CN101891886B - 一种聚乙二醇ω-氨基酸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于高分子合成化学技术领域。具体涉及一种聚乙二醇ω-氨基酸及其制备方法。首先将聚乙二醇两端羟基氧化为羧基，然后通过亲核取代反应将端基为羧基的聚乙二醇接载到树脂上，游离的羧基通过甲酯进行保护。将一端甲酯保护的双羧基聚乙二醇从树脂上裂解下来后，对游离的羧基通过叠氮化反应、Curtius重排反应进行修饰得到叔丁基氧羰基保护的氨基。本发明克服了现有方法合成聚乙二醇ω-氨基酸存在的分离纯化繁杂的缺点，本发明是采用固相反应、叠氮化反应和Curtius重排反应，条件温和，合成路线简短，分离纯化简单，产率达70％以上。这种聚乙二醇ω-氨基酸可广泛应用于靶向药物合成，生物传感，免疫分析以及多肽合成等领域。
Description
技术领域
本发明属于高分子合成化学技术领域，涉及一种聚乙二醇ω-氨基酸及制备方法。
背景技术
聚乙二醇ω-氨基酸即聚乙二醇(PEG)链的两端分别是氨基和羧基，氨基和羧基可以分别与两个具有不同特性的分子连接。化合物通过与PEG共价后，可以获得PEG的一些优良特性。例如，作为生物材料，增加其化合物的表观分子量，可减少肾脏过滤，减少免疫系统的识别和酶的水解，延长化合物在体内的半衰期；同时增加化合物的水溶性，改变生物分配等。因此，聚乙二醇ω-氨基酸可广泛应用于靶向药物合成，生物传感，免疫分析以及多肽合成等领域。
目前，聚乙二醇ω-氨基酸多数是利用双官能团的引发剂选择性引发环氧乙烷开环聚合制备。如：Zhang S等人(Reactive and Functional Polymers 2003；56：17)利用氰化甲基钾引发环氧乙烷聚合得到聚乙二醇ω-氨基酸。M.D.本特利等人(CN 1374875(2002))利用一个带有可除去基团W且结构式为W-Poly-OH的中间体聚合物获得聚乙二醇ω-氨基酸，但该中间体W-Poly-OH仍需要环氧乙烷聚合得到。由于引发体系的小分子化合物常需要相当复杂的合成步骤，且在环氧乙烷的开环聚合过程中，会伴随有一定量的副产物，或者得到的聚乙二醇ω-氨基酸具有很宽的分子量单分散性。特别是其合成过程中使用易燃和高毒性的环氧乙烷，常常给聚乙二醇ω-氨基酸的制备带来危险。
为了克服上述方法存在的安全性问题，采用对PEG链两端的羟基进行修饰得到聚乙二醇ω-氨基酸的方法。Zalipsky等人(Polymeric Preprints，1986，27：1)将过量PEG与氯化亚砜反应得到一个末端羟基被氯代的PEG，再对单氯代PEG的两端分别进行修饰得到聚乙二醇ω-氨基酸。这个方法虽然条件温和，但由于PEG两端的羟基活性相同，即使严格控制反应的量，最终还是单氯代、双氯代及未氯代PEG的混合物，单氯代的产率并不高，且需要复杂分离的操作。因而，寻找一种简单且安全的制备聚乙二醇ω-氨基酸的方法具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提出一种聚乙二醇ω-氨基酸及其制备方法。
本发明中一种聚乙二醇ω-氨基酸，其化学结构式如下：
其中n＝2-43。
本发明提出的聚乙二醇ω-氨基酸，其制备方法包括如下步骤：
(1)α，ω-二羧基聚乙二醇的制备
将聚乙二醇(PEG)、溴化钠、2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO)溶于少量水中，冰浴下磁力搅拌溶解。加入次氯酸钠溶液，并用盐酸调节pH为10左右。其中，PEG、溴化钠、TEMPO、次氯酸钠的投料摩尔为1∶0.2∶0.01∶6。维持反应温度为0℃及pH为10，反应1～3h。调节pH为酸性，乙醚洗涤；再经二氯甲烷萃取，旋蒸，乙醚沉淀，真空干燥得α，ω-二羧基聚乙二醇。
(2)α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇的制备
将步骤1制备的α，ω-二羧基聚乙二醇溶解在二氯甲烷溶剂中，与2-氯三苯甲基氯树脂反应，α，ω-二羧基聚乙二醇一端的羧基与2-氯三苯甲基氯反应，通过碳氧单键连接到2-氯三苯甲基氯树脂上。通过称重法估算α，ω-二羧基聚乙二醇的上载率，计算公式为：
其中，Mw为α，ω-二羧基聚乙二醇的相对分子量。
2-氯三苯甲基氯与α，ω-二羧基聚乙二醇的物质的量比为1∶2.0～3.0。在耦合剂二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)作用下，接枝在树脂上的α，ω-二羧基聚乙二醇上游离的羧基与甲醇发生酯化反应；形成下面的树脂结构：
接枝到树脂上的α，ω-二羧基聚乙二醇与DCC和DMAP的物质的量的比为1.0∶1.1～2.0∶0.05～0.1。重复进行1～2次，每次反应时间为10～12h，孔雀石绿显色试验监测反应进程。反应结束后，经含1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液裂解，旋蒸，冰乙醚沉淀，真空干燥得α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇。未接枝到树脂上的α，ω-二羧基聚乙二醇在洗脱下来之后，经旋蒸，乙醚沉淀，真空干燥，即可回收重复使用。
(3)α-叠氮羰基-ω-甲酯基聚乙二醇的制备
将α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇溶于丙酮，冰浴下磁力搅拌溶解，加入三乙胺，其用量是原料α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇的物质的量的1.0～3.0倍，接着加入氯甲酸乙酯，其用量是α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇的物质的量的1.0～3.0倍；反应30min，再加入1.0～5.0M的叠氮化钠水溶液，其中叠氮化钠用量是α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇的物质的量的1.0～2.0倍；冰浴下继续反应1h；反应结束后旋蒸，加入少量冰水，二氯甲烷萃取，旋蒸，冰乙醚沉淀，真空干燥得α-叠氮羰基-ω-甲酯基聚乙二醇。
(4)聚乙二醇ω-氨基酸的制备
将α-叠氮羰基-ω-甲酯基聚乙二醇溶于少量二氯甲烷中，加入到过量叔丁醇中，80℃回流反应5～10h，旋蒸。
(5)聚乙二醇ω-氨基酸的纯化
用硅胶柱层析的方法对步骤(4)制备的聚乙二醇ω-氨基酸纯化，洗脱液配比为氯仿与甲醇体积比5∶1。
本发明提出了一种聚乙二醇ω-氨基酸及其制备方法，制备过程简单，条件温和，产率达70％以上。产品通过简单的萃取和柱层析的方法进行分离、纯化，避免了色谱法分离产品的复杂操作，经过红外光谱和核磁共振谱分析，证明得到了纯净的聚乙二醇ω-氨基酸。所合成的聚乙二醇ω-氨基酸结构新颖，可以分别在酸性和碱性条件下选择性脱除氨基和羧基的保护基团，然后分别与两个具有不同特性的大分子或化合物相连接，可广泛应用于靶向药物合成，生物传感，免疫分析以及多肽合成等领域。
附图说明：
图1为实施例1制备的聚乙二醇ω-氨基酸的红外光谱图；
图2为实施例1制备的聚乙二醇ω-氨基酸的核磁共振氢谱，溶剂为CDCl3。
具体实施方式
下面结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：
将6g聚乙二醇(PEG，分子量为1000)，0.12g溴化钠，0.01g TEMPO溶解到20mL水中，冰浴下磁力搅拌。量取26mL次氯酸钠溶液(有效氯＞10％)加入，并滴加4mol·L-1盐酸调节pH值在10左右。维持反应温度和pH值不变，反应1～2h。反应结束后，加入3mL乙醇终止反应。滴入4mol·L-1盐酸调节pH值小于2，加入乙醚洗涤3次。加入二氯甲烷萃取并取油相旋蒸，再经乙醚沉淀，真空干燥得α，ω-二羧基聚乙二醇5.93g，产率96.1％。
将2g二氯三苯甲基氯树脂(交联度1％DVB，取代度0.95mmol·g-1)在二氯甲烷中溶胀10min。将5g合成的α，ω-二羧基聚乙二醇溶解于少量二氯甲烷，并加入到树脂中。滴加2.5mL N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，室温下反应2.5h。反应结束后将树脂过滤，收集滤液并旋蒸，加入冰乙醚沉淀，回收得到未参加反应的α，ω-二羧基聚乙二醇。向树脂中加入二氯甲烷和甲醇的混合液(其体积比为17∶3)，并滴加2.5mL的DIEA，室温下继续反应30min。反应结束后，用二氯甲烷洗涤树脂3次。称重法估算α，ω-二羧基聚乙二醇的上载率为48％。向树脂中加入40mL二氯甲烷和甲醇的混合液(其体积比为17∶3)，加入280mg DCC和6mg DMAP，于室温下反应10-12h。过滤树脂并重复酯化步骤，反应10-12h。反应过程中取少量树脂，用甲醇洗涤，加入2mL孔雀石绿的乙醇溶液并滴加一滴三乙胺，反应2min，用乙醇洗涤树脂直至洗涤液为无色，观察树脂的颜色，若树脂为绿色则表示反应未完全，须继续反应；若树脂为黄色则表示反应完全。待反应完全后，树脂用二氯甲烷洗涤3次。向树脂加入30mL含1％三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷溶液，室温下裂解20min。滤除树脂，收集滤液并旋蒸，冰乙醚沉淀，真空干燥得α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇0.88g。
将得到的α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇溶于丙酮和少量水的混合溶液中，冰浴下磁力搅拌溶解。滴加0.18mL三乙胺和0.12mL氯甲酸乙酯，反应30min，然后加入82mg叠氮化钠的水溶液，继续反应1h。反应结束后旋蒸，加入少量冰水，二氯甲烷萃取，旋蒸，再经冰乙醚沉淀，真空干燥得α-叠氮羰基-ω-甲酯基聚乙二醇0.74g，产率82.1％。
将上一步的α-叠氮羰基-ω-甲酯基聚乙二醇溶于少量二氯甲烷中，磁力搅拌下滴加至50mL叔丁醇中，80℃回流反应5h。反应结束后，旋蒸，得粗产品。经硅胶柱层析分离，洗脱液为氯仿∶甲醇(5∶1，v/v)，得聚乙二醇ω-氨基酸0.68g，产率89.2％。
通过红外光谱和核磁共振波谱表征，有叔丁基氧羰基保护的氨基和甲酯基存在。
实施例2：
将10g聚乙二醇(PEG，分子量为2000)，100mg溴化钠，8mg TEMPO溶解到20mL中，冰浴下磁力搅拌。量取22mL次氯酸钠溶液(有效氯＞10％)加入，并滴加4mol·L-1盐酸调节pH值为10左右。维持反应温度和pH值不变，反应1-2h。反应结束后，加入3mL乙醇终止反应。滴入4mol·L-1盐酸调节pH值小于2，加入乙醚洗涤5次。加入二氯甲烷萃取并取油相旋蒸，再经乙醚沉淀，真空干燥得α，ω-二羧基聚乙二醇10.1g，产率99.2％。
将2g二氯三苯甲基氯树脂(交联度1％DVB，取代度0.95mmol/g)在二氯甲烷中溶胀10min。将10g合成的α，ω-二羧基聚乙二醇溶解于少量二氯甲烷，并加入到树脂中。滴加2.5mL DIEA，室温下反应2.5h。反应结束后将树脂过滤，收集滤液并旋蒸，加入冰乙醚沉淀，回收得到未参加反应的α，ω-二羧基聚乙二醇。向树脂中加入二氯甲烷和甲醇的混合液(体积比为17∶3)，并滴加2.5mLDIEA，室温下继续反应30min。称重法估算α，ω-二羧基聚乙二醇的上载率为30％。反应结束后，用二氯甲烷洗涤树脂3次。向树脂中加入40mL二氯甲烷和甲醇的混合液(体积比为17∶3)，加入18mg DCC和4mg的DMAP，于室温下反应10-12h。过滤树脂并重复酯化步骤，反应10-12h。反应过程中取少量树脂，用甲醇洗涤，加入2mL孔雀石绿的乙醇溶液并滴加一滴三乙胺，反应2min，用乙醇洗涤树脂直至洗涤液为无色，观察树脂的颜色，若树脂为绿色则表示反应未完全，须继续反应；若树脂为黄色则表示反应完全。待反应完全后，树脂用二氯甲烷洗涤3次。向树脂加入30mL 1％TFA的二氯甲烷溶液，室温下裂解20min。滤除树脂，收集滤液并旋蒸，冰乙醚沉淀，真空干燥得α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇1.05g。
将上一步的α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇溶于丙酮和少量水的混合溶液中，冰浴下磁力搅拌溶解。滴加0.11mL三乙胺和0.073mL氯甲酸乙酯，反应30min，然后加入50mg叠氮化钠的水溶液，继续反应1h。反应结束后旋蒸，加入少量冰水，二氯甲烷萃取，旋蒸，再经冰乙醚沉淀，真空干燥得α-叠氮羰基-ω-甲酯基聚乙二醇0.91g，产率85.6％。
将上一步的α-叠氮羰基-ω-甲酯基聚乙二醇溶于少量二氯甲烷中，磁力搅拌下滴加至50mL叔丁醇中，80℃回流反应5h。反应结束后，硅胶柱层析分离，洗脱液为氯仿∶甲醇(5∶1，v/v)，得聚乙二醇ω-氨基酸0.81g，产率87.7％。
通过红外光谱和核磁共振波谱表征，有叔丁基氧羰基保护的氨基和甲酯基存在。
Claims (4)
1.一种聚乙二醇ω-氨基酸，其特征在于，结构式如下：
其中n＝2-43。
2.权利要求1所述的聚乙二醇ω-氨基酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)α，ω-二羧基聚乙二醇通过固相反应对一端羧基进行甲酯保护，生成α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇；具体操作如下：
将α，ω-二羧基聚乙二醇溶解在二氯甲烷溶剂中，与2-氯三苯甲基氯树脂反应，α，ω-二羧基聚乙二醇一端的羧基与2-氯三苯甲基氯反应，通过碳氧单键连接到2-氯三苯甲基氯树脂上；在耦合剂二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶作用下，接枝在树脂上的α，ω-二羧基聚乙二醇上游离的羧基与甲醇发生酯化反应，产物经含1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液裂解后，旋蒸，冰乙醚沉淀，真空干燥得α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇；
所述的2-氯三苯甲基氯树脂，目数为100-200目，交联度为1％DVB；树脂的取代度为0.3mmol/g-1.2mmol/g；
所述的2-氯三苯甲基氯与α，ω-二羧基聚乙二醇的物质的量比为1∶2.0～3.0；接枝到树脂上的α，ω-二羧基聚乙二醇与二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的物质的量的比为1.0∶1.1～2.0∶0.05～0.1；
所述的接枝到树脂上的α，ω-二羧基聚乙二醇与甲醇的酯化反应重复进行1～2次，每次反应的时间为10～12h，以孔雀石绿显色试验监测反应进程；
(2)α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇与三乙胺和氯甲酸乙酯反应生成混合酸酐，再与叠氮化钠发生叠氮化反应，生成α-叠氮羰基-ω-甲酯基聚乙二醇；具体生成过程包括：
将步骤(1)得到的α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇溶于丙酮，冰浴下磁力搅拌溶解，加入三乙胺，其用量是原料α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇的物质的量的1.0～3.0倍，接着加入氯甲酸乙酯，其用量是α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇的物质的量的1.0～3.0倍；反应30min，再加入1.0～5.0M的叠氮化钠水溶液，其中叠氮化钠用量是α-羧基-ω-甲酯基聚乙二醇的物质的量的1.0～2.0倍；冰浴下继续反应1h；反应结束后旋蒸，加入冰水，二氯甲烷萃取，旋蒸，冰乙醚沉淀，真空干燥得α-叠氮羰基-ω-甲酯基聚乙二醇。
(3)α-叠氮羰基-ω-甲酯基聚乙二醇与叔丁醇发生Curtius重排反应，生成聚乙二醇ω-氨基酸；
(4)将聚乙二醇ω-氨基酸经硅胶柱层析分离纯化。
3.根据权利要求2所述的聚乙二醇ω-氨基酸的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的聚乙二醇ω-氨基酸的具体生成过程包括：
将步骤(2)得到的α-叠氮羰基-ω-甲酯基聚乙二醇溶于少量二氯甲烷中，加入到过量叔丁醇中，80℃回流反应5～10h，旋蒸。
4.根据权利要求2所述的聚乙二醇ω-氨基酸的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的聚乙二醇ω-氨基酸经硅胶柱层析的方法分离和纯化时，洗脱液配比为氯仿与甲醇体积比5∶1。
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