CN101940579B - 安格洛苷c的医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属中药制药领域,涉及中药玄参中苯丙素类成分-安格洛苷C在制备防治心肌肥大、心室重构、充血性心衰药物中的用途。本发明采用腹主动脉缩窄致大鼠心室重构模型对安格洛苷C的作用进行研究。实验结果揭示,安格洛苷C通过抑制导致心肌肥大、心室重构的有关刺激、介导因素,从而改善心肌肥大、心室重构的症状和心肌的生物学功能。安格洛苷C对心肌细胞肥大和间质胶原重构两方面都有显著的抑制作用,能平衡心肌胶原纤维代谢,可用于制备防治心肌肥大、心室重构的药物,进而可预防或延缓心衰的发生、发展,减少心肌肥大、心室重构患者心律失常、心衰、猝死的发生率。另外,本发明公开了一种从玄参中提取分离安格洛苷C的新工艺。
Description
技术领域
本发明属中药制药领域,涉及中药玄参中苯丙素类成分-安格洛苷C的医药新用途。另外,本发明涉及一种从玄参中提取分离安格洛苷C的新工艺。
背景技术
玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoenisis Hemsl.的干燥根,是常用传统中药,性微寒,味甘、苦、咸,有滋阴、降火、生津、解毒的功能。药理研究显示具有降压、抗菌、降血糖、解热作用。常用于热病烦渴、发斑、齿龈炎、扁桃体炎、痈肿、急性淋巴节炎、淋巴结核、肠燥便秘等症。有报道玄参苯丙素苷用于治疗血栓闭塞性脉管炎(CN1931868)有效;玄参总苷(环烯醚萜类和苯丙素苷类混合物)具有用于防治缺血性脑中风的作用(CN1679810A);有机芳酸和三萜成分具有抗菌活性(Ethnopharmacol.1996,53(1):11;Pharmazie,1997,2:76);多糖具有脑缺血保护作用(CN1486991A)等。至今,未见玄参中苯丙素苷类成分安格洛苷C有改善心室重构、抗心肌肥大作用的报道。
安格洛苷C(Angoroside C)是从玄参中提取分离得到的苯丙素苷类成分,其结构式如下:
云南植物研究〔1994,16(4):407-412〕和中草药〔1999,30(7):487-490〕公开了安格洛苷C的理化及光谱数据。
中国专利CN1931868A于2007年03月21日公开了一种从玄参中提取的总苯丙素苷类化合物及其制备方法。本发明的玄参总苯丙素苷的主要成分为安格洛苷C和麦角甾苷,两者重量比为90-95∶10-5,两者含量之和占总苯丙素苷总重量的80%以上。该玄参总苯丙素苷采用乙醇热提或乙醇渗漉提取法获得。
从中药玄参中采用水提醇沉、大孔树脂和硅胶层析单独提取和分离纯化安格洛苷C的工艺未见有相关的报道。
心肌肥大(myocardial hypertrophy)、心室重构(cardiac remodeling)是心力衰竭的特征,同时也是决定心力衰竭发病率,病程进展和死亡率的因素。心室肥厚常继发于高血压和心肌梗死。心室肥厚通常涉及心室结构的改变,即发生心室重构(remodeling)。心室重构包括心肌细胞肥大、间质细胞如成纤维细胞增殖,胶原增生,同时心脏的顺应性降低,射血功能也受到明显影响。随着心肌肥大、心室肥厚的发生和发展,心律失常、心衰、猝死的发生率提高。因此,心肌细胞肥大、心室重构是慢性心衰(chronic heart failure)的病理核心,使用药物干预和逆转心肌肥大、心室重构是防治CHF的有效手段。
心肌肥大、心室重构与肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性增强,神经内分泌激素的持续激活和交感神经的持续兴奋有关。近年临床对慢性心衰的治疗策略已发生改变,从短期的改善血液动力学措施,转为长期的修复性防治。目的是通过抑制与心肌肥大、心室重构相关的刺激、介导因素,从而改善心肌的生物学功能,改变衰竭心脏的生物学性质。临床研究表明,采用血管紧张素转换酶抑制剂可防止或延缓心肌肥大、心室肥厚的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供安格洛苷C用于制备改善心肌细胞功能、防治心肌肥大、心室重构和慢性心力衰竭药物的新用途。
本发明涉及的安格洛苷C的上述新用途未见有相关的报道。
本发明所要解决的另一技术问题是提供一种从玄参中提取分离安格洛苷C的工艺。该工艺过程简便,能单独提取高纯度的安格洛苷C。
本发明通过下述技术方案实施:
1.从玄参中分离提取苯安格洛苷C及结构鉴定:
本发明提供的从玄参中提取分离安格洛苷C的工艺,包括如下步骤:称取玄参饮片,加8-12倍重量水煎煮2-4次,每次煮1-2小时,合并水煎液,减压浓缩至密度为1.1-1.3,加2-4倍体积的95%乙醇,搅匀,静置过夜,抽滤,滤液回收乙醇至无醇味,浓缩液加水稀释,用乙酸乙酯萃取2-4次,水层蒸去乙酸乙酯后上HPD100大孔吸附树脂,先用8-12倍柱体积的去离子水洗去水溶性糖和无机盐,然后用4-6倍柱体积的40%乙醇洗脱,40%乙醇洗脱液回收乙醇至干,用95%乙醇溶解,拌层析硅胶,干后上100~200目硅胶柱,用体积比氯仿∶甲醇∶水=13∶3∶0.2的混合液洗脱,收集洗脱液,通过硅胶薄层层析检查,以体积比氯仿∶甲醇∶水=10∶3∶0.2的混合液为展开剂,用15%硫酸喷雾加热显色,合并主要红色斑点流份,蒸干,产物经理化与光谱数据鉴定为安格洛苷C(Angoroside C)。
2.安格洛苷C防治心肌肥大、心室重构和慢性心力衰竭作用研究
按本领域公知技术,大鼠腹主动脉缩窄致大鼠心脏压力超负荷法制备心肌肥大、心室重构动物模型;模型动物分别口服安格洛苷C,卡托普利和饮用水,观察动物心脏和左心重量指数(HW/BW,LVW/BW)的变化;比色法测定心肌羟脯氨酸(HYP)含量变化;用放射免疫分析法测定大鼠左心室心肌组织的血管紧张素II(Ang II)浓度的变化。病理组织学方法测定心肌纤维横断面积、心肌细胞间胶原沉积情况;酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定血清基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9及基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)表达;实时荧光分析法(Real-time RT-PCR)测量心肌ET-1、TGF-β1mRNA表达。
结果显示:模型动物HW/BW,LVW/BW明显增加;心肌HYP含量上升;心肌组织AngII浓度上升;心肌细胞横断面积扩大;心肌间胶原纤维沉积增加;MMP-2、MMP-9表达增加,TIMP-1表达下降;心肌ET-1、TGF-β1mRNA表达增加。安格洛苷C可降低HW/BW,LVW/BW;减少心室HYP含量;减少心肌组织Ang II浓度;减少心肌细胞横断面积;抑制心肌细胞间胶原沉积;抑制血清MMP-2、MMP-9表达,提高TIMP-1表达;明显抑制与心室重构密切相关的心肌ET-1、TGF-β1mRNA表达。
上述结果说明安格洛苷C通过抑制导致心肌肥大、心室重构的有关刺激、介导因素,从而改善心肌肥大、心室肥厚的症状和心肌的生物学功能。可用于制备防治心肌肥大、心 室重构的药物,进而可预防或延缓心衰的发生、发展,减少心肌肥大、心室肥厚患者心律失常、心衰、猝死的发生率。
本发明的有益效果突出体现在:中药玄参价廉、易得。本发明提供的安格洛苷C提取过程简便,随后的实施例将证明本发明能单独提取高纯度的安格洛苷C。安格洛苷C具有抗心肌肥大,心室重构、防治心衰的新作用,未见明显急性毒性,将其开发应用于防治充血性心力衰竭,对于改善心衰患者的生活质量,降低心律失常的发生率、猝死率及远期死亡率具有重要意义。
据统计,心衰的发病率约为1.0%-1.5%。65岁以上人口的年平均发病率达10%左右。尽管在过去10-20年中,对慢性心衰的治疗取得了很大进步,但心衰患者的5年病死率仍高达50%。因此,慢性心衰一旦发展到血流动力学变化明显之时,靠强心苷类药物治疗绝非上策。尽早使用具有抑制肾素-血管紧张素系统活性,抑制神经内分泌激素激活,防治心肌肥大、心室重构作用的安格洛苷C,对改善心肌的生物学功能,防治心衰具有推广价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。
实施例1
从玄参中分离提取苯安格洛苷C及结构鉴定:
称取8kg玄参饮片(玄参为玄参科多年生草本植物玄参(Scrophularia ningpoensisHemsl)的干燥根),加10倍重量水煎煮3次,每次煮1.5小时,合并水煎液,减压浓缩至密度1.1到1.3,加3倍体积的95%乙醇,搅匀,静置过夜,抽滤,滤液回收乙醇至无醇味,浓缩液加水调成3升,用乙酸乙酯萃取三次(每次用乙酸乙酯800ml),水层蒸去乙酸乙酯后上4kgHPD100大孔吸附树脂,先用10倍柱体积的去离子水洗去水溶性糖、无机盐等杂质,然后用4~6倍柱体积的40%乙醇洗脱,40%乙醇洗脱液回收乙醇至干,得68克左右, 用95%乙醇溶解,拌100克层析硅胶,干后上1500克硅胶(100~200目)柱,用氯仿∶甲醇∶水(13∶3;0.2v/v)洗脱,每份收集200ml,通过硅胶薄层层析检查,用氯仿∶甲醇∶水(10∶3∶0.2v/v)为展开剂,用15%硫酸喷雾加热显色,合并主要红色斑点流份,蒸干,得8克左右产物X。
产物X为淡黄色粉,经测定,UVλmax nm:218,329(MeOH);IR(KBr):3400,1696,1620,1584,1510,1050,810cm-1,MSm/z:807(M+Na);1HNMR(CD3OD)δ:7.67(1H,d,J=18.0Hz,α′-H);6.38(1H,d,J=18.0,β′-H);7.21(1H,d,J=2.5Hz,C2′-H),7.09(1H,dd,J=2.5,10.0Hz,C6′-H),6.81(1H,d,J=10.0Hz,C5′-H),6.76(1H,d,J=2.5Hz,C2-H),6.83(1H,d,J=10.0Hz,C5-H),6.70(1H,dd,J=2.5,10.0Hz,C6-H),4.38(1H,d,J=20.0Hz,Cα′-H),4.24(1H,d,J=20.0,Cβ′-H),3.82(3H,S,OCH3),3.90(3H,S,OCH3),3.75,3.90(2H,m,Cα-H),2.70(2H,m,Cβ-H),1.08(3H,d,rham-6H3),5.13(1H,d,rham-1H),4.15(1H,d,ara-1H),4.41(1H,d,glu-1H).13CNMR产物X的理化及光谱数据如表1所示。经理化与光谱数据鉴定,产物X为安格洛苷C(Angoroside C)。
表1.安格洛苷C的13CNMR数据(CD3OD)
以上理化及光谱数据与文献报道的安格洛苷C的一致〔云南植物研究,1994,16(4):407-412;中草药,1999,30(7):487-490〕。
实施例2
安格洛苷C对腹主动脉结扎所致大鼠心室重构的改善作用:
大鼠用3%戊巴比妥钠0.1ml/100g腹腔注射麻醉,仰位固定,打开腹腔,钝性分离腹主动脉,用内径为0.6mm的银夹不完全结扎左右肾动脉之间的腹主动脉,使之外径狭窄至0.6mm,制备压力超负荷性心室重构模型。假手术组动物仅分离腹主动脉,不做结扎。术后肌肉注射青霉素1×104U·kg-1·d-1,共3d,预防感染。
造模后3天,手术组大鼠随机分组,每组10只。每天给药1次,20ml/kg/d,连续给药4周。①安格洛苷C低剂量组:每天灌胃给予安格洛苷C水溶液7.5mg·kg-1。②安格洛苷C中剂量组:灌胃给予安格洛苷C水溶液15mg·kg-1。③安格洛苷C高剂量组:灌胃给予安格洛苷C水溶液30mg·kg-1。④卡托普利组:灌胃给予卡托普利水溶液40mg/kg。⑤假手术组和模型组大鼠灌胃给予蒸馏水20ml/kg。
(1)对血压的影响
4周后,25%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠,分离颈总动脉,插入聚苯乙烯导管,连接八导生理记录仪记录动脉收缩压(SBP)、动脉舒张压(DBP)、心率(HR)。
结果显示,腹主动脉缩窄4周后,模型组动物动脉血压,无论是收缩压还是舒张压均显著高于假手术组(P<0.01),心率加快却并不显著。与模型组相比,安格洛苷C 30mg·kg-1组动物动脉血压显著降低(P<0.05),见表2。
表2安格洛苷C对腹主动脉缩窄致心室重构大鼠血压的影响(x±SD,n=10)
注:与模型组相比,*P<0.05;**P<0.01
SBP动脉收缩压,DBP动脉舒张压,HR心率
(2)对心脏质量指数的影响
血压测定完成及取血后,快速打开大鼠胸腔取心脏,去除心房组织,沿室间隔剪开,分离左、右心室。冰冷的生理盐水中漂洗去血,用滤纸吸干水分,电子天平准确称取左心室重量和全心重量。计算左心室重量/体重(LVW/BW)比,全心重量/体重(HW/BW)比,分别记为左心室质量指数(LVWI),全心质量指数(HWI)。
结果显示,与假手术组比较,模型组心脏质量指数显著性增加(P<0.01)。与模型组比较,卡托普利组、安格洛苷C15mg·kg-1组和30mg·kg-1组心脏质量指数显著降低(P<0.05),安格洛苷C7.5mg·kg-1组心脏质量指数虽有下降,但差异不显著(P>0.05)。结果见表3。
表3.安格洛苷C对腹主动脉缩窄致心室重构大鼠心脏质量指数的影响(x±SD,n=10)
注:与模型组相比,*P<0.05;**P<0.01
(3)对血清ALD、心肌AngII含量的影响
颈动脉取血,3500r/min离心10min,取上清液测ALD。取大鼠的左室心肌组织约200mg,加入2ml生理盐水在冰浴环境中快速匀浆,3500r/min离心10min,取上清100μl加生理盐水900μl,制成1%匀浆测血管紧张素II(angiotensinII,AngII),同时进行蛋白含量测定,均按试剂盒说明书进行操作,以每毫克蛋白中的AngII含量表示。
结果显示,血清醛固酮水平各组变化不大,差异不显著(P>0.05)。与假手术组比较,模型组AngII含量显著增加(P<0.01)。与模型组比较,卡托普利组、安格洛苷C15mg·kg-1 组和30mg·kg-1组Ang II含量显著降低(P<0.05),安格洛苷C7.5mg·kg-1组虽有降低,但差异并不显著(P>0.05),结果见表4。
表4.安格洛苷C对腹主动脉缩窄致心室重构大鼠ALD、ANG II含量的影响(x±SD,n=10)
注:与模型组相比,*P<0.05;**P<0.01
(4)对心肌羟脯氨酸含量的影响
取2%的心肌组织匀浆,消化法测定心肌组织中羟脯氨酸(Hyp),按羟脯氨酸试剂盒说明书操作,考马斯亮蓝法测定心肌总蛋白含量,具体操作方法见试剂盒说明书。结果以每毫克蛋白中羟脯氨酸的量表示。
结果显示,与假手术组比较,模型组Hyp含量显著增加(P<0.05)。与模型组比较,卡托普利组、安格洛苷C15mg·kg-1组和30mg·kg-1组Hyp含量显著降低(P<0.05),安格洛苷C7.5mg·kg-1组虽有降低,但差异并不显著(P>0.05)。结果见表5。
表5.安格洛苷C对腹主动脉缩窄致心室重构大鼠心肌Hyp含量的影响(x±SD,n=10)
注:与模型组相比,*P<0.05;**P<0.01
(5)对心肌细胞横断面面积的影响
每组随机取8只固定于10%福尔马林液的大鼠左心室中段心肌,经乙醇梯度脱水、透明、浸蜡包埋后,切成5μm切片,进行HE(hematoxylin eosin,HE)染色,选择横断心肌的切片(细胞核清晰,细胞膜完整)放大400倍。用Image-Pro Plus 4.0图像分析软件,测量左心室心肌细胞横断面面积。每一标本随机测量20个心肌细胞,计算其细胞平均横断面面积。
病理切片HE染色光镜下(×400倍)观察可见腹主动脉缩窄大鼠心肌较正常心肌细胞明显肥大、增宽,细胞间距增大,间质增生,组织横断面心肌纤维增多,经安格洛苷C治疗后有所降低,接近正常组。经Image-Pro Plus 4.0图像分析系统分析统计,结果见表6。
表6.安格洛苷C对腹主动脉缩窄致心室重构大鼠左室心肌细胞横断面面积的影响(x±SD,n=8,pixel)
注:与模型组相比,*P<0.05;**P<0.01
(6)对左室心肌胶原纤维含量的影响
取固定于10%福尔马林液的大鼠左心室中段心肌,经乙醇梯度脱水、透明、浸蜡包埋后,切成5μm切片,进行苦味酸天狼猩红染色。常规封片后,在Olympns XB51型显微镜下观察并摄片(×200),采用Image-Pro plus 4.0图像分析系统,测量心肌组织胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)和血管周围胶原面积(PVCA)。CVF=胶原面积/总面积,PVCA=小动脉管腔周围胶原面积/动脉管腔面积。并在偏光显微镜下观察上述视野的胶原着色情况,偏光显微镜下着色的胶原呈现亮色,其中I型胶原纤维呈红色或黄色,排列紧密,具强双折光性;III型胶原纤维呈绿色、疏网状细纤维、具弱双折光性。
1)对心肌PVCA变化的影响①病理形态学观察:苦味酸天狼猩红染色后,可清晰显示心肌胶原纤维呈猩红色,分布于心肌内冠脉周围,有向细胞间质呈放射状分布趋势。假手术组在冠脉周围仅见少量胶原纤维,模型组在冠脉周围可见大量胶原纤维增生,并向血管周围间质延伸。卡托普利组、安格洛苷C组心肌血管周围胶原沉积与模型组相比明显减少。②心肌胶原纤维半定量分析:与假手术组相比,模型组PVCA明显增高,差异具有显著意义(P<0.01);与模型组相比,卡托普利组、安格洛苷C组PVCA明显降低,差异有显著意义(P<0.05,见表7)。
2)对心肌CVF变化的影响①病理形态学观察:苦味酸天狼猩红染色后,心肌细胞呈黄色,胶原纤维呈猩红色。假手术组心肌间隙有少量胶原纤维,模型组大鼠左室心肌间隙有大量胶原纤维堆积,并有微疤痕形成,卡托普利组、安格洛苷C组可见有猩红色胶原纤维沉积于细胞间质,但较模型组为轻。②心肌胶原纤维半定量分析:与假手术组相比,模型组CVF明显增高,差异具有显著意义P(<0.01);与模型组相比,卡托普利组、安格洛苷C组CVF明显降低,差异有显著意义(P<0.05,见表7)。
表7.安格洛苷C对腹主动脉缩窄致心室重构大鼠左室心肌PVCA和CVF的影响(x±SD,n=8)
注:与模型组相比,*P<0.05;**P<0.01
3)I型胶原纤维变化①病理形态学观察:在偏振光显微镜头下,苦味酸天狼猩红染色使心肌间质I型胶原纤维呈现红色或黄色,排列紧密,具强双折光性。假手术组较少见红色或黄色I型胶原纤维表达,模型组可见大量红色或黄色的I型胶原纤维表达;卡托普 利组、玄参组心肌I型胶原纤维含量较模型组为轻。②I型胶原纤维半定量分析:与假手术组相比,模型组的心肌I型胶原纤维含量显著增高(P<0.01);与模型组相比,卡托普利组、安格洛苷C组的心肌I型胶原纤维含量明显降低,差异具有显著意义(P<0.05,见表8)。
4)III型胶原纤维变化①病理形态学观察:在偏振光显微镜头下,苦味酸天狼猩红染色使心肌间质III型胶原纤维呈现绿色、细纤维、具弱双折光性。假手术组较少见绿色III型胶原纤维表达,模型组可见大量绿色III型胶原纤维表达;卡托普利组、安格洛苷C组心肌III型胶原纤维含量较模型组为轻。②III型胶原纤维半定量分析:与假手术组相比,模型组的心肌III型胶原纤维含量明显增高,差异具有显著意义(P<0.01);与模型组相比,卡托普利组、安格洛苷C组心肌III型胶原纤维的含量明显降低,差异有显著意义P(<0.01,见表8)。
表8.安格洛苷C对腹主动脉缩窄致心室重构大鼠左室心肌I、III型胶原纤维含量的影响(x±SD,n=8)
注:与模型组相比,*P<0.05;**P<0.01
(7)酶联免疫吸附法(ELISA法)测定血清基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9及基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)表达
取出酶标板,依照次序对应分别加入100μl的标准品于空白微孔中;分别标记样品编号,加入100μl样品于空白微孔中;在标准品孔和样品孔中加入50μl的酶标记溶液;37℃孵育反应60分钟;洗板机清洗5次,每次静置15秒;每孔加入底物A、B液各50μl; 37℃下避光孵育反应15分钟;每孔加入50μl终止液,终止反应。于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值;B为标准品OD值、B0为标准品0点OD值;以B/B0%值为纵坐标,以标准品的浓度为横坐标,在对数坐标纸上绘制标准曲线;在标准曲线上查找对应的浓度范围。
结果显示,与假手术组比较,模型组血清MMP-2含量显著增加(P<0.05)。与模型组比较,卡托普利组、安格洛苷C30mg·kg-1组MMP-2含量显著降低(P<0.05),安格洛苷C15mg·kg-1组虽有下降,但差异不显著(P>0.05)。
与假手术组比较,模型组血清MMP-9含量显著增加(P<0.01)。与模型组比较,卡托普利组、安格洛苷C15mg·kg-1组和30mg·kg-1组MMP-9含量显著降低(P<0.05),安格洛苷C7.5mg·kg-1组虽有降低,但差异并不显著(P>0.05)。
与假手术组比较,模型组血清TIMP-1含量显著性降低(P<0.05)。与模型组比较,卡托普利组、安格洛苷C30mg·kg-1组TIMP-1含量显著增加(P<0.05),安格洛苷C7.5mg·kg-1组和15mg·kg-1组虽有所增加,但差异不具有显著性(P>0.05)。
与假手术组比较,模型组MMP-2/TIMP1与MMP-9/TIMP1比值显著增大(P<0.01)。与模型组比较,卡托普利组、安格洛苷C30mg·kg-1组MMP-2/TIMP1均显著降低(P<0.01),安格洛苷C7.5mg·kg-1组和安格洛苷C15mg·kg-1组虽有降低,但差异并不显著;相较模型组,卡托普利组、安格洛苷C15mg·kg-1组和30mg·kg-1组MMP-9/TIMP1均显著降低(P<0.05),安格洛苷C7.5mg·kg-1组虽有降低,但差异并不显著。结果见表9。
表9.安格洛苷C对腹主动脉缩窄致心室重构大鼠左室血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1的影响(x±SD,n=5)
注:与模型组相比,*P<0.05;**P<0.01
(8)Real-time RT-PCR测量心肌ET-1、TGF-β1mRNA表达
1)左室心肌组织总RNA抽提
依次将各样本约100mg心肌组织转移至5ml玻璃试管中,依次在每一管中加入1mlTrizol(预冷);电动匀浆器(转速8000rpm)处理30~45秒,依次将匀浆液转至1.5ml Eppendorf管中,各管中加入氯仿200ul,振荡摇匀15秒;4℃,12000rpm离心15min;小心吸出水层加入依次编号的Eppendorf管中,再加入二倍体积的异丙醇(约600ul),混匀,置于-20℃冰箱,30min;4℃,10000rpm,离心15min,弃上清,留沉淀;用650ul 75%乙醇洗涤沉淀,4℃,8000rpm离心5min,弃上清,留沉淀;65℃烘干;20ul DEPC处理水,溶解RNA,-20℃冰箱,保存,待用。
2)逆转录cDNA
将经过稀释后的RNA样本进行RT,反应体系如下:5×逆转录buffer,4ul;oligo(dT),0.5ul;dNTPs,0.5ul;逆转录酶MMLV,1ul;DEPC处理水,10ul;RNA模板,4ul;总体积,20ul。
反应条件:37℃;1小时;95℃,5min。灭活MMLV。
3)Real-time PCR反应体系
将制备好的cDNA进行PCR扩增,扩增体系如下:SYBR Green Mix,32.5ul;上游引物F,0.5ul;下游引物R,0.5ul;ddH2O水,14.5ul;cDNA模板,2ul;总体积,50ul。扩增条件:①95℃5分钟、②95℃15秒、60℃32秒、72℃32秒40Cycle、③熔解曲线分析。引物序列如下:M-ET-1-FP:5′-ACACTCATCAACAGCACCGA-3′、M-ET-1-RP:5′-ATGTTTGTGAAAGCAACCTTT-3′;M-TGFβ1-FP:5′-GCTGCTGACCCC CACTGAT-3′、M-TGFβ1-RP:5′-TGCCGGACAACTCCAGTGA-3′;M-GAPDH-FP:5′-CCGAGGGCCCACTAAAGG-3′、M-GAPDH-RP:5′-GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3′。
4)计算公式
数据采用仪器自带软件分析:ABI Prism 7300SDS Software
mRNA相对表达量计算公式:mRNA相对表达量=2-Δct×100%
Δct=目标基因CT值-内参(GAPDH)CT值
Ct:荧光强度达到阈值所需要的循环数,Ct值中的“C”代表Cycle(循环),“t”代表检测threshhold(阈值)。
计算的ET-1、TGF-β1mRNA相对表达量结果见表10。
模型组大鼠心肌ET-1、TGF-β1mRNA表达量与假手术组相比较,其差异具有显著性(P<0.05)。安格洛苷C组与模型组比较其mRNA表达量均有下降,具有显著抑制ET-1、TGF-β1mRNA表达的作用(P<0.05)。
表10.安格洛苷C对腹主动脉缩窄致心室重构大鼠ET-1、TGF-β1mRNA的影响(x±SD,n=5)
注:与模型组相比,*P<0.05;**P<0.01
小结
慢性充血性心力衰竭(Congestive heart failure,CHF)是神经体液因素和心脏重构造成的恶化循环的病理生理过程。80年代后,人们逐渐认识到心肌肥厚、心室重构是心力衰竭 的特征,同时也是决定心力衰竭发病率,病程进展和死亡率的主要因素。血管紧张素II(AngII),醛固酮(ALD),内皮素(ET-1)等神经内分泌细胞因子的长期慢性激活促进心肌重构,加重心肌损伤和心功能恶化,其中Ang II被认为是促进心脏重构的主要因素。慢性充血性心力衰竭(CHF)是各种病因引起的多种心脏疾病的终末阶段,现已公认其发生发展的根本原因为神经内分泌被长期激活导致的心室重构(Colucci WS.Molecular andcellular mechanisms of myocardial failure[J].Am J Cardiol,1997.80:15L-25L)。
本发明进行腹主动脉缩窄实验显示,该模型组的收缩压(SBP)和舒张压(DBP)明显升高,心脏质量指数LVWI、HWI增加,心肌组织AngII含量,羟脯氨酸(Hyp)含量显著性增加,AngII具有较强的致心肌纤维化的作用,它可以通过AT1受体的介导直接作用于心脏成纤维细胞引起胶原合成的增加(Shen Jingling,Li Ruifeng,et al.The Responseness of theFibroblasts from the Myocardium-Infracted Rats to Angiotensin II[J].ISSN 100723949 Chin J Arterioscler,2002,10(2):115-117),Hyp增加反映心肌间质胶原组织增生。模型成功地反映了心室重构的主要病理特征。
本发明实验研究发现安格洛苷C能降低大鼠心肌AngII、Hyp的量,同时其具有一定的降低血压的作用。能抑制心肌细胞的肥大,减小左心室心肌细胞的横断面面积,降低PVCA、CVF以及I、III型胶原含量,对心肌细胞和间质胶原重构两方面都有显著的抑制作用。而且安格洛苷C具有显著降低TGF-β1、ET-1基因表达的作用,该作用也许与安格洛苷C降低胶原蛋白的合成,改善血管内皮功能,抑制心室重构的发生发展有关。本发明实验提示安格洛苷C能通过抑制心肌间质纤维化而改善心室重构,对于改善衰竭心脏的心功能具有积极意义。
心室重构还表现为心肌间质纤维胶原合成和降解之间的动态平衡的破坏(Jugdutt B I.Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrixWhen is enough[J].Circulation,2003,108(11):1395-1403.)。基质金属蛋白酶(MMPs)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)之间的表达平衡在调节心肌间质纤维胶原的稳态中发挥重要作用。如MMPs的活性增加、TIMPs的抑制作用减弱或高MMPs/TIMP比,将促进心室重构,相反MMPs的 活性降低、TIMPs的抑制作用存在或MMPs/TIMPs比降低,可改善心室重构(Fedak PW,Altamentova SM,Weisel RD,et al.Matrix remodeling in experimental and human heart failure:a possibleregulatory role for TIMP-3[J].Am J Physiol,2003,284:626-634.)。本发明研究结果显示较长时间、较大剂量安格洛苷C治疗能抑制腹主动脉缩窄后大鼠心脏MMP2、MMP9表达,使MMPs/TIMPs比值减小,通过调节MMP/TIMP的平衡可以对压力超负荷大鼠的心肌胶原纤维代谢进行干预,从而影响心室重构的过程,并影响心脏功能。
综上所述,安格洛苷C的较早介入治疗可以明显改善心室重构状态,防止心衰的发生和发展。本发明实验结果显示,安格洛苷C在防治心室重构和心衰方面具有开发价值。
Claims (3)
1.安格洛苷C在制备防治心肌肥大、心室重构、肥厚性心肌病和慢性心力衰竭药物中的用途。
2.安格洛苷C在制备防治与心肌肥大和心衰相关的心律失常的药物中的用途。
3.安格洛苷C在制备防治与心肌肥大和心衰相关的猝死的药物中的用途。
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