CN101888853B

CN101888853B - Mva用于治疗前列腺癌的用途

Info

Publication number: CN101888853B
Application number: CN2008801193517A
Authority: CN
Inventors: 阿兰·德尔凯尔; 雷纳·劳斯; 斯蒂法尼·曼德尔; 瑞安·B·朗特里; 法特玛·勒格兰德
Original assignee: BN ImmunoTherapeutics Inc
Current assignee: Bavarian Nordic AS
Priority date: 2007-10-18
Filing date: 2008-10-16
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2028-10-16
Also published as: KR20100109545A; EP2207564B1; EP2207564A1; US20110008386A1; CA2702586C; KR20160065985A; JP2011500718A; AU2008312444A1; CA2702586A1; US8377688B2; NZ584042A; DK2207564T3; WO2009052328A1; US20090104225A1; IL204541A; US7867483B2; IL204541A0; CN101888853A; KR101648087B1; ES2608604T3

Abstract

本发明涉及用于使用编码肿瘤相关抗原(诸如PSA和PAP)的重组MVA病毒来预防和治疗癌症的组合物、试剂盒、和方法。重组MVA病毒能诱导B和T细胞应答。所述重组MVA病毒可以在紫杉烷之前、同时、或之后施用。

Description

MVA用于治疗前列腺癌的用途

发明领域

本发明涉及使用编码肿瘤相关抗原(特别是前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP))的MVA病毒来预防和治疗癌症(特别是前列腺癌)。

发明背景

改良痘苗安卡拉(Modified Vaccinia Ankara，MVA)病毒与痘苗病毒(vaccinia virus)，即痘病毒科(Poxviridae)中的正痘病毒属(Orthopoxvirus)的一个成员有关。MVA是通过痘苗病毒安卡拉株(CVA)在鸡胚成纤维细胞上连续传516代生成的(参见综述Mayr，A.，et al.Infection 3：6-14(1975))。作为这些长期传代的结果，所得MVA病毒的基因组中删除了其基因组序列的约31kb，而且因此记载为在复制方面宿主细胞高度受限于鸟类细胞(Meyer，H.et al.，J.Gen.Virol.72：1031-1038(1991))。在多种动物模型中显示了所得MVA是显著无毒力的(Mayr，A.& Danner，K.，Dev.Biol.Stand.41：225-34(1978))。另外，已经在临床试验中作为针对人天花病来免疫的疫苗测试了此MVA株(Mayr etal.，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167：375-390(1987)；Stickl et al.，Dtsch.med.Wschr.99：2386-2392(1974))。这些研究涉及120,000人以上，包括高风险患者，而且证明了，与基于痘苗的疫苗相比，MVA具有降低的毒力或传染性，同时它诱导优良的、特异性的免疫应答。在随后的几十年里，MVA被改造成用作病毒载体(用于重组基因表达)或重组疫苗(Sutter，G.et al.，Vaccine 12：1032-40(1994))。

尽管Mayr等人在二十世纪七十年代里证明了MVA在人和哺乳动物中是高度减毒和无毒力的，某些调查人员报告了MVA在哺乳动物和人细胞系中不是完全减毒的，因为在这些细胞中可存在残余复制(Blanchard et al.，J GenVirol 79：1159-1167(1998)；Carroll & Moss，Virology 238：198-211(1997)；Altenberger，U.S.Pat.No.5,185,146；Ambrosini et al.，J Neurosci Res 55(5)：569(1999))。假设这些出版物中报告的结果是用MVA的各种已知株获得的，因为所使用的病毒在它们的特性方面，特别是在它们在各种细胞系中的生长行为方面是本质上不同的。出于各种原因，包括与在人类中使用有关的安全考虑，此类残余复制是不希望有的。

具有增强的安全性特征、用于开发更安全的产品(诸如疫苗或药品)的MVA株已有记载。参见U.S.Pat.Nos.6,761,893和6,193,752。此类株能够在非人细胞和细胞系中，尤其在鸡胚成纤维细胞(CEF)中生殖性复制，但是不能在已知容许已知痘苗株复制的某些人细胞系中生殖性复制。这些细胞系包括人角质形成细胞细胞系HaCat(Boukamp et al.J Cell Biol 106(3)：761-71(1988))、人子宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC No.CCL-2)、人胚肾细胞系293(ECACC No.85120602)、和人骨骨肉瘤细胞系143B(ECACC No.91112502)。此类病毒株也不能在体内生殖性复制，例如在某些小鼠品系中，诸如转基因小鼠模型AGR 129中，该模型是重度免疫受损的且对复制型病毒高度易感的。参见U.S.Pat.Nos.6,761,893。一种这样的MVA株及其衍生物和重组体，称作

已有记载。参见U.S.Pat.Nos.6,761,893和6,193,752。

MVA和

已经各自被改造成用作病毒载体(用于重组基因表达)或重组疫苗。参见例如Sutter，G.et al.，Vaccine 12：1032-40(1994)；U.S.Pat.Nos.6,761,893和6,193,752。

癌症相关疾病是全世界死亡率和发病率的一项首要原因。例如，仅在美国，估计六个人中有一个罹患前列腺癌。此外，尸检研究显示已知显著比例的男性人群早在30岁就携带该疾病，尽管处于其最早的非恶性阶段。参见例如Taichman et al.，JCI 117(9)：2351-2361(2007)；Webster et al.，J.Clin.Oncol.23：8262-8269(2005)。癌症免疫疗法的新近办法包括疫苗接种肿瘤相关抗原。在某些情况中，此类办法包括使用投递系统来促进宿主对肿瘤相关抗原的免疫应答。此类投递系统包括重组病毒载体，以及基于细胞的疗法。参见例如Harrop et al.，Front.Biosci.11：804-817(2006)；Arlen et al.，Semin.Oncol.32：549-555(2005)；Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(suppl.2)：14567-14571(2004)。MVA已经在转移性结肠直肠癌、转移性肾癌和激素不应性前列腺癌患者的临床试验中用作5T4癌胚抗原的疫苗佐剂。Amato，RJ.，Expert Opin.Biol.Ther.7(9)：1463-1469(2007)。

在已经的肿瘤相关抗原中有前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)。参见例如Taichman et al.，JCI 117(9)：2351-2361(2007)；Webster et al.，J.Clin.Oncol.23：8262-8269(2005)。PSA是由前列腺生成的，而且以升高的量见于具有前列腺癌、良性前列腺增生、或前列腺感染或炎症的男性的血液中。PSA已经被鉴定为癌症治疗的由细胞介导的免疫疗法办法的靶物。参见例如McNeel，D.G.，Curr.Opin.Urol.17：175-181(2007)；Nelson W.G.，Curr.Opin.Urol.17：157-167(2007)。PAP是一种在血液中测量到的酶，其水平在具有已经侵入或转移别处的前列腺癌的患者中升高。除非肿瘤已经或是经由局限性侵入或是经由远距离转移而扩散到解剖学上的前列腺囊以外，否则PAP不会升高。因此，正在数项人疫苗试验中作为靶抗原调查这种前列腺肿瘤抗原，其中一些试验获得了临床好处的证据。参见例如McNeel，D.G.，Curr.Opin.Urol.17：175-181(2007)；Waeckerle-Men et al.，Cancer Immunol.Immunother.66：811-821(2006)；Machlenkin et al.Cancer Immunol Immunother.56(2)：217-226(2007)。

已经使用重组痘苗病毒、纯化的PAP、DNA疫苗、和加载有抗原的树突细胞生成了含有PAP的疫苗。Valone et al.，The Cancer Journal 7：Suppl2：S53-61(2001)；Fong et al.，J Immunol.2001 Dec 15；167(12)：7150-6；Fong etal.，J.Immunol.159(7)：3113-7(1997)；Johnson et al.，Vaccine 24(3)：293-303(2006)；Johnson et al.，Cancer Immunol Immunother.56(6)：885-95(2007)。在一项研究中，当将经PAP-GM-CSF脉冲的树突细胞注射入大鼠中时，没有检测到针对PAP的抗体(Valone et al.at S55)。在另一项研究中，施用含有编码大鼠PAP或人PAP的基因的重组痘苗病毒不生成可测量的针对大鼠或人PAP的抗体应答(Fong et al.(1997)at 3116-7)。在另一项研究中，在用hPAP蛋白质免疫的动物的血清中以及在接受编码人PAP痘苗病毒疫苗接种、接着接受hPAP蛋白质作为强化免疫接种的动物中能检测到PAP特异性IgG，但是在用编码人PAP的痘苗病毒免疫两次的动物中检测不到(Johnson et al.(2007)at 890)。

主动癌症免疫疗法依赖在癌症患者中对针对肿瘤细胞的免疫应答的诱导。对针对广泛肿瘤相关抗原(TAA)的适应性免疫的体液和细胞这两种成分的诱导及伴随的对先天性免疫的成分的激活对于主动免疫疗法产品的最大效能是至关重要的。具体而言，认为1型或Th1型适应性免疫(其以对生成抗原特异性IFNγ的细胞毒性T细胞(CD8T细胞)的诱导为特征)对于抗癌症免疫疗法是重要的。

尽管新近在癌症治疗中获得了进展，然而前列腺癌仍然是美国癌症患者死亡的第二位首要原因。如此，需要这样的治疗性办法，该方法通过靶向肿瘤生长和转移的多个方面来更好地减轻该疾病。

紫杉烷(诸如帕利他塞和多西他塞)已经作为化疗用于癌症患者。参见例如Tannock et al.，N.Engl.J.Med.351：1502-1512(2004)。使用紫杉烷的化疗已经与不同的肿瘤疫苗治疗组合，导致各种结果。参见Chu et al.，J.Immunotherapy 29：367-380(2006)；Machiels et al.，Cancer Res.61：3689-3697(2001)；Prell et al.，Cancer Immunol.Immunother.55：1285-1293(2006)；Arlen etal.，Clinical Breast Cancer 7：176-179(2006)；及Arlen et al.，Clinical Cancer Res.12：1260-1269(2006)。关于癌症疫苗与化疗的组合的综述参见Chong et al.，Expert Opin.Phamacother.6：1-8(2005)；Emens et al.，Endocrine-Related Cancer12：1-17(2005)；及McNeel，D.G.，Curr.Opin.Urol.17：175-181(2007)。

如上所述，本领域需要用于癌症治疗的试剂和方法。

发明概述

本发明涵盖用于预防癌症和治疗癌症(包括原发性肿瘤和癌症转移)患者的方法、试剂、和试剂盒。

本发明涵盖一种用于治疗人类癌症患者的方法，包括对患者施用一种重组MVA，其编码包含人前列腺特异性抗原(PSA)抗原的多肽和包含人前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原的多肽。在一个实施方案中，所述MVA是MVA-BN。在一个实施方案中，所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2。在一个实施方案中，所述PSA抗原和所述PAP抗原插入在MVA基因间区014L/015L中。在某些实施方案中，所述癌症是前列腺癌或前列腺癌转移。

在一个实施方案中，所述重组MVA是在破坏肿瘤剂量的紫杉烷之前施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在破坏肿瘤剂量的紫杉烷的同时施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在破坏肿瘤剂量的紫杉烷之后施用的。在优选的实施方案中，所述紫杉烷是多西他塞或帕利他塞。

本发明涵盖一种用于预防前列腺癌的试剂盒，包括：重组MVA，其编码包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及在检测到前列腺癌之前施用所述重组MVA的指令。

本发明涵盖用于治疗前列腺癌的试剂盒，包括：一种重组MVA，其编码包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及对前列腺癌患者施用所述重组MVA的指令。

本发明涵盖用于治疗癌症患者的试剂盒，包括：一种重组MVA，其编码包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及在用破坏肿瘤剂量的紫杉烷处理之前、同时、或之后施用所述重组MVA的指令。

本发明涵盖一种重组MVA病毒，其表达包含人PAP抗原的多肽。在一个实施方案中，所述MVA病毒包含SEQ ID NO：2。在一个实施方案中，所述MVA是MVA-BN。

本发明涵盖一种重组MVA病毒，其表达包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽。在一个实施方案中，所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQ IDNO：1。在一个实施方案中，所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQ ID NO：2。在一个实施方案中，所述MVA是MVA-BN。

本发明涵盖一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PAP抗原的多肽，其中所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PAP的B细胞和T细胞免疫应答。

本发明涵盖一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PAP抗原的多肽，其中所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PAP的抗体。在一个实施方案中，所述MVA病毒包含SEQ ID NO：2。

本发明涵盖一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽，其中所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PSA和PAP的B细胞和T细胞免疫应答。

附图简述

图1A-B。

基因组的示意图。1A显示的是

基因组中六个删除位点的位置：阴影区段和字母(A至O)鉴别HindIII限制酶消化片段，而且在箭头上显示了在

中所缺少的CVA序列的位置和大小。1B显示的是HindIII限制性片段(字母A至O)和用于生成MVA-BN-PRO的IGR014L/015L位点。

图2。MVA-BN-PRO病毒的示意概观。

基因组图(HindIII限制图，由字母A至O表示)，粗绘在基因间区014L/015L中克隆的重组插入物：PSA和PAP基因，各自在牛痘病毒ATI启动子(ATI)的控制下。

图3A-B。与MVA-BN-PRO一起温育的CT26细胞培养物的上清液中的PAP(A)和PSA(B)检测。用MVA-BN-PRO(正方形)或(三角形)以所示感染复数(MOI)感染密度为6×10⁵个细胞每孔(黑色正方形和三角形)或6E4细胞每孔(灰色正方形)的CT26细胞。24小时后，收获细胞上清液，并分别通过PAP酶测定法和PSA ELISA来测量PAP和PSA蛋白质水平。

图4A-B。用MVA-BN-PRO处理的小鼠中的抗PSA(A)和抗PAP(B)抗体应答。用MVA-BN-PRO(白色正方形)或

(黑色正方形)免疫动物三次(第1天、第15天和第29天)。在处理前、第14天、第28天、和第42天收集血液样品。滴度为O.D.值比背景(来自用TBS处理的动物的、相同稀释度的血清)高至少2倍的最后稀释度的倒数值。显示为零的滴度在所测试的最低血清稀释度(1∶50)呈阴性。

图5A-B。用MVA-BN-PRO处理的小鼠中的抗PSA和抗PAP T细胞应答。将来自用MVA-BN-PRO免疫的动物(A)和TBS对照动物(B)的脾细胞与所示浓度的来自PAP(灰色正方形)、PSA(白色正方形)或HER2(黑色正方形)序列的OPL一起温育。使用ImmunoSpot分选仪对指示IFN-γ生成T细胞的斑点计数。为每一个所测试的OPL浓度呈现了来自一式三份孔的均值和标准偏差。

图6A-B。CD4和CD8T细胞对由MVA-BN-PRO介导的T细胞应答的贡献。用MVA-BN-PRO免疫动物四次(第1天、第15天、第29天、和第49天)，并在最后一次处理后六天收集脾细胞，将消减了CD8的脾细胞(A)和消减了CD4的脾细胞(B)与所示浓度的来自PAP(灰色正方形)、PSA(白色正方形)或HER2(黑色正方形)序列的OPL一起温育。所述分析是如图5所述进行的。

图7A-F。用MVA-BN-PRO处理的小鼠中对肿瘤生长的预防。以3周时间间隔以所示TCID50的、在TBS中稀释的病毒处理动物3次。第三次处理后六周，用1×10⁵个表达PSA的E5肿瘤细胞皮内攻击动物。使用测径器每周两次测量肿瘤生长。如下计算肿瘤体积：(LxW²)/2。7A至7E：为每个处理组报告了各小鼠中的肿瘤生长。7F：为所有处理组报告了肿瘤大小均值和标准偏差。

图8。用MVA-BN-PRO处理的小鼠中对肿瘤生长的预防。两项分开的实验中第29天测量的比较。以2周时间间隔(灰色符号)用2×10⁶TCID₅₀的、在TBS中稀释的所示病毒处理动物三次。最后一次处理后两周，用1×10⁵个表达PSA的E5肿瘤细胞皮内攻击动物。使用测径器每周两次测量肿瘤生长。如下计算肿瘤体积：(LxW²)/2。点显示了每只动物在肿瘤植入后第29天的肿瘤体积。来自图7所述分开的实验的匹配组的数据以黑色符号呈现，供比较用。这里报告的这两项实验是在相似条件下进行的，除了处理时间间隔的长度(3周对2周时间间隔)和肿瘤细胞植入时间(第三次处理后六周对两周)。

图9A-F。用MVA-BN-PRO处理的小鼠中对肿瘤生长的治疗性遏制。BALB/c小鼠(每组10只动物)在第1天用E6细胞(id注射1×10⁵个细胞)攻击，并在第1天、第8天、和第15天用TBS(E)、

(5×10⁶或5×10⁷TCID₅₀；A和B)、或MVA-BN-PRO(5×10⁶或5×10⁷TCID₅₀；C和D)皮下处理。在第22天处死小鼠。小图A-E显示了各小鼠的肿瘤大小。小图F中描绘了每个组的肿瘤大小平均值和标准偏差。使用测径器每周两次测量肿瘤生长。如下计算肿瘤体积：(LxW²)/2。误差棒代表标准偏差(SD)。

图10。用MVA-BN-PRO处理的小鼠中对PAP阳性肿瘤生长的遏制。BALB/c小鼠(每组10只动物)在第1天用CT26-PAP(静脉内注射5×10⁵个细胞)攻击，并在第4天用TBS、MVA-BN(5×10⁷TCID₅₀)、或MVA-BN-PRO(2×10⁶和5×10⁷TCID₅₀)腹膜内处理。在第14天处死小鼠，并对它们的肺称重。数据点代表各小鼠的肺重量。水平棒指示每个组的肺重量均值。

图11。BALB/c或C57BL/6小鼠中诱导的抗PSA和抗PAP抗体应答。在第1天、第15天、和第29天用5×10⁷TCID₅₀的MVA-BN-PRO免疫雄性BALB/c和C57BL/6小鼠(每组5只动物)。在第42天收集血液样品，并对通过ELISA合并血清的连续稀释液分析抗PSA或抗PAP IgG的存在。滴度作为O.D.值比背景(定义为来自用TBS处理的动物的、相同稀释度的血清)高至少2倍的最后稀释度的倒数值来计算。滴度低于所测试的最低稀释度(＜125)的血清的数据点是任意放置在x轴上的，出于绘图目的，将x轴放置在比测定法的第一稀释度(62.5)低一个稀释度。

图12。用MVA-BN-PRO处理的患者中的T细胞应答。在处理前(基础)或MVA-BN-PRO处理后(TC3)收集来自患者J-D-1001血液的PBMC。将细胞与图上所示浓度的PSA蛋白质、PSA交叠肽文库(OPL)、PAP蛋白质、PAPOPL、自肿瘤相关抗原(TAA)衍生的MHC I型和II型肽集合或MVA-BN一起温育40小时。通过测量所分泌的IFN-γ的ELISpot来测定T细胞激活。对于每种刺激条件，结果表述成均值IFN-γ斑点形成细胞(SFC)每2×10⁵个PBMC。SFC值是自一式四份孔的均值减去背景而得来的。

发明详述

在一组体外和体内测定法中测试了表达人PSA和PAP抗原的重组MVA(MVA-BN-PRO)。分别使用PSA检测试剂盒和磷酸酶活性功能测定法评估了这两种由MVA-BN-PRO编码的前列腺特异性抗原(PSA和PAP)在与MVA-BN-PRO一起温育的真核细胞中的表达。使用ELISA和ELISpot测定法来监测用MVA-BN-PRO处理的小鼠中对抗PSA和抗PAP抗体及T细胞免疫应答的诱导。在PSA肿瘤模型中在预防设置和治疗设置两者中评估了MVA-BN-PRO的抗肿瘤活性。

这些研究证明了(i)在体外细胞对MVA-BN-PRO的摄取导致PAP和PSA两者以相似的量表达；(ii)用MVA-BN-PRO处理小鼠导致抗PSA和抗PAP体液免疫应答及Th1细胞免疫应答；(iii)用MVA-BN-PRO处理小鼠在预防和治疗两种设置中都抑制PSA(+)肿瘤生长；(iv)用MVA-BN-PRO处理小鼠在治疗设置中抑制PAP(+)肿瘤生长；(v)在人体中，MVA-BN-PRO处理提高抗PSA T细胞和抗PAP T细胞两者的水平；及(vi)MVA-BN-PRO处理在人体中导致针对其它肿瘤抗原的T细胞应答的扩散。如此，MVA-BN-PRO通过触发抗原特异性体液应答和细胞Th1型应答而激活免疫系统，这在体内导致针对表达PSA和PAP的肿瘤的显著治疗活性。因此，MVA-BN-PRO是人类中前列腺癌免疫疗法的有吸引力的疫苗候选物。

MVA-BN-PRO是能够诱导保护性抗肿瘤免疫力的有力免疫原，其在预防设置中预防肿瘤生长且还遏制已建立的肿瘤的生长。MVA-BN-PRO的预防性和治疗性抗肿瘤活性是由抗PSA特异性适应性免疫应答介导的。然而，适应性免疫应答是针对由MVA-BN-PRO编码的前列腺特异性抗原，PSA和PAP诱导的。伴随的对针对多种肿瘤抗原的适应性应答的激活使得MVA-BN-PRO能够更高效地抗击肿瘤和提高成功治疗癌症患者的潜力。

在一个实施方案中，本发明涵盖重组MVA病毒用于前列腺癌治疗的意图。所述重组MVA是通过将异源序列插入MVA病毒中而生成的。在本发明的实践中有用且已经依照布达佩斯条约的要求保藏的MVA病毒株的例子有MVA 572(1994年1月27日保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(EuropeanCollection of Animal Cell Cultures，ECACC)，Salisbury(UK)，保藏号ECACC94012707)和MVA 575(2000年12月7日保藏于ECACC 00120707)。别的例示性菌株有

(2000年8月30日保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)，编号V00083008)及其衍生物。

虽然

由于其较高的安全性(复制能力较低)是优选的，但是所有MVA都适合于本发明。依照本发明的一个实施方案，所述MVA株是及其衍生物。参见PCT/EP01/13628，通过述及收入本文。

在某些实施方案中，重组MVA表达肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，肿瘤相关抗原是PSA。在一个实施方案中，肿瘤相关抗原是PAP。在一个优选的实施方案中，所述MVA表达两种肿瘤相关抗原，优选PSA和PAP抗原。在一个实施方案中，所述两种肿瘤相关抗原包含核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。在一个实施方案中，所述两种肿瘤相关抗原是自包含核苷酸序列SEQ ID NO：3的盒表达的。

在其它实施方案中，所述肿瘤相关抗原被修饰成包括一种或多种外来T_H表位。如本文所述，此类癌症免疫治疗剂对于预防和/或治疗癌症(包括癌症转移)是有用的。本发明容许将此类药剂用于人和其它哺乳动物的引发/强化疫苗接种方案，包括免疫受损的患者；而且包括体液和细胞这两种免疫应答，诸如在先前存在的Th2环境中诱导Th1免疫应答。

术语“多肽”指两个或更多个通过肽键或经修饰肽键而彼此连接的氨基酸的聚合物。所述氨基酸可以是天然存在的以及非天然存在的，或者是天然存在氨基酸的化学类似物。该术语还指蛋白质，即如下的功能性生物分子，其包含至少一条多肽；当包含至少两条多肽时，这些可形成复合物，是共价连接的，或者可以是非共价连接的。蛋白质中的多肽可以是糖基化的和/或脂化的(lapidated)和/或包含辅基。

在人细胞系诸如细胞系HaCAT(Boukamp et al.1988，J Cell Biol 106(3)：761-71)或HeLa中术语“不能生殖性复制”在本申请中如WO 02/42480中所定义的那样使用。如此，在细胞系中“不能生殖性复制”的病毒为在所述细胞系中显示不到1的扩增速率的病毒。病毒的“扩增速率”指自受感染细胞生成的病毒(输出)对最初首先用于感染该细胞的量(输入)的比。输出和输入之间的比“1”定义如下的扩增状态，其中自受感染细胞生成的病毒的量与最初用于感染该细胞的量相同。依照本发明的一个实施方案，在人细胞系中“不能生殖性复制”的病毒可以在上述人细胞系HeLa、HaCat和143B任一中具有1.0(平均值)或更低、或甚至0.8(平均值)或更低的扩增速率。

在某些实施方案中，所述MVA是于2000年8月30日以编号V00083008保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)且记载于U.S.Pat.Nos.6,761,893和6,193,752的如那些专利出版物中所记载的，

不在细胞系293、143B、HeLa和HaCat中生殖性复制。具体而言，

在人胚肾细胞系293中展现出0.05-0.2的复制速率。在人骨骨肉瘤细胞系143B中，

展现出0.0-0.6的复制速率。

在人子宫颈腺癌细胞系HeLa中展现出0.04-0.8的复制速率，而在人角质形成细胞细胞系HaCat中展现出0.02-0.8的复制速率。

在非洲绿猴肾细胞(CV1：ATCC No.CCL-70)中具有0.01-0.06的复制速率。

的扩增速率在鸡胚成纤维细胞(CEF：原代培养物)中超出1，如U.S.Pat.Nos.6,761,893和6,193,752中所记载的。所述病毒能在CEF原代培养物中容易地繁殖和扩增，速率超出500。

在某些实施方案中，重组MVA是

的衍生物。此类“衍生物”包括展现与保藏株(ECACC No.V00083008)本质上相同的复制特征但在其基因组的一个或多个部分中展现差异的病毒。“衍生物”不必衍生自

与所述保藏病毒具有相同“复制特征”的病毒为与保藏株以相似的扩增速率在CEF细胞和细胞系HeLa、HaCat和143B中复制；且在体内显示相似的复制特征(如例如在AGR129转基因小鼠模型中所测定的)的病毒。

本发明涵盖具有MVA-BN的下列两种特性中的一项或两项的MVA病毒：

-能够在鸡胚成纤维细胞(CEF)中生殖性复制，但是不能在人角质形成细胞细胞系(HaCaT)、人胚肾细胞系(293)、人骨骨肉瘤细胞系(143B)、和人子宫颈腺癌细胞系(HeLa)中生殖性复制；和

-不能在能够生成成熟B和T细胞且因此是重度免疫受损的且对复制型病毒高度易感的小鼠模型中复制。

在某些实施方案中，所述MVA是含有与所述痘苗病毒异源的别的核苷酸序列的重组痘苗病毒。在某些此类实施方案中，所述异源序列编码诱导免疫系统产生应答的表位。如此，在某些实施方案中，使用所述重组MVA来针对包含所述表位的蛋白质或药剂进行疫苗接种。在一个优选的实施方案中，所述表位是肿瘤相关抗原，优选PSA或PAP。在一个实施方案中，所述PSA抗原包含序列SEQ ID NO：1。在一个实施方案中，所述PAP抗原包含序列SEQ IDNO：2。

在某些实施方案中，将异源核酸序列插入病毒基因组的非必需区域中。在某些那些实施方案中，将异源核酸序列插入在MVA基因组的天然存在删除位点处，如PCT/EP96/02926中所记载的。用于将异源序列插入痘病毒基因组中的方法是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，将异源核酸序列插入在MVA基因组的基因间区中，如以公布的美国专利申请20050244428中所记载的。在一个实施方案中，所述基因间区是IGR 014L/015L。

在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种药学可接受的和/或批准的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。此类添加剂包括例如但不限于水、盐水、甘油、乙醇、湿润剂或乳化剂、和pH缓冲物质。例示性的载体典型地是大的、缓慢代谢的分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集物、诸如此类。

为了制备疫苗，可以将MVA转变成生理学可接受形式。在某些实施方案中，此类制备基于在制备用于针对天花疫苗接种的痘病毒疫苗中的经验，如例如Stickl，H.et al.，Dtsch.med.Wschr.99：2386-2392(1974)中所记载的。

下文是一种例示性的制备。将纯化的病毒以在10mM Tris、140mMNaCl，pH7.4中配制成5×10⁸TCID₅₀/ml的滴度保存于-80℃。为了制备疫苗弹，在安瓿(优选玻璃安瓿)中在存在2％蛋白胨和1％人清蛋白的情况中在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冻干例如10²-10⁸个病毒颗粒。或者，可以通过逐步、冷冻-干燥配制剂中的病毒来制备疫苗弹。在某些实施方案中，所述配制剂含有别的添加剂，诸如甘露醇、右旋糖苷、糖、甘氨酸、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、或其它添加剂，诸如包括但不限于适合于体内施用的抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白质(例如人血清清蛋白)。然后将所述安瓿密封，而且可以于合适的温度(例如在4℃和室温之间)保存数月。然而，只要没有需要，所述安瓿优选保存于低于-20℃的稳定。

在涉及疫苗接种或治疗的各种实施方案中，将冻干物在0.1-0.5ml水溶液(优选生理盐水或Tris缓冲液)中溶解，并系统或局部施用，即通过胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、鼻内、皮内、或熟练从业人员已知的任何其它施用途径。施用模式、剂量、和施用次数的优化在本领域技术人员的能力和知识之内。

在某些实施方案中，减毒痘苗病毒株对于在免疫受损的动物(例如受SIV感染的猴(CD4＜400/μl血液))或免疫受损的人中诱导免疫应答是有用的。术语“免疫受损的”描述只展现不完全的免疫应答或在针对传染剂的防御中具有降低的效率的个体的免疫系统状态。

某些例示性肿瘤相关抗原

在某些实施方案中，在受试者中诱导针对细胞相关多肽抗原的免疫应答。在某些此类实施方案中，细胞相关多肽抗原是肿瘤相关抗原。

在某些实施方案中，细胞相关多肽抗原是肿瘤相关抗原以外的自身蛋白质抗原(其涉及多种病理学过程)、或病毒抗原、或自细胞内寄生物或细菌衍生的抗原。在某些情况中，此类病原体相关抗原常常是相对较弱的免疫原(例如来自分支杆菌(诸如结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)以及来自原生动物(诸如疟原虫(Plasmodiumspp.)的抗原)。

众多肿瘤相关抗原是本领域已知的。例示性的肿瘤相关抗原包括但不限于5种α-还原酶、甲胎蛋白、AM-1、APC、April、BAGE、β-联蛋白、Bcl12、bcr-abl、CA-125、CASP-8/FLICE、组织蛋白酶、CD19、CD20、CD21、CD23、CD22、CD33 CD35、CD44、CD45、CD46、CD5、CD52、CD55、CD59、CDC27、CDK4、CEA、c-myc、Cox-2、DCC、DcR3、E6/E7、CGFR、EMBP、Dna78、法尼基转移酶、FGF8b、FGF8a、FLK-1/KDR、叶酸受体、G250、GAGE家族、胃泌素17、胃泌素释放激素、GD2/GD3/GM2、GnRH、GnTV、GP1、gp100/Pmel17、gp-100-in4、gp15、gp75/TRP-1、hCG、类肝素酶(heparanse)、Her2/neu、HMTV、Hsp70、hTERT、IGFR1、IL-13R、iNOS、Ki67、KIAA0205、K-ras、H-ras、N-ras、KSA、LKLR-FUT、MAGE家族、mammaglobin、MAP17、melan-A/MART-1、mesothelin、MIC A/B、MT-MMPs、粘蛋白、NY-ESO-1、骨粘连蛋白、p15、P170/MDR1、p53、p97/黑素运铁蛋白、PAI-1、PDGF、uPA、PRAME、probasin、progenipoientin、PSA、PAP、PSM、RAGE-1、Rb、RCAS1、SART-1、SSX家族、STAT3、STn、TAG-72、TGF-α、TGF-β、胸腺素-β-15、TNF-α、TP1、TRP-2、酪氨酸酶、VEGF、ZAG、p16INK4、和谷胱甘肽-S-转移酶。前列腺癌中的肿瘤相关抗原的具体例子包括但不限于PSA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PAP、和前列腺干细胞抗原(PSCA)。

PSA和PAP抗原

本发明涵盖PSA和PAP抗原，其是PSA和PAP的全长或片段。优选的是，所述PSA和PAP抗原是人的。在另一个实施方案中，所述PSA和/或PAP是大鼠或小鼠的。在一个优选的实施方案中，所述PSA和PAP抗原分别由核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2编码。

在一个实施方案中，所述PAP抗原是PAP片段。优选的片段包含人PAP的氨基酸181-95、112-120、133-152、155-163、173-192、199-213、228-242、248-257、299-307、或308-322。参见Waeckerle-Men et al.，Cancer Immunol.Immunother.55：1524-1533(2006)；Klyushnenkova et al.，Prostate67(10)：1019-28(2007)；Matsueda et al.，Clin Cancer Res.11(19 Pt 1)：6933-43(2005)；Harada et al.，Oncol Rep.12(3)：601-7(2004)；Machlenkin et al.，CancerRes.65(14)：6435-6442(2005)；及McNeel et al.，Cancer Res.61(13)：5161-7(2001)，通过述及收入本文。在一个实施方案中，所述多肽包含这些表位之一。在其它实施方案中，所述多肽包含这些表位中的2、3、4、5、6、7、8、9、或10种。本发明明确涵盖这些表位的每一种可能组合。

在某些实施方案中，所述PAP片段包含人PAP的25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、或375个连续氨基酸。可以使用本领域公知测定法对PAP片段测定表位的保留。参见例如Klyushnenkova etal.，Prostate 67(10)：1019-28(2007)；Matsueda et al.，Clin Cancer Res.11(19 Pt1)：6933-43(2005)，通过述及收入本文。

可以通过PCR或其它常规分子生物学技术来生成编码这些片段的DNA。

在一个实施方案中，所述PSA抗原是PSA片段。优选的片段包含人PSA的氨基酸16-24或154-163。参见Waeckerle-Men et al.，Cancer Immunol.Immunother.55：1524-1533(2006)；Matsueda et al.，Clin Cancer Res.11(19 Pt1)：6933-43(2005)，通过述及收入本文。在一个实施方案中，所述多肽包含这些表位之一。在其它实施方案中，所述多肽包含这两种表位。

可以使用本领域公知测定法(诸如表位扫描)对PSA片段测定表位的保留。在某些实施方案中，所述PSA片段包含人PSA的25、50、75、100、125、150、175、200、225、或250个连续氨基酸。

可以通过本领域公知方法来生成各种经修饰的PAP和PSA多肽抗原和方法。例如，可使用U.S.Pat.No.7,005,498和U.S.Pat.Pub.Nos.2004/0141958和2006/0008465中记载的方法，通过述及收入本文。

应当考虑下列参数：

1.已知的和预测的CTL表位；

2.与相关蛋白质的同源性；

3.半胱氨酸残基的保守性；

4.预测的环、α-螺旋和β-片层结构；

5.潜在的N-糖基化位点；

6.对暴露的和埋藏的氨基酸残基的预测；

7.结构域组织。

与其它相关蛋白质具有高度同源性的区域对于“总体”三级结构及因此对于抗体识别有可能在结构上是重要的，而具有低同源性的区域有可能能改变，结果只是结构的局部改变。

半胱氨酸残基常常涉及分子内二硫桥形成，而且如此涉及三级结构，不应当改变。预测形成α-螺旋或β-片层结构的区域应当避免作为外来表位的插入点，因为认为这些区域涉及蛋白质折叠。

若想要蛋白质甘露糖基化，则应当考虑潜在的N-糖基化位点。

(根据它们的疏水性特性)预测在分子内部的区域优选应当保留，因为它们可涉及折叠。相反，溶剂暴露区能充当用于插入模型TH表位P2和P30的候选位置。

最后，由于其对蛋白质结构和功能的相关性，应当考虑蛋白质的结构域排布(organization)。

通过免疫动物(诸如小鼠)以测定修饰对体液和细胞免疫应答的影响，可以测定修饰PSA和PAP的效果。

经过修饰的肿瘤相关抗原

在某些实施方案中，细胞相关多肽抗原是经过修饰的，使得在与APC表面上的MHC I型分子结合而呈递时，针对呈递表位的细胞的CTL应答得到诱导，所述表位衍生自所述细胞表面上的多肽抗原。在某些此类实施方案中，至少一种第一外来T_H表位在被呈现时与APC表面上的MHC II型分子结合。在某些此类实施方案中，细胞相关抗原是肿瘤相关抗原。

能够呈递表位的例示性APC包括树突细胞和巨噬细胞。别的例示性APC包括任何胞饮或吞噬APC，其能够同时呈递1)结合至MHC I型分子的CTL表位和2)结合至MHC II型分子的T_H表位。

在某些实施方案中，对PSA和/或PAP进行修饰，使得在对受试者施用后，主要与PSA和/或PAP起反应的多克隆抗体得到引发。此类抗体能攻击和消除肿瘤细胞以及预防转移细胞发展成转移。这种抗肿瘤效应的效应器机制会是经由补体和抗体依赖性细胞的细胞毒性介导的。另外，所诱导的抗体还能经由抑制受体的生长因子依赖性寡-二聚化和内在化来抑制癌细胞生长。在某些实施方案中，此类经修饰PSA和/或PAP多肽抗原能诱导针对已知的和/或预测的、由肿瘤细胞展示的PSA和/或PAP表位的CTL应答。在一个优选的实施方案中，所述PSA和PAP抗原诱导针对这些抗原的B细胞和T细胞应答。

在某些实施方案中，经修饰的PSA和/或PAP多肽抗原包含细胞相关多肽抗原的CTL表位和变异，其中所述变异包含外来T_H表位的至少一种CTL表位。包含至少一种CTL表位的某些此类经修饰PSA和/或PAP多肽抗原和包含外来T_H表位的至少一种CTL表位的变异及其生成方法记载于U.S.Pat.No.7,005,498和U.S.Pat.Pub.Nos.2004/0141958和2006/0008465。

在某些实施方案中，外来T_H本文是天然存在的“混杂”T细胞表位。此类混杂T细胞表位在动物物种或动物群体的大比例的个体中是有活性的。在某些实施方案中，疫苗包含此类混杂T细胞表位。在某些此类实施方案中，混杂T细胞表位的使用降低对同一疫苗中有很大数目的不同CTL表位的需要。例示性的混杂T细胞表位包括但不限于来自破伤风毒素(包括但不限于P2和P30表位(Panina-Bordignon et al.，1989))、白喉毒素、流感病毒血凝素(HA)、和镰状疟原虫(P.falciparum)CS抗原的表位。

别的混杂T细胞表位包括能够结合大比例的由不同HLA-DR编码的HLA-DR分子的肽。参见例如WO 98/23635(Frazer IH et al.，assigned to TheUniversity of Queensland)；Southwood S et.al，J.Immunol.160：3363-3373(1998)；Sinigaglia F et al.，Nature 336：778780(1988)；Rammensee HG et al.，Immunogenetics 41(4)：178-228(1995)；Chicz RM et al.，J.Exp.Med 178：27-47(1993)；Hammer J et al.，Cell 74：197-203(1993)；及Falk K et al.，Immunogenetics 39：230-242(1994)。后一篇参考文献还涉及HLA-DQ和-DP配体。这些参考文献中所列出的所有表位作为如本文所描述的候选天然表位是相关的，正如与这些共享共同基序的表位。

在某些其它实施方案中，所述混杂T细胞表位是人工T细胞表位，其能够结合大比例的单元型(haplotype)。在某些此类实施方案中，所述人工T细胞表位是泛DR表位肽(“PADRE”)，如WO 95/07707和相应的论文Alexander J et al.，Immunity 1：751-761(1994)中所记载的。

重组MVA

本发明涵盖表达包含PAP抗原的多肽的重组MVA病毒。优选的是，MVA病毒表达人PAP抗原。在一个实施方案中，所述MVA病毒表达大鼠或小鼠PAP抗原。在一个实施方案中，MVA病毒编码全长PAP抗原。在一个优选的实施方案中，所述MVA包含核苷酸序列SEQ ID NO：2。

在另一个实施方案中，所述MVA编码PAP片段。可以使用本领域公知测定法对PAP片段测定表位的保留。参见例如Klyushnenkova et al.，Prostate67(10)：1019-28(2007)；Matsueda et al.，Clin Cancer Res.11(19 Pt 1)：6933-43(2005)；Machlenkin et al.，Cancer Res.65(14)：6435-6442(2005)，通过述及收入本文。在某些实施方案中，所述PAP片段包含人PAP的25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、或375个连续氨基酸。

在优选的实施方案中，所述MVA编码包含人PAP氨基酸81-95、112-120、133-152、155-163、173-192、199-213、228-242、248-257、299-307、或308-322的多肽。参见Waeckerle-Men et al.，Cancer Immunol.Immunother.55：1524-1533(2006)；Klyushnenkova et al.，Prostate 67(10)：1019-28(2007)；Matsueda et al.，Clin Cancer Res.11(19 Pt 1)：6933-43(2005)；Harada et al.，Oncol Rep.12(3)：601-7(2004)；Machlenkin et al.，Cancer Res.65(14)：6435-6442(2005)；及McNeel et al.，Cancer Res.61(13)：5161-7(2001)，通过述及收入本文。在一个实施方案中，所述多肽包含这些表位之一。在其它实施方案中，所述多肽包含这些表位中的2、3、4、5、6、7、8、9、或10种。本发明明确涵盖这些表位的每一种可能组合。

本发明涵盖表达包含PSA抗原的多肽的重组MVA病毒和表达包含PSA抗原的多肽及包含PAP抗原的多肽的重组MVA病毒。优选的是，MVA病毒表达人PSA抗原。在一个实施方案中，所述MVA病毒表达大鼠或小鼠PSA抗原。在一个实施方案中，MVA病毒编码全长PSA抗原。在一个优选的实施方案中，所述MVA包含核苷酸序列SEQ ID NO：1。

在另一个实施方案中，所述MVA编码PSA片段。可以使用本领域公知测定法对PSA片段测定表位的保留。在某些实施方案中，所述PSA片段包含人PSA的25、50、75、100、125、150、175、200、225、或250个连续氨基酸。

在优选的实施方案中，所述MVA编码包含人PSA氨基酸16-24或154-163的多肽。参见Waeckerle-Men et al.，Cancer Immunol.Immunother.55：1524-1533(2006)；Matsueda et al.，Clin Cancer Res.11(19 Pt 1)：6933-43(2005)，通过述及收入本文。在一个实施方案中，所述多肽包含这些表位之一。在其它实施方案中，所述多肽包含这两种表位。

所述重组MVA病毒可以在免疫原性组合物中使用，用于在对宿主施用时诱导针对PAP和/或PSA的B细胞和T细胞免疫应答。在一个优选的实施方案中，所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PAP和/或PSA的抗体。所述免疫原性组合物可含有佐剂、稀释剂和/或稳定剂。此类添加剂包括例如但不限于水、盐水、甘油、乙醇、湿润剂或乳化剂、和pH缓冲物质。

在一个实施方案中，所述MVA是

在一个非限制性实施方案中，如下构建包含肿瘤相关抗原的重组MVA，例如MVA-BN-PRO，其编码PSA和PAP两种抗原。最初的病毒原种是使用允许复制的细胞类型(例如CEF细胞)在细胞培养物中通过重组生成的。将细胞既用减毒的痘苗病毒(例如

)接种，又用编码肿瘤相关抗原(例如PSA或PAP)序列和病毒基因组侧翼区的重组质粒(例如pBN217)转染。在一个非限制性实施方案中，所述质粒pBN217含有也在

中存在的序列(014L和015L可读框)。将所述PSA和PAP cDNA序列插入在所述

序列之间，以容许重组入

病毒基因组中。在某些实施方案中，所述质粒还含有包含一种或多种选择基因的选择盒，以容许在CEF细胞中选择重组构建物。

同时感染和转染培养物容许在病毒基因组和重组质粒之间发生同源重组。然后分离携带插入物的病毒，表征，并制备病毒原种。在某些实施方案中，在没有选择的情况中在CEF细胞培养物中将病毒传代，以容许编码选择基因(例如gpt和红色荧光蛋白(RFP))的区域丢失。

治疗方法

具有由过表达肿瘤相关抗原(诸如PSA和/或PAP)的细胞介导的癌症的患者可以用编码一种或多种此类抗原的重组MVA来治疗。在一个优选的实施方案中，所述MVA是在一个特别优选的实施方案中，所述MVA编码包含核苷酸序列SEQ ID NO：1的多肽和包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的第二多肽。

所述癌症优选是前列腺癌。在一个实施方案中，所述癌症是转移性前列腺癌。所述癌症患者可以是任何哺乳动物，包括小鼠或大鼠。优选的是，所述癌症患者是灵长类动物，最优选是人。

所述编码一种或多种肿瘤相关抗原(例如PSA或PAP)的重组MVA可以系统或局部施用，即通过胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、鼻内、皮内、或熟练从业人员已知的任何其它施用途径。

在一个实施方案中，给患者施用10⁵-10¹⁰TCID₅₀的所述重组MVA。优选的是，给患者施用10⁷-10¹⁰TCID₅₀的所述重组MVA。最优选的是，给患者施用10⁸-10¹⁰TCID₅₀的所述重组MVA。最优选的是，给患者施用10⁸-10⁹或10⁹-10¹⁰TCID₅₀的所述重组MVA。优选的是，以1×10⁸、2×10⁸、或4×10⁸TCID₅₀的剂量给患者施用所述重组MVA。

可以一次性地或在多个时间施用所述重组MVA。在某些实施方案中，所述重组MVA施用两次、三次、四次、或五次。优选的是，所述重组MVA给予三次。最优选的是，以四周时间间隔给予三次。各施用之间的间隔优选是1-4周、1-8周、1-16周、和1-52周。在一个实施方案中，所述重组MVA在第0天施用，并在第8天和第15天再次施用。在一个优选的实施方案中，为后续施用扩大剂量。

在一个特别优选的实施方案中，以四周时间间隔给予三次1×10⁸、2×10⁸、和4×10⁸TCID₅₀。给予多剂重组MVA的基本原理基于小鼠中显示强化处理显著提高抗PSA和抗PAP免疫应答的临床前免疫原性数据。考虑到人中的巨大免疫学多态性，给予三剂或更多剂能确保每一名个体都能达到最大免疫应答。

在一个实施方案中，抗PSA和/或抗PAP抗体应答。在一个实施方案中，用重组MVA处理诱导抗PSA和/或抗PAP T细胞免疫应答。在一个实施方案中，用重组MVA处理诱导抗PSA和/或抗PAP抗体及T细胞免疫应答。

在一个实施方案中，用重组MVA处理诱导针对其它肿瘤抗原的T细胞应答的扩散。

在一个实施方案中，用重组MVA处理在预防性和/或治疗性设置中抑制PSA(+)肿瘤生长。在一个实施方案中，用重组MVA处理在预防性和/或治疗性设置中抑制PAP(+)肿瘤生长。在一个实施方案中，用重组MVA处理在预防性和/或治疗性设置中抑制PSA(+)和PAP(+)肿瘤生长。

与细胞毒剂的组合疗法

具有由过表达肿瘤相关抗原(诸如PSA和/或PAP)的细胞介导的癌症的患者可以通过编码一种或多种此类抗原的重组MVA与紫杉烷的组合来治疗。在亚破坏肿瘤剂量展现免疫调控活性的细胞毒剂对疫苗效能会是有益的。在破坏肿瘤剂量(高剂量)时，这些药剂在重组MVA处理同时、之前、或之后的使用可优于任一单独的处理。

在一个实施方案中，所述紫杉烷是多西他塞(docetaxel)。在另一个实施方案中，所述紫杉烷是帕利他塞(paclitaxel)。所述紫杉烷优选以一个破坏肿瘤剂量施用。一个“破坏肿瘤剂量”的多西他塞是至少50mg/m²。优选的是，所述破坏肿瘤剂量的多西他塞是75-100mg/m²，其对应于大约25-33mg/kg的剂量。一个“破坏肿瘤剂量”的帕利他塞是至少90mg/m²。优选的是，所述破坏肿瘤剂量的帕利他塞是135-175mg/m²。一个“亚破坏肿瘤剂量”的紫杉烷是低于破坏肿瘤剂量的剂量。所述紫杉烷可以通过熟练技术人员已知的任何手段来施用，例如静脉内。

在一个实施方案中，所述紫杉烷和编码包含前列腺肿瘤特异性抗原的多肽的MVA是同时施用的。

在一个实施方案中，所述紫杉烷是在所述重组MVA之前施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷施用的6个月内施用的。在某些实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷后3个月内、2个月内、或1个月内施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷后21天内施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷后14天内施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷后7天内施用的。通常，所述重组MVA是在用所述紫杉烷处理后至少2天施用的。

在一个实施方案中，所述紫杉烷是在所述重组MVA之后施用的。通常，所述重组MVA是在用所述紫杉烷处理前至少1周施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷前不到2年施用的。在某些实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷前不到1年、不到6个月、或不到3个月施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷前1-26周施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷前1-9周施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷前1-3周施用的。

在某些实施方案中，所述紫杉烷是在所述重组MVA之前及之后施用的。在其它实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷之前及之后施用的。所述重组MVA和所述紫杉烷的施用可以是单次施用或多次施用。例如，所述施用可相隔1、2、3、4、5、或6周。

试剂盒

本发明涵盖包含重组MVA的试剂盒。所述重组MVA可以装在管形瓶或容器中。在一个实施方案中，所述重组MVA编码PAP抗原。在一个实施方案中，所述重组MVA编码包含PSA抗原的多肽。在一个实施方案中，所述重组MVA编码包含PSA抗原的多肽和包含PAP抗原的多肽。在各种实施方案中，用于疫苗接种的试剂盒在第一管形瓶或容器中装有用于第一次疫苗接种(“引发”)的重组MVA且在第二或第三管形瓶或容器中装有用于第二或第三疫苗接种(“强化”)的重组MVA。

在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和为预防前列腺癌而施用所述重组MVA的指令。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和在检测到一种或多种前列腺肿瘤相关标志物升高后为预防前列腺癌而施用所述重组MVA的指令。在一个优选的实施方案中，所述指令可指示在确定循环中的PSA水平升高后为预防前列腺癌而要施用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示为预防前列腺癌而要对30岁以上的男性患者施用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示为预防前列腺癌而要对30岁以上、40岁以下的男性患者施用所述MVA。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和在40岁后为预防前列腺癌而施用所述重组MVA的指令。

在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和为预防前列腺癌转移而施用所述重组MVA的指令。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和在检测到前列腺肿瘤细胞相关标志物升高后为预防前列腺癌转移而施用所述重组MVA的指令。在一个优选的实施方案中，所述指令可指示在确定循环中的PSA水平升高后、尽管没有可检测的原发瘤的情况下，为预防前列腺癌转移而施用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示为预防前列腺癌转移而要对30岁以上的男性患者施用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示为预防前列腺癌转移而要对30岁以上、40岁以下的男性患者施用所述MVA。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和为预防前列腺癌转移而在40岁后施用所述重组MVA的指令。

在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和为治疗前列腺癌而施用所述重组MVA的指令。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和在检测到一种或多种前列腺肿瘤相关标志物升高后为治疗前列腺癌而施用所述重组MVA的指令。在一个优选的实施方案中，所述指令可指示在确定循环中的PSA水平升高后为治疗前列腺癌而要施用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示为治疗前列腺癌而要对30岁以上的男性患者施用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示为治疗前列腺癌而要对30岁以上、40岁以下的男性患者施用MVA。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和为治疗前列腺癌而在40岁后施用所述重组MVA的指令。

在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和在施用破坏肿瘤剂量的紫杉烷前施用所述重组MVA的指令。所述指令可指示要在紫杉烷施用前6个月和1周之间的任何时间点施用所述MVA。在优选的实施方案中，所述指令指示要在紫杉烷施用前3个月和1周、六周和1周、1个月和1周、3周和1周、及2周和1周之间的任何时间点施用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示要在紫杉烷施用前1周和0天之间的任何时间点施用所述MVA。

所述试剂盒也可装有重组MVA和在施用破坏肿瘤剂量的紫杉烷的同时施用所述重组MVA的指令。

所述试剂盒也可装有重组MVA和在施用破坏肿瘤剂量的紫杉烷后施用所述重组MVA的指令。所述指令可指示要在紫杉烷施用后1天和6个月之间的任何时间点施用所述MVA。在优选的实施方案中，所述指令指示要在紫杉烷施用后2天和1周、2天和2周、2天和3周、2天和1个月、2天和2个月、及2天和3个月、及2天和6个月之间的任何时间点施用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示要在紫杉烷施用后0和2天之间的任何时间点施用所述MVA。

下文给出了实施例和参考文献以更为详细地例示本发明，但是本发明的范围不受这些实施例限制。所例示的论文中熟练技术人员想到的任何变化意图落在本发明的范围内。此外，参考所引用的参考文献能最彻底地理解说明书，通过述及将它们都完整收入本文。

实施例

实施例1：MVA-BN-PRO的构建和对受感染细胞中蛋白质表达的分析

为了开发前列腺癌疫苗，生成了编码人前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)的重组痘苗病毒载体，MVA-BN-PRO。重组痘苗病毒载体MVA-BN-PRO衍生自高度减毒的痘苗病毒株

(改良痘苗病毒安卡拉一Bavarian Nordic)。

高度适应了原代鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞，而且不在人细胞中生殖性复制。在人细胞中，病毒基因表达，但是不生成感染性病毒。

基因的起源

使用例行分子生物学技术，自购自Clontech(产品目录编号6410801)的人前列腺总RNA转录(逆转录)PSA基因和PAP cDNA。PSA是由前列腺生成的前列腺特异性抗原，而且以升高的量见于具有前列腺癌、良性前列腺增生、或前列腺感染或炎症的男性的血液中。PSA已经被鉴定为由细胞介导的免疫疗法办法的靶物。PAP(前列腺酸性磷酸酶)是一种在血液中测量到的酶，其水平在具有已经侵入或转移别处的前列腺癌的患者中升高。除非肿瘤已经扩散到解剖学上的前列腺囊以外，否则PAP不会升高。因此，当前在数项人疫苗试验中作为靶抗原调查这种前列腺肿瘤抗原，其中一些试验获得了临床好处的证据。

所得扩增的PSA和PAP cDNA的序列据证实与那些已发表的序列匹配。也就是说，下文显示了PSA cDNA(例如GenBank M26663.1 GI：618463；同义词：激肽释放酶3；KLK3；786bp等)和PAP cDNA基因的序列(GenBankM34840.1 GI：189620；同义词：PAP，ACP3，ACP-3；ACPP；1161bp)。

人PSA cDNA序列(与GenBank序列M26663.1具有99％同一性；粗体：位于第48位、第54位和第237位的三处沉默核苷酸替换，其不改变氨基酸序列)：

ATGTGGGTCCCGGTTGTCTTCCTCACCCTGTCCGTGACGTGGATTGGCGCTGCGCCCCTCATCCTGTCTCGGATTGTGGGAGGCTGGGAGTGCGAGAAGCATTCCCAACCCTGGCAGGTGCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGTCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCCCACACCCGCTCTACGATATGAGCCTCCTGAAGAATCGATTCCTCAGGCCAGGTGATGACTCCAGCCACGACCTCATGCTGCTCCGCCTGTCAGAGCCTGCCGAGCTCACGGATGCTGTGAAGGTCATGGACCTGCCCACCCAGGAGCCAGCACTGGGGACCACCTGCTACGCCTCAGGCTGGGGCAGCATTGAACCAGAGGAGTTCTTGACCCCAAAGAAACTTCAGTGTGTGGACCTCCATGTTATTTCCAATGACGTGTGTGCGCAAGTTCACCCTCAGAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGTGCTGGACGCTGGACAGGGGGCAAAAGCACCTGCTCGGGTGATTCTGGGGGCCCACTTGTCTGTAATGGTGTGCTTCAAGGTATCACGTCATGGGGCAGTGAACCATGTGCCCTGCCCGAAAGGCCTTCCCTGTACACCAAGGTGGTGCATTACCGGAAGTGGATCAAGGACACCATCGTGGCCAACCCCTGA(SEQ ID NO：1)

人PSA的氨基酸序列为：

MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVAS

RGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPH

PLYD

MSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASG

WGSI

EPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSG

GPLV

CNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID NO：3)。

人PAP cDNA序列(与GenBank序列M34840.1具有100％同一性)：

ATGAGAGCTGCACCCCTCCTCCTGGCCAGGGCAGCAAGCCTTAGCCTTGGCTTCTTGTTTCTGCTTTTTTTCTGGCTAGACCGAAGTGTACTAGCCAAGGAGTTGAAGTTTGTGACTTTGGTGTTTCGGCATGGAGACCGAAGTCCCATTGACACCTTTCCCACTGACCCCATAAAGGAATCCTCATGGCCACAAGGATTTGGCCAACTCACCCAGCTGGGCATGGAGCAGCATTATGAACTTGGAGAGTATATAAGAAAGAGATATAGAAAATTCTTGAATGAGTCCTATAAACATGAACAGGTTTATATTCGAAGCACAGACGTTGACCGGACTTTGATGAGTGCTATGACAAACCTGGCAGCCCTGTTTCCCCCAGAAGGTGTCAGCATCTGGAATCCTATCCTACTCTGGCAGCCCATCCCGGTGCACACAGTTCCTCTTTCTGAAGATCAGTTGCTATACCTGCCTTTCAGGAACTGCCCTCGTTTTCAAGAACTTGAGAGTGAGACTTTGAAATCAGAGGAATTCCAGAAGAGGCTGCACCCTTATAAGGATTTTATAGCTACCTTGGGAAAACTTTCAGGATTACATGGCCAGGACCTTTTTGGAATTTGGAGTAAAGTCTACGACCCTTTATATTGTGAGAGTGTTCACAATTTCACTTTACCCTCCTGGGCCACTGAGGACACCATGACTAAGTTGAGAGAATTGTCAGAATTGTCCCTCCTGTCCCTCTATGGAATTCACAAGCAGAAAGAGAAATCTAGGCTCCAAGGGGGTGTCCTGGTCAATGAAATCCTCAATCACATGAAGAGAGCAACTCAGATACCAAGCTACAAAAAACTTATCATGTATTCTGCGCATGACACTACTGTGAGTGGCCTACAGATGGCGCTAGATGTTTACAACGGACTCCTTCCTCCCTATGCTTCTTGCCACTTGACGGAATTGTACTTTGAGAAGGGGGAGTACTTTGTGGAGATGTACTATCGGAATGAGACGCAGCACGAGCCGTATCCCCTCATGCTACCTGGCTGCAGCCCTAGCTGTCCTCTGGAGAGGTTTGCTGAGCTGGTTGGCCCTGTGATCCCTCAAGACTGGTCCACGGAGTGTATGACCACAAACAGCCATCAAGGTACTGAGGACAGTACAGATTAG

(SEQ ID NO：2)

人PAP的氨基酸序列为：

MRAAPLLLARAASLSLGFLFLLFFWLDRSVLAKELKFVTLVFRH

GDRSPIDTFPTDPIKESSWPQGFGQLTQLGMEQHYELGEYIRKRYRKFLNESYK

HEQV

YIRSTDVDRTLMSAMTNLAALFPPEGVSIWNPILLWQPIPVHTVPLSEDQLLYL

PFRN

CPRFQELESETLKSEEFQKRLHPYKDFIATLGKLSGLHGQDLFGIWSKVYDPLY

CESV

HNFTLPSWATEDTMTKLRELSELSLLSLYGIHKQKEKSRLQGGVLVNEILNHMK

RATQ

IPSYKKLIMYSAHDTTVSGLQMALDVYNGLLPPYASCHLTELYFEKGEYFVEMY

YRNE

TQHEPYPLMLPGCSPSCPLERFAELVGPVIPQDWSTECMTTNSHQGTEDSTD

(SEQ ID NO：4)。

启动子的起源

牛痘病毒的A型包涵体启动子(ATI)，一种晚期启动子(下文所示)，以合成方式在pBluescript KS+质粒(Stratagene)中生成，切出并插入在PAP序列和PSA序列两种的前面。因此，PSA和PAP蛋白质应当与其它晚期基因一起表达，在DNA复制之后。

ATI启动子的序列：

5′-GTTTTGAATAAAATTTTTTTATAATAAATC(SEQ ID NO：5)

PSA/PAP-MVA-BN重组质粒的构建

为了将外来基因插入基因组中，可以使用靶向

基因组的特定区域，即删除位点或基因间(非编码)区的中间重组质粒。

中间pBNX128质粒含有来自014L和015L可读框(ORF)之间基因间(非编码)区(IGR)的侧翼区域的MVA DNA序列。可以将序列(例如PSA和PAPcDNA)插入在这些侧翼序列之间。然后，当质粒和两者在同一CEF细胞中存在时，014L/015L侧翼序列介导同源重组，介导质粒序列插入到

基因组的014L/015L基因间区中(图1A-B)。所插入序列中选择盒的存在容许对重组

病毒的正选择。

MVA-BN-PRO的生成

同时感染和转染培养物容许在病毒基因组和重组质粒之间发生同源重组。在选择性条件下的多次噬斑纯化后获得了含有PSA和PAP编码区和选择盒的重组痘苗载体，命名为MVA-mBN106A。在扩增和非选择性条件下进一步噬斑纯化后，分离缺少选择盒的重组痘苗病毒MVA-BN-PRO。

制备缺少选择盒的经噬斑纯化的病毒MVA-BN-PRO。此类制备涉及十二(12)次传代，包括四(4)次噬斑纯化。

通过DNA测序和PCR分析来验证MVA-BN-PRO原种中启动子-PSA-启动子-PAP序列的存在和亲本

病毒的缺失，并施用嵌套PCR来验证选择盒(gpt和RFP基因)的缺失。图2显示了MVA-BN-PRO基因组的简化示意图。

实施例2：用MVA-BN-PRO处理的细胞中的PSA和PAP共表达

在体外与MVA-BN-PRO一起温育的细胞中证明了由MVA-BN-PRO编码的两种前列腺特异性抗原(即人PSA和人PAP)的同时表达。将CT26，一种化学诱发的BALB/c小鼠结肠直肠癌(Brattain et al.，Cancer Research 40，2142-2146(1980))的培养物与MVA-BN-PRO一起温育，并对上清液分析重组PSA和PAP的存在。使用基于ELISA的PSA诊断试剂盒测量PSA，该试剂盒例行用于筛选人血清样品(人PSA ELISA试剂盒，Anogen，Ontario，Canada；PSA检测范围：2-80ng/mL)。使用磷酸盐活性的比色测定法(酸性磷酸酶测定法；PAP检测浓度：4-40ng/mL)经由其酶特性直接测量PAP。在以范围1-100的感染复数(MOI)添加MVA-BN-PRO后24小时收集的同一培养物上清液的等分试样中评估PSA和PAP。

如图3所示，这两种抗原都能在与MVA-BN-PRO一起温育的细胞的上清液中检测到。培养物中生成的重组PSA和PAP的量取决于实验中所使用的MVA-BN-PRO的量(MOI)和细胞的数目。相反，在单独的培养基中或与MOI匹配的

一起温育的对照培养物的上清液中检测不到PSA或指示PAP的磷酸酶活性。

使用每种测定法的参照标准图计算的PSA和PAP滴度揭示了与MVA-BN-PRO一起温育的细胞生成相似量的这两种抗原。事实上，当以1×10⁵个细胞每孔接种CT26并以MOI 10与MVA-BN-PRO一起温育48小时时，在培养物上清液中测量到1043ng/mL PSA和209ng/mL PAP。PSA和PAP序列插入

基因组的同一区域中，而且它们的表达是由位于每种序列上游的ATI启动子独立驱动的。这种插入物构造表现出赋予这两种重组抗原的最佳表达以适当的环境。总之，这些数据显示了

代表了用于多种转基因抗原(像PSA和PAP)的优良平衡的和伴随的表达的适当递送媒介。

实施例3：用MVA-BN-PRO处理的小鼠中对抗PAP和抗PSA免疫应答的诱导

在BALB/c小鼠中评估用MVA-BN-PRO处理后对抗PSA和抗PAP免疫应答的诱导。在这些研究中，评估了范围为2×10⁶至5×10⁷TCID50的多种剂量的MVA-BN-PRO。在每次处理前一天和最后一次处理后两周收集血液样品，并通过ELISA分析体液应答。最后一次处理后收集脾细胞，并通过ELISpot分析细胞应答。

对抗PSA和抗PAP抗体应答的诱导

在第1天、第15天和第29天(q2周x3)用5×10⁷TCID50的MVA-BN-PRO皮下处理BALB/c小鼠(每组5只动物)。用或配制缓冲液(TBS)处理对照动物。在处理前、第14天、第28天、和第42天收集血液样品。然后合并来自每个测试组小鼠的血清，并通过ELISA来分析。使用商品化的纯化的蛋白质(Meridian Life Sciences，Inc.，Saco，ME)作为包被到微量滴定板的孔上的靶抗原来评估对抗PSA和抗PAP抗体应答的诱导。如图4A和4B所示，在用MVA-BN-PRO处理的小鼠中检测到抗PSA和抗PAP抗体应答。检测到抗PSA抗体滴度要求施用至少两次，而且滴度在第三次MVA-BN-PRO处理后升高。一般而言，针对PAP的抗体应答是更加适度的，因为滴度总是低于那些针对PSA所诱导的。所观察到的针对PAP的低抗体应答可能是由于此蛋白质的弱B细胞抗原性特性。

对抗PSA和抗PAP T细胞应答的诱导

在第1天、第15天、第31天(q2周x3)用对照(TBS)、2×10⁶或5×10⁷TCID50的MVA-BN-PRO皮下处理BALB/c小鼠(每组5只动物)。在最后一次免疫接种后5天收集脾，并合并来自每个测试组的细胞悬浮液供分析用。通过测量体外抗原特异性再刺激后IFNγ生成的ELISpot来评估对T细胞应答的诱导。分开使用覆盖全长PSA或PAP氨基酸序列的和有11聚物交叠(OPL)的15聚物肽的文库来进行再刺激。如图5所示，在用PAP和PSA两种OPL再刺激后来自MVA-BN-PRO处理组的脾细胞中检测到抗原特异性T细胞应答，然而自人HER-2ecd序列衍生的对照OPL没有效果(图5A)。当用PSA、PAP或HER-2OPL再刺激细胞时，在用

(数据未显示)或TBS处理的组(图5)的小鼠中没有检测到T细胞应答。这些数据指示MVA-BN-PRO是有力的T细胞诱导物，因为无需离体扩增就能在脾细胞中直接检测到显著数目的抗原特异性T细胞。

在体外再刺激脾细胞之前消减T细胞子集群体后，检查CD4辅助T细胞和CD8细胞毒性T细胞对小鼠中用MVA-BN-PRO处理后诱导的抗PAP和PSA T细胞应答的贡献。如图6所示，在用PSA或PAP OPL再刺激后在消减了CD4和消减了CD8的这两种T细胞子集中都检测到T细胞应答。

总之，这些研究显示了用MVA-BN-PRO重复处理小鼠诱导宽的针对两种TAA的抗原特异性适应性免疫应答，其涉及抗体及CD4和CD8二者效应器细胞亚型。正如所预期的，抗体应答主要针对PSA，而PAP(已知的弱B细胞免疫原)只触发适度的抗体应答。因为PSA和PAP本质上以抗原呈递分子/肽复合物的形式作为T细胞靶物呈现在肿瘤细胞表面上，所以对免疫系统的细胞成分的激活是MVA-BN-PRO效能的一项关键要求。在用所有所测试的MVA-BN-PRO剂量处理的动物中诱导了针对这两种TAA的强CD4和CD8 T细胞应答。因此，MVA-BN-PRO具有介导对在其表面上呈递PSA和/或PAP肽的肿瘤细胞的消除的潜力。

实施例4：用MVA-BN-PRO处理的小鼠中的抗肿瘤活性

在预防性以及治疗性癌症肿瘤模型中评估了MVA-BN-PRO影响小鼠中PSA阳性肿瘤细胞生长的能力。数据显示了MVA-BN-PRO在这两种设置中都能抑制肿瘤生长。还有，MVA-BN-PRO能够在治疗性癌症肿瘤模型中抑制小鼠中PAP阳性肿瘤细胞生长。

用MVA-BN-PRO处理后对保护性抗原特异性适应性免疫力的诱导(预防性设置)

使用移植的E5细胞作为前列腺癌模型来评估MVA-BN-PRO预防肿瘤生长的能力。E5是RM11，即一种鼠前列腺肿瘤细胞系(Elzey et al.，Int.J Cancer15；94(6)：842-9(2001))的亚克隆，是用编码人PSA基因的重组DNA转染RM11后获得的。在此效能研究中，如上所述用MVA-BN-PRO免疫小鼠，即用TBS、

(5×10⁷TCID₅₀)或MVA-BN-PRO(2×10⁶、1×10⁷或5×10⁷TCID₅₀)以3周时间间隔免疫三次。然后通过在最后一次处理后六周皮内注射1×10⁵个E5细胞来用肿瘤考验小鼠。此后每周两次观察肿瘤生长，并测量生长中的实体瘤的大小。

如图7C至7E所示，用所有剂量的MVA-BN-PRO预处理的动物中的肿瘤生长比TBS对照组的肿瘤(图7A)慢，而且在研究结束时(第29天)对于所有所测试的剂量，＞50％的小鼠仍然没有肿瘤。相反，早在肿瘤攻击后第12天在TBS对照组中100％的小鼠中检测到可测量的肿瘤。在那天，在来自所有MVA-BN-PRO处理组的仅20％的小鼠中检测到可测量的肿瘤。在所有MVA-BN-PRO处理组和TBS对照组之间在自第12天起、贯穿整个研究的所有时间点，肿瘤大小均值的差异是统计学显著的(图7F)。

与TBS对照组相似，早在肿瘤考验前第12天在几乎每一只用

处理的小鼠(90％)中检测到可测量的肿瘤(图7B)。然而，在研究结束时，处理组中的2只小鼠(20％)没有肿瘤(第29天；一只小鼠贯穿整个研究仍然没有肿瘤，而且在其它小鼠中发生肿瘤消退)。还有，直到第22天，

处理组中的肿瘤生长比TBS对照组的肿瘤慢，而且这两组之间肿瘤大小均值在两个时间点达到统计学显著差异(第19天，p＝0.034和第22天，p＝0.019)。用

处理的小鼠中肿瘤生长的迟滞只是暂时的，因为在所有其它时间点在用TBS和

处理的小鼠中观察到相似的肿瘤大小均值(图7F)。

在重复实验中证实了上文所述由MVA-BN-PRO介导的抗肿瘤活性，其中用以2周时间间隔2×10⁶TCID₅₀的MVA-BN-PRO处理小鼠，然后在处理后两周用肿瘤细胞攻击。图8显示了肿瘤植入后第29天的数据，以及来自图7的、植入后同一天的匹配数据。在这两项实验中在用MVA-BN-PRO处理的小鼠中观察到可比的肿瘤生长迟滞。此外，在MVA-BN-PRO和TBS处理组之间以及在MVA-BN-PRO和

处理组之间达到肿瘤大小均值的统计学显著差异(分别为p＝0.03和p＝0.021)。在重复实验(数据未显示)中没有检测到图7中早期时间点时观察到的

的暂时效果。这些数据显示了用MVA-BN-PRO处理小鼠诱导抗原特异性适应性免疫应答和免疫记忆建立。当随后两至六周后用肿瘤细胞攻击小鼠时，唤起免疫记忆，并抑制肿瘤细胞生长。

用MVA-BN-PRO处理后对肿瘤的遏制(治疗性设置)

使用移植的E6细胞作为前列腺癌模型来评估MVA-BN-PRO遏制已建立肿瘤的能力。E6是RM11，即一种鼠前列腺肿瘤细胞系(Elzey et al.，2001)的亚克隆，是用编码人PSA基因的重组DNA转染RM11后获得的。E6是比上文所述预防性设置中所使用的E5低的PSA生成者。通过皮内注射1×10⁵个E6细胞并在同一天、然后在第8天和第15天用TBS、

或MVA-BN-PRO(5×10⁶或5×10⁷TCID₅₀)处理来用肿瘤攻击小鼠。此后每周两次观察肿瘤生长，并测量皮肤下的实体瘤大小。

如图9所示，用MVA-BN-PRO处理的动物中的肿瘤(图9C和9D)生长显著比用

(图9A和9B)或TBS(图9E)处理的动物中的肿瘤慢。在这两个MVA-BN-PRO处理组中，在50％的动物中观察到肿瘤大小稳定或消退。图9F显示了组间肿瘤大小均值的差异。用5×10⁶TCID₅₀MVA-BN-PRO处理的动物和TBS或

处理对照组之间平均肿瘤体积有统计学显著差异(分别为p＝0.014和p＝0.032)，而5×10⁷TCID₅₀MVA-BN-PRO处理组和TBS对照组之间没有达到统计学显著性(p＝0.07)。这些数据显示了用MVA-BN-PRO处理小鼠在治疗性背景中抑制小鼠中前列腺肿瘤生长。

使用稳定表达人PAP的CT26细胞在实验性肺转移模型中评估MVA-BN-PRO还遏制已建立的、表达PAP的肿瘤的能力。CT26是化学诱发的BALB/c小鼠的结肠直肠癌(Brattain et al.，1980)。在此模型中，将CT26-PAP细胞静脉内注射入BALB/c小鼠中，并在肿瘤结生长之处的肺中评估肿瘤负荷。在第1天用静脉内注射的CT26-PAP(5×10⁵)细胞攻击小鼠，并在第4天用单次注射TBS、MVA-BN(5×10⁷TCID₅₀)或MVA-BN-PRO(2×10⁶和5×10⁷TCID₅₀)腹膜内处理。然后在第14天处死小鼠，并对它们的肺称重。如图10所示，用5×10⁷TCID₅₀的MVA-BN-PRO处理的小鼠中的肿瘤负荷显著低于对照小鼠中的(p＜0.024)；这种抗肿瘤活性是剂量依赖性的，因为较低剂量的MVA-BN-PRO没有效果。此外，这种抗肿瘤活性最有可能是由PAP特异性免疫应答介导的，因为对照和MVA-BN处理组的小鼠中的肿瘤负荷没有变化。

这些数据证明了用MVA-BN-PRO处理小鼠抑制小鼠中已建立的PAP阳性肿瘤生长。如此，由MVA-BN-PRO编码的PSA和PAP这两种前列腺抗原对能够遏制PSA或PAP阳性肿瘤生长的保护性免疫应答的诱导有贡献。

实施例5：MVA-BN-PRO跨越单元型限制的免疫原性

免疫应答源自抗原衍生表位与免疫感受态细胞上多态性抗原呈递分子的相互作用。MVA-BN-PRO中有两种肿瘤抗原的一个好处在于它们潜在增加能与各种单元型的抗原呈递分子相互作用的肿瘤抗原衍生表位的数目。因此，预期MVA-BN-PRO在比含有单一抗原的疫苗更宽的单元型范围的个体中会是有免疫原性的。在临床前模型中使用具有不同单元型的动物评估了这种可能性。在此实施例中，改良实施例1中所描述的载体，将ATI启动子用早期/晚期合成启动子替换(Ps；Chakrabarti S，Sisler JR，和Moss B，BioTechniques23：1094-1097(1997年12月))。因此，PSA和PAP蛋白质应当与其它早期和晚期基因一起贯穿整个MVA感染期表达。

Ps启动子的序列：

5’-AAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAAT(SEQ ID NO：6)

在第1天、第15天、和第29天用5×10⁷TCID₅₀的MVA-BN-PRO免疫雄性BALB/c和C57BL/6小鼠(每组5只动物)。在第42天收集血液样品，并如实施例3所述通过ELISA对合并血清的连续稀释液分析抗PSA或抗PAP IgG的存在。如图11所示，只在来自BALB/c小鼠的血清中检测到高滴度的抗PSA抗体。相反，虽然在来自这两种小鼠品系的血清中都测量到抗PAP抗体滴度，但是在来自C57BL/6小鼠的血清中检测到更高的抗PAP抗体滴度。此数据强调了针对特异性抗原的免疫应答的单元型联系且支持MVA-BN-PRO中有多种肿瘤抗原应当在具有不同单元型的更宽范围的个体中提供有效免疫力的想法。

实施例6：MVA-BN-PRO在人中的安全性和免疫原性

当前正在研究MVA-BN-PRO对前列腺癌患者的治疗。在本申请的时候，4名患者接受1-3次1E8TCID50的MVA-BN-PRO处理，没有报告不良反应。通过比较处理前后针对PSA和PAP的T细胞应答，评估了MVA-BN-PRO在这些患者之一中的免疫原性。使用ELISpot测定法测定患者外周血单个核细胞(PBMC)中抗原特异性伽马干扰素(IFN-γ)分泌T细胞的存在。在处理前(基础)和第三次用10⁸TCID₅₀的MVA-BN-PRO皮下疫苗接种(TC3)后2周测定应答。将MATIS-10％培养基(RPMI，Click氏培养基，10％人AB血清、0.5M 2-β-巯基乙醇、和2％青霉素/链霉素)中的患者PBMC(2×10⁵)转移至用10μg/mL抗人IFN-γ捕捉抗体(Mabtech，克隆MAb 1D1K，产品目录编号3420-3)预包被的Multiscreen 96孔PVDF板(Millipore，产品目录编号MSIPS4510)的水合孔。随后，用PSA(5μg/mL)(Biodesign产品目录编号A86878H)、自PSA全长序列衍生的63种15聚物肽的11聚物交叠文库(OPL)(63μM，每种肽1μM)、PAP(1μg/mL)(Biodesign产品目录编号A81277H)、自PAP全长序列衍生的94种15聚物肽的11聚物OPL(94μM，每种肽1μM)、自10种前列腺癌肿瘤相关抗原(TAA)衍生的44种MHC I型肽的集合(44μM，每种肽1μM)、自5种前列腺癌TAA衍生的15种15种MHC II型肽的集合(15μM，每种肽1μM)、或MVA(Bavarian Nordic，MVA-BN-PROD05A06-C)(感染复数(MOI)为10)刺激PBMC。

63种PSA OPL肽的序列：

MWVPVVFLTLSVTWI(SEQ ID NO：3的氨基酸1-15)

VVFLTLSVTWIGAAP(SEQ ID NO：3的氨基酸5-19)

TLSVTWIGAAPLILS(SEQ ID NO：3的氨基酸9-23)

TWIGAAPLILSRIVG(SEQ ID NO：3的氨基酸13-27)

AAPLILSRIVGGWEC(SEQ ID NO：3的氨基酸17-31)

ILSRIVGGWECEKHS(SEQ ID NO：3的氨基酸21-35)

IVGGWECEKHSQPWQ(SEQ ID NO：3的氨基酸25-39)

WECEKHSQPWQVLVA(SEQ ID NO：3的氨基酸29-43)

KHSQPWQVLVASRGR(SEQ ID NO：3的氨基酸33-47)

PWQVLVASRGRAVCG(SEQ ID NO：3的氨基酸37-51)

LVASRGRAVCGGVLV(SEQ ID NO：3的氨基酸41-55)

RGRAVCGGVLVHPQW(SEQ ID NO：3的氨基酸45-59)

VCGGVLVHPQWVLTA(SEQ ID NO：3的氨基酸49-63)

VLVHPQWVLTAAHCI(SEQ ID NO：3的氨基酸53-67)

PQWVLTAAHCIRNKS(SEQ ID NO：3的氨基酸57-71)

LTAAHCIRNKSVILL(SEQ ID NO：3的氨基酸61-75)

HCIRNKSVILLGRHS(SEQ ID NO：3的氨基酸65-79)

NKSVILLGRHSLFHP(SEQ ID NO：3的氨基酸69-83)

ILLGRHSLFHPEDTG(SEQ ID NO：3的氨基酸73-87)

RHSLFHPEDTGQVFQ(SEQ ID NO：3的氨基酸77-91)

FHPEDTGQVFQVSHS(SEQ ID NO：3的氨基酸81-95)

DTGQVFQVSHSFPHP(SEQ ID NO：3的氨基酸85-99)

VFQVSHSFPHPLYDM(SEQ ID NO：3的氨基酸89-103)

SHSFPHPLYDMSLLK(SEQ ID NO：3的氨基酸93-107)

PHPLYDMSLLKNRFL(SEQ ID NO：3的氨基酸97-111)

YDMSLLKNRFLRPGD(SEQ ID NO：3的氨基酸101-115)

LLKNRFLRPGDDSSH(SEQ ID NO：3的氨基酸105-119)

RFLRPGDDSSHDLML(SEQ ID NO：3的氨基酸109-123)

PGDDSSHDLMLLRLS(SEQ ID NO：3的氨基酸113-127)

SSHDLMLLRLSEPAE(SEQ ID NO：3的氨基酸117-131)

LMLLRLSEPAELTDA(SEQ ID NO：3的氨基酸121-135)

RLSEPAELTDAVKVM(SEQ ID NO：3的氨基酸125-139)

PAELTDAVKVMDLPT(SEQ ID NO：3的氨基酸129-143)

TDAVKVMDLPTQEPA(SEQ ID NO：3的氨基酸133-147)

KVMDLPTQEPALGTT(SEQ ID NO：3的氨基酸137-151)

LPTQEPALGTTCYAS(SEQ ID NO：3的氨基酸141-155)

EPALGTTCYASGWGS(SEQ ID NO：3的氨基酸145-159)

GTTCYASGWGSIEPE(SEQ ID NO：3的氨基酸149-163)

YASGWGSIEPEEFLT(SEQ ID NO：3的氨基酸153-167)

WGSIEPEEFLTPKKL(SEQ ID NO：3的氨基酸157-171)

EPEEFLTPKKLQCVD(SEQ ID NO：3的氨基酸161-175)

FLTPKKLQCVDLHVI(SEQ ID NO：3的氨基酸165-179)

KKLQCVDLHVISNDV(SEQ ID NO：3的氨基酸169-183)

CVDLHVISNDVCAQV(SEQ ID NO：3的氨基酸173-187)

HVISNDVCAQVHPQK(SEQ ID NO：3的氨基酸177-191)

NDVCAQVHPQKVTKF(SEQ ID NO：3的氨基酸181-195)

AQVHPQKVTKFMLCA(SEQ ID NO：3的氨基酸185-199)

PQKVTKFMLCAGRWT(SEQ ID NO：3的氨基酸189-203)

TKFMLCAGRWTGGKS(SEQ ID NO：3的氨基酸193-207)

LCAGRWTGGKSTCSG(SEQ ID NO：3的氨基酸197-211)

RWTGGKSTCSGDSGG(SEQ ID NO：3的氨基酸201-215)

GKSTCSGDSGGPLVC(SEQ ID NO：3的氨基酸205-219)

CSGDSGGPLVCNGVL(SEQ ID NO：3的氨基酸209-223)

SGGPLVCNGVLQGIT(SEQ ID NO：3的氨基酸213-227)

LVCNGVLQGITSWGS(SEQ ID NO：3的氨基酸217-231)

GVLQGITSWGSEPCA(SEQ ID NO：3的氨基酸221-235)

GITSWGSEPCALPER(SEQ ID NO：3的氨基酸225-239)

WGSEPCALPERPSLY(SEQ ID NO：3的氨基酸229-243)

PCALPERPSLYTKVV(SEQ ID NO：3的氨基酸233-247)

PERPSLYTKVVHYRK(SEQ ID NO：3的氨基酸237-251)

SLYTKVVHYRKWIKD(SEQ ID NO：3的氨基酸241-255)

KVVHYRKWIKDTIVA(SEQ ID NO：3的氨基酸245-259)

YRKWIKDTIVANP(SEQ ID NO：3的氨基酸249-261)

94种PAP OPL肽的序列：

MRAAPLLLARAASLS(SEQ ID NO：4的氨基酸1-15)

PLLLARAASLSLGFL(SEQ ID NO：4的氨基酸5-19)

ARAASLSLGFLFLLF(SEQ ID NO：4的氨基酸9-23)

SLSLGFLFLLFFWLD(SEQ ID NO：4的氨基酸13-27)

GFLFLLFFWLDRSVL(SEQ ID NO：4的氨基酸17-31)

LLFFWLDRSVLAKEL(SEQ ID NO：4的氨基酸21-35)

WLDRSVLAKELKFVT(SEQ ID NO：4的氨基酸25-39)

SVLAKELKFVTLVFR(SEQ ID NO：4的氨基酸29-43)

KELKFVTLVFRHGDR(SEQ ID NO：4的氨基酸33-47)

FVTLVFRHGDRSPID(SEQ ID NO：4的氨基酸37-51)

VFRHGDRSPIDTFPT(SEQ ID NO：4的氨基酸41-55)

GDRSPIDTFPTDPIK(SEQ ID NO：4的氨基酸45-59)

PIDTFPTDPIKESSW(SEQ ID NO：4的氨基酸49-63)

FPTDPIKESSWPQGF(SEQ ID NO：4的氨基酸53-67)

PIKESSWPQGFGQLT(SEQ ID NO：4的氨基酸57-71)

SSWPQGFGQLTQLGM(SEQ ID NO：4的氨基酸61-75)

QGFGQLTQLGMEQHY(SEQ ID NO：4的氨基酸65-79)

QLTQLGMEQHYELGE(SEQ ID NO：4的氨基酸69-83)

LGMEQHYELGEYIRK(SEQ ID NO：4的氨基酸74-87)

QHYELGEYIRKRYRK(SEQ ID NO：4的氨基酸77-91)

LGEYIRKRYRKFLNE(SEQ ID NO：4的氨基酸81-95)

IRKRYRKFLNESYKH(SEQ ID NO：4的氨基酸85-99)

YRKFLNESYKHEQVY(SEQ ID NO：4的氨基酸89-103)

LNESYKHEQVYIRST(SEQ ID NO：4的氨基酸93-107)

YKHEQVYIRSTDVDR(SEQ ID NO：4的氨基酸97-111)

QVYIRSTDVDRTLMS(SEQ ID NO：4的氨基酸101-115)

RSTDVDRTLMSAMTN(SEQ ID NO：4的氨基酸105-119)

VDRTLMSAMTNLAAL(SEQ ID NO：4的氨基酸109-123)

LMSAMTNLAALFPPE(SEQ ID NO：4的氨基酸113-127)

MTNLAALFPPEGVSI(SEQ ID NO：4的氨基酸117-131)

AALFPPEGVSIWNPI(SEQ ID NO：4的氨基酸121-135)

PPEGVSIWNPILLWQ(SEQ ID NO：4的氨基酸125-139)

VSIWNPILLWQPIPV(SEQ ID NO：4的氨基酸129-143)

NPILLWQPIPVHTVP(SEQ ID NO：4的氨基酸133-147)

LWQPIPVHTVPLSED(SEQ ID NO：4的氨基酸137-151)

IPVHTVPLSEDQLLY(SEQ ID NO：4的氨基酸141-155)

TVPLSEDQLLYLPFR(SEQ ID NO：4的氨基酸145-159)

SEDQLLYLPFRNCPR(SEQ ID NO：4的氨基酸149-163)

LLYLPFRNCPRFQEL(SEQ ID NO：4的氨基酸153-167)

PFRNCPRFQELESET(SEQ ID NO：4的氨基酸157-171)

CPRFQELESETLKSE(SEQ ID NO：4的氨基酸161-175)

QELESETLKSEEFQK(SEQ ID NO：4的氨基酸165-179)

SETLKSEEFQKRLHP(SEQ ID NO：4的氨基酸169-183)

KSEEFQKRLHPYKDF(SEQ ID NO：4的氨基酸173-187)

FQKRLHPYKDFIATL(SEQ ID NO：4的氨基酸177-191)

LHPYKDFIATLGKLS(SEQ ID NO：4的氨基酸181-195)

KDFIATLGKLSGLHG(SEQ ID NO：4的氨基酸185-199)

ATLGKLSGLHGQDLF(SEQ ID NO：4的氨基酸189-203)

KLSGLHGQDLFGIWS(SEQ ID NO：4的氨基酸193-207)

LHGQDLFGIWSKVYD(SEQ ID NO：4的氨基酸197-211)

DLFGIWSKVYDPLYC(SEQ ID NO：4的氨基酸201-215)

IWSKVYDPLYCESVH(SEQ ID NO：4的氨基酸205-219)

VYDPLYCESVHNFTL(SEQ ID NO：4的氨基酸209-223)

LYCESVHNFTLPSWA(SEQ ID NO：4的氨基酸213-227)

SVHNFTLPSWATEDT(SEQ ID NO：4的氨基酸217-231)

FTLPSWATEDTMTKL(SEQ ID NO：4的氨基酸221-235)

SWATEDTMTKLRELS(SEQ ID NO：4的氨基酸225-239)

EDTMTKLRELSELSL(SEQ ID NO：4的氨基酸229-243)

TKLRELSELSLLSLY(SEQ ID NO：4的氨基酸234-247)

ELSELSLLSLYGIHK(SEQ ID NO：4的氨基酸237-251)

LSLLSLYGIHKQKEK(SEQ ID NO：4的氨基酸241-255)

SLYGIHKQKEKSRLQ(SEQ ID NO：4的氨基酸245-259)

IHKQKEKSRLQGGVL(SEQ ID NO：4的氨基酸249-263)

KEKSRLQGGVLVNEI(SEQ ID NO：4的氨基酸253-267)

RLQGGVLVNEILNHM(SEQ ID NO：4的氨基酸257-271)

GVLVNEILNHMKRAT(SEQ ID NO：4的氨基酸261-275)

NEILNHMKRATQIPS(SEQ ID NO：4的氨基酸265-279)

NHMKRATQIPSYKKL(SEQ ID NO：4的氨基酸269-283)

RATQIPSYKKLIMYS(SEQ ID NO：4的氨基酸274-287)

IPSYKKLIMYSAHDT(SEQ ID NO：4的氨基酸277-291)

KKLIMYSAHDTTVSG(SEQ ID NO：4的氨基酸281-295)

MYSAHDTTVSGLQMA(SEQ ID NO：4的氨基酸285-299)

HDTTVSGLQMALDVY(SEQ ID NO：4的氨基酸289-303)

VSGLQMALDVYNGLL(SEQ ID NO：4的氨基酸293-307)

QMALDVYNGLLPPYA(SEQ ID NO：4的氨基酸297-311)

DVYNGLLPPYASCHL(SEQ ID NO：4的氨基酸301-315)

GLLPPYASCHLTELY(SEQ ID NO：4的氨基酸305-319)

PYASCHLTELYFEKG(SEQ ID NO：4的氨基酸309-323)

CHLTELYFEKGEYFV(SEQ ID NO：4的氨基酸313-327)

ELYFEKGEYFVEMYY(SEQ ID NO：4的氨基酸317-331)

EKGEYFVEMYYRNET(SEQ ID NO：4的氨基酸321-335)

YFVEMYYRNETQHEP(SEQ ID NO：4的氨基酸325-339)

MYYRNETQHEPYPLM(SEQ ID NO：4的氨基酸329-343)

NETQHEPYPLMLPGC(SEQ ID NO：4的氨基酸333-347)

HEPYPLMLPGCSPSC(SEQ ID NO：4的氨基酸337-351)

PLMLPGCSPSCPLER(SEQ ID NO：4的氨基酸341-355)

PGCSPSCPLERFAEL(SEQ ID NO：4的氨基酸345-359)

PSCPLERFAELVGPV(SEQ ID NO：4的氨基酸349-363)

LERFAELVGPVIPQD(SEQ ID NO：4的氨基酸353-367)

AELVGPVIPQDWSTE(SEQ ID NO：4的氨基酸357-371)

GPVIPQDWSTECMTT(SEQ ID NO：4的氨基酸361-375)

PQDWSTECMTTNSHQ(SEQ ID NO：4的氨基酸365-379)

STECMTTNSHQGTED(SEQ ID NO：4的氨基酸369-383)

MTTNSHQGTEDSTD(SEQ ID NO：4的氨基酸373-386)

44种TAA MHC I型肽的序列及相应的TAA和在TAA序列中的位置：

肽序列

SMA

4-12 LLHETDSAV(SEQ ID NO：7的氨基酸4-12)

109-117 ELAHYDVLL(SEQ ID NO：7的氨基酸109-117)

168-176 PSLYTKVVHY(SEQ ID NO：7的氨基酸168-176)

173-181 DLVYVNYAR(SEQ ID NO：7的氨基酸173-181)

178-186 NYARTEDFF(SEQ ID NO：7的氨基酸178-186)

199-207 KIVIARYGK(SEQ ID NO：7的氨基酸199-207)

207-215 KVFRGNKVK(SEQ ID NO：7的氨基酸207-215)

227-235 LYSDPADYF(SEQ ID NO：7的氨基酸227-235)

260-268 NLNGAGDPL(SEQ ID NO：7的氨基酸260-268)

347-356 HSTNGVTRIY(SEQ ID NO：7的氨基酸347-356)

354-363 RIYNVIGTLR(SEQ ID NO：7的氨基酸354-363)

403-411 GTLKKEGWR(SEQ ID NO：7的氨基酸403-411)

431-440 STEWAEENSR(SEQ ID NO：7的氨基酸431-440)

441-450 LLQERGVAYI(SEQ ID NO：7的氨基酸441-450)

461-469 TLRVDCTPL(SEQ ID NO：7的氨基酸461-469)

557-566 ETYELVEKFY(SEQ ID NO：7的氨基酸557-566)

641-649 EIASKFSER(SEQ ID NO：7的氨基酸641-649)

663-671 MMNDQLMFL(SEQ ID NO：7的氨基酸663-671)

680-688 GLPDRPFYR(SEQ ID NO：7的氨基酸680-688)

711-719 ALFDIESKV(SEQ ID NO：7的氨基酸711-719)

PSCA

7-15 ALLMAGLAL(SEQ ID NO：8的氨基酸7-15)

14-22 ALQPGTALL(SEQ ID NO：8的氨基酸14-22)

21-30 LLCYSCKAQV(SEQ ID NO：8的氨基酸21-30)

76-84 DYYVGKKNI(SEQ ID NO：8的氨基酸76-84)

108-116 ALLPALGLL(SEQ ID NO：8的氨基酸108-116)

109-117 LLPALGLLL(SEQ ID NO：8的氨基酸109-117)

115-123 LLLWGPGQ(SEQ ID NO：8的氨基酸115-123)

STEAP1

86-94 FLYTLLREV(SEQ ID NO：9的氨基酸86-94)

102-116 HQQYFYKIPILVINK(SEQ ID NO：9的氨基酸102-116)

262-270 LLLGTIHAL(SEQ ID NO：9的氨基酸262-270)

292-300 MIAVFLPIV(SEQ ID NO：9的氨基酸292-300)

PTHrp

42-51 QLLHDKGKS(SEQ ID NO：10的氨基酸42-51)

59-68 FLHHLIAEIH(SEQ ID NO：10的氨基酸59-68)

59-65 FLHHLIA(SEQ ID NO：10的氨基酸59-65)

165-173 TSTTSLELD(SEQ ID NO：10的氨基酸165-173)

TARP

4-13 FPPSPLFFFL(SEQ ID NO：11的氨基酸4-13)

27-35 FVFLRNFSL(SEQ ID NO：11的氨基酸27-35)

29-37 FLRNFSLML(SEQ ID NO：11的氨基酸29-37)

Prostein

31-39 CLAAGITYV(SEQ ID NO：12)

Eph

58-66 IMNDMPIYM(SEQ ID NO：13)

550-558 VLAGVGFFI(SEQ ID NO：14)

存活素

96-104 LTLGEFLKL(SEQ ID NO：15)

hTERT

973-981 KLFGVLRLK(SEQ ID NO：16)

HER2

665-673 VVLGVVFGI(SEQ ID NO：17)

15种TAA MHC II型的序列及相应的TAA和在TAA序列中的位置

激肽释放酶4

125-139 SVSESDTIRSISIAS(SEQ ID NO：18)

155-169 LLANGRMPTVLQCVN(SEQ ID NO：19)

160-174 RMPTVLQCVNVSVVS(SEQ ID NO：20)

组蛋白H4

14-28 GAKRHRKVLRDNIQG(SEQ ID NO：21的氨基酸14-28)

KRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLAR(SEQ ID NO：21的氨

16-39 基酸16-39)

31-45 TKPAIRRLARRGGVK(SEQ ID NO：21的氨基酸31-45)

49-63 LIYEETRGVLKVFLE(SEQ ID NO：21的氨基酸49-63)

TYTEHAKRKTVTAMDVVYALKRQG(SEQ ID NO：21的氨

71-94 基酸71-94)

TARP

1-14 MQMFPPSPLFFFLQ(SEQ ID NO：11)

14-27 QLLKQSSRRLEHTF(SEQ ID NO：11)

ENAH(bMena)

502-510 TMNGSKSPV(SEQ ID NO：22)

PSMA

TGNFSTQKVKMHIHS(SEQ ID NO：7的氨基酸

334-348 334-348)

NYTLRVDCTPLMYSL(SEQ ID NO：7的氨基酸

459-473 459-473)

YRHVIYAPSSHNKYA(SEQ ID NO：7的氨基酸

687-701 687-701)

RQIYVAAFTVQAAAE(SEQ ID NO：7的氨基酸

730-744 730-744)

于37℃、5％CO₂温育40小时后，用1μg/mL生物素化抗人IFN-γ抗体(Mabtech，克隆MAb 7-B6-1，产品目录编号3420-6)，接着添加1/5000稀释的链霉亲合素-碱性磷酸酶(BD Pharmingen，产品目录编号554065)来检测IFN-γ分泌。用Vector Blue底物(Vector Lab Inc.，产品目录编号SK-5300)对ELISpot板显色，并用自动斑点阅读仪(Cellular Technology Ltd.ImmunoSpot S3B分析仪和CTL ImmunoSpot 4.0专业软件)对斑点计数。如图12所示，在患者J-D-1001中在MVA-BN-PRO处理前检测到先前存在的针对PSA的T细胞应答。抗PSA T细胞在处理后显著增加，而抗PAP T细胞只在处理后检测到。此数据指示MVA-BN-PRO在人中是有免疫原性的，而且同时诱导抗PSA和抗PAP这两种应答是能实现的。MVA-BN-PRO处理还导致针对载体MVA-BN的强T细胞应答。最重要的是，MVA-BN-PRO处理还导致针对其它肿瘤抗原的T细胞应答的扩散，正如用TAA MHC I和II肽集合刺激的T细胞生成IFN-γ所例证的。这指示由MVA-BN-PRO诱导的免疫应答导致对肿瘤细胞的杀伤，接着是针对其它肿瘤抗原的抗肿瘤应答的放大。抗原扩散是对抗肿瘤保护性免疫力的诱导中的重要事件，因为它防止肿瘤逃避由疫苗诱导的应答。因此，MVA-BN-PRO在人中介导针对两种肿瘤抗原的免疫应答的能力是提供有效免疫疗法的特性。

序列表

<110>普罗卡塔生物系统有限公司(Procarta Biosystems Limited)

Delcayre，Alain

<120>MVA用于治疗前列腺癌的用途

<130>BNIT0002-US

<140>PCT/US2008/080229

<141>2008-10-16

<150>60/960,893

<151>2007-10-18

<160>22

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>786

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

atgtgggtcc cggttgtctt cctcaccctg tccgtgacgt ggattggcgc tgcgcccctc 60

atcctgtctc ggattgtggg aggctgggag tgcgagaagc attcccaacc ctggcaggtg 120

cttgtggcct ctcgtggcag ggcagtctgc ggcggtgttc tggtgcaccc ccagtgggtc 180

ctcacagctg cccactgcat caggaacaaa agcgtgatct tgctgggtcg gcacagtctg 240

tttcatcctg aagacacagg ccaggtattt caggtcagcc acagcttccc acacccgctc 300

tacgatatga gcctcctgaa gaatcgattc ctcaggccag gtgatgactc cagccacgac 360

ctcatgctgc tccgcctgtc agagcctgcc gagctcacgg atgctgtgaa ggtcatggac 420

ctgcccaccc aggagccagc actggggacc acctgctacg cctcaggctg gggcagcatt 480

gaaccagagg agttcttgac cccaaagaaa cttcagtgtg tggacctcca tgttatttcc 540

aatgacgtgt gtgcgcaagt tcaccctcag aaggtgacca agttcatgct gtgtgctgga 600

cgctggacag ggggcaaaag cacctgctcg ggtgattctg ggggcccact tgtctgtaat 660

ggtgtgcttc aaggtatcac gtcatggggc agtgaaccat gtgccctgcc cgaaaggcct 720

tccctgtaca ccaaggtggt gcattaccgg aagtggatca aggacaccat cgtggccaac 780

ccctga 786

<210>2

<211>1161

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

atgagagctg cacccctcct cctggccagg gcagcaagcc ttagccttgg cttcttgttt 60

ctgctttttt tctggctaga ccgaagtgta ctagccaagg agttgaagtt tgtgactttg 120

gtgtttcggc atggagaccg aagtcccatt gacacctttc ccactgaccc cataaaggaa 180

tcctcatggc cacaaggatt tggccaactc acccagctgg gcatggagca gcattatgaa 240

cttggagagt atataagaaa gagatataga aaattcttga atgagtccta taaacatgaa 300

caggtttata ttcgaagcac agacgttgac cggactttga tgagtgctat gacaaacctg 360

gcagccctgt ttcccccaga aggtgtcagc atctggaatc ctatcctact ctggcagccc 420

atcccggtgc acacagttcc tctttctgaa gatcagttgc tatacctgcc tttcaggaac 480

tgccctcgtt ttcaagaact tgagagtgag actttgaaat cagaggaatt ccagaagagg 540

ctgcaccctt ataaggattt tatagctacc ttgggaaaac tttcaggatt acatggccag 600

gacctttttg gaatttggag taaagtctac gaccctttat attgtgagag tgttcacaat 660

ttcactttac cctcctgggc cactgaggac accatgacta agttgagaga attgtcagaa 720

ttgtccctcc tgtccctcta tggaattcac aagcagaaag agaaatctag gctccaaggg 780

ggtgtcctgg tcaatgaaat cctcaatcac atgaagagag caactcagat accaagctac 840

aaaaaactta tcatgtattc tgcgcatgac actactgtga gtggcctaca gatggcgcta 900

gatgtttaca acggactcct tcctccctat gcttcttgcc acttgacgga attgtacttt 960

gagaaggggg agtactttgt ggagatgtac tatcggaatg agacgcagca cgagccgtat 1020

cccctcatgc tacctggctg cagccctagc tgtcctctgg agaggtttgc tgagctggtt 1080

ggccctgtga tccctcaaga ctggtccacg gagtgtatga ccacaaacag ccatcaaggt 1140

actgaggaca gtacagatta g 1161

<210>3

<211>261

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly

1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu

20 25 30

Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala

35 40 45

Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala

50 55 60

His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu

65 70 75 80

Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe

85 90 95

Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg

100 105 110

Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu

115 120 125

Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln

130 135 140

Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile

145 150 155 160

Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu

165 170 175

His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val Hi Pro Gln Lys Val

180 185 190

Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr

195 200 205

Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln

210 215 220

Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro

225 230 235 240

Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr

245 250 255

Ile Val Ala Asn Pro

260

<210>4

<211>386

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

Met Arg Ala Ala Pro Leu Leu Leu Ala Arg Ala Ala Ser Leu Ser Leu

1 5 10 15

Gly Phe Leu Phe Leu Leu Phe Phe Trp Leu Asp Arg Ser Val Leu Ala

20 25 30

Lys Glu Leu Lys Phe Val Thr Leu Val Phe Arg His Gly Asp Arg Ser

35 40 45

Pro Ile Asp Thr Phe Pro Thr Asp Pro Ile Lys Glu Ser Ser Trp Pro

50 55 60

Gln Gly Phe Gly Gln Leu Thr Gln Leu Gly Met Glu Gln His Tyr Glu

65 70 75 80

Leu Gly Glu Tyr Ile Arg Lys Arg Tyr Arg Lys Phe Leu Asn Glu Ser

85 90 95

Tyr Lys His Glu Gln Val Tyr Ile Arg Ser Thr Asp Val Asp Arg Thr

100 105 110

Leu Met Ser Ala Met Thr Asn Leu Ala Ala Leu Phe Pro Pro Glu Gly

115 120 125

Val Ser Ile Trp Asn Pro Ile Leu Leu Trp Gln Pro Ile Pro Val His

130 135 140

Thr Val Pro Leu Ser Glu Asp Gln Leu Leu Tyr Leu Pro Phe Arg Asn

145 150 155 160

Cys Pro Arg Phe Gln Glu Leu Glu Ser Glu Thr Leu Lys Ser Glu Glu

165 170 175

Phe Gln Lys Arg Leu His Pro Tyr Lys Asp Phe Ile Ala Thr Leu Gly

180 185 190

Lys Leu Ser Gly Leu His Gly Gln Asp Leu Phe Gly Ile Trp Ser Lys

195 200 205

Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Cys Glu Ser Val His Asn Phe Thr Leu Pro

210 215 220

Ser Trp Ala Thr Glu Asp Thr Met Thr Lys Leu Arg Glu Leu Ser Glu

225 230 235 240

Leu Ser Leu Leu Ser Leu Tyr Gly Ile His Lys Gln Lys Glu Lys Ser

245 250 255

Arg Leu Gln Gly Gly Val Leu Val Asn Glu Ile Leu Asn His Met Lys

260 265 270

Arg Ala Thr Gln Ile Pro Ser Tyr Lys Lys Leu Ile Met Tyr Ser Ala

275 280 285

His Asp Thr Thr Val Ser Gly Leu Gln Met Ala Leu Asp Val Tyr Asn

290 295 300

Gly Leu Leu Pro Pro Tyr Ala Ser Cys His Leu Thr Glu Leu Tyr Phe

305 310 315 320

Glu Lys Gly Glu Tyr Phe Val Glu Met Tyr Tyr Arg Asn Glu Thr Gln

325 330 335

His Glu Pro Tyr Pro Leu Met Leu Pro Gly Cys Ser Pro Ser Cys Pro

340 345 350

Leu Glu Arg Phe Ala Glu Leu Val Gly Pro Val Ile Pro Gln Asp Trp

355 360 365

Ser Thr Glu Cys Met Thr Thr Asn Ser His Gln Gly Thr Glu Asp Ser

370 375 380

Thr Asp

385

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>5

gttttgaata aaattttttt ataataaatc 30

<210>6

<211>43

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>6

aaaaaattga aattttattt tttttttttg gaatataaat aat 43

<210>7

<211>750

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>7

Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg

1 5 10 15

Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe

20 25 30

Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu

35 40 45

Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu

50 55 60

Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu His Asn Phe Thr Gln Ile

65 70 75 80

Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile

85 90 95

Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His

100 105 110

Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile

115 120 125

Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe

130 135 140

Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro

145 150 155 160

Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr

165 170 175

Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met

180 185 190

Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val

195 200 205

Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly

210 215 220

Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys

225 230 235 240

Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly

245 250 255

Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr

260 265 270

Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly

275 280 285

Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys

290 295 300

Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg

305 310 315 320

Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn

325 330 335

Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val

340 345 350

Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro

355 360 365

Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly

370 375 380

Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg

385 390 395 400

Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile

405 410 415

Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr

420 425 430

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435 440 445

Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val

450 455 460

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465 470 475 480

Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser

485 490 495

Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile

500 505 510

Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu

515 520 525

Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn

530 535 540

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545 550 555 560

Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val

565 570 575

Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val

580 585 590

Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala

595 600 605

Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr

610 615 620

Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr

625 630 635 640

Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser

645 650 655

Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu

660 665 670

Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg

675 680 685

His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser

690 695 700

Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp

705 710 715 720

Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala

725 730 735

Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala

740 745 750

<210>8

<211>123

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>8

Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu Gln

1 5 10 15

Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gln Val Ser Asn

20 25 30

Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys Thr Gln Leu Gly Glu Gln Cys

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Trp Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr Val Ile Ser Lys

50 55 60

Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln Asp Tyr Tyr Val Gly

65 70 75 80

Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp Leu Cys Asn Ala Ser Gly

85 90 95

Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala

100 105 110

Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro Gly Gln Leu

115 120

<210>9

<211>339

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>9

Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met

1 5 10 15

Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr

20 25 30

Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln

35 40 45

Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr

50 55 60

Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile

65 70 75 80

Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His

85 90 95

Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu

100 105 110

Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu

115 120 125

Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly

130 135 140

Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr

145 150 155 160

Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala

165 170 175

Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu

180 185 190

Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp

195 200 205

Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile

210 215 220

Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser

225 230 235 240

Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ser Lys

245 250 255

Leu Gly Ile Val Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Leu Ile Phe

260 265 270

Ala Trp Asn Lys Trp Ile Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp Tyr Thr Pro

275 280 285

Pro Thr Phe Met Ile Ala Val Phe Leu Pro Ile Val Val Leu Ile Phe

290 295 300

Lys Ser Ile Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys Lys Ile Leu Lys Ile

305 310 315 320

Arg His Gly Trp Glu Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Thr Glu Ile Cys

325 330 335

Ser Gln Leu

<210>10

<211>177

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>10

Met Gln Arg Arg Leu Val Gln Gln Trp Ser Val Ala Val Phe Leu Leu

1 5 10 15

Ser Tyr Ala Val Pro Ser Cys Gly Arg Ser Val Glu Gly Leu Ser Arg

20 25 30

Arg Leu Lys Arg Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly

35 40 45

Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile

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Ser Asp Asp Glu Gly Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys Val Glu

100 105 110

Thr Tyr Lys Glu Gln Pro Leu Lys Thr Pro Gly Lys Lys Lys Lys Gly

115 120 125

Lys Pro Gly Lys Arg Lys Glu Gln Glu Lys Lys Lys Arg Arg Thr Arg

130 135 140

Ser Ala Trp Leu Asp Ser Gly Val Thr Gly Ser Gly Leu Glu Gly Asp

145 150 155 160

His Leu Ser Asp Thr Ser Thr Thr Ser Leu Glu Leu Asp Ser Arg Arg

165 170 175

His

<210>11

<211>111

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>11

Met Lys Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro

1 5 10 15

Glu Lys Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn

20 25 30

Asn Lys Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>12

Cys Leu Ala Ala Gly Ile Thr Tyr Val

1 5

<210>13

<211>9

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>13

Ile Met Asn Asp Met Pro Ile Tyr Met

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>14

Val Leu Ala Gly Val Gly Phe Phe Ile

1 5

<210>15

<211>9

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>15

Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu

1 5

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>16

Lys Leu Phe Gly Val Leu Arg Leu Lys

1 5

<210>17

<211>9

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>17

Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile

1 5

<210>18

<211>15

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>18

Ser Val Ser Glu Ser Asp Thr Ile Arg Ser Ile Ser Ile Ala Ser

1 5 10 15

<210>19

<211>15

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>19

Leu Leu Ala Asn Gly Arg Met Pro Thr Val Leu Gln Cys Val Asn

1 5 10 15

<210>20

<211>15

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>20

Arg Met Pro Thr Val Leu Gln Cys Val Asn Val Ser Val Val Ser

1 5 10 15

<210>21

<211>103

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>21

Met Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala

1 5 10 15

Lys Arg His Arg Lys Val Leu Arg Asp Asn Ile Gln Gly Ile Thr Lys

20 25 30

Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser

35 40 45

Gly Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Gly Val Leu Lys Val Phe Leu Glu

50 55 60

Asn Val Ile Arg Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys Arg Lys

65 70 75 80

Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys Arg Gln Gly Arg

85 90 95

Thr Leu Tyr Gly Phe Gly Gly

100

<210>22

<211>10

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>22

Thr Met Asn Gly Ser Lys Ser Pro Val Glx

1 5 10

Claims

1.编码包含人前列腺特异性抗原(PSA)抗原的多肽和包含人前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原的多肽的重组改良痘苗病毒安卡拉(MVA)在制备用于治疗人类癌症患者的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述MVA是MVA-Bavarian Nordic(MVA-BN)。

3.权利要求1的用途，其中所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

4.权利要求1的用途，其中所述PSA抗原和所述PAP抗原插入在MVA基因间区014L/015L中。

5.权利要求1的用途，其中所述癌症是前列腺癌。

6.权利要求5的用途，其中所述癌症是转移性前列腺癌。

7.权利要求1的用途，其中所述重组MVA是在破坏肿瘤剂量的紫杉烷之前施用的。

8.权利要求1的用途，其中所述重组MVA是在破坏肿瘤剂量的紫杉烷的同时施用的。

9.权利要求1的用途，其中所述重组MVA是在破坏肿瘤剂量的紫杉烷之后施用的。

10.权利要求7的用途，其中所述紫杉烷是多西他塞或帕利他塞。

11.权利要求8的用途，其中所述紫杉烷是多西他塞或帕利他塞。

12.权利要求9的用途，其中所述紫杉烷是多西他塞或帕利他塞。

13.权利要求1的用途，其中所述治疗包括对患者施用引发剂量的所述重组MVA，及施用一个或多个强化剂量的所述重组MVA。

14.权利要求13的用途，其中对患者施用1x10⁸TCID₅₀的引发剂量及2x10⁸和4x10⁸TCID₅₀的两个强化剂量。

15.权利要求14的用途，其中所述强化剂量是在所述引发剂量之后四周和八周时给予的。

16.一种用于预防前列腺癌的试剂盒，包括：

(a)一种重组MVA，其编码包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及

(b)在检测到前列腺癌之前施用所述重组MVA的指令。

17.一种用于治疗前列腺癌的试剂盒，包括：

(b)对前列腺癌患者施用所述重组MVA的指令。

18.一种用于治疗癌症患者的试剂盒，包括：

(b)在用破坏肿瘤剂量的紫杉烷处理之前、同时、或之后对癌症患者施用所述重组MVA的指令。

19.一种重组MVA病毒，其表达包含人PAP抗原的多肽。

20.权利要求19的重组MVA病毒，其中所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQID NO：2。

21.权利要求19的重组MVA病毒，其中所述MVA是MVA-BN。

22.权利要求20的重组MVA病毒，其中所述MVA是MVA-BN。

23.权利要求19的重组MVA病毒，其中所述重组MVA病毒进一步包含包含人PSA抗原的多肽。

24.权利要求20的重组MVA病毒，其中所述重组MVA病毒进一步包含包含人PSA抗原的多肽。

25.权利要求21的重组MVA病毒，其中所述重组MVA病毒进一步包含包含人PSA抗原的多肽。

26.权利要求22的重组MVA病毒，其中所述重组MVA病毒进一步包含包含人PSA抗原的多肽。

27.权利要求23的重组MVA病毒，其中所述重组MVA病毒进一步包含核苷酸序列SEQ ID NO：1。

28.权利要求24的重组MVA病毒，其中所述重组MVA病毒进一步包含核苷酸序列SEQ ID NO：1。

29.权利要求25的重组MVA病毒，其中所述重组MVA病毒进一步包含核苷酸序列SEQ ID NO：1。

30.权利要求26的重组MVA病毒，其中所述重组MVA病毒进一步包含核苷酸序列SEQ ID NO：1。

31.一种重组MVA病毒，其表达包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽。

32.权利要求31的重组MVA病毒，其中所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQID NO：1。

33.权利要求31的重组MVA病毒，其中所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQID NO：2。

34.权利要求31的重组MVA病毒，其中所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQID NO：1和核苷酸序列SEQ ID NO：2。

35.权利要求31的重组MVA病毒，其中所述MVA是MVA-BN。

36.权利要求32的重组MVA病毒，其中所述MVA是MVA-BN。

37.权利要求33的重组MVA病毒，其中所述MVA是MVA-BN。

38.权利要求34的重组MVA病毒，其中所述MVA是MVA-BN。

39.一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PAP抗原的多肽，其中所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PAP的B细胞和T细胞免疫应答。

40.一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PAP抗原的多肽，其中所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PAP的抗体。

41.权利要求39的免疫原性组合物，其中所述重组MVA病毒包含核苷酸序列SEQ ID NO：2。

42.权利要求41的免疫原性组合物，其中所述MVA病毒是MVA-BN。

43.权利要求40的免疫原性组合物，其中所述重组MVA病毒包含核苷酸序列SEQ ID NO：2。

44.权利要求43的免疫原性组合物，其中所述MVA是MVA-BN。

45.一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽，其中所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PSA和PAP的B细胞和T细胞免疫应答。

46.一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽，其中所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PSA和PAP的抗体。

47.权利要求45的免疫原性组合物，其中所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQID NO：1和核苷酸序列SEQ ID NO：2。

48.权利要求47的免疫原性组合物，其中所述MVA是MVA-BN。

49.权利要求46的免疫原性组合物，其中所述重组MVA病毒包含核苷酸序列SEQ ID NO：1和核苷酸序列SEQ ID NO：2。

50.权利要求49的免疫原性组合物，其中所述MVA是MVA-BN。

51.编码包含人前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原的多肽的重组MVA病毒在制备用于在患者中诱导针对PAP的B细胞和T细胞免疫应答的药物中的用途，其中通过首先对患者施用引发剂量的编码包含人PAP抗原的多肽的重组MVA，接着施用一个或多个强化剂量的编码包含人PAP抗原的多肽的重组MVA诱导针对PAP的B细胞和T细胞免疫应答。

52.权利要求51的用途，其中所述重组MVA病毒包含核苷酸序列SEQ IDNO：2。

53.权利要求52的用途，其中所述MVA是MVA-BN。

54.权利要求51的用途，其中对患者施用1x10⁸TCID₅₀的引发剂量及2x10⁸和4x10⁸TCID₅₀的两个强化剂量。

55.权利要求54的用途，其中所述强化剂量是在所述引发剂量之后四周和八周时给予的。