC的显微照片(未显示)似乎表明真菌细胞在生物垫收获后仍优先隔离在泡沫中，而真菌细丝粘附在泡沫状AMC内的气泡表面上。

实施例2

该实施例说明了丝状真菌在AMC上的生长与丝状真菌在常规表面发酵过程中的生长之间的比较，并证明了通过使用AMC可以实现生物质显著加速的生长和显著提高的产量。

将MK7 ATCC登录保藏号PTA-10698的接种物引入生长箱中六种发酵培养基(三种常规液体培养基和三种根据本发明的AMC)中的每一种的表面上。对于六种培养基中的每一种，生长箱中发酵培养基的总体积为1750mL，顶表面积为0.25m²。然后让真菌在每种培养基上孵育96小时；从接种后36小时开始，每隔六到八小时测量一次总真菌生长量。结果显示在表3和图3中(在图3中，给出了来自三种表面发酵和三种AMC发酵的平均生长)。

表3

实施例3

该实施例说明了表面发酵真菌和AMC发酵真菌之间的真菌结构和组成的比较，并证明AMC真菌发酵过程可用于提供与常规表面发酵过程显著不同的真菌结构和组成。

将实施例2中生长的表面发酵和AMC发酵真菌的提取物进行pH缓冲，然后测定蛋白质含量；一些情况下在pH调整之前以及一些情况下在pH调整之后，还通过珠击裂解提取物。图4显示了表面发酵真菌的这些蛋白质测定的结果，且图5显示了AMC发酵真菌的这些蛋白质(图中标记为“AME”)测定的结果。

如图4和图5所示，AMC发酵产生的真菌的可提取蛋白质含量大约是常规表面发酵产生的真菌的两倍。不希望受任何特定理论的限制，据信这种蛋白质含量的差异是由于两种发酵过程的生长模式的结构差异；具体而言，据信与常规的表面发酵相比，AMC发酵导致更高的真菌菌丝的含量以及低得多的小分生孢子的含量。本发明人估计通过AMC发酵产生的真菌大约有1％的小分生孢子，而通过常规表面发酵产生的真菌大约有50％的小分生孢子。

不希望受任何特定理论的限制，AMC生长的垫和通过常规表面发酵生长的垫之间的蛋白质含量差异的另一种可能解释是真菌生长环境的差异。在AMC发酵中，大部分真菌生长发生在空气/培养基界面，例如在AMC内的空气气泡表面上；与生长在溶液中或其他菌丝下方的真菌组织相比，在这种表面上生长的菌丝暴露于例如氧气进入和有效表面张力方面的差异。因此，在AMC上生长的生物垫可能由于增加的“表面效应”，或者换句话说，由于真菌生物质的更大份额是在表面上而不是在溶液中或在菌丝体内部生长的事实，在例如蛋白质含量上表现出差异。

实施例4

该实施例说明了本发明的AMC促进网状基质表面上的真菌生长的用途。

通过添加树胶(0.4wt％刺槐豆胶、0.2wt％分离乳清蛋白)和表面活性剂(0.4wt％黄原胶)，然后使用KitchenAid浸入式搅拌器(10,000rpm)60秒通过涡流引入空气，从接种的MK102生长培养基制备200mL协同凝胶化的AMC。然后将AMC施加于由支架支撑的2mm x2mm疏水性聚烯烃网的表面；由于AMC的高粘度，可以将AMC散布在网表面而不会排水或滴落。然后将网置于27℃的培养箱中72小时，然后从网的顶部和底部表面收获真菌生物质。图6A和图6B分别是收获前的网状基质的俯视图和仰视图，图7显示了收获后的网状基质。

该测试产生了26.556g的总真菌生物量，其中从网状基质的顶部和底部表面收获的真菌生物质的质量大致相等。如图6A和图6B所示，两种垫基本相同，尽管下方垫的水分含量略高(可能是由于重力)。蒸煮45分钟后，处理后的生物质外观和气味与常规表面发酵产生的真菌生物质没有明显区别。因此，该实施例说明，与需要常规容器(盘、板、托盘等)的常规发酵培养基不同，本发明的AMC可用于在表面(包括多孔表面)上培养丝状真菌，而没有AMC的流动或排出。

实施例5

该实施例说明了各种表面活性剂、增稠剂或稳定剂、碳源和生长培养基盐对真菌生长的影响。

将MK102生长培养基倒入几个5x7玻璃托盘中的每一个中并曝气以产生AMC。在一些样品中添加或改性了各种额外的树胶产品、乳化剂、碳源等，如下表4所示。每种培养基中的碳源含量为10wt％。然后用真菌接种物对每种AMC进行接种并使之孵育70小时。表4显示了从每种AMC产生的真菌的产量和pH值，以及生物质的颜色和气味是否可接受(即与表面发酵足够相似)的主观二元指示。除非另有说明，否则每个托盘中的培养基体积为200mL。

表4

说明：NX200，CX90＝黄原胶(0.4wt％)

LBG＝刺槐豆胶(0.4wt％)

WPI＝乳清蛋白分离物(0.2wt％)

GS＝甘油硬脂酸酯(AKA甘油单硬脂酸酯)(0.2wt％)

.5G.5M＝MK102培养基中50％的甘油替换为麦芽提取物

Y-M+＝MK102培养基中的酵母提取物替换为麦芽提取物

.25V＝1/4体积(50mL)

.5V＝1/2体积(100mL)

实施例6

该实施例说明了各种表面活性剂、增稠剂或稳定剂、碳源和生长培养基盐对真菌生长的影响。

重复实施例5的程序，但进行以下修改。实施例6中使用的培养基都不包括硝酸盐；相反，典型的MK102生长培养基中的硝酸铵由等摩尔浓度的氯化铵代替。所有培养基配方均含有0.4wt％NX200黄原胶，但标注为“对照”的配方除外。表5中给出的所有结果都是两次测试运行的平均值，但标有上标“1”(一次测试运行)或“3”(三次测试运行，一次未导致垫生长)的条目除外。

表5

实施例7

该实施例说明了各种表面活性剂、增稠剂或稳定剂、碳源和生长培养基盐对真菌生长的影响。

重复实施例5的程序，但进行以下修改。总孵育时间修改为48、68或72小时，如表6所示。测试运行的碳源是100％果糖(M1和M2)、50％果糖/50％甘油(M3和M4)或100％甘油(M5和M6)。在实施例7中使用的培养基中，典型MK102生长培养基的硝酸铵由硝酸钾以二分之一(M1、M3、M5)或相等(M2、M4、M6)摩尔浓度代替。在每个测试托盘中使用100mL生长培养基。从这些测试中获得的真菌生物量的各种参数在表6中给出；给出的不含甘油单硬脂酸酯添加剂的培养基的结果是两次测试运行的平均值(培养基M2除外)，而给出的培养基M2和含有甘油单硬脂酸酯添加剂的培养基的结果是单次测试运行的结果。

表6

如表5所示，不含甘油单硬脂酸酯添加剂的培养物M2在72小时产生最高产量，而不含甘油单硬脂酸酯添加剂的培养物M2在48小时的表现优于对照培养物的72小时。

实施例8

该实施例说明了使用AMC过程和常规液体表面发酵(LSF)过程制备真菌生物垫的过程。

下表7中定义的M2培养基的所有组分(基于120升总培养基)，除了果糖，以足以提供80升培养基的量添加到煮器制造机中，并将培养基煮沸。将10升沸腾培养基泵入八个单独的罐中。以不同的量将果糖添加到这些单独的罐的每一个中，以提供含有四种果糖浓度(7.5％、10％、15％和20％w/v，分别对应于培养基中的碳氮摩尔比8.24、10.99、16.48和21.98)中的每种的两个罐。间歇搅拌每罐培养基，直至果糖完全溶解，然后盖上盖子并用保鲜膜密封。使每个罐冷却过夜至室温。第二天，用磷酸将每个罐中培养基的pH值调节至pH3.5。然后将真菌接种物以5％v/v的量添加到每个罐中。使用高速分散器(HSD)以5,000rpm的转速混合每个果糖浓度的一罐，在混合过程中加入0.4％w/v的黄原胶。从八个培养基罐的每一个中，将2升培养基倒入表面积为0.25m²的五个单独的平托盘的每一个中。然后将这40个托盘放在保持在31℃温度和88％相对湿度的箱中的架子上，使真菌生物在这些条件下生长96小时。

表7

实施例9

该实施例说明了AMC和常规LSF培养基中碳浓度和/或碳氮比对原始生物垫厚度的影响。

将实施例8中产生的生物垫从托盘中取出。在三个单独的点测量每个垫的厚度：垫的边缘、垫的中心和垫的非中心内部。这为八种培养基类型中的每一种产生了总共十五个原始垫厚度测量值，即总共120个厚度测量值。这些原始垫厚度测量的结果如图8所示。

如图8所示，在AMC上生长的样品显示出厚度随着果糖(即碳)浓度的增加而增加的趋势。随着果糖浓度从7.5％增加到10％，在LSF培养基上生长的样品显示出厚度增加，但随后随着果糖浓度的增加厚度减少，使得在最高(20％)果糖浓度下观察到最低厚度。

实施例10

该实施例说明了在AMC和常规LSF培养基中碳浓度和/或碳氮比对面积产量和生物垫密度的影响。

使用刀将实施例8中产生的40个生物垫中的每一个切成四等份，对于八种不同培养基类型中的每一种产生共计20个垫试样；每种培养基类型的这20个试样中，随机选择两个试样放入冷冻袋中冷冻以供后续显微镜检查，而其余18个试样在水中煮沸30分钟，然后在70℃的去离子水中浸泡，间歇搅拌额外的30分钟。在每种培养基类型的18个煮沸试样中，将四个在160°F下脱水23小时，然后称重。图9显示了每种培养基类型的这四个试样的平均面积产量(即每发酵托盘面积的生物垫干质量)，图10显示了这些试样的平均干密度。

如图9所示，在AMC上生长的生物垫与在常规LSF培养基上生长的生物垫之间的面积产量存在显著差异。最引人注目的是，在所有果糖浓度下，尤其是高于7.5％的果糖浓度下，在AMC上生长的生物垫的面积产量显著高于在LSF培养基上生长的生物垫。此外，虽然LSF垫在果糖浓度方面没有可辨别的产量趋势(表明碳浓度和/或碳氮比以外的条件对LSF过程的面积产量起着更大的作用)，但对于AMC垫来说存在明显的趋势，其产量随着果糖浓度增加到最高约15％而增加，然后随着果糖浓度进一步增加到20％而略有下降。这一发现表明，与原始垫厚度类似，通过控制生长培养基的碳浓度和/或碳氮比，可以有效地控制面积产量。这些趋势在图10中进一步说明，其中AMC垫和LSF垫的密度似乎不会随着果糖浓度而可预测地增加或减少，尽管有趣的是，无论存在什么趋势，其对于AMC垫和LSF垫似乎都是相同的。

实施例11

该实施例说明了碳浓度和/或碳氮比对煮沸的AMC和LSF生长的生物垫的抗张强度和断裂应变的影响。

在实施例10中产生的每种培养基类型的18个煮沸试样中，将四个切成小块以测试它们的机械性能，特别是它们的抗张强度和断裂应变。每种培养基类型的这四个试样的平均抗张强度如图11所示，这些试样的平均断裂应变如图12所示。

如图11所示，在AMC上生长的生物垫显示出抗张强度随着果糖(即碳)浓度的增加而增加的趋势，而使用LSF培养基生长的生物垫具有基本独立于果糖浓度的一致抗张强度。由于这些趋势，在低果糖浓度下，在AMC上生长的垫的抗张强度通常低于在LSF培养基上生长的垫，但随着果糖浓度的增加，这种差异会缩小，并且在果糖浓度最高时，在AMC上生长的垫的抗张强度超过了在LSF培养基上生长的垫。这再次表明，通过控制其上生长生物垫的AMC中的碳浓度和/或碳氮比，可以有效地控制真菌生物垫的机械和材料性能。

如图12所示，对于AMC生长或LSF生长的生物垫，断裂应变没有作为果糖浓度的函数的明显趋势。然而，有趣的是，在所有果糖浓度下，AMC生长的和LSF生长的生物垫的断裂应变似乎在很大程度上具有可比性。此外，不希望受任何特定理论的限制，两种类型的生物垫在最低果糖浓度(7.5％)时具有最低的断裂应变，但在次低浓度(10％)时具有最高的断裂应变的这一事实，可能通过主要碳源耗尽导致的细胞结构自溶现象解释；在非常低的碳浓度和/或碳氮比下，这种自溶可能足够显著以导致整体降解并因此导致整个垫的削弱，而在略高的果糖浓度下略低程度的自溶可能仅提供足够的自溶以允许真菌细丝在应变下更自由地移动，而不会损害结构到导致材料完全失效的程度。

实施例12

该实施例说明了碳浓度和/或碳氮比对AMC生长的和LSF生长的真菌生物垫的营养含量的影响。

在实施例10中产生的每种培养基类型的18个煮沸试样中，将两个切成小块并冷冻在50mL锥形管中用于组成分析(蛋白质、水分、脂肪、灰分和碳水化合物)。这些样品中灰分(燃烧后)、碳水化合物、粗脂肪和蛋白质的平均含量分别如图13A至图13D所示。

如图13A至图13D所示，AMC生长的和LSF生长的生物垫的营养成分通常遵循相似的趋势。对于这两种类型的垫，观察到随着果糖(即碳)浓度的增加，灰分、脂肪和蛋白质含量普遍下降，除了在果糖浓度最高(15％到20％)时灰分可能略有增加，而对于AMC生长的垫脂肪可能略有增加。在碳水化合物含量方面观察到相反的趋势，其在AMC和LSF生长的垫中都随着果糖浓度的增加显著增加。不希望受任何特定理论的限制，本发明人相信碳水化合物含量的这种增加是在实施例11中AMC生长的垫中观察到的抗张强度随着果糖浓度增加而呈正趋势的原因，尽管还不清楚为什么对于LSF生长的垫没有也观察到这种相同的趋势。

此外，不希望受任何特定理论的限制，据信本实施例中使用的垫的沸腾解释了AMC和LSF生长的垫的蛋白质含量非常相似，这与在实施例3中观察到的显著差异相反。具体而言，在测定之前将垫煮沸可能会导致AMC生长的垫中的大部分额外蛋白质被洗掉或以其他方式损失到用于煮沸的水中。

实施例13

该实施例说明了使用各种曝气和混合技术和装置制备用于真菌生物垫生长的AMC的过程。

根据实施例8中描述的程序产生生物垫，除了每批生长培养基中果糖的量为15％w/v并且所有批次都进行曝气并与0.4％w/v黄原胶混合以产生AMC；在本实施例中，区分各种AMC的变量是用于对发酵培养基曝气以产生AMC的混合装置。具体来说，使用了三种不同的混合装置：5,000rpm的高速分散器(HSD)、10,000rpm的高剪切混合器(HSM)和具有以10分之9的速度设置的搅拌器附件的KitchenAid厨房混合器。由于混合容器的体积有限，使用厨房混合器制造的AMC以较小批量(2升或更少)制备。

实施例14

该实施例说明了用于制备在其上生长生物垫的AMC的混合技术和装置对原始生物垫厚度以及生物垫面积产量和密度的影响。

根据实施例9中描述的程序测量实施例13中产生的生物垫的厚度，并且根据实施例10中描述的程序测量垫的面积产量和密度。原始垫厚度测量的结果如图14所示，面积产量和密度测量的结果分别如图15A和图15B所示。

如图14所示，在本实施例中制备的所有垫样品的厚度基本相似。在HSD AMC上生长的垫和在HSM AMC上生长的垫之间可以观察到厚度的仅有的统计学上显著性的差异；HSDAMC产生最厚的垫，而HSM AMC产生最薄的垫。所有样品具有在统计上相似的面积产量和质量密度。不希望受任何特定理论的限制，据信用于对发酵培养基曝气以产生AMC的装置或技术对于所得生物垫的厚度、产量或密度不如培养基自身支持液-气界面上的生物垫的能力重要。

实施例15

该实施例说明了用于制备真菌生物垫在其上生长的AMC的混合技术/装置对所得煮沸生物垫的抗张强度和断裂应变的影响。

根据实施例11中描述的程序测量实施例13中产生的生物垫的抗张强度和断裂应变。测试垫的平均抗张强度如图16所示，这些试样的平均断裂应变如图17所示。

如图16和图17所示，由三种类型的AMC(HSD、具有搅拌器附件的厨房混合器、和HSM)中的每一种产生的垫在其材料和机械性能上大体相似。然而，在比较这两个图时可以观察到一个显著的关系：对于任何特定的混合技术/装置，抗张强度和断裂应变之间通常存在反比关系；由HSM AMC产生的垫的断裂应变最高，但抗张强度最低，而由HSD AMC产生的垫的抗张强度最高，但断裂应变最低。

实施例16

该实施例说明了使用各种稳定剂、表面活性剂和增稠剂制备用于真菌生物垫生长的AMC的过程。

根据实施例8中描述的程序产生生物垫，除了每批生长培养基中果糖的量为15％w/v并且所有批次都使用高剪切混合器以10,000rpm曝气；在本实施例中，区分各种AMC的变量是在曝气过程中混合形成AMC的树胶或其他增稠剂或稳定剂。具体而言，制备了六种AMC，分别含有作为稳定剂/增稠剂的0.4％w/v黄原胶、1.5％w/v羧甲基纤维素(CMC)、1％w/v魔芋根、1.5％w/v瓜尔胶、1.5％w/v阿拉伯树胶和1％w/v刺云实胶。

对六种类型的AMC及其上产生的生物垫的定性评估显示出显著差异。0.4％w/v黄原胶的增稠剂形成中等粘度的液体，在曝气后形成高度稳定的AMC，并具有大体积分数的截留空气。1.5％w/v CMC的增稠剂仅在发酵培养基表面形成半稳定的泡沫(即在大部分液体培养基中没有截留空气)；生物垫在这种基质上生长不均匀且很薄。1％w/v魔芋根的增稠剂相对于CMC在液体培养基中形成更稳定的泡沫至更深的深度，但泡沫的形成仍然不完全，并且魔芋的缓慢溶解导致基质的低粘度，产生不一致的生物垫(并且在两个托盘中，根本无法生长任何生物垫)。1.5％w/v瓜尔胶的增稠剂起初溶解缓慢，导致最初的低粘度基质增稠至接近凝胶状；在这种基质上生长的生物垫始终很厚且相对干燥，并且具有很高的抗弯刚度。1.5％w/v阿拉伯树胶的增稠剂未能产生稳定的泡沫；在使用该AMC的四个托盘中，两个没有产生生物垫，另外两个只产生非常薄的垫。1％w/v刺云实胶的增稠剂形成了高粘性和稳定的AMC，其始终能产生非常厚的垫，具有特别轻且“蓬松”的真菌菌丝。

实施例17

该实施例说明了用于制备在其上生长生物垫的AMC的增稠剂对原始生物垫厚度以及生物垫面积产量和密度的影响。

根据实施例9中描述的程序测量实施例16中产生的生物垫的厚度，并且根据实施例10中描述的程序测量垫的面积产量和密度。原始垫厚度测量的结果如图18所示，面积产量和密度测量的结果分别如图19A和图19B所示。

如图18所示，生物垫的厚度受到用于产生在其上生长生物垫的AMC的增稠剂的极大影响。从含有黄原胶、瓜尔胶或刺云实胶的AMC中获得高厚度垫，所有这些都是中等或高粘度的AMC；不希望受任何特定理论的限制，假设当真菌被物理支撑在空气-培养基界面上时最有效地促进真菌生物垫的生长。如图19A所示，面积产量遵循与垫厚度相似的趋势。如图19B所示，垫的密度通常相当稳定并且与所使用的增稠剂无关，除了在刺云实胶AMC上生长的垫，其密度明显低于在其他AMC上生长的垫。

实施例18

该实施例说明了用于制备真菌生物垫在其上生长的AMC的增稠剂对所得煮沸生物垫的抗张强度和断裂应变的影响。

根据实施例11中描述的程序测量实施例16中产生的生物垫的抗张强度和断裂应变。测试垫的平均抗张强度如图20所示，这些试样的平均断裂应变如图21所示。

如图20所示，煮沸的生物垫的抗张强度在所有使用的增稠剂中都相当一致。这方面的两个异常值是在瓜尔胶AMC上生长的垫，其抗张强度明显低于其他垫，以及在阿拉伯树胶AMC上生长的垫，其抗张强度明显高于其他垫；不希望受任何特定理论的限制，假设后者相对高的抗张强度是由于这些垫较薄。还观察到，除了具有较低的抗张强度外，在瓜尔胶AMC上产生的垫主观上比其他垫更脆，这可能是由于在垫生长过程中干燥得更多。如图21所示，所有使用的增稠剂的断裂应变也相当一致，但可以观察到垫密度和断裂应变之间存在负相关；不希望受任何特定理论的限制，据信密度较低的垫具有较大的内部空隙空间，因此真菌细丝之间的缠绕或互连程度较低，当应力施加时允许菌丝相对于彼此进行更大的运动。

实施例19

该实施例说明了用于制备真菌生物垫在其上生长的AMC的增稠剂对所得煮沸生物垫的抗张强度和断裂应变的影响，特别是组合的黄原胶/CMC增稠剂相对于单独的黄原胶的影响。

根据实施例8中描述的程序产生生物垫，不同的是每批生长培养基中果糖的量为15％w/v并且所有批次均使用高速分散器以5,000rpm曝气；在本实施例中，区分AMC的变量是一半AMC样品(18个中的九个)仅含有0.4％w/v黄原胶，而另一半同时含有0.4％w/v黄原胶和0.5％w/v CMC(均在曝气/混合过程中添加直至完全溶解)。据观察，与单独使用黄原胶相比，添加CMC和黄原胶导致AMC更粘稠。

根据实施例11中描述的程序测量所产生的生物垫的抗张强度和断裂应变。结果在表8中给出。

表8

如表8中给出的结果所示，在黄原胶之外添加CMC导致生物垫强度的提高(断裂应变平均提高116％，抗张强度平均提高19％)。这允许更强力或能量密集的后处理步骤，例如将生物垫转化为纺织品或结构材料，而不会有生物垫破损、破裂或撕裂的风险。

实施例20

该实施例说明了在AMC上生长的生物垫与在常规液体表面发酵培养基上生长的生物垫之间的显著形态差异。

对在实施例8的15wt％果糖培养基(AMC和LSF)上生长的垫的5μm横截面进行获取并染色，然后通过可见光显微镜检查以检查这些样品之间的形态结构差异。在LSF培养基上生长的垫的显微照片显示在图22A到图22D中，而在AMC培养基上生长的垫的显微照片显示在图23A到图23D中。

图22A到图23D的显微照片的比较揭示了所获得的垫的形态存在一些显著且重要的差异。在常规LSF培养基上生长的垫具有更均匀的形态，其中从培养基侧(图22B和图22A的顶部)到菌丝侧(图22D和图22A的底部)的细丝密度逐渐降低。相比之下，在AMC上生长的垫显示出三个非常清晰可见的形态层：培养基侧的非常致密的细丝层(图23B和图23A的顶部)，菌丝侧的密度稍低的层(图23D和图23A的底部)，以及在垫内部的这些层之间，相对稀疏的细丝生长和显著的空隙空间的层(图23C和图23A的中间)。

不希望受任何特定理论的限制，据信根据本发明在AMC上生长的生物垫的分层形态可以赋予若干优点，因为不同形态的层具有不同的性质。作为第一个非限制性实例，在收获生物垫之后，可以“刮除”或以其他方式选择性地从生物垫去除或分离一层或多层，例如如图23B所示的致密培养基侧层，从而从单次生物垫生产运行中获得两种或更多种具有不同形态的真菌材料，适合生产两种或更多种不同的产品(例如具有不同营养成分的食品、具有不同质地特性的食品或纺织品、具有不同机械性能的结构材料或纺织品、或这些的组合)。作为第二个非限制性实例，垫内部细丝的相对缺乏可以降低细丝相互缠绕的程度，从而允许生物垫的细丝或层相对于彼此更大程度的运动，这反过来又可以改善整个生物垫的机械特性(例如抗张强度或断裂应变)。

实施例21

该实施例说明了AMC的稳定剂含量对AMC的溢出和排水速率的影响，以及进而这些参数对生物垫产量的影响。

制备了四个基于果糖的发酵培养基样品并曝气以形成AMC；除了向每个样品中添加不同量的黄原胶以稳定AMC之外，这些样品是相同的。每个AMC的pH值调整为3.25。曝气前每个培养基的密度测量为1.174g/mL，在AMC制备后立即通过测量AMC的密度并将其与原始发酵培养基的密度进行比较测量溢出量(即AMC的体积相对于所用发酵培养基的体积的增加)。在AMC制备后一小时记录排水速率(即每单位时间在泡沫下生成的游离液体的体积)。AMC的粘度是在AMC制备后两小时在25℃下测量的。随后，将1750g的每个培养基样品接种丝状真菌接种物，并在27℃和85％相对湿度下孵育72小时，并记录所得生物垫的产量。结果在表9中给出。

表9

如表9所示，增加AMC中的稳定剂含量会导致排水速率降低(即泡沫稳定性增加)和粘度降低。继而，AMC的这些材料特性与所产生的干生物垫的面积产量的增加密切相关。

此处示例性公开的本发明可以在不存在此处未具体公开的任何要素的情况下实施。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明的许多改变、变化、修改、其他用途和应用是可能的，并且不背离本发明的精神和范围的改变、变化、修改、其他用途和应用也被认为由本发明所涵盖，本发明仅受所附权利要求的限制。

出于说明和描述的目的，提出了本发明的前述讨论。前述内容并非旨在将本发明限制于本文所公开的一种或多种形式。例如，在本发明的前述详细描述中，本发明的各种特征在一个或多个实施方案中组合在一起，以简化公开内容。本发明的实施方案的特征可以在除上述讨论的那些之外的替代实施方案中组合。这种公开方法不应被解释为反映了要求保护的发明需要比每个权利要求中所明确列举的更多特征的意图。相反，如以下权利要求所反映的，创造性方面不在于单个前述公开的实施方案的所有特征。因此，以下权利要求在此并入本发明的详细描述中，每个权利要求作为本发明的单独优选实施方案独立存在。

此外，虽然本发明的描述已经包括一个或多个实施方案的描述以及某些变化和修改，但是其他变化、组合和修改也在本发明的范围内，例如在理解本公开之后，可能在本领域技术人员的技能和知识范围内。旨在获得包括在允许范围内的替代实施方案的权利，包括替代的、可互换的和/或等同于要求保护的结构、功能、范围或步骤的那些，无论这种替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤是否在本文公开，并且不打算公开提供任何可授权的主题。

Claims (29)

1.用于在发酵培养基中培养丝状真菌的方法，其包括：

(a)对所述发酵培养基曝气以提供空气-培养基胶体(AMC)；和

(b)在所述AMC中或所述AMC上培养所述丝状真菌以形成所述丝状真菌的生物质。

2.权利要求1的方法，其中所述AMC包含所述丝状真菌的接种物。

3.权利要求1的方法，其进一步包括用所述丝状真菌的接种物接种所述AMC。

4.权利要求1的方法，其中所述AMC包含稳定剂。

5.权利要求4的方法，其中所述稳定剂选自下组：多糖胶、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、鲸蜡硬脂醇聚醚20、纤维素、二乙酰酒石酸甘油单酯和甘油二酯(DATEM)、甘油二酯、乳化蜡、甘油单硬脂酸酯、卵磷脂、甘油单酯、芥末、非离子表面活性剂、肥皂、磷酸钠、硬脂酰乳酸钠、两性离子表面活性剂、皂苷、淀粉、变性淀粉、植物蛋白表面活性剂、动物蛋白表面活性剂、微粒、二氧化硅及它们的组合和混合物。

6.权利要求5的方法，其中所述稳定剂包含黄原胶。

7.权利要求4的方法，其中所述AMC中的所述发酵培养基与所述稳定剂的质量比在约100:1和约1,000:1之间。

8.权利要求1的方法，其中所述AMC中空气的体积分数在约0.05和约0.95之间、在约0.1和约0.9之间、在约0.2和约0.8之间、在约0.3和约0.7之间、在约0.4和约0.6之间或约0.5。

9.权利要求1的方法，其中所述AMC是在至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天或至少约30天内稳定的泡沫。

10.权利要求1的方法，其中所述丝状真菌属于选自下组的目：黑粉菌目(Ustilaginales)、红菇目(Russulales)、多孔菌目(Polyporales)、伞菌目(Agaricales)、盘菌目(Pezizales)和肉座菌目(Hypocreales)。

11.权利要求1的方法，其中所述丝状真菌属于选自下组的科：黑粉菌科(Ustilaginaceae)、猴头菌科(Hericiaceae)、多孔菌科(Polyporaceae)、灰树花孔菌科(Grifolaceae)、离褶伞科(Lyophyllaceae)、球盖菇科(Strophariaceae)、马勃科(Lycoperdaceae)、伞菌科(Agaricaceae)、侧耳科(Pleurotaceae)、膨瑚菌科(Physalacriaceae)、小皮伞科(Omphalotaceae)、块菌科(Tuberaceae)、羊肚菌科(Morchellaceae)、绣球菌科(Sparassidaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)和虫草菌科(Cordycipitaceae)。

12.权利要求1的方法，其中所述丝状真菌属于选自下组的物种：茭白黑粉菌(Ustilagoesculenta)、猴头菌(Hericulum erinaceus)、宽鳞多孔菌(Polyporous squamosus)、灰树花(Grifola fondosa)、斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)、榆干玉蕈(Hypsizygusulmarius)、香杏丽蘑(Calocybe gambosa)、光帽鳞伞(Pholiota nameko)、大秃马勃(Calvatia gigantea)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、皱环球盖菇(Strophariarugosoannulata)、砖红垂幕菇(Hypholoma lateritium)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、侧耳(Pleurotus ostreatus)、白松露(Tuber borchii)、羊肚菌(Morchella esculenta)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)、梯棱羊肚菌(Morchella importuna)、绣球菌(Sparassiscrispa)、丝状镰刀菌(Fusarium venenatum)、MK7 ATCC登记保藏号PTA-10698、肋状皱盘菌(Disciotis venosa)和蛹虫草(Cordyceps militaris)。

13.权利要求1的方法，其进一步包括，在步骤(b)之前或期间，将食品级或食品安全添加剂添加到所述AMC中。

14.丝状真菌生物垫，其通过权利要求1的方法产生。

15.权利要求14的生物垫，其包含稳定剂。

16.权利要求14的生物垫，其包含食品级或食品安全添加剂。

17.权利要求14的生物垫，其具有以下特性中的至少一种：

(a)至少约1.75mm的厚度；

(b)每平方米所述AMC顶表面积至少约295克的质量；

(c)至少约0.20g/cm³的干密度；

(d)至少约255kPa的抗张强度；

(e)干燥时至少约47wt％的碳水化合物含量。

18.食品，其包含权利要求14的生物垫的至少一部分。

19.结构材料，其包含权利要求14的生物垫的至少一部分。

20.纺织材料，其包含权利要求14的生物垫的至少一部分。

21.丝状真菌生物垫，其具有以下特性中的至少一种：

(a)至少约1mm的厚度；

(b)上面培养所述丝状真菌生物垫的生长培养基的每平方米顶表面积至少约295克的质量；

(c)至少约0.20g/cm³的干密度；

(d)至少约255kPa的抗张强度；和

(e)干燥时至少约47wt％的碳水化合物含量。

22.权利要求21的生物垫，其包含稳定剂。

23.权利要求21的生物垫，其包含食品级或食品安全添加剂。

24.权利要求21的生物垫，其通过权利要求1的方法产生。

25.食品，其包含权利要求21的生物垫的至少一部分。

26.结构材料，其包含权利要求21的生物垫的至少一部分。

27.纺织材料，其包含权利要求21的生物垫的至少一部分。

28.空气培养基胶体(AMC)，其包含：

发酵培养基；和

空气，其胶状地分散在整个所述发酵培养基中。

29.权利要求28的AMC，其进一步包含稳定剂。

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