JP2021509254A - H3n2亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
このため、一態様では、本願は、N結合型グリコシル化部位を含まないH3N2亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体に関する。N結合型グリコシル化部位がないことから、かかる突然変異体は、N結合型グリコシル化鎖を含まない。或る特定の好ましい実施の形態では、本願は、H3N2亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体を提供するが、ここで、H3N2亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質と比較して、突然変異体は、N結合型グリコシル化部位を含まず、任意に、突然変異体は、野生型ヘマグルチニンタンパク質のN末端シグナルペプチド及び/又は膜貫通領域を含まない。
(1)N残基が欠失するか、又は1つ以上の他のアミノ酸残基(例えば、非Nアミノ酸残基)に置き換えられる;
(2)(S又はT)残基が欠失するか、又は1つ以上の他のアミノ酸残基(例えば、非S及び非Tアミノ酸残基)に置き換えられる;
(3)X残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる;
(4)1つ以上のアミノ酸残基(例えば、非Nアミノ酸残基)がN残基とX残基との間に付加される;及び、
(5)1つ以上のアミノ酸残基(例えば、非S及び非Tアミノ酸残基)がX残基と(S又はT)残基との間に付加される;
からなる群から選択される1つ以上の突然変異を有し、
ここで、Nはアスパラギンを表し、Xはプロリン以外の任意の1つのアミノ酸を表し、Sはセリンを表し、Tはトレオニンを表す;
したがって、該突然変異体が特徴的配列N−X−(S又はT)を全く有しない。
(1)N残基が欠失するか、又は別のアミノ酸残基(例えば、非Nアミノ酸残基)に置き換えられる;
(2)(S又はT)残基が欠失するか、又は別のアミノ酸残基(例えば、非S及び非Tアミノ酸残基)に置き換えられる;
(3)X残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる;
(4)1つ以上のアミノ酸残基(例えば、非Nアミノ酸残基)がN残基とX残基との間に付加される;及び、
(5)1つ以上のアミノ酸残基(例えば、非S及び非Tアミノ酸残基)がX残基と(S又はT)残基との間に付加される;及び、
(6)(1)〜(5)の任意の組合せ;
からなる群から選択される突然変異を有するという点で異なる。
(1)N残基が欠失するか、又は保存的に置き換えられる;
(2)(S又はT)残基が欠失するか、又は保存的に置き換えられる;
(3)X残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる;
(4)非Nアミノ酸残基がN残基とX残基との間に付加される;
(5)非S及び非Tアミノ酸残基がX残基と(S又はT)残基との間に付加される;及び、
(6)(1)〜(5)の任意の組合せ;
からなる群から選択される突然変異を有するという点で異なる。
一態様では、本願は、本発明によるH3N2亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体と、突然変異体に連結した付加的なペプチド断片とを含む組換えタンパク質に関する。
別の態様では、本願は、本発明の突然変異体又は本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる核酸分子に関する。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の核酸分子は、単離又は精製されている。
一態様では、本願は、本発明の複数の突然変異体又は本発明の複数の組換えタンパク質を含むか又はそれからなる多量体に関する。或る特定の好ましい実施の形態では、多量体は三量体である。言い換えると、多量体は、本発明の3つの突然変異体又は組換えタンパク質を含むか又はそれからなる。或る特定の好ましい実施の形態では、三量体は、天然HAタンパク質から形成される三量体と同じ又は同様の立体配座を有する。
別の態様では、本願は、上述の突然変異体、又は上述の組換えタンパク質、又は上述の核酸分子、又は上述のベクター、又は上述の宿主細胞、又は上述のウイルス、又は上述の多量体を含む組成物にも関する。或る特定の好ましい実施の形態では、組成物は、本発明の突然変異体又は組換えタンパク質を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組成物は、本発明の多量体を含む。
別の態様では、本発明は、本発明の突然変異体又は組換えタンパク質又は多量体を含み、任意に薬学的に許容可能な担体及び/又は賦形剤を更に含む医薬組成物(例えば、ワクチン)にも関する。本発明の医薬組成物(例えば、ワクチン)は、インフルエンザウイルスの感染、又はインフルエンザ等のインフルエンザウイルスの感染によって引き起こされる疾患を予防又は治療するために使用することができる。
別の態様では、本発明は、本発明の宿主細胞又はウイルスを突然変異体又は組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で培養することと、発現された突然変異体又は組換えタンパク質を回収することとを含む、上述の突然変異体又は組換えタンパク質を作製する方法に関する。
本願では、特に明記しない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。加えて、本明細書で用いられる細胞培養、分子遺伝学、核酸化学及び免疫学の研究所操作工程は全て、対応する分野で広く用いられている日常手順である。一方、本発明をより良く理解するために、関連用語の定義及び説明を下記に与える。
本願は、種々の亜型(例えば、H3N2、H7N9及び/又はH1N1亜型)のインフルエンザウイルスに対する防御抗体を誘導し、種々の亜型のインフルエンザウイルスに対する防御を達成することが可能であり、したがって、インフルエンザウイルスの複数の亜型(例えば、少なくとも2つ、少なくとも3つ又はそれ以上の亜型)の感染及び感染に関連する疾患(例えば、インフルエンザ)の予防及び/又は治療のためのインフルエンザウイルスの複数の亜型(例えば、少なくとも2つ、少なくとも3つ又はそれ以上の亜型)に対する広域ワクチンとして使用することができる、H3N2亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体を提供する。
本発明に関わる配列の情報を下記表1に提示する。
ここで、本発明を説明することを意図するが、本発明を限定しない以下の実施例を参照して本発明を説明する。
(A)HAタンパク質突然変異体の設計及び構造
インフルエンザウイルスの天然HAタンパク質では、N結合型グリコシル化を受けるアミノ酸は通常、特徴的配列N−X−(S又はT)中のアスパラギン(N)であり、ここで、Nはアスパラギンを表し、Xはプロリン以外の任意の1つのアミノ酸を表し、Sはセリンを表し、Tはトレオニンを表す。本実施例では、天然HAタンパク質の特徴的配列N−X−(S又はT)中のアスパラギン(N)をアラニン(A)へと突然変異させることによってHAタンパク質のN結合型グリコシル化部位を除去した。
(1)配列番号2に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号1のアミノ酸1〜10及び504〜550が欠失しており、トロンビン切断部位、フォールディングモチーフ及び6×Hisタグを含むペプチド断片(タンパク質の精製及び三量体形成を容易にするために配列番号10及び11の配列を有する)が配列番号1のC末端に導入されているという点で配列番号1とは異なる天然HAタンパク質(WI2005−WT−HA)。したがって、天然HAタンパク質(WI2005−WT−HA)から形成される三量体は、ヘッド領域及びステム領域の両方にN結合型グリコシル鎖を含んでいた(図2A)。
(2)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有し、上述の10個のN結合型グリコシル化部位の各々のアスパラギンがアラニンに突然変異しているという点で天然HAタンパク質(WI2005−WT−HA;配列番号2)とは異なるHA−mut1。したがって、HA−mut1によって形成される三量体は、ヘッド領域及びステム領域にN結合型グリコシル鎖を含まなかった(図2B)。
(3)配列番号4に示されるアミノ酸配列を有し、ヘッド領域に(すなわち、配列番号1の63位、126位、133位、144位、165位及び246位に)位置するアスパラギンの各々がアラニンに突然変異しているという点で天然HAタンパク質(WI2005−WT−HA;配列番号2)とは異なるHA−mut2。したがって、HA−mut2によって形成される三量体は、ヘッド領域にN結合型グリコシル鎖を含まないが、ステム領域にN結合型グリコシル鎖を依然として含んでいた(図2C)。
(4)配列番号5に示されるアミノ酸配列を有し、ステム領域に(すなわち、配列番号1の22位、38位、285位及び483位に)位置するアスパラギンの各々がアラニンに突然変異しているという点で天然HAタンパク質(WI2005−WT−HA;配列番号2)とは異なるHA−mut3。したがって、HA−mut3によって形成される三量体は、ステム領域にN結合型グリコシル鎖を含まないが、ヘッド領域にN結合型グリコシル鎖を依然として含んでいた(図2D)。
天然HAタンパク質、HA−mut1タンパク質、HA−mut2タンパク質及びHA−mut3タンパク質(それらの各々について、シグナルペプチド(配列番号9)をN末端に導入し、トロンビン切断部位、フォールディングモチーフ及び6×Hisタグを含むペプチド断片(配列番号10及び11)をC末端に導入した)を別個にコードするDNA配列がShanghai Sangon Biotechnology Co., Ltdによって合成され、続いてこれらのDNA配列をバキュロウイルストランスファーベクターpAcGP67−B(BD Company、カタログ番号:554757)にそれぞれクローニングした。続いて、関心のDNA配列を有するトランスファーベクターを大腸菌DH5aのコンピテント細胞に別個に形質転換し、増幅させた。プラスミドミニプレップキット(TIANprep Mini Plasmid Kit;TianGen Corporation、カタログ番号:DP103−03)を用いて、関心のDNA配列を有するトランスファープラスミドを形質転換大腸菌から後に使用するために抽出した。
トランスフェクションの1時間前に、1×106個の昆虫細胞(Sf9細胞、Invitrogen)を6ウェル培養プレートにプレーティングし、血清添加培地中で培養した。1μgの工程(B)で作製したトランスファープラスミド、0.1μgのバキュロウイルス線状DNA(BD)、1μlのリポソーム(Sigma)及び100μlの無血清細胞培養培地を混合し、室温で30分間静置して、トランスフェクション混合物を得た。血清含有培地を各ウェルから除去し、トランスフェクション混合物を添加した。27℃で6時間のインキュベーション後に、トランスフェクション混合物を各ウェルから除去し、2mlのCCM3含有培地を各ウェルに添加して、細胞を培養し続けた。結果として、関心のDNA配列を有するトランスファープラスミド及びバキュロウイルス線状DNAが昆虫細胞にトランスフェクトされ、組み換えバキュロウイルスが生成した。
得られた組み換えバキュロウイルスを継代して、2代目の組み換えバキュロウイルスを得た。2代目の組み換えバキュロウイルス15mlを1200mlのSf9昆虫細胞に添加し、27℃で48時間培養した。細胞及び培養上清を回収し、11500rpmで30分間遠心分離した。遠心分離後に、組換えにより生成した標的タンパク質を含有する上清を回収した。
加えて、Juine-Ruey Chen et al. (Proc Natl Acad Sci, USA. 2014 Feb 18; 111 (7): 2476-81)に記載の方法を参照することで、天然HAタンパク質(WI2005−WT−HA)を、エンドグリコシダーゼH及びエンドグリコシダーゼFを用いる酵素処理に供し、N結合型グリコシル化部位に単一グリコシル基を有するHAタンパク質(以下、HAmgと称する)及びN結合型グリコシル化部位にグリコシル基を実質的に有しないHAタンパク質(以下、HAugと称する)を作製した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を用いて、実施例1で作製した6つのタンパク質(天然HAタンパク質、HA−mut1、HA−mut2、HA−mut3、HAmg及びHAug)を分析した。使用した上層ゲルは、5%濃縮ゲル(以下のように調製した:830μlの30%アクリルアミド、630μlの1M Tris(pH6.8)、50μlの10%SDS、50μlの10%過硫酸アンモニウム及び5μlのTEMEDを3.4mlの水に添加した)であった。使用した下層ゲルは、12%分離ゲル(以下のように調製した:4mlの30%アクリルアミド、2.5mlの1M Tris(pH8.8)、100μlの10%SDS、100μlの10%過硫酸アンモニウム及び10μlのTEMEDを3.3mlの水に添加した)であった。使用した電気泳動条件は、電気泳動を150Vで2時間行うというものであった。電気泳動後に、ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー(Sigma)で染色した。実験結果を図3に示す。
(A)免疫実験
6週齢のSPFグレードの雌性Balb/Cマウスは、厦門大学の実験動物センターによって提供され、体重はおよそ20gであった。実施例1で作製した6つのタンパク質(天然HAタンパク質、HA−mut1、HA−mut2、HA−mut3、HAmg及びHAug)、並びにPBS(陰性対照として使用される)を別個にアルミニウムアジュバントと1:1の体積比で混合し、マウスの免疫化に使用した。免疫化スケジュールは、以下の通りであった。各群6匹のマウスを使用した。免疫化方法は、筋肉内注射とした。免疫化用量は、マウス1匹当たり5μgのタンパク質であった。注射量は、マウス1匹当たり100μlであった。免疫化を14日間隔で2回行った。2回目の免疫化の14日後に、血清を各マウスから採取した。採取した血清サンプルを56℃で30分間不活性化した後、後に使用するために−20℃で保管した。
中和価は、血清サンプルが疾患を予防及び治療する可能性があるかを評価するための重要な指標である。本実験では、プラーク減少中和試験(plaque reduction neutralization test;PRNT)を用いて、採取した血清サンプルの中和抗体価を分析した。使用したインフルエンザウイルスは、異なる時点で異なる地域から単離され、異なる亜型(H3N2、H7N9及びH1N1)を表すインフルエンザウイルスの代表的な株であり、特定のウイルス株は、以下の通りであった:A/Wisconsin/67/2005(H3N2亜型)、A/Victoria/361/2011(H3N2亜型)、A/Beijing/32/1992(H3N2亜型)、A/Aichi/2/1968(H3N2亜型)、A/Shanghai/02/2013(H7N9亜型)及びA/California/04/2009(H1N1亜型)。
実施例3におけるPRNT実験から、実施例1で作製した6つのタンパク質によって誘導される抗血清のH3N2亜型、H7N9亜型及びH1N1亜型ウイルス株に対する中和価が異なり、中でもHA−mut1によって誘導される抗血清が最も広域の中和活性を有することが確認された。動物におけるインフルエンザウイルスに対する免疫防御の誘導におけるこれら6つのタンパク質の効果を更に検証するために、本発明者らは、インフルエンザウイルスA/Beijing/32/1992(H3N2亜型)、A/Aichi/02/1968(H3N2亜型)、A/Shanghai/02/2013(H7N9亜型)及びA/California/04/2009(H1N1亜型)を感染させたマウス動物モデルに基づいて、これらの6つのタンパク質のin vivo抗ウイルス効果をバイオセーフティー研究所において評価した。具体的なスキームは、以下の通りである。
動物:Balb/Cマウス、SPFグレード、6週齢〜8週齢、雌性、体重約20g。
ワクチン:天然HAタンパク質、HA−mut1タンパク質、HA−mut2タンパク質、HA−mut3タンパク質、HAmgタンパク質、HAugタンパク質及びPBS(陰性対照として使用される)。
免疫化スキーム:天然HAタンパク質、HA−mut1タンパク質、HA−mut2タンパク質、HA−mut3タンパク質、HAmgタンパク質、HAugタンパク質及びPBS陰性対照を別個にアルミニウムアジュバントと1:1の体積比で混合し、マウスの免疫化に使用した。各群6匹のマウスを使用し、筋肉内注射によって免疫化した。免疫化用量は、マウス1匹当たり5μgのタンパク質であり、注射量は、マウス1匹当たり100μlであった。免疫化を2回行い、2回の免疫化の間に14日間の間隔を開けた。2回目の免疫化の14日後に、マウスをウイルスでチャレンジした。以下のインフルエンザウイルス株を使用した:
H3N2亜型インフルエンザウイルスのマウス適応株:A/Beijing/32/1992;
H3N2亜型インフルエンザウイルスのマウス適応株:A/Aichi/02/1968;
H7N9亜型インフルエンザウイルスのマウス適応株:A/Shanghai/02/2013;
H1N1亜型インフルエンザウイルスのマウス適応株:A/California/04/2009。
麻酔薬:イソフルラン(Isoflorane)。
動物のグループ分け:マウスを前日にバイオセーフティー研究所に送り、1つのケージに6匹のマウスでグループ分けし、各マウスの体重を記録した。
ウイルス感染:各ウイルスのチャレンジ用量は、50%致死量(LD50)の25倍とし、ウイルス接種量は、マウス1匹当たり50μlとした。接種前に、マウスにイソフルランで麻酔をかけ、続いてマウスに鼻腔からウイルスを接種した。
観察:ウイルス感染の1日後〜14日後にマウスの体重変化及び生存を毎日記録した。実験結果を図6〜図9に示す。
本実施例では、天然HAタンパク質の特徴的配列N−X−(S又はT)中のアスパラギン(N)をグルタミン(Q)へと突然変異させることによってHAタンパク質のN結合型グリコシル化部位を除去した。
(1)配列番号7に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号6のアミノ酸1〜25及び518〜565が欠失しており、トロンビン切断部位、フォールディングモチーフ及び6×Hisタグを含むペプチド断片(タンパク質の精製及び三量体形成を容易にするために配列番号10及び11の配列を有する)が配列番号6のC末端に導入されているという点で配列番号6とは異なる天然HAタンパク質(HK2014−WT−HA)。したがって、天然HAタンパク質(HK2014−WT−HA)によって形成される三量体は、ヘッド領域及びステム領域の両方にN結合型グリコシル鎖を含んでいた。
(2)配列番号8に示されるアミノ酸配列を有し、上述の11個のN結合型グリコシル化部位の各々のアスパラギン(N)がグルタミン(Q)に突然変異しているという点で天然HAタンパク質(HK2014−WT−HA;配列番号7)とは異なる突然変異体HK2014−DG−HA。したがって、突然変異体HK2014−DG−HAによって形成される三量体は、ヘッド領域及びステム領域の両方にN結合型グリコシル鎖を含まなかった。
実施例5で作製したタンパク質HK2014−WT−HA、HK2014−DG−HA及びHK2014−HAugを別個にフロイントアジュバントと混合して免疫原を調製し、これを続いて6週齢〜8週齢のBalb/C雌性マウス(体重約20g)の免疫化に使用した。免疫化手順は、以下の通りであった:各免疫化について14日間の間隔を開けた3回の皮下免疫化。3回目の免疫化の14日後に、マウス血清を採取し、採取した血清サンプルを56℃で30分間不活性化した後、後に使用するために−20℃で保管した。
動物におけるインフルエンザウイルスに対する実施例5で作製したタンパク質の免疫防御効果を更に検証するために、以下の実験を行った。
Claims (12)
- H3N2亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体であって、該突然変異体がN結合型グリコシル化部位を含まず、
好ましくは、該突然変異体が前記H3N2亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも該突然変異体が特徴的配列N−X−(S又はT)を含まないという点で異なり、ここで、Nはアスパラギンを表し、Xはプロリン以外の任意の1つのアミノ酸を表し、Sはセリンを表し、Tはトレオニンを表し、好ましくは、該突然変異体が前記野生型ヘマグルチニンタンパク質のN末端シグナルペプチド及び/又は膜貫通領域を含まず、
好ましくは、該突然変異体が前記H3N2亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも該野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列N−X−(S又はT)が独立して以下のもの:
(1)N残基が欠失するか、又は1つ以上の他のアミノ酸残基(例えば、非Nアミノ酸残基)に置き換えられる;
(2)(S又はT)残基が欠失するか、又は1つ以上の他のアミノ酸残基(例えば、非S及び非Tアミノ酸残基)に置き換えられる;
(3)X残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる;
(4)1つ以上のアミノ酸残基(例えば、非Nアミノ酸残基)がN残基とX残基との間に付加される;及び、
(5)1つ以上のアミノ酸残基(例えば、非S及び非Tアミノ酸残基)がX残基と(S又はT)残基との間に付加される;
からなる群から選択される1つ以上の突然変異を有することで、該突然変異体が特徴的配列N−X−(S又はT)を有しないという点で異なり、
ここで、Nはアスパラギンを表し、Xはプロリン以外の任意の1つのアミノ酸を表し、Sはセリンを表し、Tはトレオニンを表し、したがって、該突然変異体が特徴的配列N−X−(S又はT)を有さず、
好ましくは、該突然変異体が前記H3N2亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも該野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列N−X−(S又はT)が独立して以下のもの:
(1)N残基が欠失するか、又は別のアミノ酸残基(例えば、非Nアミノ酸残基)に置き換えられる;
(2)(S又はT)残基が欠失するか、又は別のアミノ酸残基(例えば、非S及び非Tアミノ酸残基)に置き換えられる;
(3)X残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる;
(4)1つ以上のアミノ酸残基(例えば、非Nアミノ酸残基)がN残基とX残基との間に付加される;及び、
(5)1つ以上のアミノ酸残基(例えば、非S及び非Tアミノ酸残基)がX残基と(S又はT)残基との間に付加される;及び、
(6)(1)〜(5)の任意の組合せ;
からなる群から選択される突然変異を有するという点で異なり、
好ましくは、該突然変異体が前記H3N2亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも該野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列N−X−(S又はT)が独立して以下のもの:
(1)N残基が欠失するか、又は保存的に置き換えられる;
(2)(S又はT)残基が欠失するか、又は保存的に置き換えられる;
(3)X残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる;
(4)非Nアミノ酸残基がN残基とX残基との間に付加される;
(5)非S及び非Tアミノ酸残基がX残基と(S又はT)残基との間に付加される;及び、
(6)(1)〜(5)の任意の組合せ;
からなる群から選択される突然変異を有するという点で異なり、
好ましくは、前記野生型ヘマグルチニンタンパク質がA/WISCONSIN/67/2005(H3N2)及びA/HONG_KONG/4801/2014(H3N2)等のH3N2亜型インフルエンザウイルスに由来し、
好ましくは、前記野生型ヘマグルチニンタンパク質が配列番号1及び6からなる群から選択される配列を有し、
好ましくは、前記野生型ヘマグルチニンタンパク質が配列番号1に示されるアミノ酸配列を有し、該突然変異体が配列番号1とは、少なくとも該突然変異体が特徴的配列N−X−(S又はT)を含まないという点で異なり、ここで、Nはアスパラギンを表し、Xはプロリン以外の任意の1つのアミノ酸を表し、Sはセリンを表し、Tはトレオニンを表し、任意に、該突然変異体がシグナルペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸1〜10)及び/又は膜貫通領域(例えば、配列番号1のアミノ酸504〜550)を含まず、
好ましくは、前記野生型ヘマグルチニンタンパク質が配列番号6に示されるアミノ酸配列を有し、該突然変異体が配列番号6とは、少なくとも該突然変異体が特徴的配列N−X−(S又はT)を含まないという点で異なり、ここで、Nはアスパラギンを表し、Xはプロリン以外の任意の1つのアミノ酸を表し、Sはセリンを表し、Tはトレオニンを表し、任意に、該突然変異体がシグナルペプチド(例えば、配列番号6のアミノ酸1〜25)及び/又は膜貫通領域(例えば、配列番号6のアミノ酸518〜565)を含まず、
好ましくは、該突然変異体が配列番号12及び13からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、又は該突然変異体が、配列番号12及び13からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%及び92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%若しくは100%の同一性を有するが、但し、該突然変異体がN結合型グリコシル化部位を全く含まない(例えば、該突然変異体が特徴的配列N−X−(S又はT)を全く含まない)か、又は該突然変異体が配列番号12及び13からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して1つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失又は置換を有するが、但し、該突然変異体がN結合型グリコシル化部位を全く含まない(例えば、該突然変異体が特徴的配列N−X−(S又はT)を全く含まない)、突然変異体。 - 請求項1に記載の突然変異体と付加的なペプチド断片とを含む組換えタンパク質であって、前記付加的なペプチド断片が前記突然変異体に連結し、
好ましくは、前記付加的なペプチド断片が前記突然変異体に直接連結するか、又は該突然変異体にリンカーを介して連結し、
好ましくは、前記付加的なペプチド断片が前記突然変異体のN末端又はC末端に連結し、
好ましくは、該組換えタンパク質が少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも5つ又はそれ以上の付加的なペプチド断片を含み、
好ましくは、前記付加的なペプチド断片がシグナルペプチド、タグペプチド、フォールディングモチーフ、検出可能な標識及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、
好ましくは、前記シグナルペプチドが前記突然変異体のN末端に連結し、更に好ましくは、該シグナルペプチドが配列番号9に示されるアミノ酸配列を有し、
好ましくは、前記フォールディングモチーフが前記突然変異体のC末端に連結し、更に好ましくは、該フォールディングモチーフが配列番号10に示されるアミノ酸配列を有する、組換えタンパク質。 - 請求項1に記載の突然変異体又は請求項2に記載の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる核酸分子。
- 請求項3に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項3に記載の核酸分子又は請求項4に記載のベクターを含む宿主細胞又はウイルス(例えば、バキュロウイルス)。
- 複数の請求項1に記載の突然変異体又は請求項2に記載の組換えタンパク質を含むか又はそれからなる多量体であって、好ましくは三量体である、多量体。
- 請求項1に記載の突然変異体、又は請求項2に記載の組換えタンパク質、又は請求項3に記載の核酸分子、又は請求項4に記載のベクター、又は請求項5に記載の宿主細胞若しくはウイルス、又は請求項6に記載の多量体を含む組成物。
- 請求項1に記載の突然変異体又は請求項2に記載の組換えタンパク質又は請求項6に記載の多量体を含む医薬組成物(例えば、ワクチン)であって、任意に薬学的に許容可能な担体及び/又は賦形剤を更に含む、医薬組成物。
- 被験体におけるインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防又は治療する方法であって、予防有効量又は治療有効量の請求項1に記載の突然変異体又は請求項2に記載の組換えタンパク質又は請求項6に記載の多量体又は請求項8に記載の医薬組成物を前記被験体に投与することを含み、
好ましくは、前記インフルエンザウイルスがH3N2、H7N9及びH1N1亜型のインフルエンザウイルスから選択され、
好ましくは、前記インフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患がインフルエンザであり、
好ましくは、前記被験体がマウス及びヒト等の哺乳動物である、方法。 - 医薬組成物(例えば、ワクチン)の製造における請求項1に記載の突然変異体又は請求項2に記載の組換えタンパク質又は請求項6に記載の多量体の使用であって、前記医薬組成物(例えば、ワクチン)が被験体におけるインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防又は治療に使用され、
好ましくは、前記インフルエンザウイルスがH3N2、H7N9及びH1N1亜型のインフルエンザウイルスから選択され、
好ましくは、前記インフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患がインフルエンザであり、
好ましくは、前記被験体がマウス及びヒト等の哺乳動物である、使用。 - 請求項1に記載の突然変異体又は請求項2に記載の組換えタンパク質を作製する方法であって、請求項5に記載の宿主細胞又はウイルスを前記突然変異体又は前記組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で培養することと、発現された前記突然変異体又は組換えタンパク質を回収することとを含む、方法。
- ワクチンを作製する方法であって、請求項1に記載の突然変異体又は請求項2に記載の組換えタンパク質又は請求項6に記載の多量体を薬学的に許容可能な担体及び/又は賦形剤と混合することを含み、任意に、アルミニウムアジュバント等のアジュバント、及び/又はインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防又は治療することが可能な付加的な有効成分等の付加的な有効成分を混合することを更に含む、方法。
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