CN101855336A - 含艰难梭菌类毒素a和b的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包括艰难梭菌毒素和/或类毒素的组合物及相应方法。本发明的组合物包括一种或多种增加所述毒素的稳定性和/或减少所述毒素聚集的赋形剂。
Description
发明领域
本发明涉及包括艰难梭菌(Clostridium difficile)类毒素的组合物及相应方法。
发明背景
艰难梭菌(C.difficile)类毒素A和B是造成艰难梭菌相关性疾病(CDAD)的原因，该疾病表现为院内感染腹泻和假膜性结肠炎(Kuijper et al.，Clinical Microbiology and Infection 12(Suppl.6)：2-18，2006；Drudy et al.，International Journal of Infectious Diseases 11(1)：5-10，2007；Warny et al.，Lancet 366(9491)：1079-1084，2005；Dove et al.，Infection and Immunity 58(2)：480-488，1990；Barroso et al.，NucleicAcids Research 18(13)：4004，1990)。用甲醛处理毒素得到相应的完全灭活并保留至少部分免疫原性的类毒素A和B(Torres et al.，Infectionand Immunity 63(12)：4619-4627，1995)。已经证实，采用两种类毒素接种疫苗对仓鼠、健康成人和复发CDAD患者是有效的(Torres et al.，Infection and Immunity 63(12)：4619-4627，1995；Kotloff et al.，Infectionand Immunity 69(2)：988-995，2001；Sougioultzis et al.，Gastroenterology128(3)：764-770，2005；Torres et al.，Vaccine Research 5(3)：149-162，1996)。此外，施用游离的和铝盐(佐剂)结合的类毒素引起适当的免疫应答(Torres et al.，Vaccine Research 5(3)：149-162，1996；Giannascaet al.，Infection and Immunity 67(2)：527-538，1999)。同时施用两种类毒素比仅施用单个蛋白更有效(Kim et al.，Infection and Immunity55(12)：2984-2992，1987)。因此所述A和B都是疫苗开发的候选物。其构象完整性的改善和/或其聚集倾向的减少对得到最佳保存稳定性是可取的。
发明概述
本发明提供组合物，例如药物组合物(如疫苗组合物)，其包括艰难梭菌的毒素或类毒素(例如艰难梭菌毒素A和/或B的类毒素；和类毒素A和B以如5∶1至1∶5，例如3∶2(A∶B)比率存在)，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，相对于没有所述一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，所述赋形剂减少或延迟所述毒素和/或类毒素聚集，和/或增加所述毒素或类毒素的热稳定性。在一个实施例中，相对于没有所述一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂减少或延迟所述毒素和/或类毒素聚集50％或更多。在另一实施例中，相对于没有所述一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂增加所述毒素和/或类毒素的热稳定性0.5℃或更多。任选地，本发明的组合物可包括佐剂(例如铝化合物，例如氢氧化铝、磷酸铝或磷酸羟铝化合物)。所述组合物可以是液体形式，冻干、喷雾干燥或泡沫干燥的干粉形式。
所述一种或多种药学上可接受的赋形剂可以是，例如选自缓冲剂、张度剂、简单糖、糖、糖聚合物、氨基酸、寡肽、聚氨基酸、多元醇及其醚、洗涤剂、脂质、表面活性剂、抗氧化剂、盐、人血清白蛋白、明胶、甲醛或其组合。在各种实施例中，(i)所述缓冲剂选自浓度5-100mM的柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸、组氨酸、碳酸盐和重碳酸盐；(ii)所述张度剂是浓度1-50mM的甘露醇；(iii)所述糖选自浓度1-30％的山梨醇、海藻糖和蔗糖；(iv)所述氨基酸、寡肽或聚氨基酸浓度最高达100mM；(v)所述多元醇选自甘油、聚乙二醇及其分子量200-10,000的醚，浓度最高达20％；(vi)所述洗涤剂和脂质选自浓度最高达0.5％的脱氧胆酸钠、吐温20、吐温80和普朗尼克；(vii)所述糖聚合物选自葡聚糖和纤维素；(viii)所述盐选自最高达150mM的氯化钠、氯化钾、氯化镁和醋酸镁；以及(ix)0.001-0.02％的甲醛。
这样的赋形剂的具体例子包括列于表1、表2、表8或表9中的赋形剂。在其它实施例中，所述组合物包括柠檬酸钠或柠檬酸钾，和/或磷酸钠或磷酸钾，任选地和蔗糖和/或甲醛相组合。因此，在各种实施例中，所述组合物包括艰难梭菌类毒素A和B，5-100mM(例如10-30mM，或20mM)柠檬酸钠或柠檬酸钾(或磷酸盐)，2-20％(例如2-10％或5％)蔗糖，和≤0.020％(例如0.016％)甲醛，pH 5.5-8.5(例如6.5-8.0或7.5)。在其它实施例中，采用山梨醇、右旋糖和/或吐温80的组合。
本发明还提供制备包括艰难梭菌毒素或类毒素，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物的方法，相对于没有所述一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂减少或延迟所述毒素和/或类毒素的聚集，和/或增加所述毒素或类毒素的热稳定性。这些方法包括提供艰难梭菌的毒素或类毒素，并将所述艰难梭菌的毒素或类毒素与一种或多种药学上可接受的赋形剂，例如本文所述的赋形剂相混合。如本文所述，所述组合物可以以液体形式或冻干保存。
本发明进一步提供诱导受试者对艰难梭菌免疫应答的方法，其包括将本文所述的组合物施用于所述受试者。在一个实施例中，所述患者尚未患有，但有罹患艰难梭菌疾病的风险，在另一实施例中，所述患者患有艰难梭菌疾病。此外，本发明包括本发明的所述组合物在诱导受试者对艰难梭菌免疫应答，或在制备用于此目的的制剂中的用途。
本发明有一些优势。例如本文所述赋形剂的使用可导致增加的艰难梭菌类毒素A和B的物理稳定性，和/或降低或延迟的聚集，这对包括所述类毒素的药物(例如疫苗)的制备是重要的。进一步地，使用本发明所述的比率(例如3∶2，A∶B)，并在施用前(而非在保存疫苗的配置中)加入佐剂，可导致增加的免疫原性。
本发明的其它特点和优势由以下详细说明、附图和权利要求是显而易见的。
附图简述
图1.存在20％海藻糖(□)、20％蔗糖(■)、10％山梨醇(○)、10％右旋糖(●)、20％甘油(△)、0.05％吐温80(▲)、0.1％普朗尼克F68(◇)时，对类毒素A(x)结构稳定性的溶质效应研究。(a)208nm的CD信号；(c)ANS发射强度；(d)ANS发射峰位置；和(b)DSC热分析图。热示踪代表2次测量的均值，这里每个数据点有小于0.5的标准误差。
图2.存在20％海藻糖(□)、20％蔗糖(■)、10％山梨醇(○)、10％右旋糖(●)、20％甘油(△)、0.05％吐温80(▲)、0.1％普朗尼克F68(◇)时，对类毒素B(x)结构稳定性的溶质效应研究。(a)208nm的CD信号；(c)ANS发射强度；(d)ANS发射峰位置；和(b)DSC热分析图。热示踪代表2次测量的均值，这里每个数据点有小于0.5的标准误差。
图3.存在10％山梨醇和0.05％吐温80(□)，10％右旋糖和0.05％吐温80(■)，10％山梨醇、10％右旋糖和0.05％吐温80(○)，10％右旋糖和10％山梨醇(●))时，对类毒素A(x)热稳定性的溶质组合的效应研究：(a)208nm处CD信号监测和(b)OD350nm。热示踪代表2次测量的均值，其中每个数据点有小于0.5的标准误差。
图4.存在10％山梨醇和0.05％吐温80(□)，10％右旋糖和0.05％吐温80(■)，10％山梨醇、10％右旋糖和0.05％吐温80(○)，10％右旋糖和10％山梨醇(●))时，对溶质组合及其对类毒素B(x)热稳定性的作用的研究。(a)208nm处CD信号监测和(b)OD350nm。热示踪代表2次测量的均值，这里每个数据点有小于0.5的标准偏差。
图5.存在10％右旋糖(■)、10％山梨醇(○)、10％右旋糖和10％山梨醇(●))时，对作为温度函数的吐温80(□)的性质研究：0.05％吐温80(a)和0.1％吐温80(b)的208nm CD信号；0.05％吐温80(c)和0.1％吐温80(d)的OD 350nm；0.05％吐温80(e)和0.1％吐温80(f)的基于MSD数(实心正方形)和基于对数正态数(实心菱形)的水力学直径。考虑到DLS测量的性质，＞1μm的大小不准确。热示踪代表2次测量的均值，其中每个数据点有小于0.5的标准误差。
图6.存在山梨醇和0.05％吐温80(◆)，右旋糖和0.05％吐温80(■)，山梨醇、右旋糖和0.05％吐温80(▲)，山梨醇、右旋糖和0.1％吐温80(x)，山梨醇和右旋糖(◇)时，用类毒素A(a)和类毒素B(b)的CD 208nm信号监测溶质浓度对热转变中点(Tm)的影响的研究。
图7.作为温度函数的类毒素A(a-c)和类毒素B(d-f)的水力学直径，这里实心正方形代表基于MSD数的直径，实心菱形代表基于对数正态数的直径。考虑到DLS测量的性质，＞1μm的大小不准确。(a、d)仅蛋白；(b、e)存在10％山梨醇和10％右旋糖的蛋白；(c、f)存在10％山梨醇、10％右旋糖和0.05％吐温80的蛋白。热示踪代表2次测量的均值，这里每个数据点有小于0.5的标准误差。
图8.
(氢氧化铝佐剂)结合研究：存在2M NaCl时类毒素A(◇)和类毒素B(▲)的(a)吸附等温线和(b)解吸等温线。
图9.通过pH范围5.5至7.5的圆二色性(CD)光谱对类毒素A二级结构的研究。
图10.通过pH范围5.5至7.5的圆二色性(CD)光谱对类毒素B二级结构的研究。
图11.通过pH范围5.5至8.0圆二色性(CD)光谱对类毒素A解链温度的研究。
图12.通过pH范围5.0至7.5圆二色性(CD)光谱对类毒素B解链温度的研究。
图13.固定保存温度时，随时间在不同pH值时的聚集研究。
图14.37℃下，随时间类毒素A的盐依赖性聚集研究。
图15.37℃下，随时间类毒素B的盐依赖性聚集研究。
图16.疫苗制剂的冻干法参数研究。
详述
本发明提供包含艰难梭菌毒素和/或类毒素，以及一种或多种药学上可接受的为所述组合物提供有益属性的赋形剂的组合物。例如，并如下进一步所述，本发明的组合物中包括的赋形剂可以增加所述组合物的一种或多种类毒素成分的稳定性，和/或减少或延迟所述类毒素的聚集。
可包括在本发明的所述组合物中的艰难梭菌类毒素可以使用任意一些本领域已知方法制备。例如，可以使用包括用甲醛灭活的方法(见例如Kotloff et al.，Infection and Immunity 69(2)：988-995，2001)。优选地，所述组合物包括类毒素A和类毒素B，但仅包括这些类毒素之一的组合物还可以包括在本发明中。能用作毒素来源的典型艰难梭菌菌株是ATCC 43255(VPI 10463)。所述类毒素可以以各种比率出现在所述组合物中，例如5∶1(A∶B)至1∶5(A∶B)。在具体实施例中，所述比率可以是2∶1、3∶1，或3∶2(A∶B)。本发明所述组合物中类毒素的总量可以是，例如100ng-1mg、100ng-500μg、1-250μg、10-100μg、25-75μg或50μg。所述组合物可任选地以一个单位剂量保存在小瓶中。
本发明的所述组合物包括一种或多种化合物，例如缓冲剂(柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸、组氨酸、碳酸盐、重碳酸盐；5-100mM；可使用的柠檬酸盐的例子包括钠、钾、镁和锌)；张度剂(例如甘露醇；5-100mM)；糖，如糖或糖醇(例如山梨醇、海藻糖或蔗糖；1-30％)或糖聚合物(例如右旋糖酐和纤维素)；氨基酸、寡肽或聚氨基酸(最高达100mM)；多元醇(例如甘油、聚乙二醇或其醚，分子量200-10,000，并且浓度最高达20％)；洗涤剂、脂质或表面活性剂(例如吐温20、吐温80或普朗尼克，浓度最高达0.5％)；抗氧化剂；盐(例如氯化钠、氯化钾、氯化镁或醋酸镁，最高达150mM)；白蛋白(例如人血清白蛋白)；明胶；甲醛(0.001-0.02％)；或其组合。
可用于本发明组合物的赋形剂的例子包括列于下面表1、2、8和9的赋形剂。在各种实施例中，所述赋形剂可以是引起以下结果的赋形剂(i)增加的热稳定性(例如至少0.5℃，例如0.5-5℃、1-4℃或2-3℃)，如通过例如下述检测测量的(例如差示扫描量热仪(DSC))，和/或(ii)增加或延迟类毒素A、类毒素B，或类毒素A和类毒素B两者聚集，例如50％或更多(例如60％或更多，70％或更多，80％或更多，90％或更多，95％或更多，98％或更多，99％或更多，或100％)，如例如通过下述分析测量的。包括类毒素聚集物的组合物也包括在本发明中。
因此，典型的赋形剂和缓冲剂包括柠檬酸钠(例如0.01-0.2M，例如0.02-0.1M)、蔗糖(例如1-20％或5-10％)、山梨醇(例如4-20％或5-10％)、海藻糖(例如4-20％或5-10％)、吐温80(例如0.05-0.1％)、二乙醇胺(例如0.3M)、组氨酸(例如0.02-0.3M)、胍(例如0.3M)、葡萄糖(例如5-20％)、甘油(例如20％)、白蛋白(例如1-2.5％)、乳糖(例如10-20％)、甘露醇(例如10％)、蔗糖(例如5-20％)、普朗尼克F-68(例如0.1％)、2-羟丙基β-CD(例如5-10％)、右旋糖苷T40(例如0.03-0.08mg/ml)、玻雷吉(例如0.01-0.1％)、赖氨酸(例如0.3M)、吐温20(例如0.01-0.05％)，以及天冬氨酸(例如0.15M)(见表1、2、8和9)。这些赋形剂可以以表中所列浓度用于本发明。或者，正如本领域中所理解的，所述量可以变化例如0.1-10倍。其它本领域已知的糖、糖醇、表面活性剂和氨基酸也可包括在本发明的组合物中。
所述赋形剂和缓冲剂可以单独或组合使用。作为组合的例子，所述组合物可以包括已经证明对类毒素稳定性有益的柠檬酸钠和蔗糖。这些组分的量可以是，例如10-30mM、15-25mM或20mM柠檬酸钠；和1-20％或5-10％蔗糖。除了这些组分，这样的组合物可包括少量甲醛，例如0.001-0.020、0.01-0.018或0.16％甲醛。这样的组合物的pH值可以是例如5.5-8.0或6.5-7.5，所述组合物可以在例如2-8℃，以液体或冻干形式保存。在此组合物的变化中，柠檬酸钠可用磷酸钠(10-30mM、15-25mM或20mM)替代，和/或蔗糖可用山梨醇(例如4-20％或5-10％)或海藻糖(4-20％或5-10％)替代。所述组合物的其它变化包括在本发明中，并包括使用本文所列其它组分。基于以上，本发明的典型组合物包括20mM柠檬酸钠、5％蔗糖和0.016％甲醛，pH 7.5。
在另一实施例中，所述组合物包括山梨醇、右旋糖和吐温80，此为已证实对聚集和稳定性有益的组合(见下)。这些组分的量可以是，例如5-15％、8-12％或10％山梨醇；5-15％、8-12％或10％右旋糖；以及0.01-1％、0.025-0.5％或0.05-0.1％吐温80。其中这些组合物为10％(山梨醇和右旋糖)以及0.05-0.1％(吐温80)的具体实施例见下述。在另一实施例中，所述赋形剂是右旋糖(10％)和山梨醇(10％)。
本发明的组合物可以液体或干燥形式保存，后者包括例如冻干粉末形式、冻干形式、喷雾干燥形式和泡沫干燥形式。因此，除了一种或多种赋形剂，如上所述，本发明的所述组合物可包括可用例如含有NaCl(例如150mM)的磷酸钠(例如5mM)缓冲的液体介质(例如盐水或水)。本发明所述组合物的典型pH范围是5-10，例如5-9、5-8、5.5-9、6-7.5或6.5-7。进一步地，所述组合物可包括一种或多种稳定剂。在其它实施例中，所述组合物是冻干形式，并且这样的组合物在施用前，可通过使用液体介质复溶(例如盐水或水)。
除了上述的类毒素或毒素抗原以及赋形剂外，本发明的组合物可任选地包括一种或多种佐剂。可用于本发明的佐剂包括铝化合物，例如氢氧化铝、磷酸铝和磷酸羟铝。抗原可使用标准方法，用铝化合物沉淀，或吸附到铝化合物上。作为具体实施例，可使用明矾(例如Rehydragel
Reheis，Inc.，Berkeley Heights，NewJersey；最高达例如2mg AlOH/剂，例如约1.5mg AlOH/剂；
(例如2％；(氢氧化铝佐剂))，Brenntag Biosectror，Frederickssund，Denmark(AlOH3))。使用的铝的量可以是例如100-850μg/剂、200-600μg/剂或300-600μg/剂。
本发明包括的一种配制方法涉及临用前，将所述类毒素和赋形剂配制在一起，然后加入佐剂，例如明矾佐剂。如下进一步所述，此方法已经被证实增加免疫原性。在另一方法中，所述佐剂在保存(或者液体或者冻干形式)前，包括在制剂中。可用于本发明组合物和方法中的另外的佐剂包括RIBI(ImmunoChem，Hamilton，MT)，QS21(Aquila)，Bay(Bayer)和聚磷嗪(Polyphosphazene)(VirusResearch Institute，Cambridge，MA；WO 95/2415)。
本发明还包括制备本文所述的组合物的方法，其包括如通过Kotloff et al.，Infection and Immunity 69(2)：988-995，2001所述的类毒素制备，并使用药物配制的标准方法将所述类毒素与本文所述的一种或多种赋形剂混合。如上所述，所述组合物可以以液体或冻干形式保存。冻干可使用标准方法(见例如下面的实施例)进行，并且在施用前，冻干材料可在有或没有佐剂的无菌液体(如包括任意所需赋形剂的水、盐水或溶液)中复溶。
进一步地，本发明包括所述组合物在预防和治疗艰难梭菌感染或疾病中的用途。因此，本发明包括施用本发明的组合物以预防或治疗艰难梭菌相关性疾病，例如复发CDAD，以及CDAD特征包括腹泻(例如院内感染腹泻)和假膜性结肠炎。正如本领域所知，CDAD常常与用抗生素治疗患者，例如住院患者有关。因此，本发明的治疗方法可用于治疗这样的患者。此外，根据本发明的治疗可与抗生素(万古霉素和/或灭滴灵)治疗和/或被动免疫治疗合用(见例如美国专利号6,214,341)。本发明的施用方法还可用于生成用于患者被动免疫的艰难梭菌免疫球蛋白(见例如美国专利号6,214,341)。
本发明还包括鉴别可用于生成包括具有改善性质的艰难梭菌毒素或类毒素的组合物的赋形剂的方法。这些方法包括筛选检测，例如下面进一步描述的那些，这有利于鉴别导致减少或延迟组合物的一种或多种毒素和/或类毒素聚集，和/或增加组合物的一种或多种毒素和/或类毒素稳定性的条件。这些方法包括如下进一步所述的聚集检测和稳定性检测。此外，本发明包括使用其它的鉴别可取制剂的检测，包括溶解度、免疫原性和粘性检测。
本发明的组合物可通过例如经皮(例如肌内、静脉内或腹膜内)途径，以经本领域熟练技术人员确定合适的量和方案给药。例如，可施用100ng-1mg、100ng-500μg、1-250μg、10-100μg、25-75μg或50μg类毒素。对于预防或治疗目的，疫苗可以施用例如1、2、3或4次。当给予多剂量时，所述剂量可与另一剂量隔开例如一周至一个月。在另一实施例中，四个剂量每个50μg可以在任意8周时间内肌内给药。
实施例I
为鉴别增强艰难梭菌类毒素A和B物理稳定性的条件，筛选稳定性化合物。不同浓度以及几种组合的30 GRAS(通常被认为是安全的)化合物的筛选分两部分进行。首先，高通量聚集分析用于筛选应激条件下(pH 5-5.5下类毒素55℃孵育55或75分钟)延迟或防止类毒素聚集的化合物。进一步研究稳定两种蛋白的化合物其在导致可能类天然折叠态(pH 6.5)的条件下延迟解折叠的能力。(氢氧化铝佐剂)表面上类毒素的热稳定性用DSC监测，在某些赋形剂存在时也显示明显改善。进一步研究有效抑制两种类毒素聚集的化合物其增加蛋白结构稳定性的能力。为鉴别佐剂结合类毒素的稳定剂，进一步研究选定赋形剂其增加佐剂结合类毒素热稳定性的能力。综上所述，本研究已得到关于一系列能用于设计具有增强物理稳定性的药物制剂的条件(温度和溶质)下，游离的和佐剂结合的类毒素性能的信息。
实验材料和方法
材料
使用前述的方法，制备高纯化形式的类毒素A和B(Kotloff etal.，Infection and Immunity 69(2)：988-995，2001)。分别使用浓度1mg/mL时，类毒素A吸收单位1.173，类毒素B吸收单位0.967，通过280nm的UV吸收确定蛋白浓度。所有用到的试剂都是分析级的，从Sigma(St.Louis，MO)购买。含有150mM NaCl的磷酸钠缓冲剂(5mM、pH 5.0、5.5和6.5)用于赋形剂筛选研究。含有150mM NaCl的磷酸钠缓冲剂(5mM、pH 6.5)用于振荡和佐剂研究。对于缓冲交换，蛋白在冷藏室温度下使用
透析盒，10kDa MWCO(Pierce，Rockford，IL)透析。
赋形剂筛选研究
聚集分析。筛选有58种浓度变化和几种组合的大约30种GRAS(通常认为是安全的)化合物其抑制类毒素聚集的能力。蛋白的聚集使用96孔板读取器(Spectra Max M5，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，通过350nm处光密度测量进行监测。55℃时，对类毒素A(1.2mg/ml)于pH 5.5，对类毒素B(0.5mg/ml)于pH 5.0进行聚集检测。在这些条件下，蛋白部分解折叠并自发结合。因此，干扰这两种过程的赋形剂的任何稳定性影响可能被检测到。蛋白加到含有处于相应pH值的赋形剂的96孔板的孔中，如果是类毒素A，则样品55℃孵育75分钟，类毒素B孵育55分钟。溶液的光学密度在350nm处每5分钟监测。同时检测没有加入的化合物并且仅缓冲剂和赋形剂(空白)的蛋白溶液对照。数据分析前，对于本身的缓冲剂-赋形剂性能，通过减去空白校正测量值。每个样本求值三次。聚集的抑制百分比采用下面的表达式计算：
这里ΔOD350(E)代表赋形剂存在时蛋白OD 350nm的变化，ΔOD350(C)代表没有赋形剂时蛋白OD 350nm的变化(Peek et al.，Journal of Pharmaceutical Sciences 96(1)：44-60，2006)。
结构稳定性研究。研究类毒素溶液，在浓度0.2mg/ml时进行CD测量，在0.1mg/ml时进行荧光和UV吸收分析。在此范围内，未见浓度依赖性。每个样本重复求值两次，以确保测量的重现性。
远UV圆二色(CD)谱。使用配有6-位置Peltier温控仪的Jasco J-810分光偏振计得到CD谱。CD谱得自260-190nm，扫描速度20nm/分钟，累积为2，2秒响应时间。采用15℃/小时的温度斜坡，在温度范围10至85℃每0.5℃监测208nm的CD信号，研究蛋白(密封小管内，光径0.1cm)的热转化(熔化曲线)。CD信号通过Jasco Spectral Manager软件转化为摩尔椭圆率。使用Origin软件，从熔化曲线的S型拟合获得热转化中点温度
ANS荧光光谱。通过外源探针8-苯胺基-1-萘磺酸盐(ANS)的荧光发射监测蛋白上非极性位点的可接近性。每个样本含有比蛋白过量20倍摩尔量的ANS。372nm ANS激发后，采集400至600nm的发射光谱，步长2nm，积分时间1秒。在10至85℃温度范围内，每2.5℃采集发射光谱，5分钟平衡。从原始发射光谱减去每个相应pH值的ANS缓冲基线。使用Origin软件，从多项式拟合得到发射光谱的峰位置。
高分辨率UV吸收光谱。使用Agilent 8453紫外可见分光光度计得到高分辨率UV吸收光谱。在10至85℃范围内，每个温度孵育5分钟(足以达到平衡)，通过每2.5℃监测350nm处OD值研究蛋白聚集。
动态光散射。pH6.5时蛋白(单独的或有赋形剂存在时)的平均水力直径，采用动态光散射仪(Brookhaven Instrument Corp.，Holtzille，NY)分析。该仪器配备50mW的二极管泵激光器(λ＝532nm)，与入射光成90°角监测散射光。使用数字自相关仪(BI-9000AT)生成自相关函数。使用累积量法(基于对数正态分布数)，通过Stokes-Einstein方程从扩散系数计算水力直径。这些数据适合非负约束最小二乘算法，产生多重模态分布(MSD)。该仪器配有温控循环水浴RTE111(Neslab，Newington，NH)，在10至85℃的温度范围内监测水力直径。
差示扫描量热法(DSC)。DSC使用带自动进样器的MicroCalVPDSC(MicroCal，LLC；Northampton，MA)进行。用60℃/小时的扫描速率，得到10-90℃的仅类毒素(0.5mg/ml)或赋形剂存在下的类毒素(0.5mg/ml)的热谱图。每次扫描开始前，填充细胞在10℃平衡15分钟。分析前从每个蛋白扫描扣除仅缓冲剂的热谱图。
振荡研究。在有或没有赋形剂时研究浓度0.4mg/ml时的类毒素溶液。蛋白样品(0.4ml)置于1.5ml离心管中，在旋转器(Thermomixer R，Eppendorf AG，Hamburg，Germany)中恒定温度4℃，300rpm振荡72小时。旋转前和旋转后测量蛋白浓度和OD350nm，评估管壁吸附和聚集。样品4℃，10,000xg速度离心10分钟，测量上清的浓度和OD 350nm，以检测不溶性聚集体的形成。蛋白结构通过CD评价。每个样本重复测量两次。
佐剂研究
吸附至氢氧化铝
(氢氧化铝佐剂)。类毒素吸附到不同浓度(0.025-1mg/ml)
(Brenntag Biosectror，Frederickssund，Denmark；氢氧化铝佐剂)的能力通过建立结合等温线测定。冰箱温度下，0.4mg/ml(氢氧化铝佐剂)存在下的蛋白溶液在立式圆筒形试管旋转器旋转20分钟。样品14,000xg离心30秒，以沉淀佐剂。上清中剩余蛋白的浓度值用于建立结合曲线。赋形剂存在下，蛋白结合到
(氢氧化铝佐剂)的能力用同样的步骤测定。在这种情况下，
(氢氧化铝佐剂)加到蛋白——赋形剂溶液中。
类毒素从(氢氧化铝佐剂)解吸附。在2M NaCl存在下，评价所述类毒素蛋白从
(氢氧化铝佐剂)解吸附。类毒素
(氢氧化铝佐剂)沉淀如上所述制备。加入NaCl溶液前，用缓冲剂(pH 6.5)洗涤沉淀，去除上清中存在的蛋白。
(氢氧化铝佐剂)溶液于冰箱温度下在立式圆筒形试管旋转器中旋转20分钟。样品14,000xg离心30秒，以沉淀赋形剂。上清中蛋白的浓度用于建立解吸附等温线。
类毒素结合到(氢氧化铝佐剂)的稳定性。结合到
(氢氧化铝佐剂)的类毒素的热稳定性使用MicroCalVP-AutoDSC(MicroCal，LLC，Northampton，MA)，用DSC监测。通过上述步骤0.5mg/ml类毒素结合到0.4mg/ml
(氢氧化铝佐剂)。扫描速率60℃/小时，得到10至90℃的类毒素热谱图。每次扫描前，样品10℃平衡15分钟。分析前，从每次蛋白/佐剂扫描中减去仅
(氢氧化铝佐剂)的热谱图。
结果和讨论
赋形剂筛选研究
为研究GRAS化合物预防/延迟聚集的能力，在应激条件(在55℃孵育)下单独孵育类毒素，或在赋形剂存在下孵育类毒素。类毒素聚集以高通量方式，通过监测孵育时间过程中350nm处OD值变化进行监测。进一步用浊度变化计算％聚集抑制，类毒素A总结于表1，类毒素B总结于表2。
类毒素A的高通量聚集分析发现，超过一半的赋形剂或者延迟或防止OD 350nm随时间增加，并使得聚集抑制90％或更多(表1)。在检测的赋形剂中，2.5％白蛋白、2.5％α-环糊精、0.1％吐温80、0.3M组氨酸和0.3M赖氨酸导致突然的高OD 350nm值，这表明类毒素A在这些条件下是不溶的。类毒素A的聚集在16种其它赋形剂存在时也明显增加，其中25和50mM精氨酸/谷氨酸盐混合物、0.3M精氨酸和0.3M脯氨酸尤其作用大。
15种赋形剂存在下，类毒素B被抑制90％或更多(表2)。0.3M组氨酸或0.2M柠檬酸钠的存在引起突然的高OD 350nm。其它20种化合物在监测时间过程中，更加逐步诱导聚集。0.015M氯化钙、0.15M抗坏血酸和0.3M精氨酸存在时，观察到非常高的OD350nm增加。
在许多情况下，同样的赋形剂促进两种类毒素的聚集(表1和3)。相比之下，5％2-羟丙基γ-CD、0.01％和0.1％吐温20、0.15M天冬氨酸和0.3M胍促进仅类毒素B的聚集。此外，0.015M氯化钙存在下类毒素B的聚集比类毒素A多得多。这可能与存在氯化钙时类毒素A的C端域的已知增加的热稳定性有关(Demarest et al.，Journal of Molecular Biology 346(5)：1197-1206，2005)。在其对溶质诱导聚集的应答中类毒素之间的相异可能与相应毒素之间的结构差异性有关(Warny et al.，Lancet 366(9491)：1079-1084，2005；Just et al.，Reviews of Physiology，Biochemistry and Pharmacology 152：23-47，2005)。研究的化合物中没有肌醇磷酸，表明观察到的类毒素聚集不涉及自身催化裂解(Reineke et al.，Nature(London，United Kingdom)446(7134)：415-419，2007)。大多数检测的糖、洗涤剂和环糊精抑制类毒素的聚集。下面的赋形剂被发现有效抑制两种类毒素的聚集：20％海藻糖、20％蔗糖、10％山梨醇、10％右旋糖和20％甘油。
通过监测加热后ANS荧光、CD信号变化和DSC，进一步研究上述糖、山梨醇、甘油和两种表面活性剂(0.05％/0.1％吐温80和0.1％普朗尼克F-68)其稳定pH 6.5时蛋白质二级和三级结构的能力(图1和2)。存在20％蔗糖和20％海藻糖时，类毒素A更早开始二级结构变化，而其余的赋形剂延迟热转化～2℃(图1a)。出人意料的是，类毒素B仅在存在20％蔗糖时，表现出更早开始二级结构变化，而其余的赋形剂延迟热转化～1℃(图2a)。海藻糖和/或蔗糖存在时类毒素二级结构变化开始早，可以通过溶质稳定部分解折叠态来解释。此外，不能排除类毒素通过多糖结合到其C端糖识别重复序列而部分解折叠的可能性(Greco et al.，Nature Structural &Molecular Biology 3(5)：460-461，2006)。在第二个机制的结构不稳定的情况下，海藻糖存在下两种类毒素性能的差异可能与类毒素之间的结构差异有关(类毒素A的C末端域有30个重复序列，类毒素B有19个重复序列；Just et al.，Reviews of Physiology，Biochemistry andPharmacology 152：23-47，2005)。有趣的是注意到单糖(右旋糖)对这两种类毒素的二级结构有稳定作用。温度诱导的两种类毒素的解折叠和ANS的相关结合不受所述化合物存在的影响(图1b，2b)。洗涤剂对温度诱导的类毒素解折叠的作用用DSC监测，并且似乎不明显(图1c、2c和表3)。这些观察数据表明，赋形剂没有通过详细描述的优先排除机制强烈稳定类毒素结构，而是通过其它机制抑制其聚集，如直接阻断造成蛋白结合的蛋白/蛋白相互作用(Timasheff，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(15)：9721-9726，2002；Timasheff，Advances in Protein Chemistry 51(大分子相互作用的结合热力学)：355-432，1998)。
为研究更有活性的物质组合对二级结构的作用，通过用CD监测类毒素的热转化并用OD350nm监测聚集，鉴定从山梨醇、右旋糖和吐温80的混合物得到的结果(图3和4)。加热仅吐温80(0.05％或0.1％)或山梨醇和/或右旋糖存在时的溶液，引起其胶团结构变化，这通过CD信号减少和用OD350nm监测的增加的光散射显示(图5)。赋形剂浓度对热转化温度有近似线性效应(图6)。这支持了赋形剂通过直接抑制蛋白结合而防止聚集的假设。赋形剂对热转化的影响总结于表4和5。存在或不存在0.05％吐温80时，10％右旋糖和10％山梨醇的组合往往会最大程度地延迟两种类毒素热转化的中点(类毒素A为～4℃，类毒素B为～10℃)(图3)。这可以通过或者协同效应和/或更高总浓度的稳定性化合物解释。在类毒素B的情况下，存在物质的组合时，转化的起始温度并没有延迟，但其热转化的中点明显推迟。这可能与两种或多种赋形剂存在下类毒素B更多逐步的解折叠有关。存在稳定性化合物时，类毒素A表现出明显的聚集延迟(用OD350nm监测)(图4a)。赋形剂存在或不存在时，类毒素的水力直径也通过DLS监测(图7)。存在赋形剂时，类毒素A表现出之前观察的水力学直径增加的延迟开始(图7a-c)，而对类毒素B观测到更小的作用(图7d-f)。这些观察表明，这里检测的可能疫苗赋形剂的特定组合通过优先水合机制和直接抑制蛋白结合来稳定蛋白结构。这种稳定化合物的使用可能会增加储存过程中类毒素的物理稳定性。
振荡研究
振荡对类毒素物理稳定性的作用通过监测蛋白吸附到保存小瓶的瓶壁、不溶性聚集物的形成和蛋白热稳定性变化进行研究。存在和不存在赋形剂时，蛋白浓度、OD350nm和CD熔化的轻微变化表明，通过使用基于振荡的应力，类毒素没有较大物理变化。
佐剂研究
佐剂结合等温线显示，在低浓度时类毒素有效结合至
(氢氧化铝佐剂)(图8a)，在更高蛋白浓度时结合饱和(图8a)。0.5mg/ml的类毒素95％或更多结合到(氢氧化铝佐剂)，其允许使用DSC直接监测佐剂表面上蛋白的稳定性。加入2M NaCl后没有类毒素吸附，表明如在蛋白/氢氧化铝相互作用中观察到的，类毒素与
(氢氧化铝佐剂)的相互作用并不仅仅是静电相互作用(图8b；Gupta et al.，PharmaceuticalBiotechnology 6：229-248，1995；Seeber et al.，Vaccine 9(3)：201-203，1991；White et al.，Developments in Biologicals(Basel，Switzerland)103(Physico-Chemical Procedures for the Characterization ofVaccines)：217-228，2000)。
通过结合至
(氢氧化铝佐剂)，类毒素A在其热稳定性方面，没有表现出可检测的改变，而佐剂结合类毒素B显示Tm下降～1.4℃。大部分赋形剂存在时，结合类毒素的
(氢氧化铝佐剂)百分比略有减少(表6和7)。这表明，可能通过与或者蛋白和/或佐剂间的直接相互作用，赋形剂部分地干扰类毒素结合至
(氢氧化铝佐剂)。赋形剂存在和不存在时，结合至
(氢氧化铝佐剂)的蛋白热稳定性，类毒素A的总结于表6，类毒素B的总结于表7。赋形剂的存在或者通过降低或者通过增加转化温度，干扰佐剂结合类毒素的热稳定性。存在10％山梨醇时，两种类毒素都发现热稳定性降低，而10％山梨醇和10％右旋糖的存在降低了仅类毒素B的热稳定性。此外，吐温80只在佐剂结合类毒素B的情况下有稳定作用。另一方面，右旋糖(10％)对两种类毒素有热稳定作用。有趣的是，这三种赋形剂(10％山梨醇、10％右旋糖和0.05％或0.1％吐温80)的组合往往会提高两种佐剂结合类毒素的热转化3-4℃。
结论
稳定剂筛选的系统办法引起鉴别改善艰难梭菌类毒素A和B热稳定性的赋形剂。选定赋形剂存在下，对
(氢氧化铝)结合类毒素的研究，确定了得到佐剂结合蛋白改善的物理稳定性的条件。这项研究也产生在一系列可用于设计具有增强的保存稳定性的制剂的条件(温度、溶质)下，有关类毒素物理性能的信息。
实施例II
研究艰难梭菌类毒素疫苗配制的其它变化，努力改善疫苗的稳定性和免疫原性图谱。最新产生的疫苗临床前和临床资料表明，增加的稳定性和免疫原性图谱对支持未来的临床研究将是重要的。
pH
确定带来最大稳定性的pH是配制改进努力的一部分。研究在保存于65℃、5℃、25℃和37℃最高达28天，pH范围5.5-7.5的液体样品进行。采用下面的方法建立稳定性图谱：
1.圆二色光谱(CD)(二级结构变化)
2.圆二色光谱(CD)(熔化温度变化，Tm)，以及
3.分光光度法(OD350nm)和SEC-HPLC(聚集体形成)。
类毒素A在pH6.0以上以及类毒素B在检测的整个pH范围内，在CD谱内未观察到二级结构的变化(图9和图10；Salnikovaet al.，J.Pharm.Sci.97(9)：3735-3752，2008)。从CD测量获得的熔点数据显示，这两种类毒素最高稳定性的pH大于7.0(图11和图12)。
通过SEC-HPLC分析聚集体形成(％单体)和％回收面积时，在≤-60℃范围内，pH 6-7.5范围内类毒素A和B聚集状态几乎无变化。但是，升高温度时(尤其高于5℃)时，在整个pH范围内聚集状态的差异更明显，越低的pH值趋向于越高的聚集水平变动。如Salnikova et al.，J.Pharm.Sci.97(9)：3735-3752，2008所述，这伴随有更低pH值时350nm处光密度的增加。
评估固定保存温度(≤-60℃)(图13)下随时间变化不同pH值的聚集时，结果再次显示聚集状态在超低温时非常稳定，表明更低pH水平(＜pH 7.0)时促进聚集。考虑到这些数据，疫苗批量保存的名义pH设为7.5。
离子强度
确定带来最大稳定性的离子强度也是配制改进努力的一部分。用保持在-65℃、5℃、25℃和37℃下，在20mM柠檬酸钠缓冲液，pH 7.25以及各种浓度(0-300mM)氯化钠中最高达28天的液体样品进行研究。还检测了用5％蔗糖代替NaCl。用来建立稳定性图谱的方法是SEC-HPLC、SDS-PAGE和可见外观。
通过SDS-PAGE或可见外观，没有可辨别的明显差异。SEC-HPLC清楚地显示更高盐浓度下类毒素B的聚集。类毒素A聚集似乎是时间和温度依赖性的，唯一明显影响在50mM氯化钠时可见。数据表明，应添加0-50mM的氯化钠或5％蔗糖，以实现类毒素的最大稳定性(图14和图15)。
缓冲剂变化和赋形剂的添加
进行了初步研究，评估缓冲剂和赋形剂对类毒素稳定性的作用。从HPLC-SEC得到的数据证明，柠檬酸钠缓冲液与作为赋形剂的山梨醇提供了通过随时间变化类毒素回收百分比所确定的最大稳定性，如表8和表9所示。
冻干制剂的评价
为选择第二阶段临床试验稳定的冻干制剂，我们采用仓鼠免疫原性分析，因为它是显示对与临床免疫原性有关的产物变化最高敏感性的临床前分析。初步研究数据引起基于作为缓冲剂的柠檬酸钠和作为稳定赋形剂的山梨醇的赋形剂筛选研究。由于山梨醇制剂中观察到的低Tg’和长冻干时间，所以蔗糖作为稳定性赋形剂被引入以代替冻干制剂中的山梨醇。基于平行研究的数据，二次冻干/赋形剂筛选研究也使用磷酸钾缓冲液和海藻糖进行。从这些研究和之前的实验数据，出现三种主要制剂——一种液体和两种冻干的。
在实时和加速条件下制备冻干制剂，并评价其稳定性。类毒素A和B分开保存，以便更密切地研究其单个稳定性图谱。-65、5或42℃储存三个月后，从一种制剂(冻干，20mM柠檬酸盐、5％蔗糖、0.016％甲醛，pH7.5)得到的外观数据和仓鼠免疫原性数据如下。研究开始时以及-65、5或42℃保存三个月后，观察到制剂之间外观上略有至没有差别(表10和表11)。此外，5°和42℃保存7个月的制剂之间，或有和没有甲醛的相同制剂之间，仓鼠免疫应答没有明显不同。42℃保存是高应激条件，因为在保存过程中观察到没有变化，结果意味着制剂最有可能在较低温度下稳定相当长时间。但是，目的是估计保存期的数据的统计上的合理分析要求见到一些可量化的改变，这样可能计算出速率。由于到今天为止没有观察到变化，不能计算出真正的速率。根据这些数据，我们打算使用保存于2-8℃，冻干的由20mM柠檬酸盐、5％蔗糖、0.016％甲醛，pH 7.5中的艰难梭菌A和B组成药品制剂。
使用表12中总结的冻干周期，制备本报告中详述的稳定性研究中使用的制剂。如通过皮拉尼真空读数降至等于压力计真空读数(图16)确定的，此周期中产生的固体、白色、漂亮的块状物只是几乎完成初级干燥。对冻干周期作出以下关键改变，以解决这一问题并创建更可调比例的过程：
1.搁板温度降至-35℃，以确保药物在初级干燥过程中以更大规模保持冷冻，
2.初级干燥延长至4000分钟，以保证初级干燥在更大规模完成，以及
3.真空增加至100mT，以加速干燥并允许更多可调比率的过程。
转移到Althea Technologies，Inc.的GMP临床批次加工的冻干周期概述于表13。
理化和生物特性概述
实验确定的疫苗主要理化和生物学性质总结如下。
化学上，疫苗分别由以3∶2比率存在的艰难梭菌毒素A和B的非活性形式(类毒素)组成。艰难梭菌毒素A和B分别是类似但结构截然不同的308kDa和270kDa的大蛋白。
物理上，疫苗以≥90％纯度的溶液存在，没有可检测的聚集的迹象。
生物化学上，在蛋白质印迹分析中，疫苗的类毒素A和B对其相应的毒素A或B特异性抗体有免疫学反应。
生物学上，疫苗在仓鼠身上是免疫原性的，引起一致的和剂量依赖的血清抗体应答。疫苗类毒素A和B没有细胞毒活性。如天然毒素A观察到的，疫苗的类毒素A组分保持某些受体结合活性。
疫苗以冻干形式存在于由20mM柠檬酸钠，pH 7.5、5％蔗糖、0.016％甲醛组成的缓冲液中。产物在2-8℃保存。
冻干筛选研究
为筛选冻干制剂，采用仓鼠免疫原性进行评价。冻干在FTSLyoStar II进行。通过降低搁板温度低至足以使产物温度低于Tg’而实现冷冻。通过打开真空并保持至游离水已升华而开始初级干燥。搁板温度随后上升开始二级干燥，并通过脱去吸附水保持以进一步干燥产物。制剂在5、25和42℃的温度条件时进行稳定性研究。
表1.GRAS赋形剂对类毒素A聚集的作用。延迟/防止聚集的化合物有正的％聚集抑制值；诱导聚集的化合物有负的％聚集抑制值。
| 赋形剂浓度 | ％聚集抑制 | 赋形剂浓度 | ％聚集抑制 |
| 白蛋白2.5％ | 103* | 甘油10％ | 88 |
| α环糊精2.5％ | 101* | 2-羟丙基γ-CD 10％ | 81 |
| 吐温80-0.1％ | 100* | 吐温20-0.05％ | 73 |
| 二乙醇胺0.3M | 100 | 吐温80-0.05％ | 67 |
| 柠檬酸钠0.1M | 100 | 天冬氨酸0.15M | 65 |
| 山梨醇10％ | 100 | 吐温20-0.1％ | 64 |
| 组氨酸0.3M | 100* | 普朗尼克F-68 0.05％ | 50 |
| 蔗糖10％ | 100 | 吐温20-0.01％ | 37 |
| 海藻糖10％ | 100 | 右旋糖酐硫酸酯0.04mg/ml | 30 |
| 胍0.3M | 99 | 玻雷吉350.05％ | 26 |
| 山梨醇20％ | 99 | 右旋糖酐硫酸酯0.004mg/ml | 16 |
| 右旋糖20％ | 99 | 2-羟丙基γ-CD5％ | 10 |
| 右旋糖10％ | 99 | 白蛋白5％ | 9 |
| 海藻糖20％ | 99 | 玻雷吉350.01％ | -2 |
| 柠檬酸钠0.2M | 99 | 氯化钙0.015M | -7 |
| 甘油20％ | 98 | 普朗尼克F-680.01％ | -14 |
| 吐温80-0.01％ | 98 | 凝胶5％ | -46 |
| 白蛋白1％ | 98 | 羟基丁二酸0.15M | -52 |
| 乳糖20％ | 98 | 乳酸0.15M | -72 |
| 乳糖10％ | 97 | 凝胶2.5％ | -74 |
| 蔗糖20％ | 97 | 谷氨酸0.15M | -77 |
| 赋形剂浓度 | ％聚集抑制 | 赋形剂浓度 | ％聚集抑制 |
| 普朗尼克F-68 0.1％ | 96 | 右旋糖酐T40 0.003mg/ml | -87 |
| 2-羟丙基β-CD 10％ | 96 | 甘氨酸0.3M | -88 |
| 2-羟丙基β-CD 5％ | 96 | 右旋糖酐硫酸酯0.1mg/ml | -88 |
| 右旋糖酐T40 0.08mg/ml | 95 | 抗坏血酸0.15M | -99 |
| 玻雷吉35 0.1％ | 95 | 脯氨酸0.3M | -112 |
| 右旋糖酐T400.03mg/ml | 93 | 精氨酸0.3M | -265 |
| 乳糖10％ | 92 | Arg/Glu每种50mM | -426 |
| 赖氨酸0.3M | 89* | Arg/Glu每种25mM | -463 |
不确定度在±1％的级别上。*高最初OD 350nm。
表2.GRAS赋形剂对类毒素B聚集的作用。延迟/防止聚集的化合物有正的％聚集抑制值；诱导聚集的化合物有负的％聚集抑制值。
| 赋形剂浓度 | ％抑制聚集 | 赋形剂浓度 | ％抑制聚集 |
| α环糊精2.5％ | 100 | 右旋糖苷T40 0.03mg/ml | 35 |
| 组氨酸0.3M | 100* | 右旋糖苷T40 0.08mg/ml | 25 |
| 吐温80-0.1％ | 100 | 2-羟丙基γ-CD 10％ | 12 |
| 吐温80-0.05％ | 100 | 玻雷吉35 0.05％ | 10 |
| 白蛋白1％ | 99 | 普朗尼克F-68 0.05％ | 6 |
| 右旋糖20％ | 99 | 甘油10％ | 4 |
| 白蛋白5％ | 98 | 右旋糖苷硫酸酯0.04mg/ml | 3 |
| 柠檬酸钠0.2M | 98* | 右旋糖苷硫酸酯0.004mg/ml | 2 |
| 赋形剂浓度 | ％抑制聚集 | 赋形剂浓度 | ％抑制聚集 |
| 海藻糖20％ | 98 | 吐温20-0.05％ | 0 |
| 柠檬酸钠0.1M | 97 | 2-羟丙基γ-CD 5％ | -5 |
| 山梨醇20％ | 97 | 吐温20-0.01％ | -5 |
| 蔗糖20％ | 96 | 普朗尼克F-68 0.01％ | -8 |
| 二乙醇胺0.3M | 96 | 吐温20-0.1％ | -13 |
| 右旋糖10％ | 95 | 玻雷吉35 0.01％ | -25 |
| 山梨醇10％ | 92 | 甘氨酸0.3M | -26 |
| 白蛋白2.5％ | 87 | 凝胶2.5％ | -36 |
| 2-羟丙基β-CD5％ | 79 | 右旋糖苷硫酸酯0.1mg/ml | -38 |
| 2-羟丙基β-CD10％ | 78 | Arg/Glu每种50mM | -39 |
| 甘露醇10％ | 76 | 谷氨酸0.15M | -41 |
| 蔗糖10％ | 71 | Arg/Glu每种25mM | -42 |
| 甘油20％ | 71 | 天冬氨酸0.15M | -50 |
| 海藻糖10％ | 69 | 凝胶5％ | -56 |
| 普朗尼克F-680.1％ | 68 | 脯氨酸0.3M | -57 |
| 玻雷吉350.1％ | 63 | 右旋糖苷T40 0.003mg/ml | -59 |
| 乳糖20％ | 52 | 乳酸0.15M | -80 |
| 羟基丁二酸0.15M | 44 | 胍0.3M | -96 |
| 吐温80-0.01％ | 40 | 氯化钙0.015M | -141 |
| 赋形剂浓度 | ％抑制聚集 | 赋形剂浓度 | ％抑制聚集 |
| 乳糖10％ | 39 | 抗坏血酸0.15M | -223 |
| 赖氨酸0.3M | 37 | 精氨酸0.3M | -280 |
不确定度在±1％的级别上。*高最初OD350nm。
表3.溶质(洗涤剂)对类毒素A和B热稳定性的影响。热稳定性(Tm)由DSC监测。Tm是对应于热转化最大峰位置的温度。
| 蛋白 | Tm(℃) |
| 类毒素A | 59.8±0.0 |
| 类毒素A+0.05％吐温80 | 59.1±0.4 |
| 类毒素A+0.1％普朗尼克F68 | 59.1±0.4 |
| 类毒素B | 55.8±0.0 |
| 类毒素B+0.05％吐温80 | 56.1±0.3 |
| 类毒素B+0.1％普朗尼克F68 | 58.0±0.3 |
表4.赋形剂对类毒素A的热转化温度中点(Tm)的影响。热转化作为温度的函数通过208nm的CD信号监测。每次测量重复两次，并有～0.5℃的不确定度
| 存在赋形剂时的类毒素A | Tm | Tm差异 |
| 类毒素A | 59.8 | 0.0 |
| 20％海藻糖 | 59.4 | -0.5 |
| 20％蔗糖 | 63.1 | 3.3 |
| 20％甘油 | 62.4 | 2.6 |
| 0.1％普朗尼克F68 | 61.1 | 1.3 |
| 10％山梨醇 | 62.4 | 2.6 |
| 10％右旋糖 | 62.4 | 2.6 |
| 存在赋形剂时的类毒素A | Tm | Tm差异 |
| 0.05％吐温80 | 59.9 | 0.0 |
| 5％山梨醇+0.05％吐温80 | 60.4 | 0.6 |
| 10％山梨醇+0.05％吐温80 | 62.3 | 2.5 |
| 15％山梨醇+0.05％吐温80 | 62.4 | 2.6 |
| 5％右旋糖+0.05％吐温80 | 60.2 | 0.4 |
| 10％右旋糖+0.05％吐温80 | 62.3 | 2.5 |
| 15％右旋糖+0.05％吐温80 | 62.5 | 2.7 |
| 2.5％山梨醇+2.5％右旋糖+0.05％吐温80 | 60.2 | 0.4 |
| 5％山梨醇+5％右旋糖+0.05％吐温80 | 61.3 | 1.5 |
| 10％山梨醇+10％右旋糖+0.05％吐温80 | 63.5 | 3.7 |
| 0.1％吐温80 | 59.0 | -0.8 |
| 10％山梨醇+0.1％吐温80 | 60.6 | 0.7 |
| 10％右旋糖+0.1％吐温80 | 61.5 | 1.7 |
| 2.5％山梨醇+2.5％右旋糖+0.1％吐温80 | 60.0 | 0.2 |
| 5％山梨醇+5％右旋糖+0.1％吐温80 | 60.5 | 0.7 |
| 10％山梨醇+10％右旋糖+0.1％吐温80 | 62.1 | 2.3 |
| 2.5％山梨醇+2.5％右旋糖 | 60.8 | 0.9 |
| 5％山梨醇+5％右旋糖 | 61.7 | 1.8 |
| 10％山梨醇+10％右旋糖 | 63.9 | 4.0 |
| 15％山梨醇+15％右旋糖 | 64.6 | 4.8 |
| 20％山梨醇+20％右旋糖 | 66.6 | 6.7 |
| 20％山梨醇+10％右旋糖 | 64.9 | 5.1 |
| 存在赋形剂时的类毒素A | Tm | Tm差异 |
| 10％山梨醇+20％右旋糖 | 50.1 | -9.7 |
表5.赋形剂对类毒素B热转化温度中点(Tm)的影响。热转化作为温度的函数通过208nm的CD信号监测。每次测量重复两次，并有～0.5℃的不确定度。
| 赋形剂存在时的类毒素B | Tm | Tm差异 |
| 类毒素B | 55.8 | 0.0 |
| 20％海藻糖 | 60.3 | 4.5 |
| 20％蔗糖 | - | - |
| 20％甘油 | 58.6 | 2.8 |
| 0.1％普朗尼克F68 | 56.2 | 0.4 |
| 10％山梨醇 | 56.6 | 0.8 |
| 10％右旋糖 | 57.3 | 1.6 |
| 0.05％吐温80 | 55.1 | -0.7 |
| 5％山梨醇+0.05％吐温80 | 56.7 | 0.9 |
| 10％山梨醇+0.05％吐温80 | 63.2 | 7.4 |
| 15％山梨醇+0.05％吐温80 | 64.0 | 8.2 |
| 5％右旋糖+0.05％吐温80 | 59.1 | 3.3 |
| 10％右旋糖+0.05％吐温80 | 70.8 | 15.0 |
| 2.5％山梨醇+2.5％右旋糖+0.05％吐温80 | 56.7 | 0.9 |
| 5％山梨醇+5％右旋糖+0.05％吐温80 | 63.5 | 7.7 |
| 10％山梨醇+10％右旋糖+0.05％吐温80 | 69.1 | 13.3 |
| 0.1％吐温80 | 53.6 | -2.2 |
| 10％山梨醇+0.1％吐温80 | 58.5 | 2.7 |
| 赋形剂存在时的类毒素B | Tm | Tm差异 |
| 10％右旋糖+0.1％吐温80 | 62.6 | 6.9 |
| 2.5％山梨醇+2.5％右旋糖+0.1％吐温80 | 60.0 | 4.2 |
| 5％山梨醇+5％右旋糖+0.1％吐温80 | 56.5 | 0.8 |
| 10％山梨醇+10％右旋糖+0.1％吐温80 | 60.8 | 5.1 |
| 5％山梨醇+5％右旋糖 | 56.5 | 0.7 |
| 10％山梨醇+10％右旋糖 | 65.3 | 9.6 |
| 15％山梨醇+15％右旋糖 | 60.1 | 4.4 |
| 20％山梨醇+20％右旋糖 | 63.1 | 7.3 |
| 20％山梨醇+10％右旋糖 | 38.0 | -17.8 |
| 10％山梨醇+20％右旋糖 | 61.2 | 5.5 |
表6.存在或不存在赋形剂(除另有指明外)时，结合至(氢氧化铝佐剂)的类毒素A的热稳定性。热稳定性(Tm)通过DSC检测，Tm表示对应于热转化峰位置的温度。测量每种条件下结合至佐剂的类毒素的百分比，不确定度为1％。每个条件重复研究两次。
表7.存在或不存在溶质(除另有指明外)时，结合至
(氢氧化铝佐剂)的类毒素B的热稳定性。热稳定性(Tm)通过DSC监测。Tm表示对应于热转化峰位置的温度。测量每种条件下结合至佐剂的蛋白的百分比，不确定度为1％。每个条件重复研究两次。
表8
表9
表10.不同温度下保存后冻干制剂的外观
表11.不同温度下保存后冻干制剂的免疫原性(仓鼠中血清抗毒素A和B IgG效价)。
H2CO＝甲醛
表12.
| 冷冻 |
| 使搁板以1℃/分钟渐至5℃。保持30分钟。 |
| 使搁板以1℃/分钟渐至-5℃。保持30分钟。 |
| 使搁板以5℃/分钟渐至-50℃。保持90分钟。 |
| 打开真空，设定点60mT。 |
| 初级干燥 |
| 使搁板以1℃/分钟渐至-40℃。保持300分钟。真空度等于60mT。 |
| 使搁板以0.5℃/分钟渐至-34℃。保持1100分钟。 真空度等于60mT |
| 次级干燥 |
| 冷冻 |
| 使搁板以0.2℃/分钟渐至5℃。保持480分钟。真空度等于60mT。* |
| 使搁板以0.1℃/分钟渐至25℃。保持300分钟。真空度等于60mT。 |
| 维持步骤 |
| 使搁板以0.5℃/分钟渐至0℃。保持9999分钟。真空度等于100mT。 |
| 回填 |
| 将干燥净化的N 2 回填至600,000mT。 |
表13.
| 冷冻 |
| 使搁板以1℃/分钟渐至5℃。保持30分钟。 |
| 使搁板以0.5℃/分钟渐至-45℃。保持120分钟。 |
| 打开真空，设定点100mT |
| 初级干燥 |
| 使搁板以0.2℃/分钟渐至-35℃。保持4000分钟。真空度设定点100mT |
| 次级干燥 |
| 使搁板以0.2℃/分钟渐至5℃。保持480分钟。真空度设定点100mT |
| 使搁板以0.2℃/分钟渐至25℃。保持300分钟。真空度设定点100mT |
| 维持步骤 |
| 冷冻 |
| 使搁板以0.5℃/分钟渐至0℃。保持9999分钟。真空度设定点100mT |
| 回填 |
| 将干燥净化的N2回填至600,000mT |
以上引用的所有文献的内容都在此引作参考。本文使用的单数形式不排除表示相应的复数形式，除非上下文表明相反的意思。因此，例如如果权利要求写明使用毒素、类毒素或赋形剂，还可以解释为包含使用超过一种毒素、类毒素或赋形剂，除非另有说明。其它实施方案在以下权利要求的范围内。
Claims (43)
1.包含艰难梭菌的毒素或类毒素，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，其中相对于没有所述一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂增加所述毒素或类毒素的热稳定性，和/或减少或延迟所述毒素和/或类毒素的聚集。
2.权利要求1所述的方法，其中相对于没有所述一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂减少或延迟所述毒素或类毒素的聚集50％或更多。
3.权利要求1所述的方法，其中相对于没有所述一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂增加所述毒素或类毒素的所述热稳定性0.5℃或更多。
4.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含艰难梭菌毒素A和B的类毒素。
5.权利要求4所述的组合物，其中所述类毒素A和B在所述组合物中出现的比率为5∶1(A∶B)至1∶5(A∶B)。
6.权利要求5所述的组合物，其中所述类毒素A和B在所述组合物中出现的比率为3∶1至3∶2，或1∶1(A∶B)。
7.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
8.权利要求1所述的组合物，其进一步包含佐剂。
9.权利要求8所述的组合物，其中所述佐剂包含铝化合物。
10.权利要求9所述的组合物，其中所述铝化合物是氢氧化铝化合物。
11.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是液体形式。
12.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是冻干、喷雾干燥或泡沫干燥的干粉形式。
13.权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种药学上可接受的赋形剂选自缓冲剂、张度剂、简单糖、糖、糖聚合物、氨基酸、寡肽、聚氨基酸、多元醇及其醚、洗涤剂、脂质、表面活性剂、抗氧化剂、盐、白蛋白、明胶、甲醛或其组合。
14.权利要求13所述的组合物，其中所述缓冲剂选自柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸、组氨酸、碳酸盐和重碳酸盐，并且浓度为5-100mM。
15.权利要求13所述的组合物，其中所述张度剂是甘露醇，浓度为1-50mM。
16.权利要求13所述的组合物，其中所述糖选自山梨醇、海藻糖和蔗糖，浓度为1-30％。
17.权利要求13所述的组合物，其中所述氨基酸、寡肽或聚氨基酸浓度最高达100mM。
18.权利要求13所述的组合物，其中所述多元醇选自甘油、聚乙二醇及其醚，分子量200-10,000，浓度最高达20％。
19.权利要求13所述的组合物，其中所述洗涤剂和脂质选自脱氧胆酸钠、吐温20、吐温80和普朗尼克，浓度最高达0.5％。
20.权利要求13所述的组合物，其中所述糖聚合物选自右旋糖酐和纤维素。
21.权利要求13所述的组合物，其中所述盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁和醋酸镁，最高达150mM。
22.权利要求13所述的组合物，其中所述甲醛的存在量为0.0-0.02％。
23.权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种赋形剂包含一种或多种表1、表2、表8或表9所列的赋形剂。
24.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含柠檬酸钠或柠檬酸钾。
25.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含磷酸钠或磷酸钾。
26.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含蔗糖。
27.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含柠檬酸钠或柠檬酸钾和蔗糖。
28.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含磷酸钠或磷酸钾和蔗糖。
29.权利要求24至28中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含甲醛。
30.权利要求29所述的组合物，其中所述组合物包含艰难梭菌类毒素A和B、5-100mM柠檬酸钠或柠檬酸钾、2-20％蔗糖，以及≤0.020％甲醛，pH 5.5-8.5。
31.权利要求30所述的组合物，其中所述组合物包含艰难梭菌类毒素A和B、10-30mM柠檬酸钠或柠檬酸钾、2-10％蔗糖，以及≤0.020％甲醛，pH 6.5-8.0。
32.权利要求31所述的组合物，其中所述组合物包含艰难梭菌类毒素A和B、20mM柠檬酸钠、5％蔗糖，以及≤0.016％甲醛，pH 7.5。
33.权利要求29所述的组合物，其中所述组合物包含艰难梭菌类毒素A和B、5-100mM磷酸钠或磷酸钾、2-20％蔗糖，以及≤0.020％甲醛，pH 5.5-8.5。
34.权利要求33所述的组合物，其中所述组合物包含艰难梭菌类毒素A和B、10-30mM磷酸钠或磷酸钾、2-10％蔗糖，以及≤0.020％甲醛，pH 6.5-8.0。
35.权利要求29所述的组合物，其中所述组合物包含艰难梭菌类毒素A和B、20mM磷酸钾、5％蔗糖，以及≤0.016％甲醛，pH7.5。
36.权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种赋形剂包含山梨醇。
37.权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种赋形剂包含右旋糖。
38.权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种赋形剂包含吐温80。
39.权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种赋形剂包含山梨醇、右旋糖和吐温80。
40.制备包含艰难梭菌的毒素或类毒素以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物的方法，其中相对于没有所述一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂增加所述毒素或类毒素的热稳定性，和/或减少或延迟所述毒素和/或类毒素的聚集，所述方法包含提供艰难梭菌的毒素或类毒素，并将艰难梭菌的所述毒素或类毒素与所述一种或多种药学上可接受的赋形剂混合。
41.在受试者中诱导对艰难梭菌免疫应答的方法，所述方法包含将权利要求1至39中任一项的组合物施用于受试者。
42.权利要求41所述的方法，其中所述患者尚未患有，但有罹患艰难梭菌疾病的风险。
43.权利要求41所述的方法，其中所述患者患有艰难梭菌疾病。
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