CN101953506B - β-葡聚糖-茶多酚复合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了β-葡聚糖-茶多酚复合物及其应用，该复合物由以下方法制得：在透析袋内加入β-葡聚糖的水溶液与茶多酚或其活性单体的水溶液，再将透析袋置pH为3～7、离子强度为0.05～0.3mol/L的磷酸缓冲液中，在温度20～60℃条件下透析至达到平衡，即得；利用本发明方法制得的β-葡聚糖-茶多酚复合物较单独的β-葡聚糖或茶多酚具有更强的抗氧化能力，且在一定浓度范围内对超氧阴离子的清除能力具有协同增效作用，可以用于制备抗氧化剂，在食品保鲜防腐领域具有良好的开发应用前景；还可以用于制备抗氧化食品或药物，在保健食品和药品领域具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合物，特别涉及一种β-葡聚糖-茶多酚复合物，以及该复合物的应用。
背景技术
β-葡聚糖作为一种可溶性膳食纤维，广泛存在于细菌、酵母、真菌和高等植物(如燕麦、大麦、黑麦和小麦等)中，主要以细胞结构成分(如细胞壁)的形式存在。现代医学研究表明，β-葡聚糖具有调节机体免疫，抗肿瘤，降低血糖、血脂和胆固醇等多种功能，在食品和医药领域已引起广泛关注。
茶多酚是茶叶中一类多羟基酚类化合物的总称，可分为黄烷醇类、羟基-[4]-黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等，其中以黄烷醇类为主，黄烷醇类又以儿茶素类为主。儿茶素类约占茶多酚总量的60～80％，主要由表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素(DLC)等几种单体组成。茶多酚具有很强的抗氧化作用，可用于食品保鲜防腐，能够延长贮存期，使食品在较长时间内保持原有色泽和营养水平；在医学方面，其具有清除活性氧自由基，阻止脂质过氧化，抗衰老，抗辐射，降低血糖、血脂和胆固醇，抗肿瘤，调节机体免疫等多种功能；已成为当前食品和医药领域研究开发的热点。
但迄今为止，国内外未见β-葡聚糖-茶多酚复合物的研究报道，也未见β-葡聚糖和茶多酚在抗氧化方面具有协同作用的研究报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种β-葡聚糖-茶多酚复合物；目的之二在于提供所述复合物在食品和医药领域的应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
1、β-葡聚糖-茶多酚复合物，由以下方法制得：在透析袋内加入β-葡聚糖的水溶液与茶多酚或其活性单体的水溶液，再将透析袋置pH为3～7、离子强度为0.05～0.3mol/L的磷酸缓冲液中，在温度20～60℃条件下透析至达到平衡，即得β-葡聚糖-茶多酚复合物。
进一步，所述β-葡聚糖为燕麦β-葡聚糖或大麦β-葡聚糖；
进一步，所述茶多酚活性单体为表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯或儿茶素；
进一步，所述制备方法中是将透析袋置pH为5.56、离子强度为0.13mol/L的磷酸缓冲液中，在温度40℃条件下透析至达到平衡。
2、所述β-葡聚糖-茶多酚复合物在制备抗氧化剂中的应用。
3、所述β-葡聚糖-茶多酚复合物在制备抗氧化食品中的应用。
4、所述β-葡聚糖-茶多酚复合物在制备抗氧化药物中的应用。
本发明的有益效果在于：β-葡聚糖-茶多酚复合物的制备采用饱和水溶液法，本发明先采用单因素试验考察了pH值、离子强度和温度等因素对β-葡聚糖和茶多酚复合量的影响，再在单因素实验基础上，采用响应面分析法对β-葡聚糖-茶多酚复合物的制备工艺进行了优化，所得优化工艺简便易行，稳定性好，β-葡聚糖对茶多酚的吸附量大。利用本发明方法制得的β-葡聚糖-茶多酚复合物较单独作用的β-葡聚糖或茶多酚具有更强的抗氧化能力，且在一定浓度范围内对超氧阴离子的清除能力大于β-葡聚糖和茶多酚单独作用时的清除能力之和，即具有协同增效作用。因此，本发明的β-葡聚糖-茶多酚复合物可以用于制备抗氧化剂，在食品保鲜防腐领域具有良好的开发应用前景；还可以用于制备具有抗氧化功效的食品或药物，在保健食品和药品领域具有良好的开发应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为pH值对β-葡聚糖和茶多酚复合量的影响；其中，标有相同小写字母的组间差异不显著(p＞0.05)，标有不同小写字母的组间差异显著(p＜0.05)；
图2为离子强度对β-葡聚糖和茶多酚复合量的影响；其中，标有相同小写字母的组间差异不显著(p＞0.05)，标有不同小写字母的组间差异显著(p＜0.05)；
图3为温度对β-葡聚糖和茶多酚复合量的影响；其中，标有相同小写字母的组间差异不显著(p＞0.05)，标有不同小写字母的组间差异显著(p＜0.05)；
图4为茶多酚标准曲线；
图5为响应面分析图，其中A和B分别为Y＝f1(X1，X2)的曲面图和等值线图(X3＝30)，C和D分别为Y＝f2(X1，X3)的曲面图和等值线图(X2＝0.10)，E和F分别为Y＝f3(X2，X3)的曲面图和等值线图(X1＝6)；
图6为β-葡聚糖(A)及β-葡聚糖-茶多酚复合物(B)的原子力显微图谱；
图7为β-葡聚糖(1)、茶多酚(2)、β-葡聚糖-茶多酚复合物(3)以及β-葡聚糖和茶多酚的混合物(4)的红外图谱；
图8为β-葡聚糖、茶多酚及其复合物对羟基自由基的清除能力；
图9为β-葡聚糖、茶多酚及其复合物对超氧阴离子的清除能力；
图10为β-葡聚糖、茶多酚及其复合物对铁离子的还原能力；
图11为β-葡聚糖、茶多酚及其复合物对1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)自由基的清除能力。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
一、实验材料和仪器
实验材料和仪器：燕麦β-葡聚糖(含量＞75％)购自郑州荔诺生物科技有限公司；茶多酚(含量为98％)购自长沙艾茵生物制品有限公司；MD44-14透析袋(截留分子量为1.4kDa)购自美国联合碳化物公司(Union Carbide Corporation)；原子力显微镜购自美国维易科(Veeco)精密仪器有限公司；Spectrum 100型傅里叶变换红外光谱仪购自美国珀金埃尔默(PerkinElmer)仪器公司。
燕麦β-葡聚糖的预处理：将燕麦β-葡聚糖与水混合，温度80℃搅拌使完全溶解后，用流水透析24小时，再用蒸馏水透析24小时(去除溶液中的小分子，避免其对透析外液中茶多酚含量测定的干扰)，4℃保存备用。
透析袋的预处理：取适当长度的透析袋，置含有质量分数为2％的碳酸氢钠和浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液中煮沸10分钟，用蒸馏水洗净，再置蒸馏水中煮沸10分钟(或置蒸馏水中高压灭菌10分钟)，冷却后，5℃保存备用(必须确保透析袋始终浸没在水中)。
二、反应各因素对β-葡聚糖和茶多酚复合量的影响
1、pH值对β-葡聚糖和茶多酚复合量的影响
方法：在透析袋内加入浓度为0.5mg/mL的β-葡聚糖溶液6mL和浓度为0.5mg/mL的茶多酚溶液2mL，再将透析袋放入pH值分别为3、4、5、6、7，离子强度为0.05mol/L的磷酸缓冲液30mL中，在室温下透析16小时至达到平衡，采用紫外分光光度法测定透析外液中茶多酚的浓度(茶多酚标准曲线如图4所示)，按照以下公式计算β-葡聚糖对茶多酚的吸附量：
式中，Mtp为初始茶多酚总量(μg)，Ct为达到透析平衡时透析外液中茶多酚的浓度(μg/mL)，V为透析内液和外液的总体积(mL)，M为β-葡聚糖总量(mg)。
结果：如图1所示，pH值对β-葡聚糖和茶多酚的复合量具有显著影响，随着pH值的升高，β-葡聚糖对茶多酚的吸附量逐步增加，当pH值达到6时，β-葡聚糖对茶多酚的吸附量达到最大值，之后继续升高pH值，β-葡聚糖对茶多酚的吸附量反而下降。其可能原因是pH值影响了β-葡聚糖的高级结构和螺旋结构，以及β-葡聚糖和茶多酚的聚集情况，从而使β-葡聚糖对茶多酚的吸附发生变化。
2、离子强度对β-葡聚糖和茶多酚复合量的影响
方法：在透析袋内加入浓度为0.5mg/mL的β-葡聚糖溶液6mL和浓度为0.5mg/mL的茶多酚溶液2mL，再将透析袋放入pH值为6，离子强度分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的磷酸缓冲液30mL中，在室温下透析16小时至达到平衡，采用紫外分光光度法测定透析外液中茶多酚的浓度，计算β-葡聚糖对茶多酚的吸附量。
结果：如图2所示，离子强度对β-葡聚糖和茶多酚的复合量具有显著影响，随着离子强度的增加，β-葡聚糖对茶多酚的吸附量急剧降低。其可能原因是离子强度的增加使β-葡聚糖处于更多的离子氛围中，与茶多酚结合的空间阻碍和静电排斥作用增大，从而使β-葡聚糖对茶多酚的吸附量减少。
3、温度对β-葡聚糖和茶多酚复合量的影响
方法：在透析袋内加入浓度为0.5mg/mL的β-葡聚糖溶液6mL和浓度为0.5mg/mL的茶多酚溶液2mL，再将透析袋放入蒸馏水30mL中，分别在温度20、30、40、50、60℃条件下透析16小时至达到平衡，采用紫外分光光度法测定透析外液中茶多酚的浓度，计算β-葡聚糖对茶多酚的吸附量。
结果：如图3所示，温度对β-葡聚糖和茶多酚的复合量具有显著影响，随着温度升高，β-葡聚糖对茶多酚的吸附量先增加后降低，当温度为30℃时，β-葡聚糖对茶多酚的吸附量达到最大值。其可能原因是温度影响了β-葡聚糖的分子结构以及茶多酚在β-葡聚糖分子链中的取向。
三、响应面分析法优化β-葡聚糖-茶多酚复合物的制备工艺
根据Box-Behnken实验设计原理，综合单因素实验结果，选取pH值、离子强度和温度三因素为自变量(X)，各分三个水平，β-葡聚糖对茶多酚的吸附量为响应值(Y)，采用Design Expert 7.0软件设计响应面实验方案并对实验结果进行回归分析。实验方案及结果见表1。实验结果的二次响应模型方差分析见表2。
表1 响应面实验方案及结果
表2 响应面实验结果的二次响应模型方差分析
由表2可知，模型的p＜0.05，差异显著；失拟项的p＞0.05，差异不显著；说明未知因素对实验结果干扰小，模型选择合适。从方差分析还可以看出，X1X3和X1 2对β-葡聚糖和茶多酚的复合量具有极显著影响(p＜0.01)，X2X3对β-葡聚糖和茶多酚的复合量具有显著影响(p＜0.05)，说明各自变量对响应值的影响不是简单的线性关系。经回归拟合后，各自变量对响应值的影响可用回归方程表示为：Y＝125.05-1.39 X1+0.043 X2+9.14 X3+4.98 X1X2-18.59 X1X3+12.59 X2X3-18.53 X1 2-7.50 X2 2-6.88X3 2；决定系数R2＝0.9425，说明回归方程的拟合程度良好，误差小。
根据上述回归方程作出响应面分析图，如图5所示。
利用Design Expert 7.0软件进行分析计算，得β-葡聚糖-茶多酚复合物的最佳制备条件为：pH值为5.56、离子强度为0.13mol/L、温度为40℃，β-葡聚糖对茶多酚的吸附量预测值为136.15μg/mg。
四、β-葡聚糖-茶多酚复合物的优化制备工艺的实验验证
按照上述最佳制备条件进行三次平行验证实验：在透析袋内加入浓度为0.5mg/mL的β-葡聚糖溶液6mL和浓度为0.5mg/mL的茶多酚溶液2mL，再将透析袋放入pH值为5.56，离子强度为0.13mol/L的磷酸缓冲液30mL中，在温度40℃条件下透析16小时至达到平衡，采用紫外分光光度法测定透析外液中茶多酚的浓度，计算β-葡聚糖对茶多酚的吸附量。结果β-葡聚糖对茶多酚的吸附量实测值为134.55±15.55μg/mg，与预测值基本一致。使用酒石酸亚铁比色法测得复合物中茶多酚含量为2％。
实验中还发现，β-葡聚糖对茶多酚的吸附作用不是简单的放热，因此，β-葡聚糖对茶多酚的吸附作用不是简单的物理吸附。
分别将β-葡聚糖溶液和β-葡聚糖-茶多酚复合物溶液滴在新解离云母片上，待自然风干后，用原子力显微镜在Tapping模式下成像。所得原子力显微图如图6所示，可见β-葡聚糖的聚集体呈球状或网状结构，同时在这些结构周边或空隙间有多糖颗粒出现，微小颗粒聚集成紧密的球状结构，球内有孔洞，球层上及周边有多糖颗粒单个分布，直径约20nm；而β-葡聚糖-茶多酚复合物呈现规则形状，在β-葡聚糖的聚集体球状周围均匀分布着茶多酚分子。
分别将β-葡聚糖、茶多酚、β-葡聚糖-茶多酚复合物以及β-葡聚糖和茶多酚的混合物进行红外光谱扫描。所得红外光谱图如图7所示，可见β-葡聚糖-茶多酚复合物与β-葡聚糖和茶多酚的混合物的红外光谱不同；与β-葡聚糖相比，β-葡聚糖-茶多酚复合物的-OH伸缩振动吸收峰向低频扩展，-OH变形振动吸收峰向高频扩展。
五、β-葡聚糖-茶多酚复合物的抗氧化能力研究
1、β-葡聚糖-茶多酚复合物对羟基自由基的清除能力
方法：参照文献方法(Jianlin Li，et al.The in vitro antioxidant activity of lotusgerm oil from supercritical fluid carbon dioxide extraction.Food Chemistry，2009，115(3)：939-944)，在具塞比色管中加入浓度为0.02mmol/L的结晶紫溶液1.4mL、浓度为5mmol/L的硫酸铁溶液1mL、pH为5.5的Tris-HCl缓冲液1mL、浓度为2.5mmol/L的过氧化氢溶液1mL、不同浓度的样品溶液2mL，用水定容至总体积为10mL，于波长580nm处测定吸光度A2，同时测定未加入过氧化氢体系的吸光度A0以及未加入样品体系的吸光度A1，按下式计算羟基自由基清除率：
羟基自由基清除率(％)＝[(A2-A1)/(A0-A1)]×100％
结果：如图8所示，β-葡聚糖-茶多酚复合物对羟基自由基的清除能力大于β-葡聚糖或茶多酚单独作用时的清除能力，且清除能力随着复合物浓度增大而逐渐增强。
2、β-葡聚糖-茶多酚复合物对超氧阴离子的清除能力
方法：参照文献方法(Sfahlan AJ，et al.Antioxidants and antiradicals in almondhull and shell(Amygdalus communis L.)as a function of genotype.Food Chemistry，2009，115(2)：529-533)，在具塞比色管中加入浓度为50mmol/L、pH为8.2的Tris-HCl缓冲液7mL、不同浓度的样品溶液2mL，25℃水浴保温20分钟，立即加入预热至25℃、浓度为45mmol/L的邻苯三酚溶液(用浓度为10mmol/L的盐酸溶液配制)40μL，25℃水浴保温3分钟，再迅速加入抗坏血酸溶液50μL，室温下放置5分钟，于波长420nm处测定吸光度A1，同时测定未加入样品体系的吸光度A0以及未加入邻苯三酚体系的吸光度A2，按下式计算超氧阴离子清除率：
超氧阴离子清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
结果：如图9所示，在一定浓度范围内，β-葡聚糖-茶多酚复合物对超氧阴离子的清除能力不仅大于β-葡聚糖或茶多酚单独作用时的清除能力，而且大于β-葡聚糖和茶多酚单独作用时的清除能力之和，即具有协同增效作用。
3、β-葡聚糖-茶多酚复合物对铁离子的还原能力
方法：参照文献方法(Jing Xu，et al.Carboxymethylation of a polysaccharideextracted from Ganoderma lucidum enhances its antioxidant activities in vitro.Carbohydrate Polymers，2009，78(2)：227-234)，在具塞比色管中加入浓度为0.2mol/L、pH为6.6的磷酸缓冲液2.5mL、不同浓度的样品溶液2.5mL和质量分数为1％的铁氰化钾溶液2.5mL，50℃水浴反应20分钟后迅速冷却，加入质量分数为10％的三氯乙酸溶液2.5mL、质量分数为0.1％的三氯化铁溶液1mL和蒸馏水5mL，混匀后室温放置10分钟，于波长700nm处测定吸光度(吸光度越大表明还原力越强)。
结果：如图10所示，β-葡聚糖-茶多酚复合物对铁离子的还原能力大于β-葡聚糖或茶多酚单独作用时的还原能力，且随复合物浓度增大，还原能力线性上升。
4、β-葡聚糖-茶多酚复合物对DPPH自由基的清除能力
方法：参照文献方法(Deliang Qiao，et al.Antioxidant activities of polysaccharidesfrom Hyriopsis cumingii.Carbohydrate Polymers，2009，78(2)：199-204)，将DPPH2mL与不同浓度的样品溶液2mL混匀后于波长517nm处测定吸光度Ai，同时，将DPPH 2mL与体积分数为95％的乙醇2mL混匀后测定吸光度A0，将不同浓度的样品溶液2mL与体积分数为95％的乙醇2mL混匀后测定吸光度Aj，按下式计算DPPH自由基清除率：
结果：如图11所示，在一定浓度范围内，β-葡聚糖-茶多酚复合物对DPPH自由基的清除能力大于β-葡聚糖或茶多酚单独作用时的清除能力，且随着复合物浓度增大，清除能力逐渐增强。
本发明方法适用于各种来源的β-葡聚糖，当β-葡聚糖的分子量较大时，其形成的复杂空间结构和螺旋结构对小分子如茶多酚的包埋效果较好，因此，本发明的β-葡聚糖优选燕麦、大麦来源的β-葡聚糖。本发明的茶多酚可以替换为其活性单体如EGC、EGCG、GCG、EC、ECG、DLC等，都可以实现本发明所述效果。本发明制备方法的主要影响因素如pH值、离子强度和温度可以根据具体实验条件如β-葡聚糖的种类和分子量以及茶多酚的种类等在本发明所述范围内进行调整和优化，以获得最佳制备条件。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (6)
1.β-葡聚糖-茶多酚复合物，其特征在于：由饱和水溶液法制得：在透析袋内加入β-葡聚糖的水溶液与茶多酚或其活性单体的水溶液，再将透析袋置pH为3～7、离子强度为0.05～0.3mol/L的磷酸缓冲液中，在温度20～60℃条件下透析至达到平衡，即得β-葡聚糖-茶多酚复合物；所述β-葡聚糖为燕麦β-葡聚糖或大麦β-葡聚糖。
2.根据权利要求1所述的β-葡聚糖-茶多酚复合物，其特征在于：所述茶多酚活性单体为表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯或儿茶素。
3.根据权利要求1或2所述的β-葡聚糖-茶多酚复合物，其特征在于：所述制备方法中是将透析袋置pH为5.56、离子强度为0.13mol/L的磷酸缓冲液中，在温度40℃条件下透析至达到平衡。
4.权利要求1所述β-葡聚糖-茶多酚复合物在制备抗氧化剂中的应用。
5.权利要求1所述β-葡聚糖-茶多酚复合物在制备抗氧化食品中的应用。
6.权利要求1所述β-葡聚糖-茶多酚复合物在制备抗氧化药物中的应用。
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| CN101953506A (zh) | 2011-01-26 |
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