CN101918440A - 新的禽类细胞因子及编码其的遗传序列 - Google Patents

Abstract

本发明总体涉及具有禽类细胞因子性质的新的重组多肽以及编码其的遗传序列。本发明具体涉及重组禽类III型干扰素多肽，编码其的遗传序列，以及细胞表达系统及其应用。本发明更具体涉及禽类干扰素-λ(IFN-λ)及其功能衍生物、同系物和片段，以及其使用方法。本发明的分子和细胞具有广泛应用，包括但不限于提供治疗和预防疾病、具体是禽类疾病的手段和方法，或者用作免疫应答调节剂。本发明还提供了筛选免疫应答的诊断手段以及鉴别IFN-λ蛋白或核酸功能性的调节剂的筛选手段。

Description

新的禽类细胞因子及编码其的遗传序列

发明领域

本发明总体涉及新的具有禽类细胞因子性质的重组多肽以及编码其的遗传序列。本发明具体涉及重组禽III型干扰素多肽及编码其的遗传序列，以及其细胞表达系统和应用。本发明更具体涉及禽类干扰素-λ(IFN-λ)及其功能衍生物、同系物和片段以及其使用方法。本发明的分子和细胞具有广泛应用范围，用于包括但不限于提供治疗和预防疾病、具体是禽类动物疾病的手段和方法，或者用作免疫应答调节剂。本发明还提供了筛选免疫应答的诊断手段及鉴别蛋白或核酸功能性的调节剂的筛选手段。

发明背景

本说明书中由作者引用的出版物的目录按字母顺序列于本文描述结束处。

说明书中对任何现有公开文献(或来自其的信息)或任何已知事物的引用不是也不应当被认为是以任何形式承认或认可所述现有公开文献(或来源于其的信息)或已知事物构成本发明所述技术领域的已知常识。

重组DNA技术的快速完善(sophistication)极大地促进了医学和兽医领域的研究。细胞因子研究特别重要，尤其是这些分子调节许多细胞如参与介导免疫应答的细胞的增殖、分化和功能。给予重组细胞因子或者调解细胞因子功能和/或合成逐渐成为治疗众多人和动物疾病的医学研究的焦点。

干扰素(IFN)代表在脊椎动物中通过调节已知称作IFN刺激基因(ISG)的数百个基因而产生不同细胞作用的一组细胞因子。IFN呈现出多功能作用，包括调节细胞生长周期以及诱导和调节炎症应答，其主要形成全部免疫应答。IFN的最为公认的特性之一是其诱导细胞对病毒抗性的能力(Hwang et al 1995，PNAS)。

脊椎动物IFN由三种类型组成，基于其结构、受体特异性以及其诱导的途径而加以分类(Smith et al.，2005；Theofilopoulos et al.，2005)。

I型IFN包括IFNα，其在脊椎动物基因组中有许多表现形式(Meager，2002)；以及包括IFNβ，通常由单个基因表示(Schultz et al.，2004)。I型IFN在检测许多病毒时被激活(Jacobs and Langland 1996；Majde 2000)，且一旦激活则与其受体IFNα/β受体(IFNα/βR)相互作用，从而诱导导致IFN-特异性抗病毒保护作用的ISG亚型(亚集)(de Veer et al.，2001；Takaoka and Yanai2006)。I型IFN的治疗应用已经成功用于保护哺乳动物免于病毒感染，所述病毒包括流感病毒(Beilharz et al.，2007；Koerner et al.，2007)、丙型肝炎病毒(Marcello et al.，2006)以及一些其它病毒(Kotenko et al.，2003；Sheppard etal.，2003；Meager et al.，2005)。

II型IFN组由一个成员IFNγ(Schroder et al.，2004)组成。IFNγ通过IFNγ受体(IFNγR)激活抗病毒活性以及细胞免疫性(Kamijo et al.，1994；Schroder，et al.，2004)。这个IFN还证实抗病毒活性，包括针对Foot and Mouth Disease(FMD)病毒(Moraes et al.，2007)、多瘤病毒(Abend et al.，2007)及其它病毒(Chesler et al.，2003)的抗病毒活性，且已经相似地用作针对多种病原体的治疗剂(Schroder et al.，2004)。

近年来报道了在哺乳动物中的第三种IFN家族，III型IFN，目前其具有三个已知亚型：IFNλ1(也称作IL29)、IFNλ2(也称作IL28A)和IFNλ3(也称作IL28B)(Sheppard，et al.，2003)。哺乳动物IFNλ成员与独特的受体复合物相互作用，所述受体复合物由IFNλ受体1(IFNλR1)和IL10受体β(IL10Rβ)组成(Donnelly et al.，2004)。这些亚单位受体在配体结合时二聚，磷酸化转录因子的信号转导物和激活物(STAT)(Kotenko et al.，2003；Donnelly et al.，2004)，使得IFNλ-特异性基因集合活化(Ank et al.，2006；Marcello et al.，2006)。尽管其IL10-样信号复合物(Sheppard et al.，2003；Donnelly et al.，2004)，但是哺乳动物IFNλ呈现出类似I型IFN的抗病毒性质(Meager et al.，2005).因此，看起来IFNλ可以通过另一种受体复合物诱导I型IFN样基因亚集(Marcello et al.，2006)。

对于人INFλ(HuIFNλ)进行的一些研究表明IFNλ抑制病毒的潜力。例如已经证实HuIFNλII在哺乳动物细胞培养物中抑制丙型肝炎病毒(Robek etal.，2005；Marcello et al.，2006)。这种保护作用与I型IFN的作用相似，但是每种IFN启动不同基因亚集(Marcello et al.，2006)。因此，病毒保护作用可以从不同阵列的受到刺激的基因中启动(Rio et al.，1998；Stohr and Esveld，2004；Meager et al.，2005；Annibali et al.，2007)。此外，IFNλ和I型IFN的抗病毒保护作用对比证实这两种类型IFN能抑制EMCV。然而，作用级别明显不同(Meager et al.，2005)。在包括VSV的研究中观测到相似发现(Kotenkoet al.，2003)。这提示INFλ应答途径可能是在某些病毒感染中的特异功能作用必需的。

目前对于禽病毒予以密切关注，禽流感的爆发可以在禽类动物和人群中迅速传播并导致高发病率(Stohr and Esveld 2004)。在家禽中处理问题病毒的艰巨任务组合使用I型和II型IFN治疗可观测到相关的免疫毒性这个事实(Kotenko et al.，2003；Stohr and Esveld 2004；Meager et al.，2005)，迫使进一步研究新的及另外的抗病毒策略。因此，需要改善禽病毒的控制方法，以有益于家禽业以及帮助降低这些病毒传播至人的危险(Chen et al.，2007)。进一步地，鉴于家禽业在全社会经济和食品供应中的重要性，至关重要的是开发调节和改良免疫调节作用的新手段。

在本发明的研究工作中，分离并测序了编码鸡IFN-λ(后文称作ChIFN-λ)的核酸分子。包含本发明的分离的核酸分子的重组遗传构建体已经在转化的细胞中产生和表达，从而可以分离和测序ChIFN-λ。这些发现提供了其它IFN治疗的机会。

发明概述

在本说明书及权利要求书中，除非特别指出，则术语“包含”应理解为包含所述的元件或整数或者元件或整数组，但不排除任何其它元件或整数或者元件或整数组。

在本说明书和权利要求书中，除非特别指出，则术语“包含”应理解为包含所述的元件或整数或者元件或整数组，但不排除任何其它所述的元件或整数或者元件或整数组。

如本文所用，术语“衍生自”是指所述整数或整数组源自所述种类，但是非必需直接得自所述来源。再者，如本文所用，除非特别指出，则单数形式“一个”包括多个所指事物。

除非特别指出，本文所用所有技术和学术用语均具有本发明所述领域技术人员通常理解的含义。

本说明书含有使用PatentIn Version 3.1程序制作的氨基酸和核苷酸序列信息，在后文参考文献之后列出。每个氨基酸和核苷酸序列均在序列表中通过数字指示符<210>及随后的序列标识符(例如<210>1、<210>2等)示出。序列的长度、类型(氨基酸、DNA等)以及每个序列的来源生物体分别以数域指示符<211>、<212>和<213>提供的信息标示。本说明书中提及的氨基酸和核苷酸序列通过指示符SEQ ID NO：及随后的标识符识别(例如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2等)。本说明书中提及的序列标识符与序列表中数域指示符<400>提供的信息相关，其随后是序列标识符(例如<400>1、<400>2等)。也就是说本说明书中描述的SEQ ID NO：1与序列表中<400>1标示的序列相关。

本说明书中使用的单字母和三字母缩写在表1中示出。

本发明一方面涉及核酸分子，其编码禽类细胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物或者互补于编码禽细胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物的核酸分子，其中所述多肽是III型干扰素。

本发明另一方面提供了核酸分子或者其功能片段或者衍生物，其编码禽类细胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物或者互补于编码禽类细胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物的核酸分子，其中所述多肽是III型干扰素，其中所述禽类动物是选自鸡、鸭、鹅、火鸡、矮脚鸡、鹌鹑或者珍珠鸡的家禽。

另一方面，所述III型干扰素多肽是鸡IFN-λ(ChIFNλ)多肽或者包含其或者其功能片段、衍生物或者禽类同系物的融合分子。

再一方面，本发明提供了核酸分子或者其功能片段或者衍生物，其编码鸡IFN-λ多肽或者其功能片段或者衍生物或者互补于编码鸡IFN-λ多肽或者其功能片段或者衍生物的核酸分子。

本发明再一方面涉及选自如下的分离的核酸：

(i)分离的核酸分子或者其功能片段、衍生物或者禽类同系物，其包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码或者互补于编码基本如SEQ IDNO：2或4所示氨基酸序列的序列，或者编码与SEQ ID NO：2或4所示序列在序列长度上具有至少大约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性的氨基酸序列的序列，或者在低严格条件下能与所述核酸分子杂交的核酸序列。

(ii)分离的核酸分子或者其功能片段、衍生物或者禽类同系物，其包含核苷酸序列或者互补于所述序列，其中所述核苷酸序列基本如SEQ ID NO：1或3所示，或者是与所述序列在全长上具有至少大约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列，或者是能与SEQ ID NO：1或3所示序列或者其互补形式在低严格条件下能杂交的核苷酸序列。

(iii)分离的核酸分子或者其功能衍生物、片段或者禽类同系物，其包含SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列。

本发明另一方面提供了禽类干扰素III型多肽或者其功能片段或者衍生物。

本发明再一方面涉及如SEQ ID NO：2或4所示或者与SEQ ID NO：2或4所示序列在序列长度上具有至少大约60％、65％、75％、80％或者更高相同性的分离的蛋白质，或者其功能衍生物、片段或者禽类同系物。

本发明另一方面涉及由SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列或者能在低严格条件下与SEQ ID NO：1或3杂交的序列编码的蛋白质，且其编码SEQID NO：2或4所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2或4在序列长度上具有至少大约60％、65％、70％、75％、80％或者更高相同性。

本发明另一方面提供了在细胞中生产重组禽III型干扰素分子的方法，所述方法包括在所述细胞中表达核酸分子，所述核酸分子编码所述禽III型干扰素或者互补于编码所述禽III型干扰素的核酸分子。

本发明再一方面提供了分离的细胞，其表达内源或者重组禽III型干扰素或者其功能片段、衍生物或者同系物。

一方面，本发明提供了在细胞中生产重组禽III型干扰素的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)在所述细胞中导入包含核酸分子的遗传构建体，所述核酸分子编码所述禽III型干扰素或者互补于编码所述禽III型干扰素的核酸分子，置于合适的启动子序列控制下；

(ii)将所述细胞在足以使得所述核酸分子表达的时间和条件下培养；

(iii)分离所述表达产物。

另一方面，本发明提供了在细胞中产生禽III型干扰素融合分子的方法，所述方法包括在所述细胞中导入包含核酸分子的遗传构建体，所述核酸分子编码禽III型干扰素多肽或者其功能片段、衍生物或者禽类同系物或者互补于编码禽III型干扰素多肽或者其功能片段、衍生物或者禽类同系物的核酸分子，其中所述多肽是第一种III型干扰素与第二种III型干扰素或者第一种III型干扰素与第二种I型或II型干扰素之间的融合多肽，所述I型或II型干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、Ch IFN-β或者Ch IFN-γ等。

再一方面，本发明提供了第一种III型干扰素与第二种III型干扰素或者第一种III型干扰素与第二种I型或II型干扰素之间的重组融合多肽，所述I型或II型干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ChIFN-α、ChIFN-β或者ChIFN-γ等。

本发明再一方面提供了包含核酸分子的遗传构建体，所述核酸分子编码禽III型干扰素融合多肽或者其功能片段或者衍生物或者互补于编码禽III型干扰素融合多肽或者其功能片段或者衍生物的核酸分子，其中所述多肽是III型干扰素与第二种III型干扰素或者第一种III型干扰素和第二种I型或II型干扰素之间的融合多肽，所述I型或II型干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、Ch IFN-β或者Ch IFN-γ等。

本发明另一方面提供了鉴别禽III型干扰素遗传序列或者其功能片段或者衍生物的方法。

本发明再一方面提供了检测III型干扰素多肽或者其功能片段、衍生物或者同系物存在的方法。

本发明另一方面提供了治疗或者预防禽类动物疾病的方法，所述方法包括在足以保持、刺激或者增强所述禽类动物免疫应答的时间和条件下给予所述禽类动物有效量的禽III型干扰素多肽或者其功能片段、衍生物或者同系物。

本发明再一方面提供了治疗或者预防禽类动物疾病的方法，所述禽类动物已经暴露于或者感染病原性生物体，所述方法包括给予所述禽类动物有效量的禽III型干扰素多肽或者其功能片段、衍生物或者同系物。

本发明再一方面涉及禽类干扰素III多肽用于治疗或者预防禽类动物疾病。

本发明再一方面涉及禽III型干扰素多肽在生产调节禽类动物免疫应答和/或治疗或者预防禽类动物疾病的药物中的应用。

本发明另一方面提供了包含禽类细胞因子分子的佐剂，其中所述细胞因子是III型干扰素或者是所述III型干扰素分子与第二种细胞因子分子及任选药物可接受的载体、赋形剂或者稀释剂的融合分子。

本发明再一方面提供了兽用药物组合物，其包含免疫调节有效量的禽III型干扰素或者禽III型干扰素与第二种细胞因子之间的融合分子或者能表达其的遗传序列，以及兽用可接受的一或多种载体和/或稀释剂。

表1：单字母和三个字母的氨基酸缩写

附图简述

图1是对得自用Poly(I:C)(50μg/ml)处理2小时的鸡脾细胞的ChIFN转录物的RT-PCR表达分析图。ChIFNα、β或者λ通过使用IFN特异性测序引物扩增并在1％琼脂糖凝胶上电泳。水作为阴性对照。GAPDH的表达作为内部对照。

图2是使用ClustalW(BioManager)产生的ChIFNλ和各种脊椎动物物种的IFNλII的推导的氨基酸序列对比示意图。将ChIFNλ的预测的蛋白质序列与HuIFNλII(登记号NM_172138)、mIFNλII(登记号AY869695)和fishIFNλ(登记号AB093588)对比。相同的氨基酸残基以‘*’标示，保守的和半保守的残基分别以‘:’和‘.’标示。短线指出为了优化该对比而导入序列中的缺口(gap)。信号肽被鉴别并以方框示出，但是fishIFNλ未能预测信号肽。

图3是ChIFNλ核苷酸序列和预测的氨基酸翻译的示意图。对ChIFNλ的ORF进行序列分析，示出预测的氨基酸翻译。预测的信号肽以下划线标示，内含子位置以箭头标示。

图4是使用完整编码序列示出ChIFNλ的氨基酸序列、一些其它脊椎动物IFNλ以及选择的其它鸡细胞因子关系的无根系统发生树示意图。每个基因的Genebank登记号可见于表4。

图5是大肠杆菌表达的重组鸡IFN的SDS-PAGE分析图。大肠杆菌表达的重组ChIFNα、ChIFNβ和ChIFNλ蛋白在IPTG诱导之后通过Ni-NTA金属-亲和性层析纯化。然后将这些重组蛋白质在12％SDS-PAGE上电泳，以及通过考马斯亮蓝染色分析。包含较宽范围的分子量标记(Markers)作参考。

图6是鸡IFN刺激的亚硝酸盐产生图示。将HD11鸡巨噬细胞样细胞与ChIFNλ和ChIFNβ一起培养24小时，然后检测上清中诱导的亚硝酸盐产生情况。所示数值是一式三份进行的每个实验的平均值。结果是2个独立实验的代表。

图7是示出在用IFN处理后CEF细胞中免于SFV感染的保护作用图示。将CEF细胞与各种ChIFN一起培养18小时，然后感染SFV。然后通过用中性红染色测量细胞裂解情况，以及在感染后24小时测量吸光度(OD₅₄₀)。所示数值是一式三份进行的实验的平均值。结果是2个独立实验的代表。

图8是示出在IFN预处理之后在HD11鸡巨噬细胞中流感减少示意图。将HD11细胞用ChIFNα、ChIFNβ、ChIFNλ或者单独培养基处理6小时，然后用流感病毒(PR8)感染。通过HA试验在感染后不同时间点测量病毒效价。所示数值是一式四份进行的每个实验的平均值。结果是2个独立实验的代表。

图9是示出Poly(I:C)诱导IFN mRNA表达的示意图。将鸡脾单核细胞与30μg/ml Poly(I:C)培养2和4小时。随后，收获细胞，使用qRT-PCR测量ChIFNα、ChIFNβ和ChIFNλmRNA水平。数据表示各种IFN相对于未刺激对照物的表达。GAPDH用作管家基因以标准化结果。数值是平均值±SE。一式三份进行实验，结果是2个独立实验的代表。

图10是示出IFN诱导TLR3 mRNA表达的示意图。将鸡脾单核细胞与不同浓度的ChIFNα、ChIFNβ和ChIFNλ一起培养3小时，然后使用qRT-PCR测量TLR3水平。GAPDH用作管家基因以标准化结果。相对于未受刺激的对照物示出表达。数值是平均值±SE。一式三份进行实验，结果是2个独立实验的代表。

图11是示出在H5N1(禽流感病毒)感染期间IFNλ被诱导的示意图。在H5N1(V/1203)感染后，在鸡肺、脾和脑中通过qRT-PCR测量细胞因子IFNλ。数据示出与未感染对照禽类动物相比成倍改变。数据代表平均值(n＝7)±SE。

图12是示出IFNλ在感染前和感染后起保护作用免于流感感染示意图。将HD11细胞用三个浓度的chIFN-α、β和λ预处理(B)或者后处理(A)，然后用流感病毒(PR8)攻击。条柱示出在第24、40、48、60和72小时通过HA测量的病毒相对水平。在24小时和40小时无病毒可被检测。在每个时间点获得多个样品。

图13是示出IFNλ抗体对于IFNλ活性的抑制作用示意图。通过HA效价确定抗-chIFN-λ抗体与流感疫苗病毒在卵内共接种增加流感病毒效价。数据代表直至7个实验的平均值±SE。统计学显著性由一个星号(*)表示p＜0.05，两个星号(**)表示p＜0.005，三个星号(***)表示p＝0.0001。

图14是示出在免疫后IFNλ提高抗体应答示意图。用0.2ml包装的绵羊红细胞(SRBC)在存在或者不存在细胞因子的条件下经腹部内注射接种无特定病原体的鸡(SPF)(n＝7)。在免疫后第15天用单独的SRBC对该禽类动物再次免疫。每周取所有该禽类动物的血样，测量HA效价。通过完全凝血确定的血清抗体效价以每组的平均值表示。

图15是示出RchIFN-λ抑制脾细胞中Con A诱导的增殖示意图。将脾细胞与系列稀释的大肠杆菌表达的rchIFN-α、β和λ以及次最佳Con A(5μg/mL)一起培养48小时。然后加入胸苷H3T，将细胞再培养24小时。测量放射性以确定细胞增殖，以一式四份样品的平均值±SE表示。单独用ConA处理的细胞以一式四份平均值表示。

发明详述

本发明部分基于相应于新的禽III型干扰素基因、特别是鸡IFN-λ基因的核酸分子的分离和测序。这个发现提供了用于免疫调节的新的蛋白质和核酸分子。在用病毒攻击的细胞中，当将该细胞在存在鸡IFN-λ基因表达产物的条件下培养时观测到病毒诱导的细胞裂解的保护作用。因此，这个新的禽类细胞因子基因的鉴别特别促进用于治疗、预防和诊断/监测与暴露于或者感染病原性生物体的禽类动物疾病的产品和方法的开发。

因此，本发明一方面涉及核酸分子，其编码禽类细胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物或者互补于编码禽类细胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物的核酸分子，其中所述多肽是III型干扰素。

术语“禽类”应理解为包含通常称作鸟类动物的脊椎动物纲的成员。应理解如本文所用，术语“禽类”包括两种性别和所有发育阶段的家禽(poultry)、家禽(domestic bird)和猎禽(game bird)，选自鸡、火鸡(turkey)、矮脚鸡(bantam)、鹌鹑(quail)、珍珠鸡(guinea fowl)、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋(emu)、鸽子、金丝雀(canary)、虎皮鹦鹉(budgerigar)、鹦鹉(parrot)及雀(finch)等。

本文所用术语“细胞因子多肽”应理解为是指这样的多肽分子，其包含生物学活性蛋白质的至少一个亚基，具有III型干扰素的一或多种特征性生物学特征，特别是具有调节禽免疫细胞功能性的能力，所述禽免疫细胞如淋巴细胞(B或T细胞)、粒细胞(嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或者中性粒细胞)或者其它非特异性免疫细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、NK细胞等)。

不将本发明限于任一理论或者作用模式，已经确定III性干扰素呈现出与I型干扰素类似的生物学性质。因此，提及III型干扰素的生物学活性时应理解为包括但不限于抗病毒和免疫刺激活性，如病毒诱导的表达导致通过Janus激酶(Jak)-STAT信号转导途径产生信号及IFN刺激的调节基因表达(ISRE)的激活，主要组织相容性复合物(MHC)I型抗原表达的正调节，以及针对病毒感染诱导的致细胞病变的保护作用。

因此，本发明另一方面提供了这样的核酸分子或者其功能片段或者衍生物，其编码禽类细胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物或者互补于编码禽类细胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物的核酸分子，其中所述多肽是III型干扰素，且其中所述禽类动物是鸡、火鸡、矮脚鸡、鹌鹑、珍珠鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋、鸽子、金丝雀、虎皮鹦鹉、鹦鹉或者雀等。

最优选地，本发明的核酸分子衍生自鸡。

不将本发明限于任一理论或者作用模式以及如前文所述，IFN基于分子结构、受体类型及其诱导的功能途径而被分为三个家族。这三个家族是IFN-I、IFN-II和IFN-III。III型IFN包含IFNλ，IFNλ在哺乳动物中具有三个亚型，即IFNλ1(IL29)、IFNλ2(IL28A)和IFNλ3(IL28B)。虽然在鸡中INF-λ仅包含一个成员，但是应理解提及禽IFN-λ时包含所有形式的这些分子以及其功能片段、衍生物和禽类同系物，包括可以从IFN-λmRNA可变剪接中产生的异构体形式、多聚体形式、等位基因形式以及以二聚体、多聚体和融合蛋白存在的形式。

不将本发明限于任一理论或者作用模式，IFN-λ基因优选包含在染色体7上的5个外显子区域，其编码分子量为21kDa的具有186个氨基酸的多肽，其在核苷酸水平与HuIFNλII仅具有36％相同性。如前文所述，IFN-λ基因的表达产物优选呈现出抗病毒和免疫刺激活性。

在一个优选的实施方案中，所述III型干扰素多肽是鸡IFN-λ(ChIFNλ)多肽或者包含所述多肽或者其功能片段、衍生物或者禽类同系物的融合分子。

根据这个优选的实施方案，本发明提供了这样的核酸分子或者其功能片段或者衍生物，其编码鸡IFN-λ多肽或者其功能片段、禽类同系物或者衍生物或者互补于编码鸡IFN-λ多肽或者其功能片段、禽类同系物或者衍生物的核酸分子。

本发明再一方面涉及分离的核酸，所述核酸选自：

(i)包含这样的核苷酸序列的分离的核酸分子或者其功能片段、衍生物或者禽类同系物，所述核苷酸序列编码或者互补于编码基本如SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：2或4在序列长度上具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性的氨基酸序列的序列，或者能在低严格条件下雨所述核酸分子杂交的核酸序列。

(ii)包含核苷酸序列或者与所述序列互补的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是基本如SEQ ID NO：1或3所示序列，或者是与所述序列在序列长度上具有至少大约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性的核苷酸序列，或者是能在低严格条件下与SEQ ID NO：1或3或者其互补形式杂交的核苷酸序列。

(iii)分离的核酸分子或者其功能衍生物、片段或者禽类同系物，其包含SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列或者所述分子的功能片段。

本发明应理解为提供了上述cDNA核苷酸序列的基因组DNA形式。为此，SEQ ID NO：1相应于ChIFNλcDNA，包括编码信号肽的序列。SEQ IDNO：3相应于编码成熟蛋白质即没有信号序列的蛋白质的ChIFNλcDNA开放读框的序列，。SEQ ID NO：2相应于包括信号序列的ChIFNλ蛋白；而SEQID NO：4相应于不包括信号序列的ChIFNλ蛋白。

本文提及的ChIFNλ的基因组和cDNA形式应理解为是其最广泛含义，且包括：

(i)经典的基因组基因，由转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或未翻译序列(即内含子、5′-和3′-未翻译序列)组成；

(ii)相应于编码区(即外显子)的mRNA或者cDNA，任选包含该基因的5′-或者3′-未翻译序列；和/或

(iii)相应于有或无与该蛋白质前体形式相关的序列如信号序列的编码区的mRNA或cDNA，以及任选5’-或者3’-未翻译序列。

如前文所述，ChIFNλ相应于先前未鉴别的禽类干扰素分子。应理解本发明还提供了前述核酸分子的表达产物。

因此，本发明另一方面涉及禽类细胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物，其中所述多肽是III型干扰素。

优选地，所述禽类干扰素III型多肽是禽IFN-λ多肽或者其功能片段或者衍生物。

更优选地，所述IFN-λ多肽是ChIFN-λ。

本发明另一方面涉及分离的蛋白质，其如SEQ ID NO：2或4所示或者与SEQ ID NO：2或4所示序列在全长上具有至少大约60％、65％、75％、80％或更高相同性，或者其功能衍生物、片段或者禽类同系物。

术语“蛋白质”应理解为包含肽、多肽和蛋白质。也应理解这些术语在本文可互换使用。蛋白质可以是糖基化或者非糖基化蛋白质，和/或可以含有与蛋白质如氨基酸、脂质、碳水化合物或者其它肽、多肽或者蛋白质融合、连接、结合或者另外关联的许多其它分子。在后文提及“蛋白质”时包括包含氨基酸序列的蛋白质以及与其它分子如氨基酸、脂质、碳水化合物或者其它肽、多肽或者蛋白质关联的蛋白质。

优选地，所述60％或者更高的相似性是指65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％相似性。

本发明的蛋白质优选是分离形式。“分离的”是指经历至少一个纯化步骤且适宜地通过例如组合物而定义的蛋白质，所述蛋白质组合物相对于其它成分包含至少大约10％所述蛋白质、优选至少大约20％、更优选至少大约30％、更优选至少大约40-50％、甚至更优选至少大约60-70％、以及更优选80-90％或更高的所述蛋白质，这通过分子量、氨基酸序列或者其它常规方式确定。在一个优选的实施方案中，本发明的蛋白质也可以被认为是生物学纯的。

如本文所用，关于权利要求的蛋白质和核酸分子，术语“分离的”是指所述材料已经从其原始环境(例如如果其是天然发生的则从其天然环境)中分离出。例如，存在于活的动物中的天然发生的多核苷酸或者蛋白质不是分离的，但是从天然系统中一些或者所有共存材料中分离的相同多核苷酸或蛋白质则是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分，和/或这种多核苷酸或者蛋白质可以是组合物的一部分，且在这种载体或者组合物不是其天然环境的一部分时仍是分离的。如本文所用，分离的材料或者组合物也可以是“纯化”的组合物，即其不需要绝对纯度，而是相对定义。得自文库的各个核酸可以被常规纯化为电泳同质性。在另一方面，本发明提供了这样的核酸，其已经从基因组DNA中或者从文库的其它序列或者其它环境中纯化至少1、2、3、4、5或者更高数量级。

本发明的蛋白质可以分离自天然来源、是合成的或者是重组产生的多肽。肽和蛋白质可以在体外或者体内重组表达。本发明的蛋白质可以通过使用本领域已知方法产生和分离。本发明的蛋白质也可以使用本领域熟知的化学方法整体或者部分合成。见例如Caruthers et al.(1980)Nucleic AcidsRes.Symp.Ser.215-223；Horn et al.(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.225-232；Banga，A.K.，Therapeutic Peptides and Proteins，Formulation，Processing and Delivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.，Lancaster，PA所述。例如，可以使用各种固相技术(见例如Roberge et al.(1995)Science269：202；Merrifield(1997)Methods Enzymol.289：3-13)进行肽合成，自动合成可以例如通过使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)根据厂商指导实现。

本发明的蛋白质也可以是作为与其连接的一或多个其它结构域的融合蛋白而合成和表达，以例如更易于分离重组合成的肽、鉴别和分离抗体和表达抗体的B细胞等。便于检测和纯化的结构域包括例如金属螯合肽如多组氨酸序列段和组氨酸-色氨酸模块，使得可以在固定化金属上纯化；蛋白质A结构域，使得可以在固定化免疫球蛋白上纯化；以及在FLAGS延伸/亲和性纯化系统(Immunex Corp，Seattle WA)中使用的结构域。在纯化结构域与包含基序的蛋白质之间包含可裂解接头序列如因子Xa或者肠激酶(Invitrogen，San Diego CA)以便于纯化。例如，表达载体可包含与六组氨酸残基连接的编码表位的核酸序列，随后是硫氧还蛋白和肠激酶裂解位点(见例如Williams et al.(1995)Biochemistry 34：1787-1797；Dobeli et al.(1998)Protein Expr.Purif.12：404-14)。所述组氨酸残基便于检测和纯化，而肠激酶裂解位点提供了从剩余融合蛋白中纯化区域的手段和方法。与编码融合蛋白的载体及融合蛋白的应用相关的技术在一些学术和专利文献中充分描述，见例如Kroll et al.(1993)DNA Cell.Biol.，12：441-53所述。

尽管本发明涵盖重组蛋白质，但是在合成所述蛋白质中也包含化学合成技术。

根据本发明，化学合成的多肽是基于分离自禽类动物的分子适宜地合成的。禽类动物分子的分离可以通过任何合适方法实现，例如通过层析分析，如使用CM-纤维素离子交换层析及随后Sephadex(例如G-50柱)过滤。许多其它技术也是合适的，包括HPLC、PAGE等技术。

优选本发明的化学合成的多肽是基于分离自鸡的分子适宜地合成。

所述多肽可以使用如Carpino et al.(1991)所述F-moc化学方法通过固相合成方法合成。多肽及其片段也可以通过另外的化学方法合成，包括但不限于如Stewart et al.(1985)所述t-Boc化学方法，或者通过传统的液相肽合成方法合成。

本发明再一方面涉及由SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列或者互补于能在低严格条件下与SEQ ID NO：1或3杂交的序列的序列编码的蛋白质，其编码SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：2或4在序列长度上具有至少大约60％、65％、70％、75％、80％或者更高相同性。

本发明明确包含衍生自禽类动物而不是仅仅是鸡的相关或同源的III型干扰素基因或蛋白质，所述禽类动物例如但不限于任何家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或者猎禽，选自火鸡、矮脚鸡、鹌鹑、珍珠鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋、鸽子、金丝雀、虎皮鹦鹉、鹦鹉和雀等。本发明进一步提供了衍生自胚胎组织或者培养的细胞的所述禽III型干扰素基因。

在本文提及“III型干扰素”时应理解为是指前文所述核酸和蛋白质分子。

如本文所用，短语“核酸”或者“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸；或者任何这些的片段；基因组或合成来源的DNA或RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA)，其可以是单链或双链DNA或RNA且可以代表有义链或反义链；肽核酸(PNA)；或者任何DNA样或者RNA样材料，天然或合成来源的，包括例如iRNA、核糖核蛋白(例如iRNP)。该术语涵盖了含有已知天然核苷酸类似物的核酸，即寡核苷酸。该术语还涵盖了具有合成主链的核酸样结构，见例如Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197；Strauss-Soukup et al.(1997)Biochemistry 36：8692-8698；Samstaget al.(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6：153-156。

最后，应理解本发明提供了反义核酸分子，其针对本文定义的禽类细胞因子核酸分子。

“表达产物”包括RNA分子如mRNA转录物以及蛋白质。一些基因是非蛋白质编码基因且产生mRNA或者其它RNA分子，且参与调节RNA:DNA、RNA:RNA或者RNA:蛋白质相互作用。所述RNA(例如mRNA)可以直接起作用，或者通过引导其它分子如RNAi或者通过剪接产物(例如外显子或内含子)起作用。本发明也涵盖短的干扰RNA(si-RNA)。其它基因编码mRNA转录物，其随后被翻译为蛋白质。蛋白质包括多肽。因此，不同表达的核酸分子可仅编码mRNA，或者另外编码蛋白质。mRNA和蛋白质均是“表达产物”。

本发明另一方面提供了在细胞中产生重组禽III型干扰素分子的方法，所述方法包括在所述细胞中表达编码所述禽III型干扰素的核酸分子或者互补于编码所述禽III型干扰素的核酸分子的核酸分子。

本发明的核酸优选是分离形式或者与载体如表达载体的连接形式。“分离的”是指核酸分子经历至少一个纯化步骤，且其例如通过组合物而被适宜地定义，所述组合物相对于其它成分包含至少大约10％所述核酸分子，优选至少大约20％、更优选至少大约30％、更优选至少大约40-50％、以及更优选至少大约60-70％、甚至更优选80-90％或更多的所述核酸分子，这通过分子量、氨基酸序列或者其它合适方式确定。在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子也被认为是生物学纯的。

本发明的核酸可以通过例如克隆和表达cDNA文库、通过PCR扩增信使或基因组DNA等方式产生、分离和/或操纵。在实施本发明的方法中，同源基因可以通过如本文所述操纵模板核酸而进行修饰。本发明可以与本领域已知的任何方法或方案或装置联合实施，这些在学术和专利文献中充分描述。

用于实施本发明的核酸，无论是RNA、iRNA、反义核酸、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或者其杂交体，均可以通过遗传工程、扩增和/或表达/重组产生等方式分离自多个来源。从这些核酸中产生的重组多肽可以单独分离或者克隆，并检测其预期活性。任何重组表达系统均可使用，包括细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或者植物细胞表达系统。

或者，这些核酸可以在体外通过熟知的化学合成技术合成，例如Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov et al.(1997)supra；Frenkel et al.(1995)supra；Blommers et al.(1994)supra；Narang et al.(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown et al.(1979)Meth.Enzymol.68：109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；美国专利No.4,458,066所述。

本发明提供了包含本发明序列的寡核苷酸，所述序列如本发明举例的序列的亚序列。寡核苷酸可包括例如单链多脱氧核苷酸或者两个互补多脱氧核苷酸链，其可以是化学合成的。

操纵核酸的技术如亚克隆、标记探针(例如使用Klenow聚合酶进行随机-引物标记，切口平移(nick translation)、扩增)、测序、杂交等技术在学术和专利文献中充分描述，见例如Sambrook，ed.，Molecular Cloning：aLaboratory Manual(2nd ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，ed.John Wiley&Sons，Inc.，New York(1997)；Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology：Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part I.Theory and NucleicAcid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。

核酸、载体、壳体、多肽等可以通过本领域技术人员熟知的任何众多一般方法分析和量化。这些方法包括例如分析生物化学方法如NMR、分光光度测定法、X射线成像、电泳、毛细管电泳、高效液相层析(HPLC)、薄层层析(TLC)以及超扩散层析，各种免疫学方法如液体或凝胶沉淀反应、免疫扩散、免疫电泳、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、Southern分析、Northern分析、斑点印迹分析、凝胶电泳(例如SDS-PAGE)，核酸或者靶或者信号扩增方法，放射标记，闪烁计数以及亲和性层析。

获得和操纵用于实施本发明方法的核酸可以通过从基因组样品中克隆而进行，且如果需要则筛选和再克隆从例如基因组克隆或者cDNA克隆中分离或者扩增的插入体。本发明方法中使用的核酸的来源包括基因组或者cDNA文库，其包含于例如哺乳动物人工染色体(MAC)中，见例如美国专利No.5,721,118、6,025,155；酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体，见例如Woon et al.(1998)Genomics 50：306-316所述；P1-衍生的载体(PAC)，见例如Kern(1997)Biotechniques 23：120-124；粘粒、重组病毒、噬菌体或者质粒。

本发明的核酸可以与启动子可操纵地连接。启动子可以是一个基序或者核酸控制序列的一个阵列，其指导核酸的转录。启动子可包含转录起始位点邻近的必需的核酸序列，如在聚合酶II型启动子的情况中包含TATAT元件。启动子也任选包含远侧增强子或者阻抑物元件，其可以位于与转录起始位点相隔数千个碱基对。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下是活性的启动子。“可诱导”启动子是在环境或者发育调节下的启动子。“组织特异性”启动子在生物体的某些组织类型中是活性的，但是在同一生物体的其它组织类型中是无活性的。术语“可操纵地连接”是指核酸表达控制序列(如启动子，或者转录因子结合位点的阵列)与第二个核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列指导相应于第二个序列的核酸的转录。

本发明提供了包含本发明核酸例如编码本发明蛋白质的序列的表达载体和克隆载体。本发明的表达载体和克隆载体可包含病毒颗粒、杆状病毒、噬菌体、质粒、噬菌粒、粘粒、fosmid、细菌人工染色体、病毒DNA(例如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、狂犬病病毒以及SV40衍生物)、基于P1的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体，以及特异于感兴趣宿主(如杆状细菌、曲霉菌和酵母)的任何其它载体。本发明的载体可包含染色体、非染色体以及合成的DNA序列。本领域技术人员已知大量合适的载体，这些载体是可商购的。

如果需要，可以使用常规的分子生物学方法将本发明的核酸克隆进任何载体中；在体外克隆扩增的核酸的方法在例如美国专利No.5,426,039中描述。为了便于克隆扩增的序列，可以将限制酶位点“构建进(built into)”PCR引物对。

本发明提供了编码本发明多肽和肽的表达载体文库。可以将这些核酸导入基因组或者细胞质或者细胞核中，并且通过在学术和专利文献中充分描述的多种常规技术表达。见例如Roberts et al.(1987)Nature 328：731；Schneider(1995)Protein Expr.Purif.6435：10；Sambrook，Tijssen或者Ausubel所述。所述载体可以分离自天然来源，得自如ATCC或者GenBank文库这种来源，或者通过合成或者重组方法制备。例如，本发明的核酸可以在在细胞(例如附加型表达系统)中稳定或者瞬时表达的表达盒、载体或者病毒中表达。可以在表达盒和载体中掺入选择标记，以赋予转化细胞和序列选择表型。例如，选择标记可编码附加型维持和复制，由此不需要整合进宿主基因组中。

一方面，本发明的核酸在体内给予以在原位表达本发明的肽或者多肽。所述核酸可以作为“裸DNA”给予(见例如美国专利No.5,580,859)，或者以表达载体形式例如重组病毒性形式给予。所述核酸可以通过任何途径给予，包括肿瘤周围或者肿瘤内给予，如下文描述。在体内给予的载体可以衍生自病毒基因组，包括重组修饰的有包膜或无包膜DNA和RNA病毒，优选选自杆状病毒、细小病毒、picornoviridiae、疱疹病毒、痘病毒、腺病毒或者小RNA病毒科。也可以使用嵌合载体，其采用每个亲代载体的有利性质(见例如Feng et al.(1997)Nature Biotechnology 15：866-870)。这种病毒基因组可以通过重组DNA技术修饰以包含本发明的核酸；以及可以进一步工程化为复制缺陷、条件复制或者具有复制能力。另一方面，载体衍生自腺病毒(例如衍生自人腺病毒基因组的无复制能力的载体，见例如美国专利No.6,096,718、6,110,458、6,113,913、5,631,236)；腺伴随病毒和逆转录病毒基因组。逆转录病毒可包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)以及这些病毒的组合的那些病毒；见例如美国专利No.6,117,681、6,107,478、5,658,775、5,449,614；Buchscher and Panganiban(1992)J.Virol.66：2731-2739；Johann etal.(1992)J.Virol.66：1635-1640)。基于腺伴随病毒(AAV)的载体可用于转导具有靶核酸的细胞，例如在体外产生核酸和肽以及在体内和离体基因治疗方法中；见例如美国专利No.6,110,456、5,474,935；Okada et al.(1996)GeneTher.3：957-964所述。

如本文所用，术语“表达盒”是指这样的核苷酸序列，其能影响结构基因(即蛋白质如本发明的多肽的编码序列)在与这种序列相容的宿主中表达。表达盒包含与多肽编码序列以及任选其它序列例如转录终止信号可操纵地连接的至少一个启动子。也可以使用实现表达必需或者有益的其它因子，例如增强子。如本文所用，“可操纵地连接”是指DNA序列上游连接启动子，由此该启动子介导所述DNA序列的转录。因此，表达盒也包含质粒、表达载体、重组病毒、任何形式重组“裸DNA”载体等。

“载体”包含核酸，其可感染、转染、瞬时或者持久转导细胞。应意识到载体可以是裸核酸或者与蛋白质或者脂质复合的核酸。所述载体任选包含病毒或细菌核酸和/或蛋白质和/或膜(例如细胞膜、病毒脂质包膜等)。载体包括但不限于复制子(例如RNA复制子、噬菌体)，DNA片段可以与其附着且变得可以复制。载体因此包括但不限于RNA、自主复制环状或线性DNA或RNA(例如质粒、病毒等，见例如美国专利No.5,217,879)，且包括表达和非表达质粒。在重组微生物或者细胞培养物作为“表达载体”宿主时，其包括已经掺入宿主染色体中的染色体外环状和线性DNA和RNA。在载体由宿主细胞维持时，所述载体可以在有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳定复制，或者被掺入宿主基因组中。

为了在特定组织或者在指定条件下优化表达，所述核酸核酸分子可以可操纵地置于启动子序列控制下，如前文所述。为此目的的合适的细胞和病毒颗粒也在前文论述。产生高水平表达的细胞或病毒颗粒的启动子序列和培养条件为本领域技术人员熟知。

本发明还提供了包含本发明核酸序列如编码本发明多肽的序列或者包含本发明载体的转化的细胞。所述宿主细胞可以是本领域技术人员熟知的任何宿主细胞，包括原核细胞，真核细胞，如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或者植物细胞。举例的细菌细胞包括大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌、伤寒沙门氏菌，以及假单胞菌、链霉菌和葡萄球菌属的各个菌种。举例的昆虫细胞包括果蝇S2和Spodoptera Sf9。举例的动物细胞包括CHO、COS或者Bowes黑素瘤，或者任何小鼠或者人细胞系。合适宿主的选择在不利于技术人员能力范围内。

载体可以通过使用任何各种技术导入宿主细胞中，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪，或者Ti介导的基因转移。特殊的方法包括磷酸钙沉淀转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂染或者电穿孔。

工程化的宿主细胞可以在针对激活启动子、选择转化体或者扩增本发明基因而适当修改的常规营养培养基中培养。在转化合适的宿主以及宿主生长至合适细胞密度之后，通过合适方式诱导选择的启动子(例如温度转变或者化学诱导)，以及可以将细胞另外培养一段时间以使其产生希望的多肽或者其片段。

细胞可以通过离心收获、通过物理或化学方法破坏，以及保留所得粗提物以进一步纯化。用于表达蛋白质的微生物细胞可以通过任何常规方法破坏，包括冷冻-解冻循环、超声处理、机械破坏或者使用细胞裂解剂。这些方法为本领域技术人员熟知。可以从重组细胞培养物中回收和纯化表达的多肽或者片段，通过包括如下的方法进行：硫酸铵或者乙醇沉淀、酸提取、阴离子或者阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和性层析、羟磷灰石层析以及血凝素层析。如果需要，可以在完成多肽构型中使用蛋白质重折叠步骤。如果需要，可以应用高效液相层析(HPLC)进行最终纯化步骤。

因此，本发明另一方面提供了分离的细胞，其表达内源或重组禽III型干扰素或者其功能片段、衍生物或者同系物。

在最优选的实施方案中，本发明这个方面的禽III型干扰素分子是禽IFN-λ，特别是ChIFN-λ。

或者，分离的细胞可以是转化的真核细胞，其通过如先前所述那些遗传构建体表达III型干扰素分子。在细胞中导入遗传构建体的方法已经在本文定义，且为本领域技术人员熟知。

分离表达内源或者重组禽III型干扰素的细胞的方法已经在本文论述，且为本领域技术人员熟知。

如本文所用，术语“相似性”和“相同性”包括在核苷酸或氨基酸水平对比的序列之间的精确相同性。在核苷酸水平无相同性的情况中，“相似性”及包括“相同性”在序列之间不同，其编码在结构、功能、生物化学和/或构象水平彼此相关的不同氨基酸。在一特别优选的实施方案中，在相同性而不是在相似性水平进行核苷酸序列对比。

用于描述两或多个多核苷酸之间序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗”、“序列相似性”、“序列相同性”、“序列相似性百分比”、“序列相同性百分比”、“基本上相似(substantially similar)”和“基本上相同性(substantialidentity)”。“参考序列”长度为至少12个、但通常为15-18以及通常至少25或更多个如30个单体单位。由于两个多核苷酸可各自包含(1)两个多核苷酸之间相似的序列(即仅完整多核苷酸序列的一部分)，及(2)两个多核苷酸之间不同的序列，所以两个(或多个)多核苷酸之间序列对比典型通过“比较窗”对比两个多核苷酸序列以鉴别和对比序列相似性的局部区域。“比较窗”是指与参考序列对比的典型12个连续残基的节段。比较窗与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含大约20％或更少的添加或缺失(即缺口)，以优化两个序列的对比。可以通过计算机执行程序(GAP，BESTFIT，FASTA，以及TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，GeneticsComputer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA)进行比较窗对比的序列优化对比，或者通过任何选择的方法产生目测和最佳序列对比(即达到与比较窗最高同源百分比)。可以提及的是例如Altschul et al.(Nucl.Acids Res.25：3389，1997)揭示的BLAST程序。关于序列分析的详细论述可以见于Unit19.3 of Ausubel et al.(“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley&Sons Inc，Chapter 15，1994-1998)。可以使用许多其它算法对比核苷酸和氨基酸序列，例如但不限于PILEUP、CLUSTALW、SEQUENCHER或者VectorNTI。

如本文所用，术语“序列相似性”和“序列相同性”是指序列在比较窗上以逐个核苷酸为基础的相同或者功能或结构相似达到程度。因此，例如计算“相同性百分比”是通过比较窗对比两个最佳对比的序列，确定在这个两个序列中出现的相同核酸碱基(例如A，T，C，G，I)的位置数以产生匹配位置数，将匹配的位置数除以比较窗中位置总数(即窗口大小)，将结果乘以100产生序列相同性百分比。对于本发明，“序列相同性”应理解为通过DNASIS计算机程序(Version 2.5 for windows；available from Hitachi Softwareengineering Co.，Ltd.，South San Francisco，California，USA)计算的平均“匹配百分比”，使用软件参考手册中使用的标准默认值。相似的评述适用于序列相似性。

如上所述以及更特别地，蛋白质和/或核酸序列相同性(同源性)可以通过使用本领域已知的任何序列对比算法和程序计算。序列相同性(同源性)的程度可以通过使用任何计算机程序和相关参数确定，包括本文所述那些程序和参数，如BLAST 2.2.2.或者FASTA version 3.0t78，使用程序默认参数。例如，所述序列对比算法是BLAST算法。一方面，对于核酸序列相同性分析，BLAST核苷酸参数包括word size＝11，expect＝10，filter lowcomplexity with DUST，cost to open gap＝5，cost to extend gap＝2，penalty formismatch＝-3，reward for match＝1，Dropoff(X)for BLAST extensions in bits＝20，final X dropoff value for gapped alignment＝50，所有其它选项均为默认值。一方面，对于多肽序列相同性分析，序列对比算法是BLAST算法，例如其中BLAST核苷酸参数包括word size＝3，expect＝10，filter lowcomplexity with SEG，cost to open gap＝11，cost to extend gap＝1，similaritymatrix Blosum62，Dropoff(X)for blast extensions in bits＝7，X dropoff valuefor gapped alignment(in bits)＝15，final X dropoff value for gapped alignment＝25。

举例的算法和程序包括但不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(8)：2444-2448，1988；Altschul et al.，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990；Thompson et al.，Nucleic Acids Res.22(2)：4673-4680，1994；Higgins et al.，Methods Enzymol.266：383-402，1996；Altschul et al.，Nature Genetics3：266-272，1993)。同源性或者相同性可以通过使用序列分析软件测量(例如Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)。这种软件通过各种缺失、取代和其它修饰赋予同源性程度数值而比较相似序列。

BLAST，BLAST 2.0和BLAST 2.2.2算法也用于本发明。这些程序在例如Altschul et al.(1990)，supra中描述。进行分析的软件可以通过国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。这个算法包括首先通过鉴别在查询序列中的短字长W而鉴别高得分序列对(HSP)，其当与数据库序列同样长度的字对比时匹配或满足正值阈值得分T。T是指相邻字得分阈值(Altschul et al.(1990)supra)。这些最初的相邻字hits作为种子起始检索以发现含有它们的更长的HSP。所述字hits沿每个序列两个方向延伸直至累积对比得分可以增加。对于核苷酸序列，累积得分用参数M(对于一对匹配残基的奖分；总是＞0)计算。对于氨基酸序列，使用得分矩阵计算累积得分。当累积对比得分从其最大实现值降低X数量时；当由于一或多个负分残基对比积累导致累积得分为0或以下时；或者到达每个序列末端时，字hits在每个方向的延伸终止。BLAST算法参数W、T和X确定了对比的灵敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用如下默认参数：字长(W)为11，预期(E)为10，M＝5，N＝-4及比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用如下默认参数：字长为3，预期(E)为10，BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)对比(B)为50，预期(E)为10，M＝5，N＝-4，及比较两条链。BLAST算法还进行两个序列之间的相似性统计学分析(参见例如，Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873)。BLAST算法提供的相似性的一个测量是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸比较中的最小和概率小于大约0.2、更优选小于大约0.01、最优选小于大约0.001，则核酸被认为与参考序列相似。在一个方面，蛋白质和核酸序列同源性用Basic Local Alignment Search Tool(“BLAST”)评估。例如，可以使用5个特殊BLAST程序以进行下述任务：(1)BLASTP和BLAST3针对蛋白质序列数据库比较氨基酸查询序列；(2)BLASTN针对核苷酸序列数据库比较核苷酸查询序列；(3)BLASTX针对蛋白质序列数据库比较查询核苷酸序列(两条链)的六框概念(six-frame conceptual)翻译产物；(4)TBLASTN针对在所有6个读框中翻译的核苷酸数据库(两条链)比较查询蛋白质序列；及(5)TBLASTX针对核苷酸序列数据库的six-frame翻译比较核苷酸查询序列的six-frame翻译。BLAST程序通过鉴别查询氨基酸或核酸序列和优选得自蛋白质或核酸序列数据库的测试序列之间的相似节段(它们在本文称作“高得分节段对”)而鉴别同源序列。高得分节段对优选通过得分矩阵鉴别(即对比)，它们中的许多是本领域已知的。优选地，所用得分矩阵是BLOSUM62矩阵(Gonnet et al.，Science256：1443-1445，1992；Henikoff and Henikoff，Proteins 17：49-61，1993).较不优选地，也可以使用PAM或PAM250矩阵(参见例如，Schwartz and Dayhoff，eds.，1978，Matrices for Detecting Distance Relationships：Atlas of ProteinSequence and Structure，Washington：National Biomedical ResearchFoundation)。

在本发明的一个方面，为确定是否核酸具有在本发明范围内的所需序列相同性，使用NCBI BLAST 2.2.2程序，默认选项blast(default options toblast)。在BLAST 2.2.2程序中有大约38个设定选项。在本发明的这个举例方面，除了默认filtering设定(i即所有参数设为默认，除了filtering被设为OFF)使用所有默认值；在其位置使用“-F F”设定，其使得不能filtering。默认filtering的使用经常导致由于短序列长度所致的Karlin-Altschulviolations。

用于本发明这个举例方面的默认值包括：

“Filter for low complexity：ON

Word Size：3

Matrix：Blosum62

Gap Costs：Existence：11

Extension：1”

其它默认设定为：filter for low complexity OFF，word size of 3 for protein，BLOSUM62 matrix，gap existence penalty of-11 and a gap extension penalty of-1。

术语“同源性”和“相同性”在两个或多个核酸或多肽序列上下文中，是指当针对比较窗或指定区域进行最大对应性比较或对比时，如用任何序列比较算法测量或者手工对比或者肉眼观察，两个或多个序列或亚序列是相同的或者具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。为序列比较，一个序列可以作为参考序列，测试序列针对其进行比较。当用序列比较算法时，测试和参考序列被输入计算机，如果需要指定亚序列坐标，以及指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。序列比较算法然后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列相同性百分比。

“比较窗”，如本文所用，包括任何数目连续残基的节段。例如，在本发明的其它方面，范围为20到全长本发明的举例多肽或核酸序列的连续残基与同样数目的连续位置的参考序列在两个序列最佳对比后相比较。如果参考序列具有所需的与本发明的举例多肽或核酸序列的序列相同性，则该序列在本发明范围内。

短语“基本上相同”在两个核酸或多肽的上下文，可以指当最大对应性比较或对比时，如用如下详细讨论的一种任何已知序列比较算法测量或者肉眼观察，两个或多个序列具有例如至少大约至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高序列相同性或者更高核苷酸或氨基酸残基(序列)相同性。在其它方面，本发明提供了具有与本发明的举例序列的基本相同性的核酸和多肽序列。本发明的核酸序列可以在多肽编码区的整个长度上基本上相同。

可以用上述程序检测的基序包括编码亮氨酸拉链、螺旋-转角-螺旋基序、糖基化位点、遍在位点、α螺旋和β折叠的序列，编码指导被编码蛋白质的分泌的信号肽的序列，参与转录调节的序列如同源框，酸性序列段，酶活性位点，底物结合位点，及酶裂解位点。

为in silico确定和鉴别序列相同性、结构同源性、基序等，本发明的序列可以被存储、记录和操作在可由计算机读和接近的任何介质上。因此，本发明提供了计算机、计算机系统、计算机可读介质、计算机程序产品等，其上记录或存储本发明的核酸和多肽序列。如本文所用，术语“记录”和“存储”是指用于在计算机介质上存储信息的过程。本领域技术人员能容易地采用任何已知方法用于在计算机可读介质上记录信息以产生包含本发明一或多种核酸和/或多肽序列的产品。

本发明另一方面是计算机可读介质，其上记录至少一种本发明的核酸和/或多肽序列。计算机可读介质包括磁可读介质、光学可读介质、电子可读介质和磁/光学介质。例如，计算机可读介质可以是硬盘、软盘、磁带、CD-ROM，Digital Versatile Disk(DVD)、Random Access Memory(RAM)或Read Only Memory(ROM)以及本领域技术人员已知的其它类型的其它介质。

如本文所用，术语“计算机”、“计算机程序”和“处理器”以其最广泛的一般含义使用，包括所有这种装置。

本发明提供了分离的或者重组的核酸，其在严格条件下与本发明举例的序列杂交。另一方面，所述严格条件是高严格条件、中等严格条件或者低严格条件，这些条件如本领域已知以及本文所述。这些方法可用于分离本发明的核酸。

另一方面，根据其在严格条件下杂交的能力定义的本发明的核酸可以是本发明核酸的大约5个残基至全长核酸；例如其长度可以是至少5，10，15，20，25，30，35，40，50，55，60，65，70，75，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800或者更多个残基，或者是全长基因或编码序列，例如cDNA。本发明也包括短于全长的核酸。这些核酸可以用作例如杂交探针、标记探针、PCR寡核苷酸探针、iRNA、反义核酸或者编码抗体结合肽(表位)的序列、基序、活性位点等。

“杂交”是指核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程。杂交反应可以是灵敏性及选择性的，由此甚至在感兴趣的特定序列以低浓度存在于样品中时也可以被鉴别。严格条件可以通过例如预杂交和杂交溶液中盐或者甲酰胺的浓度定义，或者通过杂交温度定义，这些条件为本领域熟知。例如，提高严格性可以通过降低盐浓度、增加甲酰胺浓度，或者提高杂交温度、改变杂交时间等方式实现，如下文详细描述。另一方面，本发明的核酸通过其在各种严格条件(例如高、中、低)下的杂交能力而定义。

本文提及的低严格条件包括对于杂交条件而言至少大约0-15％v/v甲酰胺和至少大约1M-2M盐，以及对于洗涤条件而言至少大约1M-2M盐。通常地，低严格条件温度是大约25-30℃至大约42℃。可以改变温度，较高的温度用于代替甲酰胺和/或产生另外的严格条件。在需要时，可以使用另外的严格条件，如中等严格条件，其包括对于杂交条件而言至少大约16％v/v-30％v/v甲酰胺和至少大约0.5M-0.9M盐，以及对于洗涤条件而言至少大约0.5M-0.9M盐；或者使用高严格条件，其包括对于杂交条件而言至少大约31％v/v-50％v/v甲酰胺和至少大约0.01M-0.15M盐，以及对于洗涤条件而言至少大约0.01M-0.15M盐。通常地，洗涤在T_m＝69.3+0.41(G+C)％进行(Marmur and Doty，J.Mol.Biol.5：109，1962)。然而，双链DNA的T_m降低1℃，则错配碱基对的数目增加1％(Bonner and Laskey，Eur.J.Biochem.46：83，1974)。甲酰胺在这些杂交条件中是任选的。因此，特别优选的严格水平如下：低严格条件是6×SSC缓冲液，0.1％w/v SDS，25-42℃；中等严格条件是2×SSC缓冲液，0.1％w/v SDS，温度为20℃-65℃；高严格条件是0.1×SSC缓冲液，0.1％w/v SDS，温度为至少65℃。

在本发明的核酸通过其在高严格条件下杂交的能力定义的情况中，这些条件包括大约50％甲酰胺，温度为大约37℃-42℃。一方面，通过其在降低的严格条件下杂交的能力定义的本发明的核酸，所述条件包括大约35％-25％甲酰胺，温度为大约30℃-35℃。或者，本发明的核酸通过其在高严格条件下杂交的能力定义，所述条件包括在42℃在50％甲酰胺、5×SSPE、0.3％SDS以及重复序列封闭核酸如cot-1或者鲑精DNA(例如200n/ml剪切和变性的鲑精DNA)中。一方面，本发明的核酸通过其在降低的严格条件下杂交的能力定义，所述条件包括35％甲酰胺，温度降低为35℃。

在杂交之后，可以在50℃将滤膜用6×SSC、0.5％SDS洗涤。高于25％甲酰胺的这些条件被认为是“中等严格条件”，低于25％甲酰胺的这些条件被认为是“低严格条件”。一个具体的“中等”杂交条件实例是在30％甲酰胺条件下进行上述杂交的条件。一个具体的“低”杂交条件实例是在10％甲酰胺条件下进行上述杂交的条件。

相应于特定水平严格条件的温度范围可以通过计算感兴趣的核酸的嘌呤与嘧啶的比率以及据此调节温度而进一步缩小。本发明的核酸也通过其在如Ausubel和Sambrook所述的高、中等和低严格条件下杂交的能力定义。本领域熟知上述范围和条件的变化。杂交条件在下文进一步论述。

可以修改上述程序以鉴别与探针序列的同源性水平降低的核酸。例如，为了获得与检测探针同源性降低的核酸，可以使用较低的严格条件。例如，在Na+浓度为大约1M的杂交缓冲液中，杂交温度可以5℃的增量从68℃降低至42℃。在杂交之后，可以将滤膜用2×SSC、0.5％SDS在杂交温度洗涤。高于50℃的这些条件被认为是“中等”严格条件，低于50℃的这些条件被认为是“低”严格条件。一个具体的“中等严格”杂交条件实例是在大约55℃进行上述杂交。一个具体的“低严格”杂交条件实例是在大约45℃进行上述杂交。

或者，杂交可以在含有甲酰胺的缓冲液如6×SSC中在42℃进行。在这种情况中，杂交缓冲液中的甲酰胺浓度可以5％的增量从50％降低至0％，以鉴别与探针同源性水平降低的克隆。在杂交之后，可以将滤膜用6X SSC、0.5％SDS在50℃洗涤。高于25％甲酰胺的这些条件被认为是“中等”严格条件，低于25％甲酰胺的这些条件被认为是“低”严格条件。一个具体的“中等严格”杂交条件实例是在30％甲酰胺进行上述杂交。一个具体的“低严格”杂交条件实例是在10％甲酰胺进行上述杂交。

然而，杂交形式的选择不是关键的-关键的是洗涤条件的严格性，其确定核酸是否在本发明范围内。用于鉴别本发明范围内的核酸的洗涤条件包括例如：盐浓度为大约0.02摩尔，pH 7，温度为至少大约50℃或者大约55℃至大约60℃；或者盐浓度为大约0.15M NaCl，在72℃进行大约15分钟；或者盐浓度为大约0.2×SSC，温度为至少大约50℃或者大约55℃至大约60℃，进行大约15-20分钟；或者将杂交复合物用含有0.1％SDS的盐浓度为大约2×SSC的溶液在室温洗涤两次，每次15分钟，然后用含有0.1％SDS的0.1×SSC在68℃洗涤两次，每次15分钟；或者使用等价条件。见Sambrook，Tijssen和Ausubel关于SSC缓冲液和等价条件的描述。

在一个相关的实施方案中，本发明提供了在细胞中生产重组禽III型干扰素的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)在所述细胞中导入包含置于合适启动子序列的控制下的核酸分子的遗传构建体，所述核酸分子编码所述禽III型干扰素或者互补于编码所述禽III型干扰素的核酸分子；

(ii)在足以使所述核酸分子表达的时间和条件下培养所述细胞；以及

(iii)分离所述表达产物。

在另一个相关的实施方案中，本发明提供了在细胞中生产禽III型干扰素融合分子的方法，所述方法包括在所述细胞中导入包含核酸分子的遗传构建体，所述核酸分子编码禽III型干扰素多肽或者其功能片段、衍生物或者禽类同系物或者互补于编码的核酸分子，其中所述多肽是第一个III型干扰素与第二个III型干扰素之间或者第一个III型干扰素与第二个I型或II型干扰素之间的融合多肽，所述I型或II型干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、Ch IFN-β或者Ch IFN-γ等。

因此，在另一个相关的实施方案中，本发明提供了第一个III型干扰素与第二个III干扰素或者第一个III型干扰素与第二个I型或II型干扰素之间的重组融合多肽，所述I型或II型干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ChiFN-α、ChIFN-β或者ChIFN-γ等。

根据本发明这方面所述的前述实施方案，所述重组禽III型干扰素优选是禽IFN-λ多肽分子或者包含其的融合分子。在特别优选的实施方案中，所述III型干扰素是ChIFN-λ多肽。

在另一个实施方案中，本发明提供了遗传构建体，所述遗传构建体包含如前述核酸分子或者编码禽III型干扰素融合多肽或者其功能片段或者衍生物或互补于编码禽III型干扰素融合多肽或者其功能片段或者衍生物的核酸分子的核酸分子，其中所述多肽是III型干扰素与第二个III型干扰素或者第一个III型干扰素与第二个I型或II型干扰素之间的融合多肽，所述I型或II型干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、Ch IFN-β或者Ch IFN-γ等。

优选地，所述III型干扰素是IFN-λ，特别是ChIFN-λ。

为了产生融合多肽，将编码包含禽III型干扰素多肽或者其功能片段或者衍生物的第一个编码区的核酸分子克隆在第二个编码区邻近，任选由间隔核酸分隔，由此第一个编码区与第二个编码区在相同的开放读框中，在这两个编码区之间没有介于其中的终止密码子。当翻译时，由此产生的多肽包含第一个和第二个编码区的多肽产物之间的融合体。编码融合多肽的遗传构建体进一步包含至少一个起始密码子和一个终止密码子，其能由在其中进行表达的细胞翻译机构识别。产生融合多肽的方法为本领域技术人员熟知。

本发明另一方面涉及所述蛋白质和核酸分子的抗体。这种抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体，且可以选自天然发生的抗体或者可以是特定产生的抗体。在后者的情况中，首先需要将ChIFNλ多肽或者核酸抗原与载体分子结合以实现免疫原性。本发明的抗体可用作治疗剂或者诊断剂。分子的抗体包括特异于所述分子的抗体。

这些抗体可用于分离、鉴别或者量化本发明的多肽或者相关多肽。

术语“抗体”包括肽或多肽，衍生自能特异性结合抗原或者表位的免疫球蛋白基因或者其片段，以其为原型或者基本由其编码，见例如Fundamental Immunology，Third Edition，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993)；Wilson et al.(1994)J.Immunol.Methods 175：267-273；Yarmush et al.(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25(4)：285-97所述。术语抗体包括保留结合抗原能力的抗原结合部分，即“抗原结合位点”(例如片段、亚序列、互补决定区(CDRs))，包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也包含在术语“抗体”中。

本发明分子的抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体，且可以选自天然发生的抗体或者可以是针对这些多肽和基因产物特定产生的抗体。本发明提供了重组和合成的抗体以及抗体杂交体。在本文“合成抗体”被认为包括抗体片段和杂交体。本发明这个方面的抗体可特别用于免疫治疗，也可以用作诊断工具或者作为纯化指定多肽或核酸分子的手段。

免疫、产生和分离抗体(多克隆抗体和单克隆抗体)的方法为本领域技术人员已知，且在一些学术和专利文献中描述，见例如Coligan，CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites(eds.)BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(7th ed.)Lange MedicalPublications，Los Altos，CA(“Stites”)；Goding，MONOCLONALANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(2d ed.)Academic Press，NewYork，NY(1986)；Kohler(1975)Nature 256：495；Harlow(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Publications，New York。除了使用动物在体内产生抗体的传统方法之外，抗体也可以在体外产生，例如使用表达噬菌体文库的重组抗体结合位点产生。见例如Hoogenboom(1997)Trends Biotechnol.15：62-70；Katz(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：27-45。

针对本发明多肽产生的多克隆抗体可以通过将所述多肽直接注射进动物体内或者通过给予非人动物所述多肽而获得。然后如此获得的抗体结合所述多肽。以此方式，即使仅编码所述多肽片段的序列也可用于结合完整天然多肽的产生抗体。这种抗体可用于从表达多肽的细胞中分离所述多肽。

对于单克隆抗体的制备，可以使用通过连续细胞系培养产生抗体的任何技术。所述技术例如包括杂交瘤技术、三瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术以及EBV-杂交瘤技术(见例如Cole(1985)in Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。

可以采用产生单链抗体的技术(见例如美国专利No.4,946,778)产生本发明多肽的单链抗体。或者，可以使用转基因小鼠表达这些多肽或者其片段的人源化抗体。

如本文所用，术语“衍生物”包括核酸分子的部分(portions)、片段或者部分(parts)或者其翻译产物。衍生物也可以是单一或多重核苷酸或者氨基酸取代、缺失和/或添加。本发明的核酸分子的衍生物也包括在至少低严格条件下能与SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列杂交的核酸分子。本发明核酸分子的衍生物还包括寡核苷酸、PCR引物、反义分子、适用于共抑制的分子以及融合核酸分子。也涵盖的一些分子是能调节ChIFN-λ基因表达的分子。

本文所述多肽分子的衍生物包括片段、部分(parts)、部分(portions)、突变体、变体，以及源于天然、合成或者重组来源，包括融合蛋白。所述衍生物包括具有与肽、多肽或者其它蛋白质样或者非蛋白质样分子融合的完整蛋白质的特定表位或者部分的片段。部分或片段包括例如ChIFN-λ多肽的活性区域。衍生物可以衍生自氨基酸插入、缺失或者取代。便利地，这些衍生物通过首先在编码核酸产生一或多个核苷酸取代、缺失和/或添加而制备。或者，一旦已知氨基酸序列，则氨基酸可以通过确定的技术化学添加在需要提供希望的突变体的任何序列中。所有这种衍生物均包含在本发明中。

本发明的禽III型干扰素的氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基末端融合以及一或多个氨基酸的序列内插入。插入氨基酸序列变体是其中在蛋白质的预定位点导入一或多个氨基酸残基的那些变体，但是随机插入也可以适当筛选所得产物。缺失变体特征在于从序列中除去一或多个氨基酸。取代氨基酸变体是其中已经除去至少一个残基，其在这个位置插入一个不同的残基。典型的取代是根据表2进行的那些取代。

表2：合适的氨基酸取代残基

原始残基        举例的取代

Ala             Ser

Arg             Lys

Asn             Gln；His

Asp             Glu

Cys             Ser

Gln             Asn；Glu

Glu             Asp

Gly             Pro

His             Asn；Gln

Ile             Leu；Val

Leu             Ile；Val

Lys             Arg；Gln；Glu

Met             Leu；Ile；Val

Phe             Met；Leu；Tyr

Ser             Thr

Thr             Ser

Trp             Tyr

Tyr             Trp；Phe

Val             Ile；Leu；Met

在禽III型干扰素衍生物是由于氨基酸取代而产生的情况中，所述氨基酸通常由具有相似性质如疏水性、亲水性、电负性、大侧链等性质的其它氨基酸置换。氨基酸取代典型为单一残基取代。氨基酸插入通常是大约1-10个氨基酸残基，缺失通常是大约1-20个残基。优选地，缺失或插入是成对产生，即缺失两个残基及相应插入两个残基。

取代氨基酸变体是已经除去序列中至少一个残基且在这个位置插入一个不同残基。举例的取代氨基酸变体是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代典型包括在如下一组残基内取代：甘氨酸与丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸与亮氨酸；天冬氨酸与谷氨酸；天冬酰胺与谷氨酰胺；丝氨酸与苏氨酸；赖氨酸与精氨酸；以及苯丙氨酸与酪氨酸。在氨基酸序列中添加包括与其它肽、多肽或者蛋白质融合。

本发明禽III型干扰素多肽的重组或者合成的突变体和衍生物的其它实例包括单一或多重取代、缺失和/或添加与所述多肽相关的任何分子如碳水化合物、脂质和/或蛋白质或多肽。

为了方便及速记起见，在本文提及禽III型干扰素如IFN-λ、ChIFN-λ或者禽类干扰素样多肽时包括其如上述任何衍生物。

所述“片段”包括得自天然、合成或者重组来源的部分(parts)和部分(portions)，包括融合蛋白。部分或者片段包括例如ChIFNλ的活性区域。

如本文所用，核苷酸序列的“禽类同系物”应是指这样的分离的核酸分子，其与本发明的核酸分子或者其互补核苷酸序列基本相同，但是在所述序列内出现一或多个核苷酸取代、插入、缺失或者重排。同系物还应理解为是指分离自或者另外相应于在除了鸡之外的禽类动物中发现的分子的核酸或者蛋白质分子。“同系物”是指在另一原核生物中的序列(核苷酸或者蛋白质)，其与参考序列具有至少大约60％及优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％相同性。

所述“功能片段、衍生物或者禽类同系物”应理解为是指如前文定义能进行禽IFN-λ的一或多种活性的分子。更特别地，所述功能片段、衍生物或者禽类同系物应是指在禽类动物中能诱导或者调节针对抗原或者传染原的免疫应答的多肽、蛋白质或者其它物质，所述传染原例如但不限于传染性支气管炎病毒、禽传染性喉支气管炎病毒，传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、Marek′s病病毒、鸡贫血病病毒、禽流感病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、艾美耳球虫或者支原体等。

本发明另一方面提供了鉴别禽III型干扰素遗传序列或者其功能片段或者衍生物的方法。

在一个实施方案中，所述方法包括将核酸样品与杂交有效量的III型干扰素探针接触，然后检测所述杂交情况。

所述核酸样品可包含例如基因组DNA、mRNA或者cDNA。

感兴趣的遗传序列可以是重组形式，在病毒颗粒、噬菌体颗粒、酵母细胞、动物细胞或者植物细胞中。优选地，所述遗传序列源自禽类动物。更优选地，所述遗传序列源自禽类动物，所述禽类动物选自鸡、火鸡、矮脚鸡、鹌鹑、珍珠鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋、鸽子、金丝雀、虎皮鹦鹉、鹦鹉和雀等。在特别优选的实施方案中，所述遗传序列源自鸡。

优选地，所述禽III型干扰素探针包含至少10、20、30、40或者50个核苷酸的核苷酸序列，但是本发明也包括使用更大的探针，所述探针衍生自或者针对SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列或者其互补序列或者功能片段或者衍生物。优选地，将这个序列用能产生可鉴别信号的报道分子(例如放射性同位素如P或者S，或者生物素酰化的分子)标记。

本发明的另一实施方案提供了鉴别禽III型干扰素遗传序列或者其功能片段或者衍生物的方法，所述方法包括将衍生自禽III型细胞因子基因的核苷酸序列的长度为至少12个核苷酸的两个非互补核酸“引物分子”与核酸模板分子序列接触，所述模板分子包含与引物分子序列相关的核苷酸序列，随后在扩增反应中扩增模板分子的特定核酸分子拷贝。

在一个实施例中，第一个引物分子优选针对禽IFN-λ基因如ChIFN-λ基因以及特别是SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列或者其同系物或者衍生物的有义链，第二个引物优选针对禽IFN-λ基因如ChIFN-λ基因以及特别是SEQ ID NO：1或者3所示核苷酸序列的互补序列或者其同系物或者衍生物的反义链。因此，这两个引物杂交所述模板分子，由此在存在DNA聚合酶、辅因子和适当底物的条件下，以5′至3′方向从每个引物分子朝向DNA上另一引物分子杂交的位置发生DNA合成，从而扩增插入的DNA。

核酸引物分子可进一步包含能掺入多核苷酸分子中的任何核苷酸腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷或者肌苷的组合，或者其功能类似物或者衍生物，条件是其在至少低严格条件下能杂交SEQ ID NO：1或3所示核酸分子。

核酸引物分子可进一步是包含于包含其它核酸引物分子的水溶液中。更优选地，所述核酸引物分子是基本纯的形式。

所述核酸模板分子可以是重组形式，在病毒颗粒、噬菌体颗粒、酵母细胞、动物细胞或者植物细胞中。优选地，所述相关的遗传序列源自禽类动物细胞、组织或者器官。更优选地，所述相关遗传序列源自鸡细胞、组织或者器官。

正如本领域技术人员所熟知，基因的表达或者靶基因在体外表达的调节可以通过测量所述基因表达产物水平的变化而确定。

因此，在另一实施方案中，本发明提供了检测禽III型干扰素多肽或者其功能片段、衍生物或者同系物的存在的方法。

本领域熟知的各种方法可用于直接或者间接确定多肽水平。这种方法包括免疫化学方法，如Western印迹、ELISA、免疫沉淀和RIA；凝胶电泳方法，包括一维和二维凝胶电泳；基于蛋白质或肽层析分离的方法；使用蛋白质-融合报道构建体和比色读数的方法；基于鉴定活性翻译的多聚核糖体mRNA的方法，以及质谱分析法。

在实施本发明的筛选方法中，可以将检测化合物与本发明的多肽在体外接触，或者在体内给予本发明的细胞或者禽类动物。不将本发明限于任一理论或者作用模式，所述检测化合物包括免疫反应性分子，如前文描述的抗体。

免疫测定可用于检测禽类动物中细胞因子的存在，特别是检测其中所述禽类细胞因子水平例如在感染病原体之后改变的情况中的免疫应答。由此这种免疫测定特别用于确定禽类动物是否已经暴露于病原体或者目前感染病原体或者具有延长的低级病原性感染。免疫测定也可用于量化细胞因子，特别是用于筛选对于病原体具有改良的疾病抗性的高表达细胞因子的遗传原种。本发明提供了免疫反应性分子的所有这种应用，以及需要进行所述免疫测定的诊断测试。

众多的免疫测定技术可以是例如在美国专利No.4,016,043、4,424,279和4,018,653中所述那些技术。这些方法可以用于检测III型干扰素。例如，将针对ChIFN-λ产生的抗体固定在固体支持物上，形成第一个复合物，将得自待检测细胞因子存在的动物的生物学样品与结合的分子接触。在使得足以形成抗体-细胞因子二级复合物的适当保温时间之后，然后加入用能产生可检测信号的报道分子标记的第二个ChIFN-λ抗体，以及保温足以形成抗体-细胞因子-标记的抗体三级复合物的时间。洗去任何未反应的材料，通过观测报道分子信号确定所述三级复合物的存在。所述结果可以通过简单观测可见信号而定性，或者通过与含有已知量半抗原的对照样品对比而定量。对这个测试进行的改变包括同时测试，其中将样品和标记的抗体同时加入结合的抗体中；或者反向测试，其中首先组合标记的抗体与待检测的样品，保温，然后同时加入结合的抗体中。这些技术为本领域技术人员熟知，显然可以存在微小变化。以上使用的抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体。

所述固体基质典型是玻璃或者聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或者聚丙烯。所述固体支持物可以是试管、珠、盘或者微滴定平板，或者是适于进行免疫测定的任何其它表面。所述结合方法为本领域熟知，通常包括所述分子与不溶载体的交联共价结合或者物理吸附。

如本文所用，“报道分子”是指这样的分子，通过其化学性质产生可以检测抗原结合的抗体的可检测分析的信号。检测可以是定性或者定量检测。这种类型测定中最常用的报道分子是酶、荧光团或者含有分子的放射性核素(即放射性同位素)。在酶免疫测定的情况中，通常通过戊二醛或者高碘酸盐将酶与第二种抗体缀合。然而正如所公认的，存在许多为本领域技术人员可易于获得的许多不同的缀合技术。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。特定酶使用的底物通常根据在由相应酶水解时产生的可检测的颜色改变加以选择。也可以使用荧光底物，其产生荧光产物。

或者，可以将荧光化合物如荧光素和罗丹明与抗体化学结合，而不改变其结合能力。当通过特定波长的光照射而激活时，所述荧光染料标记的抗体吸收光能，在分子中诱导可激发状态，随后发射在使用光学显微镜可观察的特征性颜色的光。如在EIA中，使荧光标记的抗体结合第一个抗体-半抗原复合物。在洗去未结合的反应物之后，将剩余的复合物暴露于合适波长的光，观测到的荧光表示存在感兴趣的半抗原。免疫荧光和EIA技术在本领域已经充分确定，特别优选用于本发明方法。然而，也可以使用其它报道分子如放射性同位素、化学发光或者生物发光分子。本领域技术人员显然已知怎样改变所述程序以更适合所需目的。

前文所述抗体也可用于纯化本发明的重组禽类细胞因子。使用抗体亲和性纯化蛋白质的方法为本领域技术人员熟知。

本文揭示的禽III型IFN的鉴别和测序促进了用于禽类动物疾病的诊断和预防/治疗方案的开发。也促进了用于其中的试剂的开发。因此，本发明应被理解为提供了本文所揭示的禽III型干扰素多肽或者其功能片段、衍生物或者同系物在治疗和/或预防禽类动物疾病中的应用。

例如，本发明可特别用于但不限于治疗或者预防感染病原性生物体的禽类动物疾病。然而，应理解本文所述预防也包括预防或治疗健康禽类动物，以提供针对感染的保护作用或者其它有利作用。

因此，本发明一方面提供了诱导或者正调节禽类动物免疫应答的方法，所述方法包括在足以诱导、增强或者另外保持免疫应答的时间和条件下给予所述禽类动物有效量的前述多肽或者核酸分子。

本发明另一方面提供了治疗或者预防禽类动物疾病的方法，所述方法包括在足以保持、刺激或者增强所述禽类动物免疫应答的时间和条件下给予所述禽类动物有效量的前述禽III型干扰素多肽或者核酸分子或者其功能片段、衍生物或者同系物。

本发明再一方面提供了治疗或者预防禽类动物疾病的方法，所述禽类动物已经暴露于或者感染病原性生物体，所述方法包括给予所述禽类动物有效量的前述禽III型干扰素多肽或者核酸分子或者其功能片段、衍生物或者同系物。

在本发明的一个优选实施方案中，所述禽类动物包括家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或猎禽。

如本文所用，“禽类动物”是指鸡、火鸡、矮脚鸡、鹌鹑、珍珠鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋、鸽子、金丝雀、虎皮鹦鹉、鹦鹉和雀等。特别优选的禽类动物是家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或猎禽，更优选鸡。

根据先前的实施方案，特别优选所述禽类细胞因子是III型干扰素分子，特别是IFN-λ。

在最特别优选的实施方案中，所述禽类细胞因子是ChIFN-λ。

本发明特别用于治疗或者预防禽类动物病原体如细菌、病毒或者寄生虫感染。这种病原体例如包括禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、Marek′s病毒、鸡贫血病毒、大肠杆菌、沙门氏菌(Salmonella ssp.)、艾美球虫(Eimeria ssp)或者支原体等。

本文提及“治疗”和“预防”时是指其最广泛的含义。术语“治疗”非必须意味着治疗哺乳动物直至完全痊愈。相似地，“预防”非必须意味着预防对象最终也不感染疾病。因此，治疗和预防包括改善特定疾病的症状或者预防或者另外降低特定疾病的发生危险。术语“预防”可以被认为是降低特定疾病的严重性或者发作。“治疗”也可以是降低现有疾病的严重性。

“有效量”是指至少部分获得预期反应或者延缓疾病发作或者抑制疾病进展或者完全停止所需的量，治疗个体的特定病症的发作或进展，治疗个体的分类，预期的保护程度，疫苗的配制，医疗状况的评估，以及其它相关因素。预期该数量在可以通过常规试验确定的相对广泛范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或者预防暴露于病原性生物体的禽类动物的方法，所述方法包括在足以维保持、刺激或者增强所述动物免疫应答的时间和条件下给予所述禽类动物有效量的包含III型干扰素的第一个禽类细胞因子组合第二个禽类细胞因子分子。

所述第一个和第二个细胞因子可以作为两个分子共同给予，或者它们可以作为融合分子给予。优选地，所述第二个禽类细胞因子选自I型或II型干扰素，例如但不限于IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、Ch IFN-β或者Ch IFN-γ等，或者选自III型干扰素或者任何其它禽类细胞因子。

在最优选的实施方案中，所述第一个禽类细胞因子和所述第二个禽类细胞因子是融合分子。

根据本发明的整个实施方案，本发明的第一个和第二个禽类细胞因子与动物的免疫系统相互作用，刺激、增强或者另外调节免疫系统对于病原体攻击的免疫应答。

本发明另一方面涉及禽III型干扰素多肽或者编码核酸分子在治疗或者预防禽类动物疾病中的应用。

本发明再一方面涉及禽III型干扰素多肽或者核酸分子在生产调节禽类动物免疫应答和/或治疗或预防禽类动物疾病的药物中的应用。

优选地，所述禽III型干扰素分子是IFN-λ，特别是ChIFN-λ。

本发明III型IFN可以在需要治疗和预防的禽类动物的整个生命周期期间给予。治疗或预防最有效的发育阶段根据寻求抗其的保护作用的病原体的性质而不同，包括其传播模式和最高传染性时期。“最高传染性时期”是指这样的宿主的发育阶段，在此期间其最易受到特定病原体的攻击，或者在此期间由于病原体感染而存在导致家畜损失或者降低生产力的更大可能。给予所述细胞因子影响动物最佳发育阶段的参数为本领域技术人员熟知。

因此，本发明的治疗或预防方法是在指定治疗或预防的家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或猎禽的生命周期的任何发育阶段给予所述禽类细胞因子。

本发明的细胞因子或者核酸分子可以通过任何方式给予，包括例如卵内或者孵化后注射，腹膜内注射、皮内注射、肌内注射、眼内注射、静脉内注射、皮下注射或者其它注射方式，通过加药的食物或者治疗性食物的摄取，或者通过在所述禽中导入编码或者互补于编码所述细胞因子的核酸分子的分离的核酸分子，或者导入包含能在体内或卵内表达所述细胞因子的遗传构建体的载体，或者例如活的重组病毒载体、活的重组细菌载体。

在本发明的细胞因子通过导入编码所述细胞因子的分离的核酸分子如DNA或RNA分子或者包含能表达所述细胞因子的遗传构建体的载体而给予的情况中，所述核酸分子或者遗传构建体在将其给予合适的禽类动物对象之后必须被转录和翻译以产生生物活性细胞因子分子。

本发明的细胞因子的另一重要应用是作为疫苗的天然佐剂，特别是通过重组DNA技术产生的亚单位或者合成的肽疫苗。

如本文所用，术语“佐剂”是指这样的物质，当其与第二种物质或者抗原组合给予动物时可以增强免疫反应性分子如抗体的产生，所述免疫反应性分子识别所述第二种物质或者抗原分子。佐剂可以治疗性应用以产生针对少量抗原的抗体，或者延长抗体产生时间，或者增加产生的抗体的量。不希望受到任何理论或者作用模式的限制，佐剂通过诱导局部抗体形成细胞流入给予部位而发挥作用。

因此，本发明另一方面提供了包含禽类细胞因子分子的佐剂，其中所述细胞因子是III型干扰素或者所述III型干扰素分子与第二个细胞因子分子之间的融合分子，以及任选药物可接受的载体、赋形剂或者稀释剂。

优选地，所述禽III型干扰素分子是IFN-λ，特别是ChIFN-λ。

在其中所述禽类细胞是融合分子，所述第二个细胞因子可以是在禽类动物中起作用的任何细胞因子分子，特别是IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、Ch IFN-β或者Ch IFN-γ，或者III型干扰素分子或者任何其它细胞因子。

根据本发明，禽类细胞因子如III型干扰素、特别是ChIFN-λ，用于疫苗中以增强抗原的免疫原性，特别是在亚单位疫苗中，导致个体禽类动物中抗体效价增加，增强特定抗原免疫的禽类动物的保护作用(即增强的群体免疫性)和/或在免疫的动物体内增加保护性抗体的持续性。本发明提供的另一优势是有效免疫动物需要的特定抗原的数量减少，从而降低生产成本。

根据这些实施方案描述的本发明的细胞因子可以通过任何方式给予，包括例如通过卵内或者孵化后注射，如腹膜内注射、皮内注射、肌内注射、眼内注射、静脉内注射、皮下注射或者其它注射方式，通过作为加药食物或者治疗性食物摄取。

缓释技术和活的非致病菌和病毒作为这些分子的输送载体的开发将保证当给予家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或者猎禽时的成本效益。其也可以用于核酸接种中。因此，本发明的禽类细胞因子或者疫苗也可以通过遗传方式输送。例如，重组禽ChIFN-λ可以由输送系统中的遗传构建体编码，所述输送系统如病毒、酵母、细菌、原生动物、昆虫、禽类动物或者哺乳动物细胞。这种输送系统在靶动物中的表达使得可以输送所述重组禽类细胞因子。

根据这个实施方案，预期这样的遗传构建体，其包含：(i)可操纵地置于第一个启动子序列的控制下的第一个核苷酸序列，其编码禽III型干扰素或者所述III型干扰素与第二个细胞因子之间的融合细胞因子分子，；(ii)可操纵地置于第二个启动子序列控制下的限定对其需要赋予免疫性的抗原的第二个核苷酸序列；以及(iii)输送载体，其包含促进所述遗传构建体在输送细胞中复制的遗传序列，所述输送细胞如细菌、酵母、昆虫、原生动物或者哺乳动物细胞。

优选地，所述III型干扰素是IFN-λ，特别是ChIFN-λ。也优选所述第二个细胞因子选自IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、Ch IFN-β或Ch IFN-γ，或者选自II型干扰素或者任何其它细胞因子。

根据这个实施方案，所述输送载体正常使用对于靶动物无害或者无致病性。方便地使用减毒的输送载体。特别有益的输送载体是如减毒的病毒和重组病毒以及细菌载体这样的载体。

例如，减毒的病毒载体用作活疫苗。将编码禽类细胞因子如ChIFN-λ或者其衍生物的遗传序列克隆进病毒序列中，并将该重组病毒用于感染靶动物。所述重组病毒导致动物细胞感染且在其中复制，导致重组细胞因子产生。感染的重组病毒随后可以在免疫调节有效量的重组细胞因子产生之后被清除。使用活的细菌载体采用相似的方案。或者，可以使用非复制、非传染性病毒载体。非复制的病毒载体提供导入遗传序列的方式，由于非复制病毒载体不能在细胞至细胞之间传播，因此其能瞬时表达希望的细胞因子。

本发明提供了通过给予禽类细胞因子、特别是III型干扰素如ChIFN-λ或者其衍生物，直接或者通过重组遗传序列的表达而增强动物、特别是家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或猎禽(如上述那些禽类动物)免疫应答的机会。这是特别重要的，因为大多数亚单位和合成的肽疫苗的抗原性很低。可以单独、组合抗原或者作为融合分子给予所述细胞因子。可以通过减毒的病毒、重组病毒载体或者细菌载体给予，或者可以通过注射或者口服给予细胞因子(例如在加药食物中)。

本发明提供了用于禽类动物例如家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或者猎禽的兽用药物组合物，以增强所述禽类动物的免疫系统或者改善其免疫活性或者促进免疫调节作用，所述组合物包含重组禽III型干扰素或者III型干扰素与第二个细胞因子之间的融合分子，所述第二个细胞因子融合于抗原或者编码抗原的遗传序列，以及适于兽用的一或多个载体和/或稀释剂。

优选地，在所述组合物包含前述重组禽类细胞因子的情况中，将所述组合物在卵内或者孵化后注射，或者通过气雾剂或者摄食给予。在所述组合物包含遗传物质的情况中，将其作为病毒载体、细菌载体的一部分或者作为核酸分子给予。

需要治疗的家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或者猎禽的病症包括由前述病毒、细菌或者寄生虫导致的传染性疾病、癌症、免疫抑制、变态反应，以及用于增强或者抑制生殖系统。所述病症也包括其中动物处于免疫缺失状态如应激期间或之后、由于过度拥挤及运输、气候改变等情况。

本发明的分子可以同源用于其衍生自的物种中，或者其可异源用于其中禽III型干扰素在除了其衍生自的物种之外禽类动物中是有效的情况中。所述组合物也可含有其它活性分子如抗生素或者抗原分子。细胞因子分子与抗原分子的组合可增加疫苗的效力。

因此本发明提供了兽用药物组合物，其包含免疫调节有效量的禽III型干扰素或者禽III型干扰素与第二个细胞因子或者能表达其的遗传序列之间的融合分子，以及适于兽用的一或多种载体和/或稀释剂。

在一个优选的实施方案中，所述III型干扰素是IFN-λ，特别是ChIFN-λ。

在所述药物组合物包含融合分子的情况中，所述融合分子优选是ChIFN-λ或者其功能片段、衍生物或者同系物与第二个细胞因子之间的融合分子，所述第二个细胞因子选自I型干扰素如IFN-α、IFN-β、ChIFN-α、ChIFN-β，II型干扰素如IRN-α或者III型干扰素或者任何其它干扰素。

所述药物组合物的活性成分当根据特定情况给予一定量时，预期呈现刺激、增强或者另外促进动物、特别是家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或者猎禽免疫应答的活性。所述变化根据例如细胞因子而定，以及在一些情况中根据刺激免疫应答的抗原而定。例如，每天每千克体重需要大约0.5μg-20mg特定细胞因子，其可以组合其它细胞因子。可以调节剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以每天、每周或者每月或者以其它合适的时间间隔给予一些分成几部分的剂量，或者可以随着紧急情况而按比例降低剂量。所述活性化合物可以通过卵内或者孵化后注射或者通过以任何便利形式口服或者可以通过遗传序列在百度或者细菌载体中给予。

所述活性化合物也可以分散于甘油、液体聚乙二醇和/或其混合物以及在油中给予。在常规贮存和使用条件下，这些制品含有防腐剂以防止微生物生长。

适于肠道外给予的药物形式包括无菌水溶液(在水溶性情况中)或者分散液，以及即时制备无菌注射溶液或者分散液的无菌粉末。在所有情况中，所述形式必须是无菌的且必须是易于注射器注射的液体。其在生产和贮存条件下必须是稳定的，且必须是保持无微生物如细菌和真菌污染。所述载体可以是溶剂或者分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)，合适的其混合物，以及植物油。可以例如通过使用包膜如卵磷脂，通过在分散情况中保持颗粒大小以及通过使用表面活性剂，从而保持适当流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂防止微生物作用，所述抗菌剂和抗真菌剂例如是抗生素、parabens、氯丁醇、苯酚、山梨酸、thimerosal等。在许多情况中，优选包括等渗剂，例如糖或者氯化钠。延长所述注射组合物的吸收可以例如通过在组合物中使用延迟吸收的制剂而实现。

无菌注射溶液的制备是通过将活性化合物以需要量掺入根据需要而具有上述各种其它成分的合适溶剂中，随后过滤灭菌。通常地，制备分散液是通过将不同的无菌活性成分掺入无菌载体中，所述无菌载体含有基本分散介质以及需要的上述其它成分。在制备无菌注射溶液的无菌粉末情况中，优选的制备方法是真空干燥以及冷冻-干燥技术，产生活性成分加上前述无菌过滤溶液任何其它所需成分的粉末。

适于兽用的载体和/或稀释剂包括任何和所有溶剂、分散介质、水溶液、包膜、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这种介质和制剂在药物活性物质中的应用为本领域熟知。除了与所述活性成分不相容的任何常规介质或制剂之外，其它均可以用于所述组合物中。辅助的活性成分也可以掺入组合物中。后者是本发明特别预期的多价疫苗或者多成分细胞因子分子。

本发明的兽用药物组合物除了禽III型干扰素或者包含其融合分子之外，还可包含一或多种其它活性化合物如抗原或者免疫刺激化合物。

所述细胞因子也可以通过活的输送系统输送，例如使用细菌表达系统在细菌中表达所述细胞因子蛋白，其可以被掺入肠道菌群中(gut flora)。或者，可以使用病毒表达载体或者将其掺入重组疫苗中。在这方面，一种形式的病毒表达是在为动物提供传染有效量的活的载体(例如病毒或细菌)的情况中，通过喷雾、饲料或者水给予活的载体。另一形式的病毒表达系统是非复制病毒载体，其能感染细胞但不在其中复制。所述非复制病毒载体提供了将遗传物质导入细胞因子中以瞬时表达的方式。给予这种载体的模式与给予活的病毒载体的模式一样。

本发明通过如下非限制性图和实施例得以进一步描述。

实施例1：鸡III型IFN的克隆、表达和鉴定

材料和方法

淋巴细胞的分离和细胞培养

从4周龄无特定病原体(SPF)的鸡中获取脾，通过70μm滤网过滤进入含有DMEM的培养皿中，从各个脾中制备白细胞的单细胞悬浮液。将悬浮液经过lymphoprep(Nicomed Pharma AS，Oslo)分层，在1500g_max离心15分钟。收集在界面的单核细胞，洗涤，重悬浮，并在补加10％FCS的DMEM中培养。将连续的鸡巨噬细胞样细胞系HD11维持在补加6％FCS、2mM谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI中。根据需要传代HD11细胞，并接种过夜至80％铺满，之后进行IFN处理。

试剂

根据厂商指导制备合成的dsRNA类似物Poly(I:C)(Invivogen)和ssRNA类似物poly C(Invivogen)并贮存。在本发明人的实验室中产生鸡IL6(chIL6)(Asif et al.，manuscript in preparation)和ChIFNγ(ChIFNγ)(Digby andLowenthal 1995)。将核酸在-80℃贮存，将细胞因子在4℃贮存。

病毒培养

将H1N1型流感病毒A/PR/8/34(PR8)(Talon et al.，2000)在10天龄含胚鸡卵的尿囊腔中培养48小时。然后收获含有尿囊液的病毒，等份以及在-80℃贮存。随后将病毒在HD11鸡巨噬细胞中传代5次，通过确定50％终点组织培养感染剂量(TCID₅₀)，在这些细胞单层上滴定传染性。

RNA分离逆转录

根据厂商指导，使用Tri-试剂(Sigma-Aldrich)收获RNA。根据厂商指导，使用DNase 1(Sigma-Aldrich)对提取的RNA进行Dnase处理。然后使用逆转录试剂盒(Promega)将Dnase处理的RNA逆转录为互补DNA(cDNA)。

克隆和表达

设计IFN-特异性引物以扩增全长ChIFNλ、ChIFNα和ChIFNβ，这些引物在表3中示出。将合成的cDNA与基因特异性引物用于标准PCR扩增反应中，使用35次如下循环：94℃1分钟，55℃1分钟以及72℃1分钟；以及在72℃进一步延伸15分钟，随后进行最后的循环。将感兴趣的DNA产物通过使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶纯化，然后在pGemT-Easy(Promega)中连接以进行序列分析。将这些载体命名为pGemIFNλ、pGemIFNα和pGemIFNβ。

pQE50IFNλ、pQE50IFNα和pET32IFNβ表达载体的构建

引物λ3和λ4(表3)分别含有BamHI和HindIII限制位点，将其用于在标准PCR中从pGemIFNλ中扩增ChIFNλ成熟ORF。对PCR片段进行纯化以及限制消化，然后连接在BamHI和HindIII限制消化的pQE50(Qiagen)表达载体的6×His-标记序列下游以产生pQE50IFNλ。使用引物α3和α4(表3)将ChIFNα相似地亚克隆进表达载体pQE30(Qiagen)中，产生pQE30IFNα。使用引物β3和β4(表3)将ChIFNβ也相似地亚克隆进表达载体pET32(Novagen)中，产生pET32IFNβ。使用BamHI和HindIII限制消化以及DNA测序证实所有三个表达载体。

重组ChIFNλ、α和β的表达和纯化

使用标准表达程序表达每个鸡IFN(Qiagen，1997)。培养大肠杆菌菌株TOP10F′(pQE30IFNα)、TOP10F′(pET32IFNβ)或者TOP10F′(pQE50IFNλ)，并通过异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，然后通过离心收获。使用Triton X-100处理超声处理的细胞裂解物，使用金属-亲和性层析固定蛋白质，然后使用咪唑洗脱。在每个纯化步骤收集样品进行分析，在12％SDS-PAGE凝胶上运行。使用Detoxi-gel(Pierce，USA)对样品进行解毒，以从纯化的样品中除去任何LPS。

使用Semliki Forest Virus(SFV)生物测定法测定IFN活性

如先前所述(Lowenthal et al.，1995)，通过IFN抑制SFV-介导的细胞裂解的能力确定其活性。将鸡胚成纤维细胞(CEF)以5×10⁴个细胞/孔接种于96孔平板中，在补加10％FCS的DMEM中在37℃保温过夜。然后弃去培养基，一式两份加入样品。将细胞与样品保温18小时，然后将培养基用含有SFV(10³TCID₅₀/ml)的100μl DMEM置换，在37℃保温过夜。通过中性红染料的摄取以及测量的吸光度(OD₅₄₀)确定细胞生存力。

硝酸盐产生测定

鸡细胞系(HD11)用于确定氧化氮的产生，通过Greiss测定(Migliorini etal.，1991)同样方式测量亚硝酸盐的积聚(Green et al.，1982；Sung et al.，1991)，然后测量吸光度(OD₅₄₀)。

通过PR8抑制作用确定IFN活性

将HD11细胞生长至80％铺满，然后加入IFN。将PR8加入含有胰蛋白酶(5μg/ml)的RPMI中，然后加入孔中(moi 0.1)，保温1小时。然后用补加1％FCS和5μg/ml胰蛋白酶的RPMI置换含有病毒的培养基，在37

保温直至90小时。通过凝血活性检测上清中病毒的存在情况。

凝血试验

在微滴定平板(Thermo)中进行凝血(HA)试验。将在PBS中连续2倍稀释的病毒样品与等体积的0.5％(vol/vol)得自SPF鸡的悬浮的新鲜鸡红细胞组合。使组合的病毒和红细胞在室温保温30分钟。观测含有贴壁同源红细胞层的孔为凝血状态，记录为阳性。出现阳性凝血的最低病毒稀释度记录为HA单位/ml(HAU)(Li et al.，2005)。

半定量RTPCR(qRT-PCR)

根据厂商指导(Applied Biosystems)，在ABI Prism 7700序列检测系统上相对定量处理后的基因表达，使用比较阈值法(Ct)获得基因表达的倍数变化。使用如先前所述(Karpala et al.，in press)数学公式ΔΔCt(AppliedBiosystems)获得的平均值计算相对基因表达。

结果

ChIFNλ的分子克隆和生物信息分析

得自用Poly(I:C)刺激2小时的鸡脾白细胞的cDNA用作模板，进行鸡IFNλ的PCR扩增。鉴别一个561碱基对(bp)的条带(数据未示出)。克隆ChIFNα和ChIFNβ相似地分别获得582和612bp的DNA条带(数据未示出)。获得所有三个IFN的序列。先前已经报道了ChIFN α和β序列(Sekellick et al.，1994)。因此，将新鉴别的鸡基因称作ChIFNλ。ChIFNλ的基因组结构看起来组构成5个外显子区，产生预测分子量为21kDa的由186个氨基酸组成的蛋白质(图3)。对ChIFNλ进行的信号肽分析(Bendtsen et al.，2004)揭示在第21与22位残基之间的裂解位点(图3)。ChIFNλ与HuIFNλII具有相对较高的氨基酸(aa)相同性(36％)，而与其它鸡细胞因子对比观测到相对较低的氨基酸相同性(表4)。将翻译的ChIFNλ与一些其它先前定义的IFNλII对比，鉴别保守的残基(图2)。

系统发生分析进一步示出ChIFNλ簇接近HuIFNλII(IL28A)，并支持ChIFNλ与HuIFNλ2结构最相似(图4)。

重组ChIFNα、β和λ的表达

将编码每个ChIFN的成熟蛋白质的ORF亚克隆进其表达载体中，表达及纯化，随后使用SDS-PAGE分析。预期表达的ChIFNα和ChIFNλ的分子量为大约22kDa(图5A和C)。用于ChIFNβ的pET32a表达系统产生大约34kDa的预期分子量(图5B)。

ChIFNλ与HD11相似地在鸡巨噬细胞样细胞中刺激氧化氮产生

活性氧和氮(ROS)的产生是病毒重要的细胞抑制机制(Schroder et al.，2004)。ChIFNγ已经示出刺激影响氧化氮水平的代谢物的产生(Lowenthal etal.，1995)。为了检测ChIFNλ的氧化氮增强活性，将HD11细胞用2倍稀释的重组(r)ChIFNλ处理，并与rChIFNγ和rChIFNβ对比。RChIFNλ与rChIFNβ相似地增强氧化氮的产生(图6)。RChIFNγ证实对于检测的IFN最高的氧化氮活性(图6)。

ChIFNλ的体外生物活性低于ChIFNα

为了评定ChIFNλ的病毒抑制性质，将rChIFNα与rChIFNλ在SFV生物测定中进行对比。随后在CEF细胞中通过每种rChIFN降低病毒诱导的细胞裂解(图7)。

ChIFNλ对于流感病毒(PR8)具有抑制作用

由于ChIFNλ呈现对于SFV的病毒抑制作用，因此研究其对于流感病毒的抑制作用。将HD11细胞用rChIFNα、rChIFNβ或者rChIFNλ预处理，然后用PR8感染，通过HA试验确定对于PR8的不同浓度依赖性保护水平(图8)。在较高的rChIFNλ剂量(100ng/ml)，与未处理的细胞在所有时间点相比病毒效价降低，范围是在感染后(pi)40小时无病毒至在感染后90小时320HAU(图8)。最低剂量(25ng/ml)获得一些保护作用，中等剂量(50ng/ml)获得中等保护作用(图8).这清楚证实IFNλ在鸡巨噬细胞中抑制流感病毒。应用rChIFNα具有最大的保护作用，范围是在感染后90小时在最高剂量(100ng/ml)未检测到病毒至在最低剂量(25ng/ml)为1280HAU/ml(图8)。ChIFNβ也提供了保护作用，范围是在感染后90小时在较高剂量(100ng/ml)未检测到病毒至在最低剂量(25ng/ml 5120HAU/ml(图8)。总之，所有测试的IFN均以剂量依赖性方式抑制流感病毒效价。

鸡白细胞正调节IFNλ，与I型IFN相似

由于IFNλ看起来与I型IFN在抗病毒方面功能相似，因此测量ChIFNλ是否以与I型IFN、ChIFNα和ChIFNβ相似的方式被诱导。因此，Poly(I:C)用于刺激脾白细胞，通过qRT-PCR测量ChIFNα、ChIFNβ和ChIFNλ的mRNA水平。在刺激后2小时发现所有3个ChIFN均被正调节(图9)。ChIFNα，mRNA增加86倍，ChIFNβ增加52-倍，ChIFNλ增加15倍(图9)。在刺激后4小时所有IFN的IFN正调节程度均降低(图9)。ChIFNλ被正调节程度低于ChIFNα或ChIFNβ。

TLR3由I型IFN而不是IFNλ诱导

研究I型IFN可诱导基因是否可以相似地被ChIFNλ诱导。先前的研究表明抗病毒相关受体TLR3是I型ISG(Tissari et al.，2005)。因此将鸡脾白细胞与rChIFNα、rChIFNβ或者rChIFNλ培养，表明仅I型IFN(rChIFNα、rChIFNβ)显著诱导TLR3(图10)。在应用50ng/ml的rChIFNα和rChIFNβ在2小时之后诱导TLR3分别为6.6倍和7.5倍，在100ng/ml较高剂量分别为11.3倍和12.3倍(图10)，而rChIFNλ对于TLR3诱导作用很小。

实施例2

方法

将H5N1病毒A/Vietnam/1203/04(V/1203)流感病毒在10天龄含胚无特定病原体(SPF)卵的尿囊液中进行传代。收获尿囊液，等份，然后在-80℃贮存以进行接种。SPF白色来亨鸡(4周龄)经眼内接种50卵感染剂量(EID₅₀)的V/1203。感染后(p.i.)24小时，将鸡麻醉，立即取组织样品进行RNA提取，随后通过qRT-PCR分析IFNλ。

根据Karpala，A.J.，K.R.Morris，M.M.Broadway，P.G.McWaters，T.E.O′Neil，K.E.Goossens，J.W.Lowenthal，and A.G.Bean.2008.Molecularcloning，expression，and characterization of chicken IFN-lambda.J InterferonCytokine Res 28：341-50所述方法，使用IFNλ进行病毒保护作用。

通过以每个卵1000μg或者20μg稀释纯化的抗-chIFNλ，进行流感病毒和抗血清的卵内接种。将200μL抗-chIFN-抗体与200μL疫苗病毒注射进每个卵的尿囊液中。48小时后，从每个卵中取5mL尿囊液，通过凝血测定确定病毒效价(Karpala et al.，2008)。

IFNλ佐剂活性通过注射有或无IFNλ的羊红细胞(SRBC)测定。在第0天为4组SPF鸡注射0.01ml SRBC和各佐剂，然后在第15天单独注射SRBC。在不同时间点取鸡血样，根据Van der Zijpp and Leenstra，Poultry Sci.59：1363-1369的方法通过HA确定总抗体。

结果

在鸡感染H5N1(禽流感)之后诱导IFNλ表达(图11)。证实应用IFNλ在感染前和之后在体外对抗流感的保护作用，然而当在感染之前应用IFNλ时进一步增强保护作用(图12)。这些发现与这样的事实一致，即chIFNλ活性的抑制(通过IFNλ的抗体)增强流感疫苗在卵中的生长(图13)。

证实IFNλ呈现佐剂潜力，因为其在抗原(羊红细胞)接种之后刺激抗体产生(图14)。应用IFNλ抑制ConA诱导的淋巴细胞增殖(图15)。

本领域技术人员意识到除了特殊描述之外可以对本发明加以改变和修改。应理解本发明包括所有这种改变和修改。本发明还包括本说明书中个别或总体提及或者指定的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任两或多个所述步骤或特征的任何及所有组合。

参考文献

Abend J.R.，Low J.A.and Imperiale M.J.(2007)Inhibitory effect ofgamma interferon on BK virus gene expression and replication.J Virol 81，272-9.

Ank N.，West H.，Bartholdy C.，Eriksson K.，Thomsen A.R.and PaludanS.R.(2006)Lambda interferon(IFN-lambda)，a type III IFN，is induced byviruses and IFNs and displays potent antiviral activity against select virusinfections in vivo.J Virol 80，4501-9.

Annibali V.，Giovanni S.D.，Cannoni S.，Giugni E.，Bomprezzi R.，MatteiC.，Elkahloun A.，Coccia E.M.，Alfo M.，Orzi F.，Ristori G.and Salvetti M.(2007)Gene expression profiles reveal homeostatic dynamics duringinterferon-beta therapy in multiple sclerosis.Autoimmunity 40，16-22.

Beilharz M.W.，Cummins J.M.and Bennett A.L.(2007)Protection fromlethal influenza virus challenge by oral type 1 interferon.Biochem Biophys ResCommun 355，740-4.

Bracei L.，Canini I.，Puzelli S.，Sestili P.，Venditti M.，Spada M.，DonatelliI.，Belardelli F.and Proietti E.(2005)Type I IFN is a powerful mucosaladjuvant for a selective intranasal vaccination against influenza virus in miceand affects antigen capture at mucosal level.Vaccine 23，2994-3004.

Chen J.M.，Chen J.W.，Dai J.J.and Sun Y.X.(2007)A survey of humancases of H5N1 avian influenza reported by the WHO before June 2006 forinfection control.Am J Infect Control 35，351-3.

Chesler D.A.，Munoz-Jordan J.L.，Donelan N.，Garcia-Sastre A.and ReissC.S.(2003)PKR is not required for interferon-gamma inhibition of VSVreplication in neurons.Viral Immunol 16，87-96.

de Veer M.J.，Holko M.，Frevel M.，Walker E.，Der S.，Paranjape J.M.，Silverman R.H.and Williams B.R.(2001)Functional classification ofinterferon-stimulated genes identified using microarrays.J Leukoc Biol 69，912-20.

Digby M.R.and Lowenthal J.W.(1995)Cloning and expression of thechicken interferon-gamma gene.J Interferon Cytokine Res 15，939-45.

Donnelly R.P.，Sheikh F.，Kotenko S.V.and Dickensheets H.(2004)Theexpanded family of class II cytokines that share the IL-10 receptor-2(IL-10R2)chain.J Leukoc Biol 76，314-21.

Dumoutier L.，Tounsi A.，Michiels T.，Sommereyns C.，Kotenko S.V.andRenauld J.C.(2004)Role of the interleukin(IL)-28receptor tyrosine residuesfor antiviral and antiproliferative activity of IL-29/interferon-lambda 1：similarities with type I interferon signaling.J Biol Chem 279，32269-74.

Green L.C.，Wagner D.A.，Glogowski J.，Skipper P.L.，Wishnok J.S.andTannenbaum S.R.(1982)Analysis of nitrate，nitrite，and.Anal Biochem 126，131-8.

Jacobs B.L.and Langland J.O.(1996)When two strands are better thanone：the mediators and modulators of the cellular responses to double-strandedRNA.Virology 219，339-49.

Kaiser P.，Poh T.Y.，Rothwell L.，Avery S.，Balu S.，Pathania U.S.，HughesS.，Goodchild M.，Morrell S.，Watson M.，Bumstead N.，Kaufman J.and YoungJ.R.(2005)A genomic analysis of chicken cytokines and chemokines.JInterferon Cytokine Res 25，467-84.

Kamijo R.，Shapiro D.，Gerecitano J.，Le J.，Bosland M.and Vilcek J.(1994)Biological functions of IFN-gamma and IFN-alpha/beta：lessons fromstudies in gene knockout mice.Hokkaido Igaku Zasshi 69，1332-8.

Karpala，A.J.，K.R.Morris，M.M.Broadway，P.G.McWaters，T.E.O′Neil，K.E.Goossens，J.W.Lowenthal，and A.G.Bean.2008.Molecularcloning，expression，and characterization of chicken IFN-lambda.J InterferonCytokine Res 28：341-50.

Koerner I.，Kochs G.，Kalinke U.，Weiss S.and Staeheli P.(2007)Protective role of beta interferon in host defense against influenza A virus.JVirol 81，2025-30.

Kotenko S.V.，Gallagher G.，Baurin V.V.，Lewis-Antes A.，Shen M.，ShahN.K.，Langer J.A.，Sheikh F.，Dickensheets H.and Donnelly R.P.(2003)IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokinereceptor complex.Nat Immunol4，69-77.

Li Y.C.，Kong L.H.，Cheng B.Z.and Li K.S.(2005)Construction ofinfluenza virus siRNA expression vectors and their inhibitory effects onmultiplication of influenza virus.Avian Dis 49，562-73.

Lowenthal J.W.，Digby M.R.and York J.J.(1995)Production ofinterferon-gamma by chicken T cells.J Interferon Cytokine Res 15，933-8.

Majde J.A.(2000)Viral double-stranded RNA，cytokines，and the flu.JInterferon Cytokine Res 20，259-72.

Marcello T.，Grakoui A.，Barba-Spaeth G.，Machlin E.S.，Kotenko S.V.，MacDonald M.R.and Rice C.M.(2006)Interferons alpha and lambda inhibithepatitis C virus replication with distinct signal transduction and generegulation kinetics.Gastroenterology 131，1887-98.

Meager A.，Visvalingam K.，Dilger P.，Bryan D.and Wadhwa M.(2005)Biological activity of interleukins-28 and -29：comparison with type Iinterferons.Cytokine 31，109-18.

Meager A.(2002)Biological assays for interferons.J Immunol Methods261，21-36.

Migliorini P.，Corradin G.and Corradin S.B.(1991)Macrophage NO2-production as a sensitive and rapid assay for the quantitation of murineIFN-gamma.J Immunol Methods 139，107-14.

Moraes M.P.，de Los Santos T.，Koster M.，Turecek T.，Wang H.，AndreyevV.G.and Grubman M.J.(2007)Enhanced antiviral activity againstfoot-and-mouth disease virus by a combination of type I and II porcineinterferons.J Virol 81，7124-35.

Rio J.，Nos C.，Marzo M.E.，Tintore M.and Montalban X.(1998)Low-dose steroids reduce flu-like symptoms at the initiation of IFNbeta-1b inrelapsing-remitting MS.Neurology 50，1910-2.

Robek M.D.，Boyd B.S.and Chisari F.V.(2005)Lambda interferon inhibitshepatitis B and C virus replication.J Virol 79，3851-4.

Schroder K.，Hertzog P.J.，Ravasi T.and Hume D.A.(2004)Interferon-gamma：an overview of signals，mechanisms and functions.J LeukocBiol 75，163-89.

Schultz U.，Kaspers B.and Staeheli P.(2004)The interferon system ofnon-mammalian vertebrates.Dev Comp Immunol 28，499-508.

Sekellick M.J.，Ferrandino A.F.，Hopkins D.A.and Marcus P.I.(1994)Chicken interferon gene：cloning，expression，and analysis.J Interferon Res 14，71-9.

Sheppard P.，Kindsvogel W.，Xu W.，Henderson K.，Schlutsmeyer S.，Whitmore T.E.，Kuestner R.，Garrigues U.，Birks C.，Roraback J.，Ostrander C.，Dong D.，Shin J.，Presnell S.，Fox B.，Haldeman B.，Cooper E.，Taft D.，GilbertT.，Grant F.J.，Tackett M.，Krivan W.，McKnight G.，Clegg C.，Foster D.andKlucher K.M.(2003)IL-28，IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R.Nat Immunol 4，63-8.

Smith C.A.，McClive P.J.，Western P.S.，Reed K.J.and Sinclair A.H.(1999)Conservation of a sex-determining gene.Nature 402，601-2.

Smith P.L.，Lombardi G.and Foster G.R.(2005)Type I interferons and theinnate immune response--more than just antiviral cytokines.Mol Immunol 42，869-77.

Stohr K.and Esveld M.(2004)Public health.Will vaccines be available forthe next influenza pandemic？Science 306，2195-6.

Sung Y.J.，Hotchkiss J.H.，Austic R.E.and Dietert R.R.(1991)L-arginine-dependent production of a reactive nitrogen intermediate bymacrophages of a uricotelic species.J Leukoc Biol 50，49-56.

Takaoka A.and Yanai H.(2006)Interferon signalling network in innatedefence.Cell Microbiol 8，907-22.

Tanabe M.，Kurita-Taniguchi M.，Takeuchi K.，Takeda M.，Ayata M.，OguraH.，Matsumoto M.and Seya T.(2003)Mechanism of up-regulation of humanToll-like receptor 3 secondary to infection of measles virus-attenuated strains.Biochem Biophys Res Commun 311，39-48.

Theofilopoulos A.N.，Baccala R.，Beutler B.and Kono D.H.(2005)Type Iinterferons(alpha/beta)in immunity and autoimmunity.Annu Rev Immunol 23，307-36.

Tissari J.，Siren J.，Meri S.，Julkunen I.and Matikainen S.(2005)IFN-alpha enhances TLR3-mediated antiviral cytokine expression in humanendothelial and epithelial cells by up-regulating TLR3 expression.J Immunol174，4289-94.

Zoller B.，Redman-Muller I.，Nanda I.，Guttenbach M.，Dosch E.，SchmidM.，Zoorob R.and Jungwirth C.(2000)Sequence comparison of avianinterferon regulatory factors and identification of the avian CEC-32 cell as aquail cell line.J Interferon Cytokine Res 20，711-7.

表3

用于本研究中的引物序列

表4

ChIFNλ与其它物种的IFNλ及其它鸡细胞因子的相似性

序列表

<110>联邦科学技术研究组织

     澳大利亚家禽合作研究中心私人有限公司

<120>新的禽类细胞因子及编码其的遗传序列

<130>30650980/TDO/RAS

<150>US 60/994,567

<151>2007-09-20

<160>16

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>561

<212>DNA

<213>avian

<400>1

atggtatgct acggggtcac aattattttg gtggggaccc tggggtccct cctggtgggt   60

gccttccccc aggtcacccc gaagaagagc tgcagcctct ccaagtacca gttccctgca  120

cctttggagt tgaaggcagt gtggaggatg aaggagcagt ttgaagacat catgctgtta  180

acaaacagaa aatgcaacac cagactcttc catcggaagt gggacatagc tgagctgtcg  240

gtacctgacc gaatcaccct ggtggaggct gagctggacc tcaccatcac cgtgctcaca  300

aaccccacaa cccagagact ggcagagacg tgccaacagc ccctggcctt ccttacccaa  360

gtccaggagg acctgcgaga ctgcttggcc ctcgaggcac cttcacatca gccctctggg  420

aaactgaggc actggctgca gaagctgaag acagccaaga agaaggagac cgccggctgc  480

ctggaggcct cagccatcct ccacatcttc caagtactga acgacctgcg gtgcgcagcc  540

cagcgcgagg attgcactta g                                            561

<210>2

<211>186

<212>PRT

<213>avian

<400>2

Met Val Cys Tyr Gly Val Thr Ile Ile Leu Val Gly Thr Leu Gly Ser

1               5                   10                  15

Leu Leu Val Gly Ala Phe Pro Gln Val Thr Pro Lys Lys Ser Cys Ser

            20                  25                  30

Leu Ser Lys Tyr Gln Phe Pro Ala Pro Leu Glu Leu Lys Ala Val Trp

        35                  40                  45

Arg Met Lys Glu Gln Phe Glu Asp Ile Met Leu Leu Thr Asn Arg Lys

    50                  55                  60

Cys Asn Thr Arg Leu Phe His Arg Lys Trp Asp Ile Ala Glu Leu Ser

65                  70                  75                  80

Val Pro Asp Arg Ile Thr Leu Val Glu Ala Glu Leu Asp Leu Thr Ile

                85                  90                  95

Thr Val Leu Thr Asn Pro Thr Thr Gln Arg Leu Ala Glu Thr Cys Gln

            100                 105                 110

Gln Pro Leu Ala Phe Leu Thr Gln Val Gln Glu Asp Leu Arg Asp Cys

        115                 120                 125

Leu Ala Leu Glu Ala Pro Ser His Gln Pro Ser Gly Lys Leu Arg His

    130                 135                 140

Trp Leu Gln Lys Leu Lys Thr Ala Lys Lys Lys Glu Thr Ala Gly Cys

145                 150                 155                 160

Leu Glu Ala Ser Ala Ile Leu His Ile Phe Gln Val Leu Asn Asp Leu

                165                 170                 175

Arg Cys Ala Ala Gln Arg Glu Asp Cys Thr

            180                 185

<210>3

<211>498

<212>DNA

<213>avian

<400>3

ttcccccagg tcaccccgaa gaagagctgc agcctctcca agtaccagtt ccctgcacct    60

ttggagttga aggcagtgtg gaggatgaag gagcagtttg aagacatcat gctgttaaca    120

aacagaaaat gcaacaccag actcttccat cggaagtggg acatagctga gctgtcggta    180

cctgaccgaa tcaccctggt ggaggctgag ctggacctca ccatcaccgt gctcacaaac    240

cccacaaccc agagactggc agagacgtgc caacagcccc tggccttcct tacccaagtc    300

caggaggacc tgcgagactg cttggccctc gaggcacctt cacatcagcc ctctgggaaa    360

ctgaggcact ggctgcagaa gctgaagaca gccaagaaga aggagaccgc cggctgcctg    420

gaggcctcag ccatcctcca catcttccaa gtactgaacg acctgcggtg cgcagcccag    480

cgcgaggatt gcacttag                                                  498

<210>4

<211>165

<212>PRT

<213>avian

<400>4

Phe Pro Gln Val Thr Pro Lys Lys Ser Cys Ser Leu Ser Lys Tyr Gln

1               5                   10                  15

Phe Pro Ala Pro Leu Glu Leu Lys Ala Val Trp Arg Met Lys Glu Gln

            20                  25                  30

Phe Glu Asp Ile Met Leu Leu Thr Asn Arg Lys Cys Asn Thr Arg Leu

        35                  40                  45

Phe His Arg Lys Trp Asp Ile Ala Glu Leu Ser Val Pro Asp Arg Ile

    50                  55                  60

Thr Leu Val Glu Ala Glu Leu Asp Leu Thr Ile Thr Val Leu Thr Asn

65                  70                  75                  80

Pro Thr Thr Gln Arg Leu Ala Glu Thr Cys Gln Gln Pro Leu Ala Phe

                85                  90                  95

Leu Thr Gln Val Gln Glu Asp Leu Arg Asp Cys Leu Ala Leu Glu Ala

            100                 105                 110

Pro Ser His Gln Pro Ser Gly Lys Leu Arg His Trp Leu Gln Lys Leu

        115                 120                 125

Lys Thr Ala Lys Lys Lys Glu Thr Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Ala

    130                 135                 140

Ile Leu His Ile Phe Gln Val Leu Asn Asp Leu Arg Cys Ala Ala Gln

145                 150                 155                 160

Arg Glu Asp Cys Thr

                165

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>primer

<400>5

atggctgtgc ctgcaagcc                                      19

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>primer

<400>6

ctaagtgcgc gtgttgcctg tg                                  22

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>primer

<400>7

actggatcct gcaaccacct tcgcccc                             27

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>primer

<400>8

actaagcttc taagtgcgcg tgttgcctg    29

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>primer

<400>9

atgactgcaa accatcag                18

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>primer

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Claims (58)

1.分离的核酸分子，其编码禽类干扰素-λ(IFN-λ)多肽或者其功能片段或者与编码禽类干扰素-λ(IFN-λ)多肽或者其功能片段的核酸分子互补。

2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述禽类是鸡、火鸡、矮脚鸡、鹌鹑、珍珠鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋、鸽子、金丝雀、虎皮鹦鹉、鹦鹉或者雀。

3.权利要求2的分离的核酸分子，其中所述禽类是鸡。

4.权利要求3的分离的核酸分子或者所述分离的核酸分子的功能片段或者禽类同系物，所述核酸分子包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码或者互补于编码SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列或者其功能片段或者禽类同系物的序列，或者编码或者互补于编码与SEQ ID NO：2或4所示序列在全长上具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的序列，或者能在低严格条件下与所述核酸分子杂交的核酸序列。

5.权利要求3的分离的核酸分子或者所述分离的核酸分子的功能片段或者禽类同系物，其中所述核酸分子包含核苷酸序列或者与所述核苷酸序列互补的序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO：1或3所示序列或者是与SEQ ID NO：1或3所示序列在全长上具有至少大约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性的核苷酸序列，或者是在低严格条件下能与SEQ ID NO：1或3所示序列杂交的核苷酸序列或者其互补形式。

6.权利要求5的分离的核酸分子，其中所述分子包含SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列或者所述分子的功能片段。

7.权利要求4或5的分离的核酸分子，其中所述严格条件是中等严格条件。

8.权利要求4或5的分离的核酸分子，其中所述严格条件是高严格条件。

9.权利要求1-8任一项的分离的核酸分子，其中所述序列是cDNA序列。

10.权利要求1-3任一项的分离的核酸分子，其中所述序列是基因组序列。

11.分离的多肽，其中所述多肽是禽类干扰素-λ(IFN-λ)多肽或者其功能片段。

12.权利要求11的分离的多肽，其中所述禽类是鸡、火鸡、矮脚鸡、鹌鹑、珍珠鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋、鸽子、金丝雀、虎皮鹦鹉、鹦鹉或者雀。

13.权利要求12的分离的多肽，其中所述禽类是鸡。

14.权利要求13的分离的多肽或者所述分离的多肽的功能片段或者禽类同系物，其中所述多肽包含SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列或者与SEQID NO：2或4所示序列在全长上具有至少大约60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或者更高相同性。

15.权利要求14的分离的多肽，其中所述多肽由权利要求4-10任一项的核酸序列编码。

16.权利要求11-15任一项的禽类干扰素-λ多肽与如下任一干扰素之间的融合多肽：

i)III型干扰素，或者

ii)I型或者II型干扰素，如选自IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、ChIFN-β或者Ch IFN-γ之一的干扰素。

17.权利要求16的融合多肽，其中所述I、II或者II型干扰素是禽类I型、II型或者III型干扰素。

18.权利要求17的融合多肽，其中所述禽类是鸡、火鸡、矮脚鸡、鹌鹑、珍珠鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋、鸽子、金丝雀、虎皮鹦鹉、鹦鹉或者雀。

19.权利要求18的融合多肽，其中所述禽类是鸡。

20.编码权利要求16-19任一项的融合多肽的核酸分子。

21.包含核酸分子的遗传构建体，其中所述核酸分子是权利要求1-10任一项的核酸分子。

22.包含核酸分子的遗传构建体，其中所述核酸分子是权利要求21的核酸分子。

23.在细胞中产生重组禽类干扰素-λ分子的方法，包括如下步骤：

(i)在所述细胞中导入权利要求21或22的遗传构建体；

(ii)在足以使所述核酸表达的时间和条件下培养所述细胞。

24.通过权利要求23的方法产生的重组禽类干扰素-λ分子。

25.表达权利要求24的重组禽类干扰素-λ的分离的细胞。

26.包含权利要求1-10任一项的核酸分子的分离的细胞。

27.包含权利要求21-22任一项的遗传构建体的分离的细胞。

28.权利要求25-27任一项的分离的细胞，其中所述细胞是真核细胞。

29.权利要求28的分离的细胞，其中所述真核细胞是禽类细胞。

30.权利要求25-27任一项的分离的细胞，其中所述细胞是原核细胞。

31.权利要求30的分离的细胞，其中所述细胞是细菌。

32.能结合权利要求11-19或者24任一项的多肽的抗体分子。

33.在其上记录权利要求1-19任一项的至少一个核酸和/或多肽序列的计算机可读介质。

34.鉴别禽类干扰素-λ遗传序列的方法，其中所述方法包括将核酸样品与杂交有效量的针对权利要求1-10任一项的核苷酸序列的禽类干扰素-λ探针接触，然后检测所述杂交情况。

35.权利要求34的方法，其中所述探针针对或者衍生自SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列或者其互补序列或者功能片段。

36.权利要求35的方法，其中第一种引物分子针对SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列的有义链或者其同系物，第二种引物分子针对SEQ IDNO：1或3所示核苷酸序列的互补序列或者其同系物。

37.测量禽类动物中权利要求11-15的禽类干扰素-λ多肽水平的测定方法，包括将得自所述禽类动物的生物学样品与权利要求32的抗体在足以使得抗体-干扰素-λ复合物形成的时间和条件下接触，然后检测所述复合物形成情况。

38.诱导或者正调节禽类动物中免疫应答的方法，所述方法包括在足以诱导、增强或者另外保持免疫应答的时间和条件下给予所述禽类动物有效量的权利要求11-15任一项的多肽或者其功能片段或者同系物，或者给予权利要求16-19任一项的融合多肽。

39.治疗或者预防禽类动物疾病的方法，所述方法包括在足以诱导、增强或者另外保持免疫应答的时间和条件下给予所述禽类动物有效量的权利要求11-15任一项的多肽或者其功能片段或者同系物，或者给予权利要求16-19任一项的融合多肽。

40.治疗已经暴露于或者感染病原性生物的禽类动物的方法，所述方法包括在足以保持或者正调节所述禽类动物的免疫应答的时间和条件下给予所述禽类动物有效量的权利要求11-15任一项的多肽或者其功能片段或者同系物，或者给予权利要求16-19任一项的融合多肽。

41.权利要求38或39任一项的方法，其中所述禽类动物易感或者已经感染了病原体。

42.权利要求40或41的方法，其中所述病原体是病毒、细菌或者寄生虫。

43.权利要求42的方法，其中所述病原体是禽流感病毒(avian influenzavirus)、传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus)、鸡传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus)、鸡传染性喉气管炎病毒(avianinfectious laryngotracheitis virus)、传染性支气管炎病毒(infectious bronchitisvirus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、Marek′s病毒、鸡贫血病毒、大肠杆菌、沙门氏菌(Salmonella ssp.)、艾美球虫(Eimeria ssp)或者支原体(Mycoplasmas ssp)。

44.权利要求38-43任一项的方法，其中所述禽类动物是鸡、、火鸡、矮脚鸡、鹌鹑、珍珠鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋、鸽子、金丝雀、虎皮鹦鹉、鹦鹉或者雀。

45.权利要求44的方法，其中所述禽类动物是鸡。

46.权利要求38-45任一项的方法，其中所述多肽与第二种禽类细胞因子分子组合给予，所述第二种禽类细胞因子分子选自III型干扰素、I型干扰素或者II型干扰素。

47.权利要求46的方法，其中所述第二种禽类细胞因子分子是IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、Ch IFN-β或者Ch IFN-γ。

48.权利要求11-19的禽类干扰素-λ多肽或者权利要求1-10的核酸分子在治疗禽类动物中的应用。

49.权利要求11-19的禽类干扰素-λ多肽或者权利要求1-10的分离的核酸分子在禽类动物中保持、刺激或者增强免疫应答中的应用。

50.权利要求11-19任一项的禽类干扰素-λ多肽或者权利要求1-10任一项的核酸分子在生产治疗或者预防禽类动物病原体感染的药物中的应用。

51.权利要求50的应用，其中所述病原体是病毒、细菌或者寄生虫。

52.权利要求51的应用，其中所述病原体是禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、Marek′s病毒、鸡贫血病毒、大肠杆菌、沙门氏菌(Salmonella ssp.)、艾美球虫(Eimeria ssp)或者支原体。

53.权利要求48-52任一项的应用，其中所述禽类动物是鸡、、火鸡、矮脚鸡、鹌鹑、珍珠鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋、鸽子、金丝雀、虎皮鹦鹉、鹦鹉或者雀。

54.权利要求53的应用，其中所述禽类动物是鸡。

55.权利要求38-47任一项的方法或者权利要求48-52任一项的应用，其中所述多肽、核酸分子或者药物是适于通过动物摄食或者通过卵内注射、孵化后注射、腹膜内注射、皮内注射、肌内注射、眼内注射、静脉内注射或者皮下注射给予禽类动物的形式。

56.适于由禽类摄食形式的加药或者治疗性食品，其包含权利要求11-19任一项的重组禽类干扰素-λ多肽或者权利要求1-10任一项的核酸分子。

57.包含权利要求11-19任一项的多肽以及任选药物可接受的载体、赋形剂或者稀释剂的佐剂。

58.包含权利要求11-19任一项的多肽以及兽用可接受的一或多种载体和/或稀释剂的兽药组合物。

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