CN101973990B - 一种应用pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱的方法：（1）氯仿、甲醇、水充分振摇后静置分层，取上相加入终浓度为10～20mM的无机酸作为固定相，下相加入终浓度为10～20mM的碱作为流动相；（2）取元胡的乙醇粗提物用固定相或者固定相和未碱化下相的混合溶液溶解制成样品溶液；（3）取固定相注满逆流色谱仪的分离柱，注入样品溶液，使分离柱正转，在750～850r/min转速下，以1.5～2.5ml/min的流速持续注入流动相，收集洗脱液，薄层层析和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值及保留时间相同且纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱。本发明工艺简单，回收率高，分离得到的去氢紫堇碱纯度高，对元胡药材的充分利用有重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及应用pH-区带精制逆流色谱从元胡粗提物中分离高纯度去氢紫堇碱的方法。
背景技术
元胡为罂粟科(Popaveraceae)植物延胡索的干燥块茎,是浙八味中的一种。在传统中国医药中，延胡索被认为可活血，行气和减轻所有类型的疼痛。元胡的主要活性成分为生物碱，去氢紫堇碱为元胡季铵碱中的一种，现代药理研究表明，去氢紫堇碱可以提高小鼠的耐缺氧能力，改善微循环，治疗心肌缺血，另有研究表明，去氢紫堇碱还可用于治疗溃疡和冠心病。
目前，去氢紫堇碱的分离主要有柱层析（张晓丽，曲扬，侯家鸣，等. 延胡索的化学成分[J]，沈阳药科大学学报， 2008，25(7)：537-540），但分离效率低且有死吸附；也有用制备型高效液相色谱进行分离（杨杰，白雪，肖海涛，等. 延胡索中去氢紫堇碱对照品的制备及含量测定[J]，时珍国医国药，2009，20(4)：1000-1002），但上样量小且有死吸附；另外还有应用标准高速逆流色谱进行分离（S. Q. Tong, J. Z, Yan, J. Z, Lou. J. Liq. Chromatogr. & Related Tech. 2005, 28 (18): 2979-2989），但上样量太小。pH-区带精制逆流色谱（pH-zone-refining counter-current chromatography）是在标准高速逆流色谱基础上发展起来的特殊逆流色谱分离制备技术，与标准高速逆流色谱相比，其突出的特点是在固定相中加入了保留酸（或碱），在流动相中加入了洗脱碱（或酸），样品中各组分依据其酸碱性及疏水性的不同而实现分离，目标组分以矩形峰被洗脱出来，而杂质则被富集在矩形峰边缘，并且不同组分被洗脱出来伴随着pH值的变化。pH-区带精制逆流色谱继承了标准高速逆流色谱高效，对固定相无污染，样品回收率高等优点，同时具有分离容量大、组分被高度浓缩等优点。目前，pH-区带精制逆流色谱已广泛的用于生物碱、肽类及其衍生物、异构体等的分离。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱的方法，该方法工艺简单，分离效率高。
本发明采用的技术方案如下：
一种应用pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱的方法，所述的方法包括以下步骤：
（1）在分液漏斗中分别加入氯仿、甲醇、水以体积比为1.5～3:1～1.5:1组成的溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相加入终浓度为10～20mM（优选10mM）的无机酸作为固定相，下相加入终浓度为10～20mM（优选10mM）的碱作为流动相；
（2）取元胡的乙醇粗提物用固定相溶解，所述的固定相加入量为25～60ml/g元胡的乙醇粗提物，溶解后制得样品溶液；
（3）取固定相注满逆流色谱仪的分离柱，随后注入样品溶液，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，在750～850r/min转速下，以1.5～2.5ml/min的流速持续注入流动相，以波长190～400nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集；
（4）将步骤（3）中收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱。
所述步骤（3）中，所述样品溶液的进样的体积通常小于分离柱柱体积的30%。
所述步骤（2）中，元胡的乙醇粗提物还可以用固定相和未碱化的下相溶解，所述的方法包括以下步骤：
（1）在分液漏斗中分别加入氯仿、甲醇、水以体积比为1.5～3:1～1.5:1组成的溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相加入终浓度为10～20mM的无机酸作为固定相，下相加入终浓度为10～20mM的碱作为流动相；
（2）取元胡的乙醇粗提物用固定相和未碱化的下相溶解，所述的固定相加入量为25～60ml/g元胡的乙醇粗提物，所述的未碱化的下相加入量为0～50ml/g元胡的乙醇粗提物，溶解后制得样品溶液； 0是指未碱化的下相的加入量无限接近于0但不为0；
（3）取固定相注满逆流色谱仪的分离柱，随后注入样品溶液，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，在750～850r/min转速下，以1.5～2.5ml/min的流速持续注入流动相，以波长190～400nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集；
（4）将步骤（3）中收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱。
所述的元胡的乙醇粗提物按如下方法制得：取元胡药材粉碎，用60～98%乙醇回流提取1～5次，合并各次的提取液，抽滤后滤液减压浓缩至浸膏状，用酸溶液捏溶至捏溶液pH值为2～3，静置10～30小时，取上清液过滤除去沉淀；滤液用氯仿萃取1～5次，收集合并氯仿层，合并的氯仿层用质量浓度为1～3%氢氧化钠溶液萃取，取氯仿层旋转蒸发回收氯仿，得元胡的乙醇粗提物。所述的酸溶液为质量浓度为1～2%的盐酸水溶液或1～2%的硫酸水溶液。所述乙醇的体积用量通常以元胡药材的质量计为10～20L/kg。
本发明所述步骤（1）中所述的溶剂体系中氯仿、甲醇和水的体积比优选为2:1:1。
本发明所述步骤（1）中，所述的无机酸优选为盐酸或硫酸，最优选盐酸。
所述步骤（1）中，所述的碱优选为三乙胺或二乙胺，最优选为三乙胺。
所述步骤（3）中，所述注入样品溶液可以通过进样圈注入样品溶液或通过泵泵入样品溶液。
所述步骤（4）中，所述的高效液相色谱的检测条件为：YMC ODS C18 column (4.6×250mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠水溶液（32:68，v/v），等度洗脱；流速：0.6ml/min；检测波长：345nm；进样量：20μl。
所述步骤（3）和（4）中，所述薄层层析的展开剂为氯仿、甲醇以体积比8:1混合的溶剂。
本发明实施例中采用半制备型逆流色谱仪（分离柱的柱体积为250ml），逆流色谱仪由恒流泵、主机（分离柱）、紫外检测器、记录仪等组成。
所述步骤（3）中，所述转速优选810r/min，流动相流速优选为2ml/min。
本发明的有益效果在于：通过pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱，工艺简单，回收率高，分离得到的去氢紫堇碱纯度高，对元胡药材的充分利用有重要作用。
具体实施方式
下面以具体实施例来对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
取元胡药材1500g粉碎后用22.5L的70%乙醇回流提取30分钟，按同样方法提取3次，合并3次的提取液，抽滤后滤液减压浓缩至浸膏状，用2%盐酸溶液捏溶至捏溶液pH值为3，静置15h，抽滤，滤液用4×400mL氯仿萃取，合并氯仿层并用2%氢氧化钠溶液萃取，取氯仿层，用旋转蒸发仪回收氯仿，得元胡粗提物10.440g。
将氯仿、甲醇和水按照体积比2:1:1配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相加入盐酸，使盐酸的终浓度为10mM作为固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的终浓度为10mM作为流动相；称取元胡粗提物208mg，用8ml固定相和8ml未碱化的下相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对元胡粗提物进行分离，分离柱的柱体积为250ml。首先将固定相以30ml/min的流速注满分离柱，然后将上述样品溶液通过进样圈注入分离柱，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为810r/min，设置流动相的流速为2ml/min，开始泵入流动相，以波长254nm的紫外检测器检测，通过色谱工作站记录色谱图并用自动部分收集器按5分钟/试管的速度接收洗脱液，用薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集。
收集得到的洗脱液通过薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值（Rf= 0.5）及保留时间（20.4min）相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到22mg去氢紫堇碱，纯度为98%，回收率为87%。
高效液相条件：YMC ODS C18柱（4.6×250mm）；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠（32:68，v/v），等度洗脱；流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长：345nm；进样量：20μl。
实施例2
取元胡药材2800g粉碎后用42L的80%乙醇回流提取60分钟，按同样方法提取3次，合并3次的提取液，抽滤后减压浓缩至浸膏状，用2%盐酸溶液捏溶至捏溶液pH值为3，静置20h，抽滤，滤液用4×800mL氯仿萃取，合并氯仿层并用2%氢氧化钠溶液萃取，取氯仿层，用旋转蒸发仪回收氯仿，得元胡粗提物17.1g。
将氯仿、甲醇和水按照体积比1.5:1.5:1配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相加入盐酸，使盐酸的终浓度为10mM作为固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的终浓度为10mM作为流动相；称取元胡粗提物205mg，用8ml固定相和8ml未碱化的下相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对元胡粗提物进行分离，分离柱的柱体积为250ml。首先将固定相以30ml/min的流速注满分离柱，然后将上述样品溶液通过进样圈注入分离柱，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为800r/min，设置流动相的流速为2ml/min，开始泵入流动相，以波长254nm的紫外检测器检测，通过色谱工作站记录色谱图并用自动部分收集器按5分钟/试管的速度接收洗脱液，用薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集。
收集得到的洗脱液通过薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值（Rf= 0.5）及保留时间（20.4min）相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到11mg去氢紫堇碱，纯度为97.4%，回收率为58.1%。
高效液相条件：YMC ODS C18柱（4.6×250mm）；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠（32:68，v/v），等度洗脱；流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长：345nm；进样量：20μl。
实施例 3
将氯仿、甲醇和水按照体积比3:1.5:1配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相加入盐酸，使盐酸的终浓度为10mM作为固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的终浓度为10mM作为流动相；称取实施例2中提取得到的元胡粗提物205mg，用8ml固定相和8ml未碱化的下相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对元胡粗提物进行分离，分离柱的柱体积为250ml。首先将固定相以30ml/min的流速注满分离柱，然后将上述样品溶液通过进样圈注入分离柱，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为810r/min，设置流动相的流速为2ml/min，开始泵入流动相，以波长254nm的紫外检测器检测，通过色谱工作站记录色谱图并用自动部分收集器按5分钟/试管的速度接收洗脱液，用薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集。
收集得到的洗脱液通过薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值（Rf= 0.5）及保留时间（20.4min）相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到15mg去氢紫堇碱，纯度为98.1%，回收率为79.8%。
高效液相条件：YMC ODS C18柱（4.6×250mm）；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠（32:68，v/v），等度洗脱；流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长：345nm；进样量：20μl。
实施例4
将氯仿、甲醇和水按照体积比3:1:1配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相加入盐酸，使盐酸的终浓度为10mM作为固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的终浓度为10mM作为流动相；称取实施例2中提取得到的元胡粗提物222mg，用8ml固定相和8ml未碱化的下相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对元胡粗提物进行分离，分离柱的柱体积为250ml。首先将固定相以30ml/min的流速注满分离柱，然后将上述样品溶液通过进样圈注入分离柱，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为810r/min，设置流动相的流速为2ml/min，开始泵入流动相，以波长254nm的紫外检测器检测，通过色谱工作站记录色谱图并用自动部分收集器按5分钟/试管的速度接收洗脱液，用薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集。
收集得到的洗脱液通过薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值（Rf= 0.5）及保留时间（20.4min）相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到15mg去氢紫堇碱，纯度为99.3%，回收率为74.6%。
高效液相条件：YMC ODS C18柱（4.6×250mm）；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠（32:68，v/v），等度洗脱；流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长：345nm；进样量：20μl。
实施例5
将氯仿、甲醇和水按照体积比1.5:1:1配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相加入盐酸，使盐酸的终浓度为10mM作为固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的终浓度为10mM作为流动相；称取实施例2中提取得到的元胡粗提物205mg，用8ml固定相和8ml未碱化的下相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对元胡粗提物进行分离，分离柱的柱体积为250ml。首先将固定相以30ml/min的流速注满分离柱，然后将上述样品溶液通过进样圈注入分离柱，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为810r/min，设置流动相的流速为2ml/min，开始泵入流动相，以波长254nm的紫外检测器检测，通过色谱工作站记录色谱图并用自动部分收集器按5分钟/试管的速度接收洗脱液，用薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集。
收集得到的洗脱液通过薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值（Rf= 0.5）及保留时间（20.4min）相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到12mg去氢紫堇碱，纯度为99.5%，回收率为64.8%。
高效液相条件：YMC ODS C18柱（4.6×250mm）；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠（32:68，v/v），等度洗脱；流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长：345nm；进样量：20μl。
实施例6
将氯仿、甲醇和水按照体积比2:1:1配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相加入盐酸，使盐酸的终浓度为20mM作为固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的终浓度为20mM作为流动相；称取实施例2中提取得到的元胡粗提物222mg，用13.3ml固定相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对元胡粗提物进行分离，分离柱的柱体积为250ml。首先将固定相以30ml/min的流速注满分离柱，然后将上述样品溶液通过泵注入分离柱，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为850r/min，设置流动相的流速为2.5ml/min，开始泵入流动相，以波长254nm的紫外检测器检测，通过色谱工作站记录色谱图并用自动部分收集器按4分钟/试管的速度接收洗脱液，用薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集。
收集得到的洗脱液通过薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值（Rf= 0.5）及保留时间（20.4min）相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到18mg去氢紫堇碱，纯度为94.4%，回收率为85.1%。
高效液相条件：YMC ODS C18柱（4.6×250mm）；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠（32:68，v/v），等度洗脱；流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长：345nm；进样量：20μl。
实施例7
将氯仿、甲醇和水按照体积比2:1:1配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相加入盐酸，使盐酸的终浓度为10mM作为固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的终浓度为10mM作为流动相；称取实施例2中提取得到的元胡粗提物200mg，用5ml固定相和10ml未碱化的下相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对元胡粗提物进行分离，分离柱的柱体积为250ml。首先将固定相以30ml/min的流速注满分离柱，然后将上述样品溶液通过进样圈注入分离柱，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为750r/min，设置流动相的流速为1.5ml/min，开始泵入流动相，以波长254nm的紫外检测器检测，通过色谱工作站记录色谱图并用自动部分收集器按5分钟/试管的速度接收洗脱液，用薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集。
收集得到的洗脱液通过薄层层析（展开剂为氯仿:甲醇=8:1，v/v）和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值（Rf= 0.5）及保留时间（20.4min）相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到16mg去氢紫堇碱，纯度为95.3%，回收率为84.8%。
高效液相条件：YMC ODS C18柱（4.6×250mm）；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠（32:68，v/v），等度洗脱；流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长：345nm；进样量：20μl。
Claims (9)
1.一种应用pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：
(1)在分液漏斗中分别加入氯仿、甲醇、水以体积比为1.5～3∶1～1.5∶1组成的溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相加入终浓度为10～20mM的无机酸作为固定相，下相加入终浓度为10～20mM的碱作为流动相；
(2)取元胡的乙醇粗提物用固定相溶解，所述的固定相加入量为25～60ml/g元胡的乙醇粗提物，溶解后制成样品溶液；所述的元胡的乙醇粗提物按如下方法制得：取元胡药材粉碎，用60～98％乙醇回流提取1～5次，合并各次的提取液，抽滤后滤液减压浓缩至浸膏状，用酸溶液捏溶至捏溶液的pH值为2～3，静置10～30小时，取上清液过滤除去沉淀；滤液用氯仿萃取1～5次，收集合并氯仿层，合并的氯仿层用质量浓度为1～3％氢氧化钠溶液萃取，取氯仿层旋转蒸发回收氯仿，得元胡的乙醇粗提物；
(3)取固定相注满逆流色谱仪的分离柱，随后注入样品溶液，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，在750～850r/min转速下，以1.5～2.5ml/min的流速持续注入流动相，以波长190～400nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集；
(4)将步骤(3)中收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱。
2.如权利要求1所述的应用pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：
(1)在分液漏斗中分别加入氯仿、甲醇、水以体积比为1.5～3∶1～1.5∶1组成的溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相加入终浓度为10～20mM的无机酸作为固定相，下相加入终浓度为10～20mM的碱作为流动相；
(2)取元胡的乙醇粗提物用固定相和未碱化的下相溶解，所述的固定相加入量为25～60ml/g元胡的乙醇粗提物，所述的未碱化的下相加入量为0～50ml/g元胡的乙醇粗提物，溶解后制成样品溶液；
(3)取固定相注满逆流色谱仪的分离柱，随后注入样品溶液，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，在750～850r/min转速下，以1.5～2.5ml/min的流速持续注入流动相，以波长190～400nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，TLC跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集；
(4)将步骤(3)中收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酸溶液为质量浓度为1～2％的盐酸水溶液或1～2％的硫酸水溶液。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述样品溶液的进样的体积小于分离柱柱体积的30％。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述的溶剂体系中氯仿、甲醇和水的体积比为2∶1∶1。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述的无机酸为盐酸。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述的碱为三乙胺。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述注入样品溶液可以通过进样圈注入样品溶液或通过泵泵入样品溶液。
9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(4)所述的高效液相色谱的检测条件为：YMC ODS C18 column 4.6×250mm，5μm；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠水溶液以体积比32∶68混合的溶液，等度洗脱；流速：0.6ml/min；检测波长：345nm；进样量：20μl。
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