CN101919991B - 一种防治宫颈hpv亚临床感染的药物组合物栓剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治宫颈癌的药物组合物及其制备方法，该药物组合物的原料药组成为银花、莪术、连翘、蜈蚣、紫草和黄柏，在制备方法中先将莪术和连翘提挥发油，其余原料药制得药粉，与挥发油混合，进一步加工成临床可接受的外用剂型：包括但不限于栓剂、泡腾剂、喷雾剂、气雾剂或膏剂。药效学实验表明本发明药物组合物具有显著的抗炎作用，并可通过分化-转化从而促进细胞凋亡，从而对人宫颈鳞癌SiHa细胞产生作用；本发明药物组合物还可直接抑制宫颈癌细胞的生长，并可能通过调控P53基因表达的分子机制，达到抑制肿瘤的目的，是一种安全、有效、无副反应的防治宫颈病变的中药外用制剂。

Description

一种防治宫颈HPV亚临床感染的药物组合物栓剂及其制备方法

发明领域

本发明涉及一种药物组合物及其制备方法，特别涉及一种防治宫颈癌的药物组合物及其制备方法。 

背景技术

子宫颈癌是女性第二大常见癌症，在一些发展中国家甚至居于首位；每年全球大约有50万例新发宫颈癌病例，20多万人死于宫颈癌，其中，80％的死亡发生在发展中国家。我国每年新发生子宫颈癌13.15万，占世界子宫颈癌新发病例总数的28.8％。随着分子生物学与流行病学的发展，人乳头瘤状病毒(human papillomauirus，HPV)感染与下生殖道疾病关系研究的不断深入。现已证实，生殖道的HPV(人乳头瘤病毒)与宫颈癌关系明确。2001年FIGO流行病学和统计学报告，子宫颈癌的发病有年轻化的趋势，年龄由20世纪50年代的平均年龄60岁下降到90年代末的50岁，严重威胁广大妇女生命健康。研究宫颈癌发生的病理机制，探索有效的治疗方法，挽救宫颈癌患者的生命，成为每一个妇科医务工作者的重要使命。 

目前认为放疗和手术是治疗宫颈癌的有效方法，然而临床上很多高危因素的病例，如晚期癌、桶状癌、淋巴结转移或小细胞癌，无论手术或放疗均不满意，宫颈肿瘤局部复发及远处转移是治疗失败的主要原因，即使应用现代的放疗设备和根治手术，都很难治愈，况且其创伤大，副反应重，可能剥夺年轻患者的生育功能，所带来的身心痛苦经济负担以及对患者生活质量的影响往往为许多妇女不愿接受或难以耐受。为此，学者们一直致力于寻求新的微创、副反应小、作用局限可以根治肿瘤的方法，随着新的化疗药物不断问世和化疗技术的不断发展，化疗在宫颈癌治疗中的作用日益重要，但现代医学中多数抗肿瘤药物缺少选择性抑制肿瘤的作用，在杀伤肿瘤细胞的同时，也常伴有不同程度的毒性反应。 

中医认为癌是正气不足、气滞、痰凝、血瘀日久而引起的，中医认为治疗癌症要以“软坚散结”为原则。决定最佳的治疗方式前必须考虑很多因素，包括肿瘤大小，病患年龄及整体健康状况还有早期晚期等等。中医药从辨证论治出发，调整机体功能，改善临床症状，减轻放疗、化疗的毒副反应，提高手术前后机体抗感染能力和细胞免疫能力，可大大提高临床疗效，应贯穿于治疗的始终，现已成为治疗癌症的主要手段。 

发明内容

本发明目的在于公开一种防治宫颈癌的药物组合物，本发明的目的还在于公开该药物组合物的制备方法。 

本发明目的是通过如下方案实现的： 

本发明药物组合物的原料药组成为： 

银花5-25重量份  莪术10-40重量份  连翘5-25重量份 

蜈蚣5-25重量份  紫草5-25重量份  黄柏5-25重量份。 

本发明药物组合物的原料药组成优选为： 

银花15重量份  莪术30重量份  连翘15重量份 

蜈蚣15重量份  紫草15重量份  黄柏15重量份。 

本发明药物组合物的原料药组成优选为： 

银花20重量份  莪术15重量份  连翘10重量份 

蜈蚣20重量份  紫草20重量份  黄柏10重量份。 

本发明药物组合物的原料药组成优选为： 

银花10重量份  莪术35重量份  连翘20重量份 

蜈蚣10重量份  紫草10重量份  黄柏20重量份。 

取本发明原料药，按常规工艺，加入常规辅料制备成临床可接受的外用剂型：包括但不限于栓剂、泡腾剂、喷雾剂、气雾剂或膏剂。 

本发明药物组合物的制备方法还可以为如下步骤： 

取原料药莪术和连翘加5-10重量倍的水，提取5-10小时，得挥发油和提取液a；取原料药银花和蜈蚣加5-10重量倍的水，煎煮5-10次，每次0.5-2.0小时，得提取溶液b；取原料药黄柏和紫草，加50％-90％乙醇提取1-3次，回收乙醇，得提取液c；合并以上提取液a、b和c，浓缩，干燥，得药粉，出粉率为10-15％；往药粉中喷入上述挥发油，按常规工艺，加入常规辅料制备成临床可接受的外用剂型：包括但不限于栓剂、泡腾剂、喷雾剂、气雾剂或膏剂。 

本发明药物组合物的制备方法还可以优选为如下步骤： 

取原料药莪术和连翘加8重量倍的水，提取8小时，得挥发油和提取液a；取原料药银花和蜈蚣加8重量倍的水，煎煮2次，每次1小时，得提取溶液b；取原料药黄柏和紫草，加70％乙醇提取2次，回收乙醇，得提取液c；合并以上提取液a、b和c，浓缩，干燥，得药粉，出粉率为12％；往药粉中喷入上述挥发油，按常规工艺，加入常规辅料制备成临床可接受的外用剂型：包括但不限于栓剂、泡腾剂、喷雾剂、气雾剂或膏剂。 

其中，本发明药物组合物栓剂的原料组成为： 

药粉1重量份  半合成脂肪酸酯2-8重量份  挥发油2-5体积份。 

其中，本发明药物组合物栓剂的原料组成优选为： 

药粉1重量份  半合成脂肪酸酯5重量份  挥发油3.5体积份。 

其中，上述重量份与体积份的关系为g/μl的关系。 

附图说明

图1：口服空白对照组凋亡率及DNA含量； 

图2：本发明药物组合物栓剂口服组凋亡率及DNA含量； 

图3：空白组含药血清作用72小时的细胞情况(10*视野图像)； 

图4：本发明药物组合物栓剂组含药血清作用72小时的细胞情况(10*视野图像)； 

图5：对P53基因表达的影响。 

本发明药物组合物由紫草、莪术、银花等药物组成，主要制成栓剂、泡腾剂、喷雾剂、气雾剂或膏剂等外用剂型，临床及药效实验表明本发明药物组合物具有显著的抗炎作用，并可通过分化-转化从而促进细胞凋亡，从而对人宫颈鳞癌SiHa细胞产生作用；本发明药物组合物还可直接抑制宫颈癌细胞的生长，并可能通过调控P53基因表达的分子机制，达到抑制肿瘤的目的。因此，本发明药物组合物在防治宫颈癌方面具有较好的临床治疗效果，而且用药方便、经济、无毒副反应，临床用药安全，是一种安全、有效、无副反应的防治宫颈病变的中药外用制剂。 

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。 

实验例1本发明药物组合物治疗宫颈糜烂98例临床疗效观察 

1临床资料 

1.1诊断标准 

根据糜烂面积大小分为3度：轻度(I度)指糜烂面积占整个宫颈面积的1/3；中度(II度)指糜烂面积占整个宫颈面积的1/3-2/3；重度(III度)指糜烂面积占整个宫颈面积的2/3以上。根据糜烂深浅程度分为3型：单纯型指在炎症初期，糜烂面被单纯柱状上皮所覆盖，表面平坦；颗粒型指宫颈腺上皮过度增生并伴有间质增生，糜烂面凸凹不平成颗粒状；乳头型指间质增生显著，表面不平现象更加明显呈乳头状。 

1.2一般资料 

98例病例均为2003年4月-2005年7月就诊的门诊患者，年龄20-45岁，平均32.21岁；病程1-2年43例，3-8年50例，8年以上5例；白带增多者84例，腰骶酸痛者48例，下腹坠痛者32例，性交出血者34例；宫颈糜烂轻度22例，中度46例，重度30例；单纯型宫颈糜烂41例，颗粒型宫颈糜烂50例，乳头型宫颈糜烂7例。见表1。 

表198例患者宫颈糜烂程度分布情况(例) 

1.3纳入病例标准 

符合慢性宫颈糜烂诊断标准：年龄在20-45岁。 

1.4排除病例标准 

年龄＜20岁或＞45岁者；宫颈癌及癌前病变者；由滴虫、霉菌、淋病等所致的炎症；1个月内使用过同类药物治疗者；妊娠、哺乳期妇女。 

2治疗方法 

使用本发明实施例1制备得到的药物组合物栓剂治疗，月经干净后3d开始用药，用窥器暴露宫颈，干棉球拭去宫颈表面分泌物，将药物放置带线棉碗上，覆盖于宫颈，线头留于阴道口外，24h自行取出棉碗，隔日用1次，10次为1个疗程，连续治疗2个疗程。经期停用，治疗期间禁止性生活。 

3结果 

3.1疗效判定标准 

治愈：子宫颈光滑，糜烂面消失，恢复弹性；显效：轻度宫颈糜烂面积缩小≥50％，中度糜烂转为轻度糜烂；重度糜烂转为中度或轻度；有效：轻度宫颈糜烂面积缩小＜50％，中度、重度糜烂面积缩小不足轻度，或糜烂面积无变化，但乳头型转为颗粒型，颗粒型转为单纯型；无效：糜烂面无变化或有发展。 

3.2治疗结果 

3.2.1宫颈糜烂疗效 

本发明药物组合物栓剂治疗宫颈糜烂98例患者中，治愈32例，占32.653％；显效32例，占32.653％；有效23例，占23.469％；无效11例，占11.225％，总有效率为88.775％。 

3.2.2宫颈糜烂成都与疗效的关系 

本发明药物组合物栓剂对轻度宫颈糜烂疗效明显高于中度及重度宫颈糜烂，单纯型宫颈糜烂疗效明显高于颗粒型及乳头型宫颈糜烂，差异显著，有统计学意义。提示宫颈糜烂深浅程度越轻，糜烂面积越小，疗效越好。结果见表2、表3。 

表2 98例宫颈糜烂面积与疗效关系 

表3 98例宫颈糜烂深浅不同与疗效关系 

3.2.3临床症状改善情况 

用消毒治疗后，白带增多、腰骶酸痛、下腹坠痛、性交出血等临床症状改善明显。结果见表4。 

表4 98例患者用药前后临床症状消失改善情况 

3.3不良反应 

69例患者治疗前后进行血\尿常规及肝肾功能等安全性指标检查，未发现异常；98例在用药期间尚未发现1例副反应及过敏现象。 

实验例2 本发明药物组合物抗炎作用实验 

1.材料与方法 

1.1材料 

(1)实验药物：本发明实施例1制备的药物组合物栓剂，制成膏剂(浓度为1g/ml)；康妇特栓，剂量2.0g/粒，含生药0.5g/粒，主要成分莪术油、氯苯米唑硝酸盐，由唐山太阳石制药厂生产。 

(2)实验动物：雌性Wistar大鼠100只，体重130～150g；昆明种小鼠100只，体重25～30g。由北京维迈利华动物技术有限公司提供。 

1.2实验方法 

(1)本发明药物组合物栓剂对大鼠蛋清性关节炎的影响实验将50只雌性Wistar大鼠随机分为5组：①阴性对照组(空白栓剂)；②本发明药物组合物栓剂高剂量组 (0.4043g/kg)；③本发明药物组合物栓剂中剂量组(0.2052g/kg)；④本发明药物组合物栓剂低剂量组(0.0513g/kg)；⑤阳性对照组(康妇特栓)。实验各组均阴道给药，每次上药一枚，隔日一次，共10次。于末次给药后30分钟开始造模，10％蛋清生理盐水0.05ml注入每只大鼠右后足部，于不同时间测量左右后足关节周长，差值为肿胀度。分别记录给药0.5、1、2、3、4、5、6小时足关节周长。 

(2)本发明药物组合物栓剂对大鼠角叉采胶足跖肿的影响实验 

将50只雌性Wistar大鼠随机分为5组：①阴性对照组(空白栓剂)；②本发明药物组合物栓剂高剂量组(0.4043g/kg)；③本发明药物组合物栓剂中剂量组(0.2052g/kg)；④本发明药物组合物栓剂低剂量组(0.0513g/kg)；③阳性对照组(康妇特栓)。实验各组均阴道给药，每次上药一枚，隔日一次，共10次。末次给药30分钟后以1％角叉采胶生理盐水注射液0.5ml，注入每只大鼠右后足跖皮下，此后不同时间测量左右后肢踝关节周长，其差值为肿胀度。分别记录给药0.5、1、2、3、4、6小时踝关节的周长。 

(3)本发明药物组合物栓剂对二甲苯致小鼠耳廓炎症影响的实验 

取雌性小鼠50只，随机分成5组：①阴性对照组(空白栓剂)②本发明药物组合物栓剂高剂量组(0.5928g/kg)：③本发明药物组合物栓剂中剂量组(0.2964g/kg)；④本发明药物组合物栓剂低剂量组(0.0741g/kg)；⑤阳性对照组(康妇特栓)。各组均隔日阴道给药一次，每次上药一枚，共10次，于末次给药后30min致炎：贴一直径0.7cm的滤纸片在左耳上，滴二甲苯3滴(0.06ml)于滤纸上，20min后处死动物，剪下耳廓，用直径为7mm打孔器取下左右耳片，两耳片重量之差为肿胀度。 

(4)本发明药物组合物栓剂对小鼠慢性增生性炎症影响的实验 

将雌性小鼠50只，随即分成5组：①阴性对照组(空白栓剂)；②本发明药物组合物栓剂高剂量组(0.5928g/kg)；③本发明药物组合物栓剂中剂量(0.2964g/kg)；④本发明药物组合物栓剂低剂量组(0.0741g/kg)；⑤阳性对照组(康妇特栓)。采用棉球肉芽肿法，取雌性小鼠50只，在2％戊巴比妥浅麻醉和无菌条件下，于两侧腋部皮下各植入2mg消毒棉球一个，术后当日起分5组，组别、剂量同前。各组均阴道给药，每次上药一枚，每日1次，连续7d，第8d将小鼠处死，剥离并取出棉球肉芽肿，于70℃烘箱烘烤后称重，减去原棉球重量，即为肉芽肿重量。 

(5)统计分析 

应用SPSS10.0统计软件进行统计分析，剂量资料采用t检验；计数资料采x2检验。 

2.结果 

2.1本发明药物组合物栓剂对大鼠蛋清性关节炎的影响见表5。 

2.2本发明药物组合物栓剂对大鼠角叉采胶足跖肿的影响详见表6。 

2.3本发明药物组合物栓剂对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响详见表7。 

2.4本发明药物组合物栓剂对小鼠棉球肉芽肿的影响详见表8。 

表5本发明药物组合物栓剂对大鼠蛋清性关节炎足关节周长的影响(mm) 

注：与康妇特组比较▲P＜0.05  ▲▲P＜0.01 

与阴性对照组比较*P＜0.05  **P＜0.01 

表6本发明药物组合物栓剂对大鼠角叉采胶中跖肿试验后足关节周长的影响(单位：mm) 

注：与康妇特组比较▲P＜0.05  ▲▲P＜0.01 

与阴性对照组比较*P＜0.05  **P＜0.01 

表7本发明药物组合物栓剂对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 

注：与康妇特组比较▲P＜0.05  ▲▲P＜0.01 

与阴性对照组比较*P＜0.05  **P＜0.01 

表8本发明药物组合物栓剂对小鼠棉球肉芽肿重量的影响 

注：与康妇特组比较▲P＜0.05  ▲▲P＜0.01 

与阴性对照组比较*P＜0.05  **P＜0.01 

结果表明，大鼠蛋清性关节炎试验中本发明药物组合物栓剂各治疗组与模型组的关节肿胀度比较差异有显著性；大鼠角叉采胶足跖肿试验中本发明药物组合物栓剂各治疗组成模型组的关节肿胀度比较差异显著；二甲苯致小鼠耳廓炎症实验中本发明药物组合物栓剂各治疗组致炎后两耳片重量差值与模型组差异极显著；小鼠慢性增生性炎症实验本发明药物组合物栓剂各治疗组棉球肉芽肿重量差值与模型组对照差异极显著。四个抗炎实验均证实本发明药物组合物栓剂具有显著的抗炎作用。 

实验例3本发明药物组合物对宫颈癌SiHa细胞凋亡及周期的影响 

1材料与方法 

1.1材料 

(1)实验药物：本发明实施例1所述药物组合物栓剂；中药阳性对照药：保妇康栓；西药阳性对照药：安达芬栓(重组人干扰素仪一2b粉针剂)。 

(2)人宫颈癌细胞系一SiHa(HPV16阳性的人宫颈鳞癌细胞系)：购自美国ATCC细胞库，保存于北京大学人民医院干细胞中心妇科实验室。 

(3)试剂：DMEM全培养液(购自美国GIBCO公司)、胎牛血清(购自元享圣马公司)、青霉素和链霉素(购自华北制药厂)、胰酶及EDTA(购自SERVA公司及赛多利斯公司)、RNaseA和PI购自Sigma公司。 

1.2方法 

(1)本发明药物组合物栓剂、空白及阳性对照药含药血清的提取：选雌性健康SD大鼠64只，体重为220～250g，随机编号，将大鼠分为4组：空白对照组、保妇康组、干扰素组和本发明药物组合物栓剂组。每组分为口服和阴道给药两组.按人临床给药剂量的等效剂量的10倍给药(计算公式：200g体重大鼠给药剂量＝60Kg体重人给药剂量*0.018*10)。每日给药1次，连续给药6天。取给药后1h血清(西药阳性对照肌注组给药后40min取血)，37℃水浴静置0.5h，3000rpm离心10min取血清，血清水浴灭活后备用。 

(2)细胞培养：选用人宫颈癌细胞系-SiHa(HPV16阳性的 人宫颈鳞癌细胞系)于含10％胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml的DMEM全培养基中培养，在恒温培养箱中以5％CO₂、37℃和饱和湿度条件下常规培养。 

(3)流式细胞仪检测生长周期的变化及凋亡：分别收集以不同含药血清培养液作用72h及对照组细胞，75％冷乙醇固定，4℃过夜。PBS冲洗去除固定液，加入10mg/ml的RnaseA溶液300μl混匀。37℃孵育30min，加入PI染液至终浓度25μg/ml50μl混匀，常温避光染色1h后以应用Cell Quest软件获取细胞10000个，以Modi Fit软件进行细胞周期分析，并绘制DNA分布图。 

1.3统计分析 

所测数据以 表示，检测结果应用SPSS 10.0软件进行t检验和单因素方差分析，P＜0.05认为差异有显著性。 

2实验结果 

各组均以血清作用72h后进行比较。 

2.1流式细胞仪检测细胞周期各时相的变化 

(1)口服给药各组不同周期细胞占总细胞比例：结果显示，口服各组含药血清组S期所占比例较空白血清对照组减少，差异有显著性(P＜0.05)，尤以西药阳性组明显(P＜0.01)，本发明药物组合物栓剂组次之，中药阳性组再次之。而G0～G1期所占比例较空白血清对照组增加，其差异有显著性(P＜0.01)，见表9。口服各组流式细胞仪检测DNA的含量，本发明药物组合物栓剂组较空白血清对照组明显减少(见图1、图2)。 

表9口服给药各组不同周期细胞占总细胞比例(％， 

) 

与空白口服组同期比较，*P＜0.05，**P＜0.01。 

(2)阴道给药各组不同周期细胞占总细胞的比例：结果显示，阴道给药各组血清作用细胞后G0-G1期所占比例较空白组有增加趋势，见表10。 

表10阴道给药各组不同周期细胞占总细胞的比例(％， 

) 

2.2流式细胞仪检测凋亡的变化 

(1)口服给药各组细胞凋亡率比较：结果显示，口服给药各组中，本发明药物组合物栓剂含药血清组对细胞凋亡有促进作用，与空白血清对照组相比，具有统计学差异(P＜0.01)；西药阳性对照组含药血清对细胞凋亡有促进作用，与空白血清对照组相比，有统计学差异(P＜0.05)；中药阳性对照组含药血清未见明显差异(见表11、图1、图2)。 

表11口服给药各组细胞凋亡率比较(％， 

) 

与空白口服组同期比较，*P＜0.05，**P＜0.01。 

(2)阴道给药各组细胞凋亡率比较：结果显示，未见明显差异(见表12)。 

表12阴道给药各组细胞凋亡率比较(％， 

) 

2.3细胞生长状况观察 

倒置相差显微镜观察细胞生长状况，见培养基对照组细胞生长状态良好，细胞形状规则，边缘光滑，细胞贴壁紧密，死亡细胞少，与10％FBS DMEM完全培养基培养下的细胞无明显差异。空白血清组与其亦无明显差异，中药阳性对照组死亡细胞量增加，西药阳性对照组及本发明药物组合物栓剂组死亡细胞量增加更为明显(见图3、图4)。 

实验例4本发明药物组合物对宫颈癌SiHa细胞P53基因调控作用的实验研究 

1材料与方法 

1.1实验材料 

1.1.1实验药物  受试药物本发明实施例1制备的药物组合物栓剂；中药阳性对照药保妇康栓及按其成分配备的口服溶液，西药阳性对照药安达芬栓及重组人干扰素a-2b粉针剂。人宫颈癌细胞系一SiHa(HPV16阳性的人宫颈鳞细胞系)，购自美国ATCC细胞库。保存于北京大学人民医院干细胞中心妇科实验室。 

1.1.2试剂  DMEM全培养液(购自美国GIBCO公司)；胎牛血清(购自元享圣马公司)；青霉素和链霉素(购自华北制药厂)；二甲基亚砜(DMSO)为上海华舜产品；胰酶及乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(购于SERVA公司及赛多利斯公司)；RNaseA和PI购于Sigma公司；噻唑 蓝(MTT)购于Sigma公司；Trizol试剂盒为北京Invitrogen公司产品，cDNA逆转录试剂盒为Promega公司产品；其余试剂均为国产分析纯。 

1.2实验方法 

1.2.1本发明药物组合物栓剂、空白及阳性对照药含药血清的提取选雌性健康SD大鼠64只，体质量为220-250g，随机分组法分为8组(每组8只)：空白对照阴道组(VBC)，中药阳性对照阴道组(VHC)，西药阳性对照阴道组(vwc)，本发明药物组合物栓剂阴道组(VQ)，空白口服组(OBC)，中药阳性口服组(OHC)，西药阳性对照肌注组(owc)，本发明药物组合物栓剂口服组(OQ)，按人临床给药剂量的等效剂量的10倍给药(计算公式为：200g体质量大鼠给药剂量＝60kg体质量人给药剂量*0.018*10)，给药1次/d，连续给药6d，取给药后1h血清，(西药阳性对照肌注组给药后40min取血)37℃水浴静置0.5h，3000r/min离心10min取血清，血清水浴灭活后备用。 

1.2.2细胞培养  选用人宫颈癌细胞系_SiHa(HPV16阳性的人官颈鳞细胞系)于含10％胎牛血清、青霉素100kU/L、链霉素100mg/L的DMEM全培养基中培养，在恒温培养箱中以5％二氧化碳(CO₂)、37℃及饱和湿度条件下常规培养。 

1.2.3MTT法测定含药血清对宫颈癌SiHa细胞的生长抑制作用取对数生长期细胞制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为7.5x10⁷个/L，接种于96孔培养板中，每孔100μL(7.5x10³/孔)。含药血清用含2.5％胎牛血清的培养基稀释为0.5％、1％、2％、4％、8％，终体积为100μL/孔，每种浓度设立6个平等对照，并设正常对照，嚣正常培养条件下培养。24h换液1次，分别于含药血清作用24、48、72及96h后，上机检测吸光度(A)值。 

1.2.4流式细胞仪检测生长周期的变化及凋亡  分别收集以不同含药血清培养液作用72h及对照组细胞，75％冷乙醇固定，4℃过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗去除固定液，加入10g/L的RnaseA溶液300μL混匀，37℃孵育30min，加入PI染液至终浓度25mg/L50μL混匀，常温避光染色1h后以应用Cell Quest软件获取细胞10000个，以Modi Fit软件进行细胞周期分析并绘制DNA分布图。 

1.2.5逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)法半定量研究P53表达的改变  取进入对数生长期的细胞，以8％不同含药血清培养液作用72h后，以Triaol试剂盒提取细胞中的总RNA，经Promega逆转录反应体系逆转录为cDNA，P53及内参β2m引物序列如下，由赛百盛生物技术公司合成。P53的引物序列(扩增片段长度128bp)：上游5’-CTACTTCCIGAAAACAACGTTC-3’、下游5’-GGCATTCTGGGAGCTTCATCT-3’，扩增条件：48℃45min，94℃2min预变性；94℃变性30s，59℃退火1min，72℃延伸1min共35循 环；72℃后延伸7min。内参β2m引物序列(扩增长度312bp)上游-5’AGTATGCCTGCCGTGTGAAC-3’下游5’-AAGTTGCCGCCAGCCCTCCTAG-3’。扩增条件：48℃45min，94℃2min预变性；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min共35循环；72℃后延伸7min。PCR产物分析：扩增产物于2％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相，用Phoretisld AdvancedV4.0软件分析。 

1.3统计学分析  所有检测数据采用SPSS12.0软件包进行统计学处理、采用方差分析。 

2结果 

2.1对细胞生长及增殖的影响 

2.1.1MTT法检测各孔A值  用药后各组与对照组出现了活细胞数量减少，吸光度值有降低趋势，(P＜0.05)，虽然本发明药物组合物栓剂含药血清对SiHa细胞的抵制作用无浓度及时间正相关依赖性，但可以看到各组含药血清在各时间点与空白对照组均有抑制作用，尤以8％浓度、72h为显著，与空白组比较有显著性差异(P＜0.01)，西药阳性药组抑制作用最强，本发明药物组合物栓剂组次之，但本发明药物组合物栓剂组与西药阳性药组间比无显著性差异(0.05)。见表13，表14。 

表13各组细胞生长增殖情况比较( 

n＝6) 

注：各组均与空白对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01；阴道给药组和口服给药组分别比较。 

表14各组S期细胞占总细胞比例及细胞凋亡率比较 

注：各组均与空白对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01；阴道给药组和口服给药组分别比较。 

2.1.2流式细胞仪检测细胞周期各时相的变化  空白血清组S期所占比例较培养基组增加，口服各组含药血清组S期所占比例较空白血清对照组减少，有显著性差异(P＜0.05)，尤以西药阳性组明显，本发明药物组合物栓剂组次之，中药阳性组再次之。阴道给药组未见明显差异。见表14。 

2.1.3流式细胞仪检测凋亡的变化  口服给药实验组本发明药物组合物栓剂血清组对细胞凋亡有促进作用，与空白血清对照组相比有统计学差异(P＜0.05)；其余含药血清组未见明显差异。见表14。 

2.2对P53基因表达的影响  经RT-PCR并测定电泳条带吸光度值，计算P53与132m基因扩增片段的吸光度比值，可见口服各组含药血清与对照组相比，P53mRNA的表达量增加(P＜0.01)，以西药阳性药组最佳，本发明药物组合物栓剂次之，但本发明药物组合物栓剂与西药阳性组相比较无显著性差异。阴道给药各组未见明显差异。见图5。 

实验例5本发明药物组合物栓剂治疗宫颈人乳头瘤病毒亚临床感染的临床研究 

1.临床资料及方法 

1.1一般资料 

病例来源为北京中医药大学东方医院妇科门诊2004年8月～2005年6月就诊的宫颈HPV亚临床感染的患者共60例。随机分成试验组(本发明实施例1制备的药物组合物栓剂组)、对照组(安达芬组)两组进行治疗观察，两组资料具有可比性。(详见表15) 

表15两组临床资料比较 

注：P＜0.05差别有显著性意义；P＜0.01差别有极显著性意义 

1.2用药方法及观察项目 

本发明药物组合物栓剂由北京中医药大学东方医院提供，规格：0.57g/枚。安达芬栓由安徽安科生物工程有限公司提供，规格：10万IU/枚。本发明药物组合物栓剂组：每次阴道塞药1枚，隔日1次，经期停用。安达芬组用法同前。10次为一疗程，连续治疗2个疗程。观察项目：①治疗前后临床症状及宫颈局部情况；②临床疗效指标：HC-IIHPVDNA、临床症状评分；③安全性指标：血压、心率、呼吸，肝、肾功能等。所有患者均签署知情同意书，符合临床试验伦理学要求。 

1.3诊断及疗效判定标准 

诊断标准：HC-II(杂交捕获二代)检测HPVDNA阳性(Rlu/CO＞1)。临床症状评分标准：参照国家药品监督管理局《中药新药临床研究指导原则》。疗效判定标准：①痊愈HC-II＜1.0pg/ml，临床症状、体征积分比≥90；②显效：HC-II病毒载量下降≥60％，70≤临床症状、体征积分比＜90；③有效：HC-II病毒载量下降≥30％，30≤临床症状、体征积分比＜70；(4)无效：HC-II病毒载量下降＜30％或上升，临床症状、体征积分比＜30。 

1.4统计分析 

应用SPSS10.0统计软件进行统计分析，计量资料采用t检验；计数资料采用X2检验；等级资料用秩和检验。 

2.结果 

2.1两组治疗前后HC-II HPVRlu/co均值、临床症状积分比较 

本发明药物组合物栓剂治疗后病毒负荷量均值及临床症状积分与疗前比较均下降明显P＜0.05，差异有显著性；安达芬治疗后病毒负荷量均值及临床症状积分与疗前比较同样下降明显。治疗后两组间进行病毒负荷量下降均值比较P＞0.05，差异无显著性。(见表16) 

2.2治疗后病毒负荷量疗效比较 

本发明药物组合物栓剂治疗后有10例患者HPVDNA显示阴性，达到治愈；13例HC-II HPVRlu/co下降值≥60％；7例下降值≥30％；5例下降值＜30％，其中2例治疗后比值升高，定为无效。有效率为85.7％(30/35)。安达芬治疗后7例患者HPVDNA显示阴性，达到治愈；9例HC-II HPVRlu/co下降值≥60％；6例下降值≥30％；3例下降值＜30％，其中有1例治疗后比值升高，定为无效。有效率为88.0％(22/25)。两组病毒载量疗效经非参数检验(秩和检验)P＞0.05，说明本发明药物组合物栓剂与安达芬的疗效无显著性差异。(见表17) 

2.3治疗后临床症状、体征积分疗效比较 

本发明药物组合物栓剂治疗后有6例患者临床症状、体征积分比≥90；11例70≤积分比＜90；10例30≤积分比＜70；8例积分比＜30，定为无效。有效率为77.14％(27/35)。安达芬治疗后有4例患者临床症状、体征积分比≥90；8例70≤积分比＜90；7例30≤积分比＜70；6例积分比＜30，定为无效。有效率为76.00％(19/25)。两组积分疗效经非参数 检验(秩和检验)P＞0.05，说明本发明药物组合物栓剂与安达芬对临床症状、体征的改善两组比较无显著性差异。(见表18) 

表16两组治疗前后病毒负荷量均值、临床症状分比较 

注：治疗前后自身比较：*P＜0.05  **P＜0.01 

表17治疗后HC-II HPVRlu/co疗效比较 

注：P＞0.05两组比较无显著性差异。 

表18治疗后临床症状、体征积分疗效比较 

注：P＞0.05两组比较无显著性差异。 

下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。 

具体实施方式

实施例1：本发明药物组合物栓剂 

银花3kg  莪术6kg  连翘3kg  蜈蚣3kg  紫草3kg  黄柏3kg； 

取原料药莪术和连翘加8重量倍的水，提取8小时，得挥发油25-30μl和提取液a；取原料药银花和蜈蚣加8重量倍的水，煎煮2次，每次1小时，得提取溶液b；取原料药黄柏和紫草，加70％乙醇提取2次，回收乙醇，得提取液c；合并以上提取液a、b和c，浓缩，干燥，得药粉，出粉率为12％；取半合成脂肪酸酯40g，取上述药粉8g，再喷入上述所得挥发油，按常规方法制得3500枚本发明药物组合物栓剂。 

实施例2：本发明药物组合物栓剂 

银花4kg  莪术3kg  连翘2kg  蜈蚣4kg  紫草4kg  黄柏2kg； 

取原料药莪术和连翘加8重量倍的水，提取8小时，得挥发油30-40μl和提取液a；取原料药银花和蜈蚣加8重量倍的水，煎煮2次，每次1小时，得提取溶液b；取原料药 黄柏和紫草，加70％乙醇提取2次，回收乙醇，得提取液c，合并以上提取液a，b和c，浓缩，干燥，得药粉，出粉率为12％；取半合成脂肪酸酯20g，取上述药粉8g，再喷入上述所得挥发油，按常规方法制得3500枚本发明药物组合物栓剂。 

实施例3：本发明药物组合物栓剂 

银花2kg  莪术7kg  连翘4kg  蜈蚣2kg  紫草2kg  黄柏4kg； 

取原料药莪术和连翘加8重量倍的水，提取8小时，得挥发油20-25μl和提取液a；取原料药银花和蜈蚣加8重量倍的水，煎煮2次，每次1小时，得提取溶液b；取原料药黄柏和紫草，加70％乙醇提取2次，回收乙醇，得提取液c；合并以上提取液a、b和c，浓缩，干燥，得药粉，出粉率为12％；取半合成脂肪酸酯60g，取上述药粉8g，再喷入上述所得挥发油，按常规方法制得3500枚本发明药物组合物栓剂。 

实施例4：本发明药物组合物泡腾剂 

银花15kg  莪术30kg  连翘15kg  蜈蚣15kg  紫草15kg  黄柏15kg； 

取原料药莪术和连翘加8重量倍的水，提取8小时，得挥发油25-30μl和提取液a；取原料药银花和蜈蚣加8重量倍的水，煎煮2次，每次1小时，得提取溶液b；取原料药黄柏和紫草，加70％乙醇提取2次，回收乙醇，得提取液c；合并以上提取液a、b和c，浓缩，干燥，得药粉，出粉率为12％；取半合成脂肪酸酯40g，取上述药粉8g，再喷入上述所得挥发油，再加入常规辅料按常规方法制得本发明药物组合物泡腾剂。 

实施例5：本发明药物组合物气雾剂 

银花20kg  莪术15kg  连翘10kg  蜈蚣20kg  紫草20kg  黄柏10kg； 

取原料药莪术和连翘加6重量倍的水，提取9小时，得挥发油30-40μl和提取液a；取原料药银花和蜈蚣加6重量倍的水，煎煮9次，每次1.5小时，得提取溶液b；取原料药黄柏和紫草，加80％乙醇提取1次，回收乙醇，得提取液c；合并以上提取液a、b和c，浓缩，干燥，得药粉，出粉率为11％；往药粉中喷入上述挥发油，按常规工艺，加入常规辅料制备成本发明药物组合物气雾剂。 

实施例6：本发明药物组合物膏剂 

银花10kg  莪术35kg  连翘20kg  蜈蚣10kg  紫草10kg  黄柏20kg； 

取原料药莪术和连翘加9重量倍的水，提取6小时，得挥发油20-25μl和提取液a；取原料药银花和蜈蚣加9重量倍的水，煎煮6次，每次0.8小时，得提取溶液b；取原料药黄柏和紫草，加60％乙醇提取3次，回收乙醇，得提取液c；合并以上提取液a、b和c，浓缩，干燥，得药粉，出粉率为14％；往药粉中喷入上述挥发油，按常规工艺，加入常规辅料制备成本发明药物组合物膏剂。 

Claims (10)

1.一种防治宫颈癌的药物组合物，其特征在于该药物组合物原料药组成为：

银花5-25重量份  莪术10-40重量份  连翘5-25重量份

蜈蚣5-25重量份  紫草5-25重量份   黄柏5-25重量份；

该药物组合物的制备方法包括如下步骤：

取原料药莪术和连翘加5-10重量倍的水，提取5-10小时，得挥发油和提取液a；取原料药银花和蜈蚣加5-10重量倍的水，煎煮5-10次，每次0.5-2.0小时，得提取溶液b；取原料药黄柏和紫草，加50％-90％乙醇提取1-3次，回收乙醇，得提取液c；合并以上提取液a、b和c，浓缩，干燥，得药粉，出粉率为10-15％；往药粉中喷入上述挥发油，按常规工艺，加入常规辅料制备成临床接受的栓剂。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物原料药组成为：

银花15重量份    莪术30重量份    连翘15重量份

蜈蚣15重量份    紫草15重量份    黄柏15重量份；

或

银花20重量份    莪术15重量份    连翘10重量份

蜈蚣20重量份    紫草20重量份    黄柏10重量份；

或

银花10重量份    莪术35重量份    连翘20重量份

蜈蚣10重量份    紫草10重量份    黄柏20重量份。

3.如权利要求1-2任一所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

取原料药莪术和连翘加5-10重量倍的水，提取5-10小时，得挥发油和提取液a；取原料药银花和蜈蚣加5-10重量倍的水，煎煮5-10次，每次0.5-2.0小时，得提取溶液b；取原料药黄柏和紫草，加50％-90％乙醇提取1-3次，回收乙醇，得提取液c；合并以上提取液a、b和c，浓缩，干燥，得药粉，出粉率为10-15％；往药粉中喷入上述挥发油，按常规工艺，加入常规辅料制备成临床接受的栓剂。

4.如权利要求1-2任一所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

取原料药莪术和连翘加8重量倍的水，提取8小时，得挥发油和提取液a；取原料药银花和蜈蚣加8重量倍的水，煎煮2次，每次1小时，得提取溶液b；取原料药黄柏和紫草，加70％乙醇提取2次，回收乙醇，得提取液c，合并以上提取液a、b和c，浓缩，干燥，得药粉，出粉率为12％；往药粉中喷入上述挥发油，按常规工艺，加入常规辅料制备成临床接受的栓剂。

5.如权利要求3或4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于其中药物组合物栓剂的制备方法中原料组成为：

药粉1重量份    半合成脂肪酸酯2-8重量份    挥发油2-5体积份；

其中，上述重量份与体积份的关系为g/μl的关系。

6.如权利要求5所述的药物组合物的制备方法，其特征在于其中药物组合物栓剂的制备方法中原料组成为：

药粉1重量份    半合成脂肪酸酯5重量份    挥发油3.5体积份。

7.如权利要求1-2任一所述的药物组合物在制备防治宫颈癌的药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于其中所述的防治宫颈癌是指阻断人宫颈鳞癌SiHa细胞从G0～G1期向S期分化，并促进其凋亡。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于其中所述的防治宫颈癌是指抑制宫颈癌细胞的生长。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于其中所述的防治宫颈癌是指调控P53基因表达的分子机制而抑制肿瘤。

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