CN101906391B - 用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90及其用途。所说的嗜热链球菌grx90是嗜热链球菌(S.thermophilus)CGMCC 3622。该菌株可以有效抑制发酵豆乳制品中不良风味物质的产生，可以制备具有良好口感的发酵豆乳制品。
Description
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90及其用途。
技术背景
大豆的保健功能众所周知，但是大豆也存在一些营养缺陷，如胰蛋白酶抑制剂影响蛋白质的消化吸收，凝血素会引起血红细胞凝集，肠胃胀气因子、过敏因子以及大豆豆腥味等都对大豆蛋白的利用有一定阻碍作用，因而大豆的食用方法与营养价值关系很大。大豆酸乳就是利用微生物的发酵作用制成的一种酸乳制品，它既能发挥大豆的营养功效，又能破坏大豆中的抗营养因子，使大豆蛋白质的消化率得到明显提高。
目前兼有大豆蛋白质和乳酸菌的酸豆乳饮料在国内迄今仍无有影响的产品上市。究其原因，主要是乳酸菌在豆乳中生长较差，发酵后的活菌数和酸度均低于酸牛奶，直接影响了酸豆乳的产品质量。用豆乳生产酸豆乳要达到酸牛乳那样的风味和品质，首先要解决两个问题，一是制备风味清香、口感舒适、稳定性好的豆乳。二是选育能在豆乳中生长良好，产酸和活菌数较高，能去除豆腥味，且能产生酸牛乳风味物质的乳酸菌。
酸豆乳与酸牛乳相同，其口感与风味与其所使用的乳酸菌的种类密切相关。不同的乳酸菌产生的酶、代谢的产物等差异很大，由此产生出不同的口感和风味。从众多乳酸菌中筛选出适合发酵豆乳的菌株具有重要的意义。不仅可以生产出优良口味的大豆发酵制品，还可以提高大豆中天然保健功能成分的利用率。在食品向天然型和保健型发展的今天，利用适合在豆乳中发酵的乳酸菌来制备各种大豆发酵制品具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明目的在于为了克服前述和其它缺点，发明一种可用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90分离株，制备具有良好口感的发酵豆乳制品。
本发明所说的嗜热链球菌grx90，是嗜热链球菌Streptococcus thermophilus(S.thermophilus)CGMCC No：3622。
本发明的另一目的在于所述嗜热链球菌grx90的应用：
可用于制备具有良好口感的发酵豆乳。
可用于制备具有良好口感的发酵混合豆乳。
可用于制备发酵型即食豆干。
可用于制备具有豆干酪食品。
经试验表明本发明的菌株可以有效抑制发酵豆乳制品中不良风味物质的产生，可以制备具有良好口感的发酵豆乳制品。
附图说明
图1是嗜热链球菌grx90革兰氏染色显微观察图
图2是嗜热链球菌grx9016S rDNA-PCR产物的荧光图谱
泳道M：EcoRI+HindIII marker；1：grx902：grx90；3：grx90
图3是嗜热链球菌grx90基因组DNA电泳图
泳道M：EcoRI+HindIII marker；1：grx90；2：grx90；3：grx90
具体实施方式
发明者通过从我国统发酵制品中分离获得的大量菌株(多数为乳酸菌)，利用研究α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)活力比较，获得一株最高活力的菌株grx90。再通过细菌形态学、生理学和培养特征，并通过法国梅埃里公司API系列试剂条及16SrDNA基因测序与BLAST在线比对，结果证实了菌株grx90是嗜热链球菌(S.thermophilus)。
1.样品来源
本发明菌株来源于我国新疆民族传统乳制品-酸马奶。酸马奶(Koumiss)是以新鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然发酵形成的酸性低酒精含量乳饮料。
2.样品采集
将样品采集后放入事先准备好的缓冲溶液中，冷藏，2天之内对样品进行分离。
3.菌株分离
将新疆民族传统乳制品酸马奶样品采用PTYG培养物于37℃培养24小时后。将该培养物涂布在PTYG琼脂平板上，然后在37℃培养3天，挑取单菌落，并进一步纯化，检测细菌特征，如下文所述的革兰氏染色如图1所示。
将分离获得的菌株用含11％脱脂乳的培养物培养后，加入保护剂，冻干、保存在-18℃，然后用于各种检测细菌特征的试验。
4.菌株筛选
将分离的菌株按3％的接种量接入50mL MRS培养基中培养→发酵液于4℃，5000r/min离心20min收集菌体→0.85％的NaCl溶液洗涤，并离心→pH6.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液悬浮进行超声波细胞破碎→离心得上清为所要酶液→200μL新配制底物α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯+200μL酶液30℃水浴20分钟后加入显色剂→15-20℃显色50分钟，于522nm处测吸光度。
5.菌株的鉴定
(1)生理生化鉴定
从纯化好的本发明菌株固体培养基上挑单菌落接种到糖发酵微量鉴定管中用无菌石蜡油封口。放入37℃恒温培养箱培养。分别于24h和48h后观察各管中液体颜色变化情况，若变色为阳性，反之阴性，结果如表1。对照《伯杰氏细菌鉴定手册》初步确定分离菌株的属种。初步鉴定该菌株为嗜热链球菌，命名为嗜热链球菌grx90。
表1本发明菌株生理生化鉴定结果
| 细胞形态 | 接触酶 | 运动性 | 麦芽糖 | 葡萄糖 | 乳糖 | 甘露醇 | 革兰氏染色 |
| 链球 | - | - | + | + | + | - | + |
| 纤维二糖 | 半乳糖 | 木糖 | 阿拉伯糖 | 山梨醇 | 45℃ | 15℃ | 明胶液化试验 |
| - | + | - | - | - | + | - | - |
| 松三糖 | 棉籽糖 | 水杨苷 | VP试验 | 吲哚试验 | 果糖 | H2S试验 | 硝酸盐还原试验 |
| + | - | + | + | - | + | - | - |
注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。
(2)API鉴定
在37℃，在厌氧条件下将嗜热链球菌grx90在MRS琼脂平板上培养48小时，然后用悬浮培养基将所得培养物悬浮，悬浮液的浊度与McFarland 2的相同。然后，将该培养细胞接种到API20Strep试剂条中，在测定糖发酵的试剂条的上层覆盖一层无菌石蜡，37℃厌氧培养以便检测酶活和对各种糖的发酵能力(表2)。
使用API识别软件程序分析了酶活和糖发酵能力。结果显示，该菌株的酶活和糖发酵能力与嗜热链球菌类似，符合率为98.5％。
表2本发明菌株API20Strep鉴定系统反应结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| VP | HIP | ESC | PYRA | αGAL | GUR | βGAL | PAL | |
| grx90 | + | + | - | - | - | - | - | - |
| 编号 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |
| LAP | ADH | RIB | ARA | MAN | SOR | LAC | TRE | |
| grx90 | + | - | - | - | - | - | + | - |
| 编号 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 |
| INU | RAF | AMD | GLYG | HEM | 45℃* | 10℃* | ||
| grx90 | - | - | - | - | - | + | - |
注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。*为补充实验
(3)菌株16SrDNA序列鉴定
采用细菌基因组DNA小量抽提试剂盒，按照说明进行操作，所提嗜热链球菌grx90基因组DNA电泳条带清晰，说明基因组DNA完整性较好可用于PCR等分子生物学操作(如图2所示)，其16SrDNA测序结果如SEQ ID NO.1所示。
以基因组DNA作为模板，采用50μl反应体系进行PCR扩增，其中模板DNA5μl(大约100ng)，2.5mM dNTP 4μl，10×buffer 5μl，10pmol上下游引物各1.5μl，Taq酶1.5U，Mg2+3μl，以ddH2O补至50μl。PCR循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性1min，64℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸8min。吸取PCR产物5μl与1μl Loading buffer混合，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，电压为80V。电泳结束后用溴化乙锭(EB)染色20-30min，拍照。可见约1500bp的条带即为目标条带(如图3所示)。
测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，测序结果：嗜热链球菌grx90的16SrDNA序列长度为1456bp。与Genbank中发表的序列比对，表明本发明菌株以同源性高达99.65％被证实属于嗜热链球菌。
API鉴定与16SrDNA序列测定结果一致，本发明菌株为嗜热链球菌(S.thermophilus)grx90。
6.菌株保藏
将本发明嗜热链球菌grx90菌株于2010年2月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；分类命名为：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，保藏号为CGMCC No：3622。
实施例1、酸豆乳的制作方法
精选黄豆→0.25％的NAaHCO3浸泡14h→清水洗两次→1∶8的比例用热水(85℃左右)磨浆→煮浆→加入8％的白砂糖和3％的全脂乳粉→均质(15-20MPa)→灭菌(90-95℃，15分钟)→冷却42℃左右接入3％嗜热链球菌grx90→42℃恒温发酵6-8h至pH值为4.3～ 4.6→放入4℃冰箱过夜即制成凝固型酸豆乳。发酵结束后经搅拌，添加果酱果汁等，冷藏，即制成搅拌型酸豆乳。
实施例2、酸豆乳酸菌饮料的制作方法
按应用实施例1制备好酸豆乳，将酸乳用杀菌并冷却的水、糖浆、乳化稳定剂等混合物稀释3-4倍左右，制成可直接饮用的酸豆乳饮料。
实施例3、发酵豆干的制作方法
按实施例2制备好酸豆乳，切割成小凝乳块，阶段性加热，加热到45-50℃促使其排出乳清，压榨到水分含量为40-43％，制成发酵豆干。
实施例4、大豆再制干酪制作
按实施例2、4制备好发酵，接种毛霉26℃培养36h，8℃成熟12天制成大豆干酪。加入20％胡萝卜汁、3.5％盐、1.5％糖、10％人造奶油、10％全脂奶粉、3％乳化稳定剂，85℃融化后进行包装。
实施例5、含嗜热链球菌grx90粉末状食品的制作方法
将嗜热链球菌grx90酸乳冷冻至-40℃～-60℃，经干燥，至含水量为3％-5％，压碎成粉末状，可将粉末状产品加入奶粉、低聚糖、麦芽糊精、风味剂等制成粉末状或片块状产品，用于日常食用。
实施例6、含嗜热链球菌grx90冰淇淋的制作方法
按应用实施例1制备好酸豆乳，冰淇淋原料配比如表5所示。
表5 1000kg冰淇淋配方
| 原料 | 重量(kg) |
| 嗜热链球菌grx90酸乳 | 400 |
| 白砂糖 | 75 |
| 全脂奶粉 | 62.5 |
| 黄奶油 | 31.25 |
| 椰子油 | 23 |
| 糖浆 | 26.25 |
| 乳化稳定剂 | 6 |
| 水 | 276 |
将除酸乳以外的其它物料混合，预热到60～65℃，采用20Mpa～30Mpa进行均质，然 后在80℃/20s杀菌，冷却到40～50℃，与酸乳混合，采用20Mpa～30Mpa进行均质，在2℃～4℃时，老化时间6h，经凝冻后经过硬化的为硬质冰淇淋，不经硬化的为软质冰淇淋。
以上本发明提供的菌株发酵的酸豆乳、大豆发酵豆干、再制干酪等几种产品风味良好，易为消费者接受。
以上本发明提供的菌株发酵的酸豆乳、豆乳饮料、大豆发酵豆干、豆乳冰淇淋、粉末状食品口感风味良好，并有一定的保健作用，易为消费者接受。
SEQUENCE LISTING
<110>扬州大学
<120>用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90及其用途
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>885
<212>DNA
<213>S.thermophilus
<400>1
cttccaatgg cgcgtgctat acatgcaagt agaacgctga agagaggagc ttgctcttct 60
tggatgagtt gcgaacgggt gagtaacgcg taggtaacct gccttgtagc gggggataac 120
tattggaaac gatagctaat accgcataac aatggatgac acatgtcatt tatttgaaag 180
gggcaattgc tccactacaa gatggacctg cgttgtatta gctagtaggt gaggtaatgg 240
ctcacctagg cgacgataca tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300
acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttcggcaatg ggggcaaccc 360
tgaccgagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgtaagt 420
caagaacggg tgtgagagtg gaaagttcac actgtgacgg tagcttacca gaaagggacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtccc gagcgttgtc cggatttatt 540
gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttgata agtctgaagt taaaggctgt ggctcaacca 600
tagttcgctt tggaaactgt caaacttgag tgcagaaggg gagagtggaa ttccatgtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagata tatggaggaa caccggtggc gaaagcggct ctctggtctg 720
taactgacgc tgaggctcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
acgccgtaaa cgatgagtgc taggtgttgg atcctttccg ggattcagtg ccgcagctaa 840
cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaac 885
Claims (4)
1.用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90，其特征在于，该菌的分类命名为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus )，保藏号为CGMCC No：3622。
2.如权利要求1所述用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90用于制备发酵豆乳。
3.如权利要求1所述用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90用于制备发酵型即食豆干。
4.如权利要求1所述用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90用于制备豆乳干酪食品。
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