KR20140132130A - 초음파 추출기술을 이용한 항산화활성이 높은 저카페인 함유 녹차추출물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카페인의 과도한 섭취를 방지하며, 카페인의 긍정적인 효과를 이용할 수 있도록 초음파 추출기술을 이용하여 카페인 함량은 낮추면서도 항산화 활성이 우수한 녹차추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 녹차를 15-25 부피%인 에탄올수용액을 이용하여 20-30 ℃에서, 20-30 분간 초음파를 조사함으로써 항산화 활성이 80-92 %이며, 카페인 함량이 13-17 mg/g인 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물을 제공한다. 본 발명에 따른 녹차추출물은 카페인 함량이 낮으면서도 항산화 활성이 높아 식품첨가제 또는 건강기능식품으로 이용이 가능하다.

Description

초음파 추출기술을 이용한 항산화활성이 높은 저카페인 함유 녹차추출물의 제조방법{Extracts of Green Tea comprising Low caffeine having antioxidant activity Using Ultrasonic waves and preparing method thereof}

본 발명은 초음파를 이용한 녹차추출물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 초음파 추출기술을 이용하여 카페인 함량은 낮으면서도 항산화 활성이 우수한 녹차추출물의 제조방법에 관한 것이다.

차(Camellia sinensis O. Kuntze)는 아열대성 상록식물로 다당류, 페노익(Phenoic) 화합물, 비타민 류와 같은 다양한 유용성분이 함유되어 있으며, 차의 여러 가지 약리적인 효능이 과학적으로 규명되어짐에 따라 단순히 마시는 음료뿐만 아니라 차 잎으로부터 기능성 성분을 추출하여 의약품, 건강기능식품, 화장품 등의 기능성 소재로 각광받고 있다. 특히, 녹차에 함유된 카테킨 화합물은 페노익 화합물의 90 % 이상을 차지하는 물질로서 강력한 항산화, 항암, 혈압강하, 콜레스테롤 재흡수 억제, 충치예방 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

대표적인 카테킨류 화합물은 Epicatechin(EC), epigallocatechin(EGC), epigallocatechin gallate(EGCg) 등이 있으며, 특히 EGCg는 대표적인 강력한 산화제로 비타민 C 보다 20배, 비타민 E 보다 30배 강한 항산화 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.

그러나 녹차에는 인체에 유용한 약리성분 뿐만 아니라 카페인도 2-4 %로 상당량 함유되어 있다. 카페인은 알칼로이드의 일종으로 생체 내에서 중추신경계 자극에 의한 운동량 및 학습능력을 증가시키고 이뇨작용, 피로경감, 관상혈관 및 말초혈관확장, 기초대사율 증가시키는 등의 긍정적 효능이 있지만, 과잉 섭취시 현기증, 불면증, 신경과민, 부정맥 등의 유해작용을 발생시키며, 특히 태반을 통과하거나 모유 중에 용이하게 이행되므로 임신, 수유부 여성은 주의가 필요한 것으로 알려져 있다.

최근 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 한국 등록특허 제 10-0673605호에서는 물 또는 알콜을 혼합한 용매를 이용하여, 환류냉각 추출의 방법으로 녹차로부터 헬리코박터 파일로리 우레아제 활성저해능을 지닌 유효성분을 추출하고 있으며, 카페인을 제거하기 위한 방법으로 이온교환 수지컬럼을 이용하고 있다. 또한 한국 등록특허 제10-1072447호에서는 물 또는 저급알콜 수용액에 녹차를 침지시켜 카테킨을 추출하고 있으며, 카페인을 추가로 제거하는 단계를 가지고 있다.

상기와 같이, 카페인은 부정적인 기능만이 아닌 상기와 같은 긍정적 효능을 동시에 가지고 있는 물질이다. 그러나 카페인을 제거하는 단계에서는 클로로포름 등의 유해한 유기용매들이 사용되고 있으므로, 인체에 유해한 유기용매를 사용하여 카페인을 모두 제거하는 것보다는, 적당량 섭취하는 것이 건강상 유익하다. 따라서 카페인 함량이 조절되면서 카테킨 등의 항산화 물질을 다량 함유하는 녹차 추출기술의 개발이 필요하다.

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 초음파 추출기술을 이용하여 카페인 함량은 낮으면서도 항산화 활성이 우수한 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 제조방법에 따라 제조된 항산화활성이 우수한 저카페인 녹차추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 상기 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는 식품첨가제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명이 해결하고자 하는 네 번째 과제는 상기 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 콜레스테롤 저하 또는 암질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 녹차를 알콜 함량이 15-25 부피%인 에탄올수용액에 침지시키고, 20-30 ℃에서, 20-30 분간 초음파를 조사하여 녹차추출물을 얻는 단계; 및 상기 녹차추출물을 0-10 ℃에서 3000-5000 rpm의 속도로 5-30분간 원심분리하고, 상층액을 0.2-10 ㎛ 멤브레인으로 여과하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 녹차는 평균입도가 10-30 ㎛ 일 수 있으며,

상기 초음파 조사는 15-25 kHz, 500-800 watt로 조사될 수 있는데,

상기 녹차추출물은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryldrazyl) 라디칼 소거능에서 항산화 활성이 80-92 %이며, 카페인 함량이 13-17 mg/g일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명은 녹차를 알콜 함량이 19.7 %인 에탄올수용액에 침지시키고, 24 ℃에서 20 kHz, 750 watt 및 20 amplitude의 초음파를 26.4 분간 조사하는 단계를 수행하여 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물을 제공할 수 있는데, 상기 녹차추출물은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryldrazyl) 라디칼 소거능에서 항산화 활성이 84.8 %이며, 카페인 함량이 16.5 mg/g일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명에 따라 제조된 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는 식품첨가제가 제공된다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명에 따라 제조된 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 콜레스테롤 저하 또는 암질환 예방 또는 개선용 건강기능식품이 제공된다.

본 발명에 따른 녹차추출물의 제조방법은 카페인의 과도한 섭취를 방지하며 카페인이 긍정적인 효과를 이용할 수 있도록 초음파 추출기술을 이용하여 녹차의 카페인 함량을 낮추면서도 항산화 활성이 우수한 녹차추출물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 낮은 온도 및 단시간에 녹차로부터 인체에 유용한 약리성분을 추출할 수 있으며, 카페인을 제거하기 위한 단계를 필요로 하지 않으므로 경제적이고, 카페인 제거를 위한 유기용매를 사용하지 않아 친환경적이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 추출용매로 물을 사용하며, 각각 초음파 및 진탕 추출방법으로 추출시간의 변화에 따라 추출된 녹차추출물의 총카테킨 함유량을 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 추출용매로 50 부피% 에탄올수용액을 사용하며, 각각 초음파 및 진탕 추출방법으로 추출시간의 변화에 따라 추출된 녹차추출물의 총카테킨 함유량을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 추출온도에 따른 녹차추출물의 총카테킨 함유량을 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 추출용매 중 에탄올 함량의 변화에 따른 녹차추출물의 유효성분을 비교한 그래프이다. 도 4(A)는 총카테킨 및 총폴리페놀 함유량을 비교한 그래프이며, 도 4(B)는 카페인 함량을 비교한 그래프이다.
도 5는 항산화 활성에 영향을 미치는 요인에 대한 3차원 반응표면 그래프이다.
도 6은 카페인 함량에 영향을 미치는 요인에 대한 3차원 반응표면 그래프이다.

일반적으로 녹차 중의 유효성분은 물이나 에탄올 등의 용매를 이용하여 추출 될 수 있는데, 물을 사용하여 추출할 경우 높은 온도 및 장시간 추출 조건을 필요로 하여 녹차에 함유된 카테킨이 분해될 수 있으며, 에피머화 현상으로 인하여 생리활성이 떨어지는 녹차추출물을 얻게 되며, 카페인이 과도하게 추출되는 단점이 있다. 한편, 에탄올 추출의 경우, 추출온도 및 추출시간을 낮춰 추출될 수 있으나, 유기용매를 사용하므로 비용이 증가하며, 환경오염 등의 문제점이 있다.

한편, 초음파를 이용한 기술은 초음파 진동에 의한 cavitation(공동현상)에 의해 매우 큰 에너지가 발생되며, 이로 인해 세척, 분산, 액체 내의 화학반응이 촉진되는 것으로 알려져 있다. 따라서 초음파를 이용할 경우 낮은 온도 및 단시간 내에 녹차추출물을 회수할 있어 추출공정의 효율화를 높일 것으로 기대된다. 이에 본 발명자들은 초음파추출 및 반응표면분석법을 이용하여 녹차추출물의 항산화력은 최대화하면서 카페인 함량은 최소화 할 수 있는 녹차추출물의 최적 추출조건을 찾고자 예의 노력한 결과 본 발명에 따른 녹차추출물의 최적 추출조건을 도출하였다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 녹차를 알콜 함량이 15-25 부피%인 에탄올수용액에 침지시키고, 20-30 ℃에서, 20-30 분간 초음파를 조사하여 녹차추출물을 얻는 단계; 및 상기 녹차추출물을 0-10 ℃에서 3000-5000 rpm의 속도로 5-30분간 원심분리하고, 상층액을 0.2-10 ㎛ 멤브레인으로 여과하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 녹차는 녹차잎을 분쇄한 가루녹차 일 수 있는데, 가루녹차를 사용하는 것이 표면적이 넓어져 녹차의 유효물질이 추출되는데 용이하므로 바람직하며, 평균입도가 1-30 ㎛인 녹차일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 의하면, 상기 초음파 조사는 15-25 kHz, 500-800 watt 및 20 amplitude로 조사될 수 있으며, 상기 범위인 것이 항산화 활성은 높고, 카페인 함량은 낮은 녹차추출물을 얻을 수 있어 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 녹차추출물은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryldrazyl) 라디칼 소거능에서 항산화 활성이 80-92 %이며, 카페인 함량이 13-17 mg/g일 수 있다.

좀 더 바람직하게는 녹차를 알콜 함량이 19.7 %인 에탄올수용액에 침지시키고 24 ℃에서 20 kHz, 750 watt 및 20 amplitude의 초음파를 26.4 분간 조사하여 녹차추출물을 얻을 수 있는데,

상기 조건인 것이 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryldrazyl) 라디칼 소거능에서 항산화 활성이 84-91 %이며, 카페인 함량이 15-17 mg/g인 저카페인을 함유하면서 항산화 활성이 우수한 녹차추출물을 얻을 수 있어 바람직하다.

또한 본 발명은 상기 저카페인을 함유하면서 항산화 활성이 우수한 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는 식품첨가제를 제공한다.

본 발명에 따른 녹차추출물을 일반 식품의 유효성분 첨가물로 사용하는 경우 본 발명에 따른 녹차추출물을 그대로 첨가하거나 나른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다.

일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명에 따른 녹차추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 추출물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 저카페인을 함유하면서 항산화 활성이 우수한 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 콜레스테롤 저하 또는 암질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 따른 녹차추출물을 건강기능식품의 유효성분으로 사용하는 경우, 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

건강기능식품을 분말, 과립, 정제 또는 캅셀 형태로 제형화 할 경우, 식품제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

상기 외 본 발명에 따른 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유될 수 있으며, 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용될 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나, 본 발명의 조성물 전체 100 중량부%에 대하여 0.01-0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예

본 발명에 사용되는 녹차는 잎 녹차를 평균입도 19.08 ㎛가 되도록 제트밀로 분쇄하여 가루녹차로 사용하였다.

본 발명에 사용되는 초음파 추출방법은 초음파 추출기(SEEC-SONIC Ⅱ, UL-Tech. com. Uiwang, Korea)를 사용하여 20 kHz, 750 watt 및 20 amplitude 조건에서 초음파를 발생시켜 추출하였으며, 온도를 일정하게 유지하기 위하여 순환식 항온 수조(Circulator Water Bath)를 연결하여 사용하였다.

실시예 1. 추출용매에 따른 녹차추출

실시예 1.1

6개의 반응기에 각각 가루녹차 5g을 증류수 500 ml에 넣고, 초음파 추출방법을 이용하여 30 ℃에서 추출시간을 각각 5, 10, 15, 20 및 30분으로 하여 녹차의 유효성분을 추출하였다. 추출물을 4 ℃에서 원심분리(4000rpm, 15분)하여 가루녹차를 침전시킨 후, 0.45 ㎛ 멤브레인으로 여과하여 녹차추출물을 얻었다.

실시예 1.2

증류수 대신 50 부피% 에탄올수용액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 녹차추출물을 얻었다.

비교예 1.

비교예 1.1

초음파 추출방법 대신 진탕(shaking) 추출방법을 이용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 녹차추출물을 얻었다.

비교예 1.2

초음파 추출방법 대신 진탕(shaking) 추출방법을 이용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 녹차추출물을 얻었다.

비교예 1.3 추출온도에 따른 영향 측정

추출온도를 30 ℃ 대신 70 ℃를 사용한 것을 제외하고는 비교예 1.1의 방법으로 녹차추출물을 얻었다.

시험예 1. 용매에 따른 카테킨의 함량 측정

녹차 카테킨 추출시 초음파 추출 및 일반적인 추출방법인 진탕(shaking) 추출에서 용매에 따른 영향을 알아보기 위하여 물 및 50% 에탄올수용액으로 각각 추출한 후 카테킨 함량을 정량하였다.

시험예 1.1 물 추출

실시예 1.1 및 비교예 1.1에서 얻은 녹차추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu assay 방법으로 정량하여 gallic acid equivalent로 나타내었으며, 카테킨 및 카페인은 XTerra RP18 column(3.5 ㎛, 4.6×150 mm, Waters, Milford, Massachusetts, USA)을 사용하여 HPLC로 분석하였으며, 이를 표 1 및 도 1에 나타내었다.

	추출시간에 따른 총 카테킨 함량 (g/100g)
	5 min.	10 min.	15 min.	20 min.	30 min.
실시예 1.1	4.329	4.805	5.364	5.015	4.996
비교예 1.1	3.412	3.770	4.192	4.296	4.325

상기 표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 물을 사용하여 초음파 추출한 경우, 진탕 추출한 경우에 비하여 카테킨의 함량이 15.5-27.9 중량% 증가하였다.

시험예 1.2 50 부피% 에탄올수용액 추출

실시예 1.2 및 비교예 1.2에서 얻은 녹차추출물의 총 폴리페놀 함량을 시험예 1.1의 방법으로 정량하였으며, 이를 표 2 및 도 2에 나타내었다.

	추출시간에 따른 총 카테킨 함량 (g/100g)
	5 min.	10 min.	15 min.	20 min.	30 min.
실시예 1.2	7.189	9.637	10.303	11.590	13.387
비교예 1.2	6.560	7.884	10.186	11.001	10.775

상기 표 2 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 50 부피% 에탄올수용액을 사용하여 초음파 추출한 경우, 진탕 추출한 경우에 비하여 카테킨의 함량이 1.4-24.2 중량% 증가하였다.

시험예 2. 추출온도에 따른 카테킨의 함량 측정

실시예 1, 비교예 1.1 및 비교예 1.3에서 추출한 녹차추출물을 시험예 1의 방법으로 카테킨의 함량을 정량하였으며, 이를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.

		추출시간에 따른 총 카테킨 함량 (g/100g)
		5 min.	10 min.	15 min.	20 min.	30 min.
실시예 1.1	30 ℃	4.329	4.805	5.364	5.015	4.996
비교예 1.1	30 ℃	3.412	3.770	4.192	4.296	4.325
비교예 1.3	70 ℃	6.004	6.127	6.735	7.010	7.642

상기 표 3 및 도 3에 나타낸 바와 같이 70 ℃에서 30분간 진탕 추출한 경우는 30 ℃에서 30분간 진탕 추출한 경우에 비하여 카테킨 함량이 약 76.6 % 증가하였다. 그러나 같은 30 ℃에서 추출한 경우에는 진탕 추출에 비해 초음파 추출이 추출시간에 따라 카테킨의 함량이 약 16-28 % 정도 더 높일 수 있는 것으로 나타났다.

따라서, 상기 시험 1 및 2의 결과를 통해, 초음파 추출방법이 녹차추출물에서 카테킨의 추출 수율을 높일 수 있는 방법이 될 수 있으며, 추출용매의 에탄올 농도와 추출온도가 카테킨의 추출 수율에 영향을 주는 것으로 나타났다. 또한, 녹차 최적추출을 위한 예비실험결과 초음파 추출 및 진탕 추출 모두 추출용매 중 에탄올의 농도에 가장 큰 영향을 받는 것으로 나타났다. 따라서 에탄올 농도에 따른 총카테킨의 함량, 총폴리페놀 함량 및 카페인 함량에 대하여 정량분석 하였다.

실시예 2. 에탄올 함량에 따른 녹차추출

6개의 반응기에 각각 가루녹차 5g을 각각 에탄올의 함량이 각각 0, 30, 50, 70, 100 부피%인 추출용매 500 ml에 넣고, 초음파 추출방법을 이용하여 30 ℃에서 120 분간 초음파를 발생시켜 녹차의 유효성분을 추출하였다. 추출물을 4 ℃에서 원심분리(4000rpm, 15분)하여 가루녹차를 침전시킨 후, 0.45 ㎛ 멤브레인으로 여과하여 녹차추출물을 얻었다.

시험예 3. 에탄올 함량에 따른 녹차추출물의 카테킨 및 카페인 함량 평가

실시예 2에서 얻은 녹차추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu assay 방법으로 정량하여 gallic acid equivalent로 나타내었으며, 카테킨 및 카페인은 XTerra RP18 column(3.5 ㎛, 4.6×150 mm, Waters, Milford, Massachusetts, USA)을 사용하여 HPLC로 분석하였으며, 이를 하기 표 4 및 도 4에 나타내었다.

하기 표 4 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 총 카테킨의 함량은 에탄올 농도에 비례하여 유의적으로 증가하다 무수에탄올에서는 오히려 물 100 %의 경우보다 더 적게 추출되는 것으로 나타났다. (P<0.05)

에탄올 농도에 따른 총 폴리페놀 함량은 도 4A에서와 같이, 30 부피% 에탄올 농도에서 13.1 g/100g, 50 부피% 에탄올 농도에서 14.0 g/100g 및 70 부피% 에탄올 농도에서 14.4 g/100g가 검출되었으며, 70 부피% 에탄올 농도에서 가장 높게 검출되는 것으로 나타났다.

반면, 에탄올 농도에 다른 카페인 함량은 도 4B에 나타낸 바와 같이 총 카테킨 함량과 비슷한 양상을 보였으나, 에탄올 50 부피%와 70 부피 % 처리구 간의 카페인 함량에 대한 유의적 차는 없는 것으로 나타났다.

에탄올 함량 (부피%)	총폴리페놀 (g/100g)	총카테킨 (g/100g)	총카페인 (g/100g)
0	8.423	7.056	1.722
30	13.102	10.788	2.138
50	13.978	12.217	2.211
70	14.378	13.608	2.241
10	7.214	6.07	1.254

실시예 3. 반응표면법( Response Surface Methodology , 이하 RSM )을 이용한 초음파 녹차추출의 최적화

카테킨 등 페노익 화합물에 나타나는 항산화 활성은 높이면서 카페인 함량은 낮출 수 있는 초음파 녹차 추출의 최적화를 위해 RSM을 사용하여 20개의 실험조건을 도출하였으며, 상기 실험조건하에서 항산화 활성 및 카페인 함량을 분석하여 하였다.

실시예 3.1 반응표면모델식의 도출

가. 실험설계

반응표면분석을 위하여 MINITAB (version 16, Minitab Inc., State college, PA, USA)을 사용하였으며 카테킨 추출을 위한 조건 최적화에 대한 실험계획은 중심합성법에 따라 설계하였다. 카테킨 추출의 최적화를 위한 독립변수는 에탄올 농도(X₁), 추출시간(X₂), 추출온도(X₃)에 대하여 각 변수들을 -1.68, -1, 0, +1, +1.68의 5단계로 부호화하여 중심합성법에 따라 총 20개의 실험구간으로 설정하였다. 이들 독립변수에 영향을 받는 종속변수는 항산화활성(Y₁) 및 카페인 함량(Y₂)을 사용하였다.

나. 반응표면분석에 의한 조건 최적화

RSM에 따라 설계한 실험구에 의하여 도출된 결과를 RSREG(response surface regression)을 이용하여 통계분석하였고, 3차원 분석을 통하여 항산화활성은 최대화하면서 카페인 함량은 최소화하는 추출 조건의 최적화를 실시하였다.

실시예 3.2 항산화 활성능 측정

녹차추출물의 항산화 활성능은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryldrazyl) 라디칼 소거능으로 확인하였으며, 측정방법은 하기와 같다.

희석한 녹차추출물 0.5 mL에 0.12 mM DPPH solution (2.5 mL)을 가한 후 10초간 진탕하고 실온에 30분간 정지 한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며 ,대조구는 시료 대신 추출용매 0.5 mL를 가하였으며 양성 대조구는 ascorbic acid를 사용하였다.

DPPH scavenging activity (%) = 100-[(absorbance of sample at 517 nm/absorbance of blank at 517 nm) × 100]

실시예 3.3 RSM 설계에 따른 분석

가. 실험설계 및 항산화활성, 카페인 함량 분석

RSM에 의하여 설계된 20개의 실험조건에 대하여 항산화 활성 및 카페인 함량을 분석하였으며, 이를 하기 표 5에 나타내었다.

실험번호	Coded and processed variable level			Response (mg/g)
	X1	X2	X3	Y1	Y2
1	0 (50)	0 (60)	-1.682(65.2)	80.48	19.49
2	0 (50)	0 (60)	0 (40)	79.77	18.54
3	-1 (32)	-1 (40)	-1 (25)	79.43	16.84
4	1 (68)	-1 (40)	1 (55)	80.22	18.08
5	0 (50)	0 (60)	0 (40)	79.58	17.96
6	0 (50)	0 (60)	0 (40)	79.51	18.22
7	0 (50)	-1.682(26.4)	0 (40)	79.49	17.93
8	0 (50)	0 (60)	0 (40)	79.09	18.07
9	-1 (32)	1 (80)	-1 (25)	79.62	17.31
10	1 (68)	-1 (40)	-1 (25)	79.62	18.04
11	0 (50)	0 (60)	0 (40)	78.87	18.00
12	-1.682(19.7)	0 (60)	0 (40)	79.67	16.39
13	1 (68)	1 (80)	-1 (25)	82.99	18.33
14	0 (50)	0 (60)	0 (40)	77.28	18.56
15	0 (50)	0 (60)	-1.682(65.2)	77.07	18.08
16	0 (50)	-1.682(26.4)	0 (40)	82.36	18.04
17	-1.682(19.7)	0 (60)	0 (40)	83.78	18.01
18	-1 (32)	-1 (40)	1 (55)	80.84	17.33
19	1 (68)	1 (80)	1 (55)	83.60	18.67
20	-1 (32)	1 (80)	1 (55)	81.45	18.09

X₁(에탄올 농도, %, v/v), X₂(추출시간, min), X₃(추출온도, ℃)

Y₁(항산화 활성, DPPH radical 소거능 %), Y₂(카페인, g/100g)

상기 표 5를 바탕으로 예상되는 Polynomial 반응 모델식을 하기 표 6에 나타내었다. 상기 모델식에서 결정계수 (R2)는 Y1, Y2에 대해 각각 0.8961, 0.9101로 비교적 높게 나타났으며 변동계수(coefficient of variation) 값은 각각 2.27 및 3.68로 낮게 나타나 예상되는 반응 모델식의 reliability(신뢰도)가 비교적 높은 것으로 나타났다.

Responses	Quadratic polynomial model equations	결정계수(R2)	변동계수(CV)
항산화활성	Y1 = 91.5074 - 0.3590X1 - 0.2940X2 + 0.0857X3 + 0.0032X1 2 + 0.0019X2 2 + 0.0000X3 2 + 0.0021X1X2 - 0.0009X1X3 + 0.0002X2X3	0.8961	2.27
카페인	Y1 = 12.1785 + 0.1707X1 + 0.0394X2 - 0.0341X3 - 0.0012X1 2 - 0.0003X2 2 + 0.0007X3 2 - 0.0001X1X2 - 0.0004X1X3 + 0.0002X2X3	0.9101	3.68

X₁(에탄올 농도, %, v/v), X₂(추출시간, min), X₃(추출온도, ℃)

Y₁(항산화 활성, DPPH radical 소거능 %), Y₂(카페인, g/100g)

R2(결정계수), CV(변동계수; coefficient of variation)

각 반응에 대한 분석결과를 하기 표 7에 나타내었으며, 모형의 타당성을 나타내주는 지표로서 사용되는 lack of fit(적합결여검정) 값은 유의수준이 0.05 이상이 될수록 모델이 반응표면을 적합시킨 것으로 판단하는데 본 실험결과 Y₁, Y₂에 대한 유의수준은 각각 0.717, 0.464로서 유의성이 인정되지 않았으므로(p>0.05) 상기 반응모델식이 타당한 것으로 판단하였다.

	Degree of freedom	Sum of squares	Mean square	F-value	P-value
항산화력
모델	9	56.6980	5.9372	9.59	0.001
X1	1	10.5842	9.8906	15.05	0.003
X2	1	11.2031	7.7975	11.87	0.006
X3	1	7.5784	0.3988	0.61	0.454
X1X2	1	13.9271	15.6784	23.86	0.001
X1X3	1	8.4326	8.3531	12.71	0.005
X2X3	1	0.0000	0.0000	0.00	0.996
X1 2	1	4.4342	4.4342	6.75	0.027
X2 2	1	0.5157	0.5157	0.78	0.396
X3 2	1	0.0226	0.0226	0.03	0.857
Lack of fit	5	2.4163	0.4833	0.58	0.717
카페인
모델	9	7.5879	0.8431	11.26	0.000
X1	1	2.8716	2.2364	29.82	0.000
X2	1	0.3873	0.1404	1.87	0.201
X3	1	1.1878	0.0633	0.84	0.380
X1X2	1	2.3152	2.2194	29.60	0.000
X1X3	1	0.2536	0.1920	2.56	0.141
X2X3		0.4088	0.4088	5.45	0.042
X1 2	1	0.0162	0.0162	0.22	0.652
X2 2	1	0.1032	0.1032	1.38	0.268
X3 2	1	0.0442	0.0442	0.59	0.460
Lack of fit	5	0.3907	0.0781	1.09	0.464

X₁(에탄올 농도, %, v/v), X₂(추출시간, min), X₃(추출온도, ℃)

Y₁(항산화 활성, DPPH radical 소거능 %), Y₂(카페인, g/100g)

나. 종속변수에 대한 독립변수의 영향

표 6의 다항식 모델식에 따른 항산화활성(Y₁) 및 카페인 함량(Y₂)에 대한 영향을 쉽게 알아보기 위한 3차원 반응표면 그래프를 도 5와 도 6에 나타내었다. 항산화활성(Y₁) 및 카페인 함량(Y₂) 모두 에탄올 농도에 가장 크게 영향을 받는 것으로 나타났다 (p<0.01).

다. 최적 제조조건 설정

녹차 초음파 추출의 최적화를 위해 Minitab 프로그램의 response optimizer를 사용하였으며 항산화 활성은 높이면서 상대적으로 카페인 함량은 낮출 수 있는 녹차 추출물을 위한 최적 조건은 하기 표 8에 나타낸 바와 같이 에탄올농도(X₁) = 19.7%, 추출시간(X₂) = 26.4분, 추출온도(X₃)= 24.0 ℃로 도출되었다. 이때 예상되는 항산화 활성과 카페인 함량은 각각 82.1% 및 15.4 mg/g으로 산출되었다.

실시예 4. 최적조건에 의한 녹차추출

상기 도출된 최적조건으로 실제 실험하여 녹차추출물을 얻은 후 항산화 활성과 카페인 함량을 측정하였다. 상기 항산화 활성과 카페인 함량은 각각 84.8 % 및 16.5 mg/g으로 이론값보다 약간 높게 나타났다.

추출법	에탄올 (%)	추출시간 (분)	추출온도 (℃)	항산화활성 (%)	카페인함량 (mg/g)
실시예 4	19.7	26.4	26	82.1 (실험:84.8)	15.4 (실험:16.5)
진탕추출	70	120	30	85.2	22.0

상기 표 8에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 항산화활성이 높은 저카페인 함유 녹차추출물은 진탕추출에 의한 녹차추출물에 비하여 항산화활성의 유의적 차이가 없으면서도 카페인 함량은 22.0 mg/g에서 16.5 mg/g로 약 25 % 낮출 수 있었다. 또한, 추출시간은 120 분에서 26.4 분으로 약 78.0 % 단축시켰으며, 에탄올의 함량은 70 %에서 19.7 %로 약 71.9 % 낮춤으로써 기존의 방법에 비하여 경제적이면서도 효율적임을 확인하였다.

비교예 2. 최적조건 검정

항산화 활성은 높이면서 상대적으로 카페인 함량은 낮출 수 있는 녹차 추출물을 위한 최적 조건에 대한 검증을 위해, 모델링에 의해 도출된 2 순위 및 3 순위 조건으로 실험하여 녹차추출물을 얻은 후 항산화 활성과 카페인 함량을 측정하였으며, 이를 하기 표 9에 나타내었다. 2 순위 최적 조건은 하기 표 9에 나타낸 바와 같이 에탄올농도(X₁) = 58.8%, 추출시간(X₂) = 38분, 추출온도(X₃)= 29.0 ℃로 도출되었으며, 3 순위 최적 조건은 하기 표 9에 나타낸 바와 같이 에탄올농도(X₁) = 26.43%, 추출시간(X₂) = 93.6분, 추출온도(X₃)= 65.2.0 ℃로 도출되었다.

비교예 2.1. 2 순위 추출조건

2 순위 추출조건에 의한 녹차추출물의 항산화 활성은 85.5 %로 최적조건에 비하여 약 0.8 %가량 증가하여 항산화 활성에 있어서 큰 차이는 없었으나, 카페인 함량은 약 13 % 가량 증가하여 18.7 mg/g 함유하는 것으로 측정되었다.

비교예 2.2. 3순위 추출조건

한편, 3 순위 추출 조건에 의한 녹차추출물은 항산화 활성이 85.9 %로 최적조건에 비하여 약 1.3 % 가량 증가하여 항산화 활성에 있어서 큰 차이는 없었으나, 카페인 함량은 약 33.3 % 가량 증가하여 22.0 mg/g을 함유하는 것으로 측정되었다. 따라서 본 발명에 의한 조건이 카페인 함량은 낮추면서도 항산화 활성이 우수한 녹차추출물을 얻을 수 있는 최적 조건임을 확인하였다.

	에탄올 (%)	추출시간 (분)	추출온도 (℃)	항산화활성 (%)	카페인함량 (mg/g)
실시예 4	19.7	26.4	24	84.8	16.5
비교예 2.1	58.8	38	29	85.5	18.7
비교예 2.2	26.43	93.6	65.2	85.9	22.0

제제예

제제예 1. 건강기능식품 ( 분말제 )의 제조

실시예 4의 녹차추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 4의 녹차추출물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 4의 녹차추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

실시예 4의 녹차추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 5. 건강기능식품의 제조

실시예 4의 녹차추출물 1,000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6. 기능성 음료의 제조

실시예 4의 녹차추출물 1,000 mg

구연산 1,000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (12)

1. 녹차를 알콜 함량이 15-25 부피%인 에탄올수용액에 침지시키고, 20-30 ℃에서, 20-30 분간 초음파를 조사하여 녹차추출물을 얻는 단계; 및
   상기 녹차추출물을 0-10 ℃에서 3000-5000 rpm의 속도로 5-30분간 원심분리하고, 상층액을 0.2-10 ㎛ 멤브레인으로 여과하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 녹차는 평균입도가 10-30 ㎛인 것을 특징으로 하는 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 초음파 조사는 15-25 kHz, 500-800 watt로 조사되는 것을 특징으로 하는 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물의 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 녹차추출물은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryldrazyl) 라디칼 소거능에서 항산화 활성이 80-92 %인 것을 특징으로 하는 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물의 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 녹차추출물은 카페인 함량이 13-17 mg/g인 것을 특징으로 하는 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물의 제조방법.
6. 제1항에 있어서, 녹차를 알콜 함량이 19.7 %인 에탄올수용액에 침지시키고 24 ℃에서 20 kHz, 750 watt 및 20 amplitude의 초음파를 26.4 분간 조사하는 것을 특징으로 하는 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물의 제조방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물.
8. 제7항에 있어서, 상기녹차추출물은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryldrazyl) 라디칼 소거능에서 항산화 활성이 80-92 %인 것을 특징으로 하는 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물.
9. 제7항에 있어서, 상기녹차추출물은 카페인 함량이 13-17 mg/g인 것을 특징으로 하는 저카페인 함유 항산화 활성 녹차추출물.
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 저카페인 함유 항산화 활성 녹차 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품첨가제.
11. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 콜레스테롤 저하 또는 암질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
12. 제11항에 있어서, 상기 건강기능식품은 분말 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 이루어진 것을 특징으로 하는 항산화, 콜레스테롤 저하 또는 암질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.

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