CN101967205B - 一种β-葡聚糖铁复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域和食品医药领域，具体提供了一种利用真菌β-葡聚糖为配体化合物，以三价铁为配位中心离子制备的β-葡聚糖铁及其制备方法，所制备的β-葡聚糖铁复合物含铁量高，水溶性好，不含游离铁离子，体外环境中稳定，体内通过胃酸作用，解离出Fe³⁺被人体吸收，在体内被还原成Fe²⁺利用，同时解离出的β-葡聚糖进而发挥其提高机体免疫力和生血活血的协同补血功效，因此β-葡聚糖铁络合物同时具有补铁补血和免疫调节的双重功效。

Description

一种β-葡聚糖铁复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有免疫调节功能的补铁制剂的制备方法，具体是利用真菌来源的葡聚糖制备高价铁葡聚糖复合物作为补铁制剂，属营养和生物医药领域。

背景技术

传统治疗缺铁性贫血(Iron-deficiency Anemia，IDA)的药物为各种亚铁盐制剂，如无机铁剂硫酸亚铁控释片、可溶性有机络合铁剂琥珀酸亚铁、富马酸铁、葡萄糖酸铁等，游离的亚铁离子刺激胃肠，造成恶心、呕吐、腹泻、便秘等消化道不良反应，且二价铁制剂易产生内源性自由基，导致细胞膜脂质过氧化而造成细胞膜损伤。注射型补铁剂右旋糖酐铁(葡聚糖铁，Fe-Dextran)、山梨醇铁，通过深部肌肉注射，解决了刺激胃肠，不利于消化吸收的问题，但可引起局部疼痛，荨麻疹、发热、头痛、关节疼痛、恶心、哮喘等，有部分病人发生过敏反应和其他过敏性副反应。静脉注射型铁剂氢氧化铁蔗糖复合物通过静脉输液治疗肾衰病人的缺铁性贫血，由于蔗糖铁不含右旋糖酐，发生过敏反应较少，并且几乎完全通过网状内皮系统摄取，不沉积在肝内，从而避免了肝损伤。

另一类补铁剂为铁-蛋白络合物，在胃内酸碱度小于4即酸性时，铁离子受蛋白膜的保护而不同胃液中的盐酸和胃蛋白酸发生反应，所以不会造成胃粘膜损伤，大大提高对铁质的耐受性。而在肠腔碱性环境下(酸碱度7.5至8)铁-蛋白络合物重新变得可溶，使蛋白膜为胰蛋白酶所消化而释放出铁离子，铁离子可迅速地在肠绒毛内高度被吸收，使疗效大大提高。但是该制剂实际上是用蛋白膜包覆的琥珀酸铁，同样具有其他二价铁制剂存在的上述缺陷。

多糖类物质的免疫调节作用机制被全面揭示之后，以三价铁(Fe³⁺)为核心，多糖为配合物的复合铁制剂成为新的口服补铁剂，以力蜚能(Niferex)为代表的多糖铁复合物(PIC)制剂迅速在临床上广泛应用起来，并成为国内补铁剂市场的主流产品。此类多糖铁制剂中的多糖来源于细菌肠膜明串珠菌的发酵产物，多糖组分为吡喃型葡萄糖单体构成的葡聚糖，糖苷键的95％是α-1，6-D-键型，其余为α-1，3-D和其他键型。该多糖的结构与右旋糖酐完全相同，所不同的是分子量更低，实际为低分子量右旋糖酐。

多糖与高价铁配合生成的多糖铁复合物，用于IDA的治疗，不仅具有较理想的稳定性、水溶性和吸收率等，释放铁后又继续发挥多糖的免疫促进功能，是一种较理想的补铁制剂，具有副作用小、配合性稳定、溶解度好，含铁量高的优点。多糖铁中的多糖成分刺激红细胞生成、促进造血母细胞和多能造血干细胞的增殖和分化、从而提高机体的造血水平，因此又是良好的造血促进剂。

目前比较有临床应用前景的多糖铁制剂有当归多糖铁、淮山药多糖铁和人参多糖铁，均为具有补血作用或免疫调节作用的中药材提取的多糖与铁制备的复合物，旨在发挥中药和铁的双重补血活血作用。但植物来源的多糖多为各种单糖构成的杂多糖，其中，具有免疫调节作用的活性成分β-葡聚糖的含量较低，多糖与铁的协同作用难以充分发挥。现有用于药品或功能食品的真菌多糖多为水提取物，虽然β-葡聚糖含量有所提高，但同样存在含有杂多糖和分子量巨大的问题，若以此为原料制备多糖铁复合物，其结果与植物多糖类似存在较大的缺陷。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种利用碱溶性真菌β-葡聚糖为配体化合物，以三价铁为配位中心离子制备的β-葡聚糖铁及其制备方法，所制备的β-葡聚糖铁复合物(β-Glucan Iron Complex，β-GIC)含铁量高，水溶性好，不含游离铁离子，体外环境中稳定，体内通过胃酸作用，解离出Fe³⁺被人体吸收，在体内被还原成Fe²⁺利用，同时解离出的β-葡聚糖进而发挥其提高机体免疫力和生血活血的协同补血功效。因此β-葡聚糖铁络合物同时具有补铁补血和免疫调节的双重功效。

本发明所述的一种β-葡聚糖铁复合物，其重均相对分子质量M_r为5-20万Dalton，对分子质量分步宽度D为1.0-3.0，铁含量为10-50％(w/w)；所述β-葡聚糖为由真菌来源提取的β-葡聚糖。

与现有各种多糖铁复合物相比，本发明的最大不同就是采用了以真菌为来源提取的β-葡聚糖作为配体化合物来进行复合制备多糖铁，且所制备的多糖铁为β-葡聚糖铁复合物，使β-葡聚糖的免疫调节作用得到了更好的发挥，同时兼顾了与三价铁的协同作用，提供了一种高价铁葡聚糖复合物。

所述真菌来源，是由去除了菌丝体的真菌菌丝体发酵液或包含菌丝体的真菌菌丝体发酵液或去除了发酵液的真菌菌丝体为来源的；或真菌子实体为来源的；优选采用不去除菌丝体的发酵液，

除此之外，还可以采用去除发酵液的鲜菌丝体为来源，菌丝体为鲜菌丝体，避免了发酵后处理中对菌丝体的洗涤、干燥和粉碎等过程，既降低能耗，又使工艺过程连贯；一般来讲，可以根据菌种的选择来确定采用哪种来源，如产胞外多糖的真菌(如小核菌、核盘菌、云芝、裂褶菌)采用不去除菌丝体的发酵液为好，去除菌丝体的发酵液次之；只产胞内多糖的香菇则采用去除发酵液的鲜菌丝体为好。

本发明所述的β-葡聚糖为真菌β-葡聚糖，该真菌β-葡聚糖中包括了同一来源的β-葡聚糖蛋白复合物，或称蛋白聚糖。无论是β-葡聚糖还是β-葡聚糖蛋白复合物(蛋白聚糖)均包含中性β-葡聚糖、酸性β-葡聚糖和中性蛋白聚糖、酸性蛋白聚糖，其中，中性蛋白聚糖和酸性蛋白聚糖中的糖均为β-葡聚糖。制备β-葡聚糖的真菌包括小菌核菌属真菌(Sclerotium spp.)，又称小核菌属真菌，还包括杂色云芝(Polystictus versicolor)，核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)，裂褶菌(Schizophyllum commune)和香菇(Lentinula edodes)。各菌种均通过商业途径购买获得，来源如下：小菌核菌，保藏于中国药用微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为CPCC 400357；核盘菌，保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号ACCC 36079；杂色云芝，保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号ACCC 50435；裂褶菌，保藏于中国林业微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为CFCC 82020；香菇，保藏于中国农业微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为ACCC 50066。

除了通过发酵的方法先制备发酵液或菌丝体，再制备β-葡聚糖外，还可以市售的云芝、裂褶菌和香菇的子实体为原料制备β-葡聚糖。

之所以采用上述的真菌作为来源，是因为这些真菌多糖的特殊结构，决定了其具有特殊的理化特性以及特殊的生物活性和生理功能，具体说明如下：

小核菌葡聚糖是由小菌核菌属(Sclerotium spp.)真菌产生的胞外多糖，又称硬葡聚糖(Scleroglucan)，是通过液体发酵培养菌丝体和发酵液中制备而来。

小核菌葡聚糖呈线性结构，由D-吡喃葡萄糖通过β-1，3-D-糖苷键相连形成主链，再与单个D-吡喃葡萄糖单位以β-1，6-D-糖苷键相连形成支链。硬葡聚糖在冷热水中均可溶解，溶液具有很高的假塑性，不受温度、pH和电解质变化的影响，稳定性也强。在发酵时多糖的分子量受条件的影响较小。此聚合物与水的结合性、稳定性、黏稠性和悬浮性特性良好。

小核菌葡聚糖本身具有重要的免疫调节、抑制肿瘤、抗病毒、抗感染等功效，具有明显的抗补体活性和促进巨噬细胞、淋巴细胞增殖的作用，对提高机体免疫力具有重要的作用。小核菌葡聚糖可大规模发酵生产，原料易得、工艺成熟、成本低廉，易于工业化生产，对其进行衍生化生成的葡聚糖糖铁复合物是一种新型补铁制剂。

核盘菌葡聚糖为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)产生的胞外多糖(SSG)，也是以β-1，6-D-葡聚糖分支的β-1，3-D-葡聚糖，结构和性质与小核菌葡聚糖非常相似，但相对分子质量要高很多，一般在80万Dalton以上，在水中溶解缓慢，粘度较高，并具有良好的流变学性质，其特性粘度几乎不随离子强度的变化而改变，在pH1.8-12.3之间，特性粘度值变化不显著，但当pH值为13.32时，由于分子构象的变化导致特性粘度值急骤下降。温度≤90℃和热处理对SSG溶液的表观粘度影响不大。可大规模发酵生产，原料易得、工艺成熟、成本低廉，易于工业化生产，核盘菌葡聚糖具有潜在的免疫调节活力和较强的抑瘤作用。

云芝、裂褶菌和香菇提取的β-葡聚糖均具有和小核菌葡聚糖相似的结构和功能。以杂色云芝(Polystictus versicolor)、裂褶菌(Schizophyllum commune)和香菇(Lentinula edodes)为原料制取的β-葡聚糖或糖肽(β-葡聚糖与小分子蛋白结合的蛋白聚糖)是目前已应用于临床的β-葡聚糖药物，用于抗病毒、增强免疫力和肿瘤辅助治疗。

由上可知，选择上述的多种真菌作为β-葡聚糖的来源，有着优异的效果，可以获得具有较高品质的β-葡聚糖。

制备上述β-葡聚糖铁复合物的方法，其步骤如下：

(1)碱溶性β-葡聚糖制备：

将完成发酵的菌丝体发酵液直接用碱在加热条件下搅拌提取β-葡聚糖；或将预处理过的菌丝体加入碱后加热提取获得β-葡聚糖，所述的预处理为将菌丝体经脱脂、水提去除脂溶物和杂多糖；还可以将子实体经脱脂、水提去除脂溶物和杂多糖，再经碱提取获得β-葡聚糖；

(2)β-葡聚糖铁的合成：

将步骤(1)所得碱溶性β-葡聚糖溶液加热至50-100℃，在搅拌条件下，先连续滴加或流加络合剂，pH降低至9.5时，再同时滴加络合剂和三价铁化合物，同时滴加或流加络合剂和三价铁化合物时起至整个合成反应完成，三价铁化合物与络合剂总用量的摩尔比为2∶n，其中n＝1-5之间的整数；通过控制络合剂的滴加速度和加入量控制pH在7.0-9.5的范围内，从pH9.5逐渐向pH7.0变化，持续进行络合反应，即可获得β-葡聚糖铁复合物；

(3)β-葡聚糖铁分离纯化：β-葡聚糖铁合成反应结束后，降温，管式离心机6000-14000r/min离心，去除不溶物，用截留相对分子质量6000-100000Dalton的超滤膜超滤浓缩，冷冻干燥或喷雾干燥；

制备方法中，步骤(1)中所述用于制备碱溶性β-葡聚糖的菌丝体发酵液，是去除或不去除菌丝体的发酵液，优选不去除菌丝体的发酵液，用其制备β-葡聚糖的方法是：添加固碱，使发酵液的最终碱浓度为0.01-0.25mol/L，所用固体碱为NaOH或KOH或Na₂CO₃，在温度为10-60℃下搅拌处理1-3h，离心，收集上清液即为碱溶性β-葡聚糖溶液；

或者是用去除发酵液的鲜菌丝体按照顺序进行脱脂、水提和碱提，其中乙醇脱脂，所用乙醇浓度为70-95％，用量为菌丝体量的10-30倍(v/w)，以浸没菌丝体为准；脱脂过程去除了其中的脂类和类脂和其他醇溶性成分，同时去除部分单糖、多肽等杂质；热水提取温度为90-100℃，目的是将水溶性多糖、低聚糖和单糖去除，所去除的多糖中的主要成分为各种杂多糖，包括不同单糖组成的杂多糖和α-糖苷键连接的多糖；碱提取所用的碱为NaOH或KOH或Na₂CO₃溶液，浓度为0.1-2.5mol/L，用量为菌丝体量的10-30倍(v/w)，该步骤所得多糖均为β-葡聚糖，该β-葡聚糖为含蛋白或不含蛋白的葡聚糖，含蛋白的β-葡聚糖又称为蛋白聚糖，HPLC检测显示为成分均一组分，且GPC法测定其中β-葡聚糖的相对分子质量介于5-20万Dalton范围内，相对分子质量分布宽度介于1.0-3.0之间；更重要的是，碱溶性β-葡聚糖溶液中保留了中性β-葡聚糖，也保留了碱溶的酸性β-葡聚糖，使β-葡聚糖的得率大大提高；所得碱溶性β-葡聚糖提取液，不经过浓缩、超滤、醇沉、干燥等过程，直接用于下一步骤β-葡聚糖铁的合成；之所以这样操作，主要是减少能耗和有机溶剂的污染，同时减少中间环节，更重要的是碱提取的β-葡聚糖提取液本身pH值大于12，高于多糖铁复合物制备所需pH值，因此进行下一步葡聚糖铁合成时，无需再用碱调pH值，而需要用酸性物质向pH降低方向调节；

步骤(1)制备碱溶性β-葡聚糖的方法中，还可采用以市售干燥子实体或其粉末为原料，按照上述菌丝体制备制备碱溶性β-葡聚糖的过程进行，可得到子实体来源的碱溶性β-葡聚糖；与菌丝体为原料不同的是，脱脂过程中使用的乙醇的浓度和用量有变化，一般控制在乙醇的浓度为60-80％(v/v)，用量为子实体粉末的10-20倍(v/w)；而步骤(1)中所提及的发酵均为现有的发酵技术，不再赘述。

上述步骤(2)所述用于β-葡聚糖铁合成的配体化合物，是将步骤(1)中所获得的含有β-葡聚糖或含β-葡聚糖的蛋白聚糖碱溶液加热到50-100℃，以利于充分溶解，并为下一步的合成反应提供条件；在搅拌条件下(10-40r/min)，向溶液中滴加或缓慢流加络合剂，调节反应的初始pH值至9.5，再同时滴加三价铁化合物溶液，通过同时连续滴加或流加络合剂和三价铁化合物，使络合反应在均相液体中进行；同时滴加或流加络合剂和三价铁化合物时起至整个合成反应完成，三价铁化合物与络合剂总用量的摩尔比为2∶n，其中n＝1-5之间的整数；络合剂优选采用酸性络合剂，酸性络合剂的加入，使溶液pH值不断下降，通过控制流加速度和加入的量，可使溶液pH值稳定在一定范围内，使络合反应得以在pH7.0-9.5的范围内进行；期间，pH值控制为连续均匀变化，反应开始的pH值控制在9.5左右，以提高β-葡聚糖的溶解性(以不出现持续沉淀为指标)，随络合反应的持续进行，逐渐降低pH值，最终控制在pH7.0以上，但低于pH9.0，直到出现的沉淀不再溶解，停止流加反应物，终止反应，继续保温1h。由于原溶液为碱性溶液，pH值大于12，而葡聚糖铁的络合反应又必需在中性偏碱的范围内进行，所以，不同于其他方法，该过程中所用的pH调节剂为酸性络合剂，也就是说，反应物中的酸性络合剂本身就兼有pH值调节剂的功能；

上述的酸性络合剂为柠檬酸、柠檬酸三钠盐、酒石酸、酒石酸钾钠、焦磷酸钠盐、苹果酸、乳酸、草酸、EDTA环己二胺四乙酸(CDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)或氨三乙酸(NTA)、亚硝基三乙酸钠中的一种或数种。

与络合剂同时流加的配位中心离子铁供体为三价铁化合物，具体为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、磷酸铁、醋酸铁中的一种。

为了达到更好的效果，一般经过上述两步处理后，将步骤(2)所获得的β-葡聚糖铁复合物进一步纯化，具体的分离方法，不同于其他用乙醇沉淀的方法，该步骤通过离心去除步骤(2)所获得的β-葡聚糖铁复合物溶液中的不溶物后，用截留相对分子质量6000-100000Dalton的超滤膜超滤浓缩，同时脱盐，去除6000-100000Dalton以下相对分子质量的小分子物质。未反应完全的铁化合物(游离Fe³⁺)、反应过程中新生成的盐或其他化合物，均通过超滤脱除。由于碱提取的β-葡聚糖和蛋白聚糖的相对分子质量均小于20万Dalton(赵峡等.药物分析杂志.2007，27(8)：1143-1146)，因此，仅通过6000-100000Dalton的超滤膜一次超滤浓缩即可，使所得葡聚糖铁复合物的分子量控制在5-20万Dalton的范围内。对截留的浓缩液部分进行冷冻干燥或喷雾干燥或40-60℃以下低温真空干燥，即得棕红色葡聚糖铁粉末。所得葡聚糖铁溶解性能和产量均大大提高。

为了检测上述获得的葡聚糖铁的性能，所得经过超滤后获得的β-葡聚糖铁中的葡聚糖含量采用硫酸-苯酚分光光度法测定；游离Fe³⁺采用亚铁氰化钾分光光度法测定；葡聚糖铁中的铁含量采用邻菲啰啉分光光度法测定。

邻菲啰啉(邻二氮杂菲)分光光度法测定铁含量的原理：邻菲啰啉(邻二氮杂菲)在pH值为2-9的溶液中与二价铁离子生成稳定的红色配合物。该反应中铁必须是亚铁状态，因此显色前还要加入还原剂(如盐酸羟胺、抗坏血酸)。红色配合物的最大吸收波长为510nm。具体测定步骤为：

标准曲线的绘制铁(II)标准贮备液的配制：精密称取硫酸亚铁胺(Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O)0.70253g，溶于少量蒸馏水，移入1000mL量瓶中，加3mL盐酸，用蒸馏水定容至刻度，冷藏备用。

铁(II)标准溶液的配制(使用时现配)：吸取10.0mL铁(II)标准贮备液，移入100mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。取8个50mL量瓶，分别加入铁(II)标准使用液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0mL，再分别加入10％抗坏血酸水溶液2.0mL，邻菲啰啉水溶液2.5mL，用蒸馏水定容，摇匀。放入水浴锅中在37℃下反应10min，于510nm处测定吸光度。计算出线性回归方程和相关系数。

结合两个现有专利技术已说明本发明的技术进步：

(1)专利CN1147322C中其所做的努力旨在尽可能地降低配体化合物葡聚糖的分子量和尽可能地取出产物中的极低相对分子质量的低聚糖。此过程须经多步酶解、修饰、超滤、纳滤处理，过程复杂而费时，制备成本巨大。这对用于注射给药的补铁剂来说是必须的，因为高分子量的葡聚糖可能导致过敏反应和其他过敏性副作用，如休克、呼吸困难等。但对于口服途径即肠道吸收的补铁剂，主要解决其刺激性问题和在肠道中的吸收利用问题，而在上述的专利中并没有提出明确的解决方案；

而本方法制备的β-葡聚糖铁的铁与上述的对比文件含量相当，但β-葡聚糖的相对分子质量要大很多，同时含有结合蛋白的β-葡聚糖更容易通过胃液或消化液屏障而更好地保存其多糖的免疫调节功能。与现有技术相比，过程相对简单，步骤少，且与传统方法相比，中间过程物沉淀、干燥处理，大大简化了工艺步骤。本方法合成的β-葡聚糖铁中的含铁量完全能够满足特殊条件下的补铁需求，同时，由于含有大分子β-葡聚糖，更易于形成螺旋形空间立体结构，对人体具有更强的免疫调节能力，与铁协同发挥生血活血的作用更强。

(2)CN100362021C中使用水溶性山药多糖为配体化合物，由于山药多糖为杂合多糖，溶液中难于形成三重螺旋空间构型，加之水提取多糖相对分子质量范围很大，20万Dalton以上相对分子质量的多糖比例高，造成水中溶解度低；

而本发明除采用鲜菌丝体以减少干燥过程，最大的优势就是节约了能源消耗，同时减少了中间步骤环节，此外，以碱提取的过程获得的是不含杂多糖而只含β-葡聚糖的单一组分葡聚糖，更进一步地，对碱提取的β-葡聚糖不做中和、醇沉、干燥等处理，进行不溶物分离后，直接用于葡聚糖铁的合成，这样做的目的，第一是获得单纯适宜相对分子质量的β-构型的葡聚糖，第二是使所得β-葡聚糖的溶解度大大提高，第三，同样是为了节约能耗，减少并降低有机溶剂的使用。另一方面，现有技术中的杂多糖作为配体化合物参与络合反应时，由于有效多糖的浓度较低，所形成的多糖铁复合物中的多糖含量也低，因此山药多糖铁在释放铁离子后，多糖本身难以发挥其固有的生理活性。与之相比，本发明的β-葡聚糖铁复合物具有显而易见的优势。

临床应用的葡聚糖铁主要为右旋糖酐铁，其多糖为α-糖苷键构型的葡聚糖。本发明的葡聚糖多糖铁是由β-葡聚糖在一定条件下与三价铁离子形成的络合物，体外环境中稳定，在肠胃环境中通过胃酸作用，解离出Fe³⁺被人体吸收，在体内被还原成Fe²⁺利用，达到补铁补血的目的；同时解离出的β-葡聚糖进而发挥其提高机体免疫力的功效。因此β-葡聚糖铁络合物同时具有补铁补血和免疫调节的双重功效。以β-葡聚糖与高价铁配合生成的葡聚糖多糖铁复合物，可望成为一种新型的、具有协同补血作用的补铁剂，既可发挥高价铁补铁、治疗缺铁性贫血的作用，又可发挥β-葡聚糖的免疫调节和生血活血的活性。

具体实施方式

下面以具体实施例进一步对本发明的内容进行说明。本发明所涉及的内容包含但不限于如下具体实施例。

实施例1

小核菌碱溶性β-葡聚糖的制备。小核菌发酵液10L，固形物含量为4.2％(w/v)，添加固体NaOH，搅拌，使发酵液中碱浓度为1.5mol/L，缓慢加热至45℃，搅拌处理1h，6000r/min离心20min，收集上清液即为碱溶性β-葡聚糖溶液。

实施例2

香菇发酵液6L，板框压滤滤除发酵液，得湿菌体920g，加入适量95％的乙醇，使菌丝体充分淹没，搅拌均匀后静置4-8h，压滤，收集脱脂液，滤饼中加入15倍(v/v)蒸馏水，加热至微沸，搅拌、保温3h，趁热压滤，去除水提取液；滤饼中加入浓度为0.1-2.5mol/L(0.4％-10％)的KOH，加热至60℃，搅拌、保温1h，压滤或离心，收集滤液，即为碱溶性β-葡聚糖溶液。

所得碱溶性β-葡聚糖提取液，不经过超滤、浓缩、醇沉、干燥等过程，直接用于下一步骤β-葡聚糖铁的合成。

实施例3

云芝子实体碱溶性β-葡聚糖的制备。

云芝干燥子实体粉末(80目)1Kg，加入12倍(v/w)80％的乙醇，搅拌均匀后静置6-12h，期间，搅拌数次，压滤，收集脱脂液，滤饼中加入20倍(v/v)蒸馏水，加热至微沸，搅拌、保温2h，趁热压滤，去除水提取液；滤饼中加入浓度为0.1-2.5mol/L(0.4％-10％)的Na₂CO₃，加热至40℃，搅拌、保温1h，压滤，收集滤液，即为碱溶性β-葡聚糖溶液。

所得碱溶性β-葡聚糖提取液，不经过超滤、浓缩、醇沉、干燥等过程，直接用于下一步骤β-葡聚糖铁的合成。

实施例4

小核菌β-葡聚糖铁复合物的制备。

(1)碱溶性β-葡聚糖制备：小核菌发酵液10L，固形物含量为3.78％(w/v)，添加固体KOH，搅拌，使发酵液中碱浓度为1mol/L，缓慢加热至30℃，搅拌处理2h，6000r/min离心20min，收集上清液即为碱溶性β-葡聚糖溶液；

(2)β-葡聚糖铁合成：将步骤(1)所得碱溶性β-葡聚糖溶液加热至80℃，在持续搅拌下，先连续滴加或流加酒石酸，pH降低至9.5时，同时流加酒石酸和氯化铁溶液，自同时流加络合剂和三价铁化合物至整个合成反应结束的过程中，氯化铁与酒石酸的摩尔比为2∶2，控制酒石酸和氯化铁的流加速度，使初始pH值控制在9.5，同时又使出现的沉淀在搅拌状态下能迅速溶解；调节酒石酸和氯化铁的流加速度，逐渐增加酒石酸的流速，使pH值每10min降低0.2，直到pH值降低至接近7.0，调节酒石酸和氯化铁的流加速度，使pH值稳定控制在7.0左右，持续进行反应，直到出现的沉淀不再溶解，停止加入酒石酸和氯化铁，继续搅拌、保温1h；

(3)β-葡聚糖铁分离纯化：β-葡聚糖铁合成反应结束后，降温，管式离心机14000r/min离心，去除不溶物，用截留相对分子质量50000Dalton的超滤膜超滤，60℃真空干燥或喷雾干燥；

(4)β-葡聚糖铁质量测定：邻菲啰啉分光光度法测定葡聚糖铁中的铁含量；硫酸-苯酚分光光度法测定葡聚糖含量；亚铁氰化钾分光光度法测定游离Fe³⁺离子；HPLC法测定成分均一性；GPC法测定相对分子质量Mr和相对分子质量分布宽度D。结果显示，10L小核菌发酵液，经上述各步骤处理，得β-葡聚糖铁113.6g，其中铁含量为32.45％，葡聚糖含量为48.78％；HPLC法测定图谱显示为单一峰，GPC法测定Mr为173640Dalton，相对分子质量分布宽度D为1.73；所得β-葡聚糖铁溶液与亚铁氰化钾溶液产生反应，反应液不呈蓝色，说明β-葡聚糖铁溶液中不含游离Fe³⁺。

实施例5

香菇β-葡聚糖铁复合物的制备及其理化性质。

香菇β-葡聚糖铁复合物的制备方法中，碱溶性β-葡聚糖溶液的制备同实施例2，简述为：香菇发酵液经板框压滤得湿菌体，加入适量95％的乙醇，搅拌均匀后静置过夜，压滤；滤饼中加入20倍(v/v)蒸馏水，加热至微沸，搅拌提取4h，压滤；滤饼中加入浓度为0.1-2.5mol/L(0.4％-10％)的Na₂CO₃，加热至40℃，搅拌提取3h，压滤，收集滤液，即为碱溶性β-葡聚糖溶液。

香菇β-葡聚糖铁复合物的合成与分离纯化同实施例3，简述为：将碱溶性β-葡聚糖溶液加热至65℃，在持续搅拌下，先连续滴加或流加氨三乙酸(NTA)，pH降低至9.5时，再同时流加氨三乙酸(NTA)和氯化铁，自同时流加络合剂和三价铁化合物至整个合成反应结束的过程中，所滴加反应物的摩尔比为NTA∶FeCl₃＝3∶2，控制流加速度，使反应过程中的pH值从9.5向7.0均匀变化，pH值降低至接近7.0，调节NTA流加速度，使pH值稳定控制在7.0左右，持续反应，到出现的沉淀不再溶解，停止流加加氨三乙酸(NTA)和氯化铁，继续反应1h后，6000r/min离心30min，用截留相对分子质量10000Dalton的超滤膜超滤浓缩，冷冻干燥。

上述方法所得香菇β-葡聚糖铁为深棕红色无定形粉末，可溶于水，在水中呈中性；水解反应，阴性，在pH7.0左右的水溶液中不生成氢氧化铁沉淀，其水溶液为棕红色透明溶液；水溶液在敞口条件下长时间(10d)暴露于空气中，水溶液无明显变化，粉末长期(6m)暴露于空气中，颜色、光泽无变化，可见在水和空气中化学性质稳定；在生理pH条件下完全可溶，不水解，不沉淀，因而可以很好地被机体吸收利用；亚铁氰化钾反应阴性(不呈蓝色，不含游离Fe³⁺)；铁含量43.9％；HPLC法测定图谱显示为单一峰，GPC法测定Mr为183122Dalton，相对分子质量分布宽度D为1.91；红外吸收光谱，在700cm^-1和910cm^-1附近有特征吸收峰。

实施例6

裂褶菌β-葡聚糖铁复合物的制备。

(1)碱溶性β-葡聚糖制备：裂褶菌发酵液10L，固形物含量为2.12％(w/v)，添加固体NaOH，搅拌，使发酵液中碱浓度为0.5mol/L，缓慢加热至50℃，搅拌处理1h，6000r/min离心20min，收集上清液即为碱溶性β-葡聚糖溶液；所得碱溶性β-葡聚糖提取液，不经过超滤、浓缩、醇沉、干燥等过程，直接用于下一步骤β-葡聚糖铁的合成；

(2)β-葡聚糖铁合成：将步骤(1)所得碱溶性β-葡聚糖溶液加热至75℃，在持续搅拌下，先连续滴加或流加柠檬酸三钠，pH降低至9.5时，同时流加柠檬酸三钠和硫酸铁，控制柠檬酸三钠和硫酸铁的流加速度，自同时流加络合剂和三价铁化合物至整个合成反应结束的过程中，硫酸铁和檬酸三钠的摩尔比为2∶3，使初始pH值控制在9.5，同时又使出现的沉淀在搅拌状态下能迅速溶解；调节柠檬酸三钠和硫酸铁的流加速度，逐渐增加柠檬酸三钠的流速，使pH值每10min降低0.2，直到pH值降低至接近7.0，调节柠檬酸三钠和硫酸铁的流加速度，使pH值稳定控制在7.0左右，持续进行反应，直到出现的沉淀不再溶解，停止加入柠檬酸三钠和硫酸铁，继续搅拌、保温1h；

(3)β-葡聚糖铁分离纯化：β-葡聚糖铁合成反应结束后，降温，管式离心机10000r/min离心，去除不溶物，用截留分子量6000Dalton的超滤膜超滤，冷冻干燥或喷雾干燥；

(4)β-葡聚糖铁质量测定：邻菲啰啉分光光度法测定葡聚糖铁中的铁含量；硫酸-苯酚分光光度法测定葡聚糖含量用；亚铁氰化钾分光光度法测定游离Fe³⁺含量。结果显示，10L裂褶菌发酵液，经上述各步骤处理，得β-葡聚糖铁97.34g，其中铁含量为33.8％，葡聚糖含量为40.21％；所得β-葡聚糖铁中不含游离Fe³⁺。

实施例7

核盘菌β-葡聚糖铁复合物的制备。

(1)碱溶性β-葡聚糖制备：核盘菌发酵液10L，固形物含量为2.67％(w/v)，添加固体Na₂CO₃，搅拌，使发酵液中碱浓度为0.5mol/L，缓慢加热至40℃，搅拌处理1h，6000r/min离心20min，收集上清液即为碱溶性β-葡聚糖溶液；所得碱溶性β-葡聚糖提取液，不经过超滤、浓缩、醇沉、干燥等过程，直接用于下一步骤β-葡聚糖铁的合成；

(2)β-葡聚糖铁合成：将步骤(1)所得碱溶性β-葡聚糖溶液加热至75℃，在持续搅拌下，先连续滴加或流加乙二胺四乙酸(EDTA)，pH降低至9.5时，同时流加乙二胺四乙酸(EDTA)和硝酸铁，自同时流加络合剂和三价铁化合物至整个合成反应结束的过程中，EDTA和硝酸铁的摩尔比为2∶1，控制乙二胺四乙酸和硝酸铁的流加速度，使初始pH值控制在9.5，同时又使出现的沉淀在搅拌状态下能迅速溶解；调节柠檬酸三钠和硫酸铁的流加速度，逐渐增加柠檬酸三钠的流速，使pH值每10min降低0.2，直到pH值降低至接近7.0，调节乙二胺四乙酸(EDTA)和硝酸铁的流加速度，使pH值稳定控制在7.0左右，持续进行反应，直到出现的沉淀不再溶解，停止加入乙二胺四乙酸(EDTA)和硝酸铁，继续搅拌、保温1h；

(3)β-葡聚糖铁分离纯化：β-葡聚糖铁合成反应结束后，降温，管式离心机8000r/min离心，去除不溶物，用截留相对分子质量100000Dalton的超滤膜超滤，冷冻干燥或喷雾干燥；

(4)β-葡聚糖铁质量测定：邻菲啰啉分光光度法测定葡聚糖铁中的铁含量；硫酸-苯酚分光光度法测定葡聚糖含量用；亚铁氰化钾分光光度法测定游离Fe³⁺含量。结果显示，10L核盘菌发酵液，经上述各步骤处理，得β-葡聚糖铁118.0g，其中铁含量为39.52％，葡聚糖含量为43.73％；所得β-葡聚糖铁中不含游离Fe³⁺。

Claims (10)

1.一种β-葡聚糖铁复合物，其特征在于：其重均相对分子质量Mr为5-20万Dalton，相对分子质量分布宽度D为1.0-3.0，铁含量为10-50w/w％；所述β-葡聚糖为真菌来源的β-葡聚糖；

其制备方法步骤如下：

(1)β-葡聚糖制备：向完成发酵的菌丝体发酵液直接加入碱并加热至10-60℃，搅拌处理1-3h提取β-葡聚糖；或将预处理过的菌丝体或子实体加入碱并加热提取获得β-葡聚糖；

所述的预处理为将菌丝体或子实体经脱脂、水提去除脂溶物和杂多糖；

(2)β-葡聚糖铁的合成：将步骤(1)所得β-葡聚糖溶液加热至50-100℃，先连续滴加或流加络合剂，pH降低至9.5时，再同时滴加或流加络合剂和三价铁化合物；通过控制络合剂流加速度和加入量，控制pH在9.5-7.0的范围内，持续进行络合反应；

(3)β-葡聚糖铁的纯化：超滤浓缩脱盐，冷冻干燥、喷雾干燥或醇沉后真空干燥。

2.根据权利要求1所述的β-葡聚糖铁复合物，其特征在于：所述真菌来源，是由去除了菌丝体的真菌菌丝体发酵液或包含菌丝体的真菌菌丝体发酵液或去除了发酵液的真菌菌丝体为来源的；或真菌子实体为来源的；所述的真菌为小菌核菌属真菌或核盘菌或杂色云芝或裂褶菌或香菇。

3.根据权利要求1所述的β-葡聚糖铁复合物，其特征在于：所述的β-葡聚糖包括中性β-葡聚糖或酸性β-葡聚糖或其混合物。

4.制备如权利要求1所述的β-葡聚糖铁复合物的方法，其步骤如下：

(1)β-葡聚糖制备：向完成发酵的菌丝体发酵液直接加入碱并加热至10-60℃，搅拌处理1-3h提取β-葡聚糖；或将预处理过的菌丝体或子实体加入碱并加热提取获得β-葡聚糖；

所述的预处理为将菌丝体或子实体经脱脂、水提去除脂溶物和杂多糖；

(2)β-葡聚糖铁的合成：将步骤(1)所得β-葡聚糖溶液加热至50-100℃，先连续滴加或流加络合剂，pH降低至9.5时，再同时滴加或流加络合剂和三价铁化合物；通过控制络合剂流加速度和加入量，控制pH在9.5-7.0的范围内，持续进行络合反应；

(3)β-葡聚糖铁的纯化：超滤浓缩脱盐，冷冻干燥、喷雾干燥或醇沉后真空干燥。

5.根据权利要求4所述的β-葡聚糖铁复合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)β-葡聚糖制备所用的向完成发酵的菌丝体发酵液直接加入的碱为固体NaOH或KOH或Na₂CO₃，添加碱固体后，整个溶液中的碱浓度为0.01-0.25mol/L。

6.根据权利要求4所述的β-葡聚糖铁复合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的络合剂选用酸性络合剂，选自柠檬酸、柠檬酸三钠、柠檬酸三钾、酒石酸钾钠、焦磷酸钠、苹果酸、乳酸、草酸、乙二胺四乙酸、环己二胺四乙酸、二乙三胺五乙酸或氨三乙酸中的一种或数种。

7.根据权利要求4所述的β-葡聚糖铁复合物的制备方法，其特征在于：通过调节酸性络合剂的加入速度和用量，控制反应过程中pH值从pH9.5逐渐向pH7.0连续变化，并控制在pH7.0-9.5之间。

8.根据权利要求4所述的β-葡聚糖铁复合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中三价铁化合物选自氯化铁或硫酸铁或硝酸铁或磷酸铁或醋酸铁。

9.根据权利要求4所述的β-葡聚糖铁复合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)所得的β-葡聚糖提取液直接用于步骤(2)中。

10.根据权利要求4所述的β-葡聚糖铁复合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中同时滴加或流加络合剂和三价铁化合物时起至整个合成反应完成，三价铁化合物与络合剂总用量的摩尔比为2：n，其中n＝1-5之间的整数。