CN105611942A - 针对艰难梭菌免疫的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及在成人受试者中诱导针对艰难梭菌毒素A和毒素B的免疫应答的方法。所述受试者可能有原发症状性艰难梭菌感染的风险。在一些实施方案中，方法是在有原发症状性艰难梭菌感染风险的成人受试者中诱导针对艰难梭菌毒素A和毒素B的免疫应答，并包括至少3次将包含艰难梭菌毒素A和毒素B的组合物给予受试者，每次给予相隔约7天。

Description

针对艰难梭菌免疫的组合物和方法

相关申请

本申请要求2013年6月14日提交的美国顺序号61/835,246的优先权，其通过引用以其整体结合到本公开内容中。

发明领域

本公开内容涉及用于在成人受试者(例如有发生原发症状性艰难梭菌感染风险的成人)中诱导针对艰难梭菌(C.difficile)毒素A和毒素B的免疫应答的方法。

发明背景

艰难梭菌(Clostridiumdifficile/C.difficile)是一种革兰氏阳性产芽孢的厌氧细菌。艰难梭菌的病理作用由所分泌的毒素A和B介导，其引起结肠粘膜损害和炎症。虽然艰难梭菌感染(CDI)在一些患者中是无症状的，但是CDI可导致急性腹泻和结肠炎，在严重的情况下可导致假膜性结肠炎和中毒性巨结肠。在接受改变正常肠菌群的药物的住院患者中，艰难梭菌是医源性腹泻和结肠炎的临床上的重要原因，在社区中CDI的报告日益增多。症状性艰难梭菌感染的风险因素包括抗生素治疗、高龄、基础疾病和在长期护理机构中住院治疗或居住。

进行了早期临床试验以评价艰难梭菌类毒素疫苗形式的安全性和免疫原性。在健康成人(18-55岁)和老年人(≥65岁)志愿者中，早期评价的包含类毒素A和B的艰难梭菌疫苗被证明是安全的，并且诱导对毒素A和毒素B两者的免疫应答(Greenberg等,Vaccine30:2245-2249(2012)；Foglia等,Vaccine,30:4307-4309(2012))。所述研究中的最大剂量为50μg，且毒素A与毒素B的比率为3:1。在第0、28和56天给予候选疫苗。在健康成人和老年人志愿者组两者中在多剂量后毒素A的血清转化高于毒素B的血清转化，而且观察到与较年轻人组相比，老年人受试者中的抗体应答更快地下降。由于老年人常常免疫受损(immunocomprised)，本领域普通技术人员将此视作是主要问题。依然需要用于存在症状性艰难梭菌感染风险的成人(尤其在老年人中)的艰难梭菌疫苗。

发明概述

本公开内容涉及用于在成人受试者(例如有原发症状性艰难梭菌感染风险的成人)中诱导针对艰难梭菌毒素A和毒素B的免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述方法可包括使用一次或多次给予(例如3次)通过任何合适的途径(例如肌内)，以有效的类毒素A:B比率(例如按重量计约3:1、3:2或1:1类毒素A:类毒素B的任一种)和足够的纯度(例如至少约50-约100%，例如约90-100%(w/w))，将包含有效量的艰难梭菌类毒素A和类毒素B(例如约40-约500μg/剂量(w/w，组合物中类毒素A和B的总量))的组合物(例如疫苗)给予受试者，彼此被适当分隔(例如相隔约1-10天，例如约7天)的多剂量给药方案的各剂量可由本领域普通技术人员按本文所述确定。在一个实施方案中，所述方法可包括第一、第二和第三次给予，其中第二次给予为第一次给予后约7天，第三次给予为第一次和/或第二次给予后至少约30天和/或至少约180天。在多剂量方案的优选实施方案中，第一剂可在第一剂后约7天给予，和/或第三剂在第一剂后约30天(或第2剂后约20-25天)给予。在一些实施方案中，所述方法可包括一种或多种佐剂(例如铝佐剂)。在某些实施方案中，所述方法可包括将组合物给予有感染风险的人类受试者。在一些实施方案中，人类受试者可为至少约40、50、65岁或更年长的任一种。在一些实施方案中，人类受试者可为约40-约65岁。在一些实施方案中，人类受试者可为约65-75岁或更年长。在某些这类实施方案中，人类受试者在第一次给予前的12个月时间内，可能有至少一次或两次留医，每次持续至少约24、48或72小时或更久的任一种，并接受全身(非局部)抗生素；和/或预期具有用于在第一次给予60天内进行计划的外科手术的住院患者的住院治疗。在一些实施方案中，预期的/即将发生的留院/住院治疗可按计划持续72小时或更久，并且可用于涉及肾/膀胱/泌尿系统、肌骨骼系统、呼吸系统、循环系统和/或中枢神经系统的至少一个的手术。优选通过这些方法诱导的免疫应答足以预防和/或治疗和/或改善和/或降低症状性艰难梭菌感染的风险。本领域的普通技术人员可从本文提供的描述推导其它实施方案。

发明详述

本公开内容涉及可用于治疗、改善症状性艰难梭菌感染、降低其风险和/或预防症状性艰难梭菌感染的组合物和方法。如上所述，本领域普通技术人员遇到设计针对由艰难梭菌引起的感染的有效疫苗的困难。有效疫苗可以是例如治疗、改善症状性艰难梭菌感染、降低其风险和/或预防症状性艰难梭菌感染的有效疫苗。通过本文所述组合物和方法出乎意料地解决了这些问题。本文描述了这些出乎意料的有效解决方法的各种实施方案。提供了示例性组合物。例如，提供使用一次或多次给予(例如3次给予或剂量)通过任何合适的途径(例如肌内)，以有效的类毒素A:B比率(例如以重量计约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%，3:1、3:2或1:1类毒素A:类毒素B)和足够的纯度(例如至少约50-约100%，例如约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或90-100%(w/w)的任一种)的包含有效量的艰难梭菌类毒素A和类毒素B(例如约40-约500μg/剂量，例如约40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500μg/剂量的任一种，例如约50-约100μg/剂量(w/w，组合物中类毒素A和B的总量))的组合物，其中多剂量给药方案的各剂量彼此被适当地分隔(例如至少约1-约10天例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天的任一种，例如约7天)。本领域的普通技术人员应了解，剂量之间的时间长度(时间间隔)随个体变化，且该间隔应足够长(例如以天测量)，使得之前剂量的免疫应答既有时间发生(例如致敏)，又不以任何方式受到随后剂量(例如一次或多次加强剂量)抑制。例如，一个具体个体在剂量之间可能需要至少约7天(例如5-8天)，而另一个体可能只需要至少约4天(例如3-5天)。因此，在一些实施方案中，给药间隔可改变达例如约10-20%。本领域普通技术人员应了解剂量之间的时间可能需要按本文所述调节。在一些实施方案中，第二次给予为在第一次给予(例如第0天)后的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，第三次给予为第一次给予后的至少约20-200天(例如约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200天，例如约30或约180天)。例如，所述方法可包括第一、第二和/或第三次给予，其中第二次给予为第一次给予后至少7天，第三次给予为第一或第二次给予后至少约30天和/或至少约180天。在一些实施方案中，第二次给予为第一次给予后约7天，第三次给予为第一次给予后约30天。在采用所述方法将所述组合物给予宿主/受试者时，通常观察到免疫应答，这通常包括体液免疫应答，并可包括细胞免疫应答。在某些实施方案中，所述方法可包括将免疫原性组合物给予有感染风险的人类受试者。在一些实施方案中，人类受试者可为至少约40、50、65岁或更年长的任一种。在一些实施方案中，人类受试者可为约40-约65岁。在一些实施方案中，人类受试者可为65-75岁。因此，还提供用于给予组合物的方法。用于制备组合物的方法描述于本文，且对于本领域普通技术人员是可获得的。根据本文提供的描述，其它实施方案将是清楚的。

本公开内容还描述了通过给予受试者(例如人类)包含艰难梭菌的一种或多种抗原的组合物以针对艰难梭菌使受试者免疫的方法。例如，合适的组合物可包含含或不含佐剂(例如氢氧化铝)、类毒素A:类毒素B比率大致约3:2、共约50或约100μg(或约50-100μg)艰难梭菌类毒素(类毒素A和类毒素B)。出于比较目的，可将含有抗原的组合物给予一组受试者，并将安慰剂组合物(例如0.9%生理盐水)给予(例如在同一方案中)另一组。可在特定日期(例如在第一次给予后第0、14、30、60、180和/或210天，和/或多达1000天)获得受试者的免疫学数据和安全性数据。给予组合物可发生在例如第0天(第一次给予)、约第7天(第二次给予)、约第30天(第三次给予)和/或约第180天(备选第三次给予或第四次给予)。

如上所述，组合物可包含有效的类毒素A:B比率(例如以重量计约3:1、3:2或1:1类毒素A:类毒素B的任一种)、足够的纯度(例如约90%或更高纯度(w/w))下的艰难梭菌类毒素A和类毒素B。例如，组合物可包含类毒素A:类毒素B比率大致约3:2的艰难梭菌类毒素A和B的高度纯化(例如>90%(w/w/))的制剂。所述组合物可采用可获得的任何制备方法制备(例如2013年3月15日提交的美国临时申请顺序号61/790,423、2014年3月14日提交的共同待审的PCT/US2014/029035、2013年3月15日提交的61/793,376和/或2014年3月14日提交的共同待审的PCT/US2014/029070中所述)，其每一个以其整体结合到本公开内容中)。如本公开内容的实施例中所述，毒素A和B经从艰难梭菌的培养物中纯化，灭活，并以目标的3:2比率混合，并且在诱导和/或提高针对艰难梭菌毒素A和B的免疫应答时显示是有效的。然而如上所述，可将类毒素A和B以任何有效的量和/或有效的比率组合(有效的表示例如提供有效的疫苗)。

本文所用术语“艰难梭菌类毒素”是指被部分或完全灭活的艰难梭菌毒素(毒素A或毒素B)。通过例如体外细胞毒性测定法或通过动物毒性测量，如果与未处理的毒素相比具有较少毒性(例如100%、99%、98%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或更少的毒性或它们之间的任何值)，则毒素被灭活。可通过从艰难梭菌培养物中纯化毒素并通过化学法(例如甲醛、戊二醛、过氧化物或氧处理)使毒素灭活，来产生艰难梭菌类毒素。或者，可采用重组方法，产生毒性缺乏或降低的野生型或突变型艰难梭菌毒素。通过遗传方法制备类毒素的方法是本领域众所周知的。例如，可进行导致毒性降低的突变。还可制备缺乏特殊区域以降低毒性的野生型或突变型艰难梭菌毒素。

组合物(其可为疫苗)可作为冻干制剂提供，在规定时，所述冻干制剂可在临床基地用稀释剂复溶，与佐剂(例如铝佐剂例如磷酸铝或氢氧化铝)或注射用水(WFI)混合。稀释剂可为例如任何药学上可接受的稀释剂(例如20mM柠檬酸钠、5%蔗糖和0.016%甲醛；10mM柠檬酸盐、4%蔗糖、0.008%甲醛、0.57%氯化钠)。佐剂可包含例如合适浓度(例如约800-1600μg/mL的任一种)的佐剂，例如在WFI中包含铝(例如氢氧化铝或磷酸铝)的佐剂。例如，佐剂(例如在0.57%氯化钠中的800-1600μg/mL氢氧化铝)可用作稀释剂以使冻干制剂复溶。WFI可用来稀释冻干疫苗用于未加佐剂的制剂。最后的给药溶液可包含例如组合物/疫苗、稀释剂和佐剂。如上所述，安慰剂还可以液体制剂(例如0.9%生理盐水)提供。每次递送剂量的研究药物(疫苗或安慰剂)的体积可为约0.5mL。可通过任何合适的途径(例如皮下、静脉内、肌内、腹膜内、皮内、结节内、鼻内、口服)给予制剂。

可通过本领域技术人员已知的各种方法的任一种，来评价本文所述材料(例如组合物)和/或方法的任一种的有用性(例如免疫原性)。本文所述测定法的任一种或多种或任何其它的一种或多种合适的测定法可用来测定本文所述的任何材料用于预期目的的适合性。应了解，这些方法是示例性的和非限制性的；其它测定法也可能是适宜的。

例如，本文所述组合物在给予受试者时通常诱导和/或提高针对艰难梭菌的抗体的产生。可采用本领域普通技术人员可获得的任何方法，检测受试者中的所述抗体。例如，如实施例部分所述，血清可获自受试者并通过EL1SA测试以检测抗艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫球蛋白G型(IgG)抗体(例如“初级免疫原性数据”)。可使试验血清中存在的抗体与微量滴定板各孔所吸附的毒素A或B抗原反应。在结合第二抗-IgG(例如抗人IgG)抗体-酶缀合物后，可采用比色底物反应，测定与抗原包被孔结合的抗体的量。然后通常加入引起与结合抗原的抗体成正比的比色变化的酶底物。可通过从标准曲线推断，得到血清中抗体的浓度，所述标准曲线由具有规定的IgG单位量(ELISA单位(EU)/mL))的参比标准血清的多个稀释液产生。

毒素中和测定法(TNA)也可用来定量艰难梭菌毒素的中和抗体。在该测定法中，可将连续稀释的血清与固定量的艰难梭菌毒素A或B一起温育。然后可加入试验细胞(例如Vero细胞)，将血清-毒素-细胞混合物在合适的条件(例如37℃达6天)下温育。血清中和艰难梭菌毒素的细胞毒效应的能力可通过细胞存活力测定并与之相关。该测定法利用封闭培养孔中酸代谢物的蓄积作为正常细胞呼吸的指示。在暴露于毒素的细胞中，代谢和CO₂产生降低；因此，如细胞培养基中的酚红pH指示剂所示，pH升高(例如至7.4或更高)。在该pH下，培养基显出红色。然而，细胞对照或暴露于已被抗体中和的毒素的细胞，以正常量代谢并产生CO₂；结果，pH保持(例如在7.0或以下)，并且在该pH下，培养基显出黄色。因此，正如它们保持某一pH(例如7.0或更低)的能力所证实的一样，艰难梭菌毒素中和抗体与血清中和细胞中艰难梭菌毒素的代谢作用的能力相关联。可使用读板仪测量(例如在562nm-630nm下)培养基的颜色变化，以进一步计算在艰难梭菌毒素介导的细胞毒性50%抑制下的抗毒素中和抗体效价。

在某些实施方案中，优选在适当给予受试者后，本文所述组合物显示免疫原性性质(例如诱导可检出的和/或中和性和/或保护性免疫应答)。与未向其给予所述物质的个体相比，如上所述和/或通过显示在向其给予本文所述材料的个体(例如人类或其它动物)中，病原体(例如艰难梭菌)的感染受到影响(例如降低)，可证明中和性和/或保护性免疫应答的存在。例如，可通过任何合适的途径和方案，将本文所述组合物给予一个或多个试验受试者(例如人或非人)，然后在合适的时间量(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周)后用致病生物攻击。在给予和/或攻击后，可监测一个或多个动物的免疫功能(例如抗体产生、T细胞活性)。可采用例如抗体ELISA和/或病原体中和测定法，分析血清的总抗体应答或特定亚型的表达。可通过例如在用抗原重新刺激后测量IFN-γ产生，来测量T细胞活性。然后可对数据进行统计分析(例如Fisher精确检验、Wilcoxon检验、Mann-Whitney检验)以确定在影响免疫应答中所述材料是否具有有效性。

在给予宿主之前，可将本文所述的艰难梭菌类毒素A和/或B与一种或多种药学上可接受的载体组合以提供组合物。药学上可接受的载体是非在生物学或其它方面不合需要的材料，例如，可将所述材料给予受试者，而不引起任何不合需要的生物作用或以有害方式与药物组合物中所包含的任何其它成分相互作用。自然地选择载体以使活性成分的任何降解减到最小，并使在受试者中的任何不良副作用减至最小，正如本领域技术人员所熟知的那样。合适的药用载体及其制剂描述于例如Remington's:TheScienceandPracticeofPharmacy,第21版,DavidB.Troy编辑,LippicottWilliams&Wilkins(2005)，并且可能是适当的。通常，将适量的药学上可接受的盐用于制剂中以使得制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于无菌水、盐水、缓冲溶液，如林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的pH一般为约5-约8或约7-约7.5。其它载体包括持续释放制剂，例如固体疏水性聚合物的半透性基质，该聚合物含有多肽或其片段。基质可呈有形物件的形式，例如膜、脂质体或微粒。对本领域技术人员而言显而易见的是，根据例如给药途径和所给予组合物的浓度，某些载体可能是更优选的。载体是适于给予人或其它受试者的那些。

药物组合物还可包括增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、佐剂、免疫刺激剂。药物组合物还可包括一种或多种活性成分例如抗微生物剂、抗炎剂和麻醉剂。还可包括佐剂(例如如本文所述或另可获得的)以刺激或提高免疫应答。

如上所述，组合物还可包含一种或多种佐剂。可包括佐剂以刺激或提高免疫应答。佐剂的合适类别的非限制性实例包括以下的那些：凝胶型佐剂(即氢氧化铝/磷酸铝(“明矾佐剂”)、磷酸钙、微生物源(胞壁酰二肽(MDP))、细菌外毒素(霍乱毒素(CT)、天然霍乱毒素亚基B(CTB)、大肠杆菌(E.coli)不稳定毒素(LT)、百日咳毒素(PT)、CpG寡核苷酸、BCG序列、破伤风类毒素、例如大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌(Salmonellaminnesota)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或Shigellaexseri的单磷酰脂质A(MPLA)、粒子佐剂(生物可降解的、聚合物微球)、免疫刺激复合物(ISCOMs))、基于油乳剂和表面活性剂的佐剂(弗氏不完全佐剂(FIA)、微流化乳剂(MF59、SAF)、皂苷(QS-21))、合成的(胞壁酰肽衍生物(莫拉丁酯、苏氨酰-MDP)、非离子嵌段共聚物(L121)、聚磷腈(PCCP)、合成多核苷酸(聚A:U、聚I:C)、沙利度胺衍生物(CC-4407/ACTIMID))、RH3-配体或聚丙交酯乙交酯(PLGA)微球等。片段、同源物、衍生物和与这些毒素的任一个的融合物也是合适的，条件是它们保留佐剂活性。佐剂的合适的突变体或变体描述于例如WO95/17211(Arg-7-LysCT突变体)、WO96/6627(Arg-192-GlyLT突变体)和WO95/34323(Arg-9-Lys和Glu-129-GlyPT突变体)。可以使用的其它LT突变体包括例如Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-110-Asp和Glu-112-Asp突变体。金属盐佐剂例如明矾佐剂作为提供具有佐剂活性的安全赋形剂是本领域众所周知的。认为这些佐剂的作用机制包括抗原库的形成，使得抗原在给予后可保留在注射部位长达3周，还有更容易被抗原呈递细胞吸收的抗原/金属盐复合物的形成。除铝以外，使用其它金属盐来吸收抗原，包括锌、钙、铈、铬、铁和铍的盐。铝的氢氧化物和磷酸盐是最常用的。含有铝盐、抗原和其它免疫刺激剂的制剂或组合物是本领域已知的。免疫刺激剂的实例为3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。在一些实施方案中，一种或多种佐剂可为铝盐、乳剂、脂质体、聚合物的任一种或多种和/或其组合。例如，合适的佐剂可包括以下的任一种或多种：阴离子聚合物、包含脂质体和Toll样7/8受体激动剂的佐剂、乙基DOPC脂质体、DC-chol、包含Toll样7/8受体激动剂或Toll样4受体激动剂的角鲨烯乳剂、包含Toll样4受体激动剂的铝盐。这些组合物的某些可包括在免疫原性组合物和/或疫苗(例如治疗性或预防性免疫原性组合物)中。其它佐剂也可以是适合的，如本领域技术人员可了解的那样。可在生产过程之前、期间或之后将这类佐剂的任一种引入组合物中。

如上文提及的，免疫组合物通常是包含一种或多种艰难梭菌抗原的组合物，在给予宿主(例如动物)时，诱导或加强针对抗原(例如艰难梭菌)的免疫应答。如上所述，此类应答可包括产生抗体(例如通过刺激B细胞)或基于T细胞的应答(例如细胞溶解反应)，其可以是保护性和/或中和性的。保护性或中和性免疫应答可以是对相当于抗原的感染性生物体(例如抗原来源于其中的生物体)有害和对宿主有益(例如通过降低或防止感染)的免疫应答。本文所用保护性或中和性抗体和/或细胞应答可与一种或多种本文所述艰难梭菌抗原起反应，尤其当以有效的量和/或方案给予时。当在动物中试验时，那些抗体和/或细胞应答可降低或抑制艰难梭菌感染的严重程度、时间和/或致死率。如实施例中所示，本文所述组合物可用于诱导针对艰难梭菌的免疫应答。在给予宿主时导致治疗性(例如通常在主动感染期间给予)和/或保护性(例如通常在主动感染之前或之后给予)和/或中和性免疫应答的免疫组合物可视为疫苗。

在一些实施方案中，还提供用于预防、改善艰难梭菌的感染、降低其风险和/或治疗(例如影响)艰难梭菌的感染的方法。用于治疗受试者的由艰难梭菌引起或涉及艰难梭菌的一种或多种疾病病况的方法包括给予受试者至少一种或多种有效剂量的本文所述组合物(例如包含艰难梭菌抗原、例如类毒素A、类毒素B)。抗原可以约1-约300μg(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290和/或300μg的任一种)的剂量给予。抗原可以相同或不同的剂量给予一次以上。在某些实施方案中，可通过相同或不同的合适途径将艰难梭菌抗原给予受试者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。当给予多剂量时，在每剂中，剂量可包含艰难梭菌抗原的大致相同或不同的类型和/或量。剂量还可通过相同或不同的间隔彼此在时间上分隔开。例如，可通过约6、12、24、36、48、60、72、84或96小时、7天、14天、21天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、200天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1.5年、2年、3年、4年、5年的任一种或在这些时间的任一个之前、之后和/或之间的任何时间把各剂量分开。在一些实施方案中，可单独或结合其它作用剂(例如抗生素)一起给予艰难梭菌抗原。此类其它作用剂可与相同或不同的艰难梭菌抗原一起同时(或差不多同时)给予或在不同的时间和/或以不同的频率给予。这类方法的其它实施方案也可以是适当的，如本领域普通技术人员可容易确定的那样。

本文还提供用于给予艰难梭菌抗原的试剂盒。在一个实施方案中，艰难梭菌抗原的一种或多种可形成试剂盒的一部分和/或作为试剂盒提供用于给予受试者。还可通过试剂盒提供用于给予艰难梭菌抗原的说明书。包含本文所述艰难梭菌抗原的组合物可包括在试剂盒(例如疫苗试剂盒)中。例如，试剂盒可包含含有呈干燥形式的本文所述组合物的第一容器和含有用于复溶组合物的水性溶液的第二容器。试剂盒可任选包括用于给予组合物的复溶液体形式的装置(例如皮下注射器、微针阵列)和/或使用说明书。可提供预灌装水性溶液用于复溶组合物的给药装置。

因此，本公开内容提供用于提供针对艰难梭菌的治疗性或保护性免疫应答的组合物，该组合物包含艰难梭菌类毒素A和类毒素B。本公开内容还提供用于给予所述组合物使得诱导和/或加强针对艰难梭菌(例如艰难梭菌抗原)的免疫应答的方法。在某些实施方案中，组合物可进一步包含一种或多种艰难梭菌抗原、一种或多种药学上可接受的载体和/或一种或多种佐剂(例如铝盐、乳剂、阳离子脂质体、阴离子聚合物、Toll样受体激动剂及其组合)。在一些实施方案中，组合物是免疫原性组合物和/或疫苗。还提供通过将任何所述组合物给予受试者(例如人类)使其免疫的方法。在一些实施方案中，所述方法可包括使用一次或多次给予(例如至少3次，各剂量适宜地彼此分隔(例如至少约7天))，以有效的类毒素A:B比率(例如3:1、3:2、1:1，以重量计(w/w))和足够的纯度(例如至少90%(w/w))，将包含有效量(例如至少约40-约500μg，例如约50-约100μg)的艰难梭菌类毒素A和类毒素B(混合的w/w)的免疫原性组合物(例如疫苗)给予受试者。有效的类毒素A:B比率是可包括在组合物中并诱导针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的有效免疫应答的任何比率。在一个实施方案中，所述方法可包括第一、第二和第三次给予，其中第二次给予为第一次给予后至少7天，第三次给予为第一次和/或第二次给予后至少约30天和/或至少约180天。在一些实施方案中，所述方法可包括第一、第二和第三次给予，其中第二次给予为第一次给予(在第0天)后约7天，第三次给予为第一次给予后约30天。在一些实施方案中，所述方法可包括第一、第二和第三次给予，其中第二次给予为第一次给予后约7天，第三次给予为第一次给予后约180天。在一些实施方案中，所述方法可包括一种或多种佐剂(例如铝佐剂)。在一些实施方案中，所述方法可加强和/或诱导之前暴露于艰难梭菌的人类(例如血清反应阳性人类、抗体再生的(anemnestic)免疫应答)的现有免疫应答。在某些实施方案中，人类在第一次给予前的12个月时间内，可能有至少一次或两次留医，每次持续至少约24、48或72小时或更久，和/或接受了全身(非局部)抗生素；和/或预期具有用于在第一次给予约60天内进行计划的外科手术的住院患者的住院治疗。在一些实施方案中，预期的/即将发生的留院/住院治疗可按计划持续约24、48或72小时或更久，并且可用于涉及肾/膀胱/泌尿系统、肌骨骼系统、呼吸系统、循环系统和中枢神经系统的至少一种的手术。优选通过这些方法诱导的免疫应答足以防止和/或改善和/或降低症状性艰难梭菌感染的风险。在某些实施方案中，所述方法可包括将免疫原性组合物给予存在症状性感染风险、年龄为至少约40、50或65岁的人类受试者。在一些实施方案中，所述方法可包括将组合物给予介于约40和约65岁之间和/或介于约65和约75岁之间的年龄组的每个个体。在一些实施方案中，所述方法可在约80、85、90、95或100%的在第一次给予前视为血清反应阳性个体群的任一个中诱导针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的基于抗体的免疫应答约2-4倍加强，通过例如EL1SA和/或TNA测量。在一些实施方案中，所述方法可在约20、25、30、35、40、45或50%的在给予组合物之前被视为血清反应阴性的个体群的任一个中诱导针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的基于抗体的免疫应答约2-4倍加强，在第一次给予后的14天(例如在给予后第0、7和30天)通过例如ELISA和/或TNA测量。在一些实施方案中，所述方法可在约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80%的在给予组合物之前被视为血清反应阴性的个体群的任一个中诱导针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的基于抗体的免疫应答约2-4倍加强，在第一次给予后的60天(例如在给予后第0、7和30天)通过例如ELISA和/或TNA测量。在一些实施方案中，所述群中的个体为约40-约65岁。在一些实施方案中，所述群中的个体为约75-约65岁。在一些实施方案中，在第一次给予(在第0天)后约30天、通常在第二次给予后在约第7天观察到这种加强，并且通常在第三次给予前(在例如约第30天或第180天)观察到。在一些实施方案中，在多次方案给药方案中，在第一次、第二次和/或第三次给予后直到约30个月(例如约1000天)可检出针对毒素A和/或毒素B的免疫应答。在一些实施方案中，通过例如ELISA和/或TNA测量，在第0天(第一次给予)、约第7天(第二次给予)和约第30天(第三次给予)给予人类受试者本文所述组合物加强或诱导针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答直到约30个月或约1000天。在一些实施方案中，通过例如ELISA和/或TNA测量，在第一次给予后约第1000天免疫应答的水平可至少与3剂量给药方案的第一次给予后约第14天的大致一样高。在一些实施方案中，通过例如ELISA和/或TNA测量，在第一次给予后约第100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000天的任一种的免疫应答的水平可至少与在第一次给予后约第14天的大致一样高。在一些实施方案中，通过例如ELISA和/或TNA测量，免疫应答可超出基线约2-8倍(例如在第一次给予前第0天的抗-毒素A和/或毒素B抗体水平)。在一些实施方案中，通过例如ELISA和/或TNA测量，免疫应答可超出基线约2.5-约6.8倍。在一些实施方案中，血清反应阳性个体(例如非幼稚)的免疫应答在约第7天从基线增加达约3倍；在第14天左右约10-约70倍；在第30天左右约30-约200倍；在第60天左右约100-约200倍，如通过针对毒素A和/或B的ELISA测量(例如在第0、7和30天给予后)。在一些实施方案中，血清反应阳性个体(例如非幼稚)的免疫应答在约第7天从基线增加达约3倍；在第14天左右约10-约100倍；在第30天左右约15-约130倍；在第60天左右约100-约130倍，如通过针对毒素A和/或B的TNA测量(例如在第0、7和30天给予后)。在一些实施方案中，血清反应阴性个体(例如幼稚)中的免疫应答在第14天左右从基线增加达约2倍；在第30天左右约5-约10倍；在第60天左右约25-约60倍，如通过针对毒素A和/或B的ELISA测量(例如在第0、7和30天给予后)。在一些实施方案中，血清反应阴性个体(例如幼稚)中的免疫应答在第14天左右从基线增加达约2-约3倍；在第30天左右约2-约5倍；在第60天左右约5-约40倍，如通过针对毒素A和/或B的TNA测量(例如在第0、7和30天给予后)。在一些实施方案中，第0天(例如在第一次给予之前)在视为血清反应阳性或血清反应阴性的个体中检出本文所述的免疫应答。在一些实施方案中，通过例如ELISA和/或TNA测量，检出针对艰难梭菌毒素A和毒素B两者的此类免疫应答。还提供用于产生此类艰难梭菌抗原(例如类毒素A和/或B)的方法(例如体外或体内)和包含艰难梭菌抗原的组合物。此类方法可包括例如本领域普通技术人员可得到的和/或已知的那些中的任一种，和/或描述于前面提及的2013年3月15日提交的共同待审的美国临时申请顺序号61/790,423、2014年3月14日提交的共同待审的PCT/US2014/029035、2013年3月15日提交的61/793,376和/或2014年3月14日提交的共同待审的PCTUS2014/029070中的方法。本领域的普通技术人员可从本文提供的描述推导其它实施方案。

如本领域的普通技术人员应了解的那样，还提供其它实施方案。

术语“左右”、“约”等当在数值或范围列表之前时，是指列表或范围中每个个别的值独立地就像该列表或范围中每个个别的值之前紧接该术语。这些术语意指与之所提及的值精确相同、接近或相似。

如本文所用，受试者或宿主意指个体。受试者可包括驯养动物例如猫和狗、家畜(例如牛、马、猪、绵羊和山羊)、实验室动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠)和鸟。一方面，受试者是哺乳动物例如灵长类动物或人。

任选或任选地意指随后描述的事件或事项可能发生或可能不发生，并且该描述包括其中事件或事项发生的情况和其中其不发生的情况。例如，短语任选组合物可能包含组合意指组合物可包含不同分子的组合或可不包括组合使得该描述包括组合和没有组合(即组合的各个成员)两者。

范围在本文可表示为从约一个特定值和/或到约另1个特定值。当表示这类范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到其它特定值。同样，当数值通过使用先行词约或大约表示为近似值时，应了解该特定值形成另一个方面。还应了解，与其它端点有关和独立于其它端点两者，所述范围各自的端点是有意义的。范围(例如90-100%)意指包括该范围本身以及所述范围内的各个独立的值，就像各个值被分别列出一样。

当术语预防、预防性和防止在本文与指定病况的指定治疗(例如防止感染)联用时，意指表达接受治疗的受试者根本不发生临床上可观察水平的所述病况，或者与他/她如未治疗相比较不频繁地发生。这些术语不仅仅限于以下的情况：其中受试者无论如何都未经历所述病况的方面。例如，如果在受试者暴露于预期会产生指定病况表现的刺激期间给予治疗，并且导致受试者经历与否则预期的相比较少和/或较轻的病症症状，则称治疗为防止了该病况。通过导致受试者只显示感染的轻微明显症状，治疗可“防止”感染；它并不意味着感染性微生物一定不会侵入任何细胞。同样，可结合用指定治疗的症状性感染的风险陈述本文所用降低、减轻和减少(例如降低存在症状性艰难梭菌感染的风险)。例如降低、减轻和减少通常可指与在不存在治疗(例如使用所公开的抗原或组合物给药或接种)时发生感染的对照或基础水平相比，受试者更慢地发生感染或发生感染至更小的程度。降低症状性感染的风险可导致受试者只显示出感染的轻微明显症状或感染症状延缓；它不意味着感染性微生物一定不会侵入任何细胞。

本公开内容内所引用的所有参考文献通过引用以其整体结合到本文中。在下面的实施例中进一步描述了某些实施方案。这些实施方案仅作为实例提供，并无意以任何方式限制权利要求的范围。

实施例

实施例1

A．试验设计

在成人中进行了II期随机安慰剂对照的改进双盲(剂量和制剂的双盲；对接种方案为开放标签)剂量范围多中心试验。登记年龄为40-75岁、在试验期间因以下原因有发生艰难梭菌感染风险的成人受试者：(i)即将在登记60天内住院治疗，或(2)目前或在登记60天内即将居住在长期护理机构或康复机构。排除有现行或既往CDI发作的受试者。根据年龄对受试者分级：40-65岁(50%的受试者)和65-75岁(50%的受试者)。试验有2期。I期测试4种不同疫苗候选物的制剂，II期使用这些制剂之一研究不同的接种方案。在I期中，登记了共455名受试者，并随机化以在第0、7和30天接受下列制剂或安慰剂之一：

第1组：低剂量(共50μg抗原(类毒素A，类毒素B)，类毒素A:类毒素B的大致比率为3:2)，含佐剂(400μg氢氧化铝(ALOH))；

第2组：低剂量(共50μg抗原(类毒素A，类毒素B)，类毒素A:类毒素B的大致比率为3:2)，无佐剂；

第3组：高剂量(共100μg抗原(类毒素A，类毒素B)，类毒素A:类毒素B的大致比率为3:2)，含佐剂(400μgALOH)；

第4组：高剂量(共100μg抗原(类毒素A，类毒素B)，类毒素A:类毒素B的大致比率为3:2)，无佐剂；和

第5组：安慰剂(0.9%生理盐水)。

基于在第0、14、30和60天采集的血样的免疫结果和安全性数据，选择一种制剂用于II期。在II期中，206名受试者经随机分配以在2个另外方案之一中接受3剂量的选择制剂：

第6组：第0、7和180天。

第7组：第0、30和180天。

将在II期中登记的受试者的结果与在I期研究期间在第0、7和30天接受所选择的疫苗制剂的受试者获取的数据进行比较。在I期中，要求受试者在第0、7、14、30天，直到第60天，并包括第180和210天提供血样，直到选出制剂。在II期中，要求所有受试者在第0、7、14、30、60、180和210天提供血样。

所评价的疫苗是艰难梭菌类毒素A和B(以类毒素A:类毒素B大致3:2的比率)的高度纯化的制剂。将毒素A和B从艰难梭菌的培养物中纯化，灭活，并以目标3:2比率混合。疫苗作为冻干制剂提供，在规定时，其在临床基地用稀释剂复溶，并与ALOH佐剂或注射用水(WFI)混合。稀释剂由20mM柠檬酸钠、5%蔗糖和0.016%甲醛组成。佐剂由WFI中的1600μg/mLALOH组成。对于未加佐剂的制剂，使用WFI稀释冻干疫苗。最终的疫苗给药溶液由疫苗和稀释剂和佐剂(需要时)组成。安慰剂作为液体制剂(0.9%生理盐水)提供。研究药物(疫苗或安慰剂)各递送剂量的体积为0.5mL。肌内给予疫苗制剂。

通过EL1SA针对抗艰难梭菌毒素A和毒素B的免疫球蛋白G型(IgG)抗体测试血清，以产生初步免疫原性数据。使试验血清中存在的抗体与微量滴定板各孔所吸附的毒素A或B抗原反应。在结合第二抗-人IgG抗体-酶缀合物后，通过比色底物反应测定结合抗原包被孔的抗体的量。加入酶的底物，这引起与结合抗原的抗体成正比的比色变化。从标准曲线推断得出血清中抗体的浓度，所述标准曲线由具有定义的IgG单位量(ELISA单位(EU)/mL)的参比标准血清的多个稀释液产生。

还采用毒素中和测定法以定量测定艰难梭菌毒素的中和抗体。在测定中，将连续稀释的血清与固定量的艰难梭菌毒素A或B一起温育。然后加入Vero细胞，使血清-毒素-细胞混合物在37℃下温育6天。血清中和艰难梭菌毒素的细胞毒效应的能力通过Vero细胞的存活力测定，并与之关联。该测定法利用封闭培养孔中酸代谢物的蓄积作为正常细胞呼吸的指示。在暴露于毒素的细胞中，代谢和CO₂产生降低；因此，pH上升至7.4或更高，如细胞培养基中酚红pH指示剂所示。在该pH下，培养基显出红色。然而，细胞对照或暴露于已被抗体中和的毒素的细胞，以正常量代谢并产生CO₂；结果，pH保持在7.0或以下。在该pH下，培养基显出黄色。因此，艰难梭菌毒素中和抗体与血清中和细胞中艰难梭菌毒素的代谢作用的能力相关，正如其保持pH为7.0或更低的能力所证实的那样。可通过读板仪以562nm-630nm测量培养基的颜色变化，以进一步计算在艰难梭菌毒素介导的细胞毒性50%抑制下的抗毒素中和抗体效价。研究包括观察目标，即描述初次出现的CDI发作。

B.I期

安全性评价

在任何治疗组中没有受试者报告的相关SAE或死亡，并且诱发或非诱发的3级反应的数目在所有治疗组中相似且极少。诱发的不良反应(AR)和非诱发的AE一般为短期的强度1级，不导致研究中止，并且不被视为在临床上是重大的。在疫苗治疗组有更多诱发的注射部位和全身反应；然而，耐受性概况是可接受的，并且与其它许可的疫苗的耐受性概况类似或比之更好。报告了与未加佐剂组相比，加佐剂组中更多受试者在整体病症和给药部位情况的SOC中非诱发的非严重AR，更具体地说非诱发的注射部位反应；然而，耐受性概况是可接受的，并且与其它许可的疫苗的耐受性概况类似或比之更好。总的来说，较大年龄组(年龄为65-75岁)中受试者未经历诱发的AR或非诱发的AE增加；安全性概要与年龄为40-64岁的较年轻受试者的类似。如同较年轻的受试者一样，在加佐剂组中，有较多报告AE和AR的受试者；然而，耐受性概况是可接受的。未鉴定出安全顾虑。

免疫原性评价

与安慰剂相比，在所有疫苗组中有显著的治疗效果。

ELISA结果—几何平均浓度(GMC)

所有治疗组中的免疫应答是稳健的，并且在第60天继续增加。对于毒素A和毒素B两者，在第60天，在第3次疫苗剂量后30天，在各活性疫苗组中观察到最高GMC(EU/mL)。从第0天到第60天各采血日GMC存在持续升高(表1)。对于年龄为40-64岁的受试者和年龄为65-75岁的受试者，毒素A和毒素B的GMC从第0天到第60天增加。当疫苗与佐剂一起给予时，年龄为65-75岁的受试者的GMC往往较高。针对毒素B在基线为血清反应阳性(定义为对于毒素A≥1.5EU/mL，对于毒素B≥0.8EU/mL)的受试者的数目比针对毒素A的高，这可表示既往暴露和/或测定灵敏度。基线的血清阳性提高第60天对毒素A和B的免疫应答。

ELISA结果—血清转化

与第0天相比，在第60天显示4倍血清转化的符合方案群体(per-protocolpopulation)中，第3组受试者具有所有受试者的最高百分比(对于毒素A为97.3%，对于毒素B为91.8%)。对于毒素A和B的组合物(定义为对毒素A和B两者进行血清转化的受试者)，在第0天和第60天之间第3组中以IgG≥4倍升高进行血清转化的所有受试者的数目和百分比为90.4%(66/73)。这高于第1组(85.7%；60/70)、第2组(82.4%；56/68)和第4组(86.1%；62/72)。

对于毒素A和B的组合物，在第0天和第60天之间第3组中以IgG≥4倍升高进行血清转化的年龄为65-75岁的受试者的数目和百分比为89.1%(41/46)。这高于第1组(77.3%；34/44)、第2组(71.1%；32/45)和第4组(73.8%；31/42)。在免疫原性的全分析集(FASI)中，对于毒素A，在第0天和第60天之间各组中以IgG≥4倍升高进行血清转化的受试者的数目和百分比如下：第1组94.3%(82/87)；第2组88.3%(83/94)；第4组88.6%(78/88)；第5组6.3%(3/48)。对于毒素B，在第0天和第60天之间各组中以IgG≥4倍升高进行血清转化的受试者的数目和百分比如下：第1组87.5%(77/88)；第2组77.7%(73/94)；第4组91.1%(82/90)；第5组12.5%(6/48)。对于毒素A和B的组合物，在第0天与第60、180和210天之间各组中以IgG≥4倍升高进行血清转化的受试者的数目和百分比见表2中所述。

毒素中和测定法(TNA)结果—GMT

对于毒素A和毒素B两者，在第60天，在第3次疫苗剂量后30天观察到各活性疫苗组中的最高GMT。从第0天到第60天在各采血日存在GMT的持续升高。对于毒素A，GMT在第1组和第3组中较高。在第3组中在第60天观察到最高GMT。对于毒素B，GMT在第1组和第2组中相似。GMT在给予高剂量疫苗时比给予低剂量时的高。在第4组中在第60天观察到最高GMT。

TNA结果—血清转化

对于毒素A，与第0天相比，第3组受试者具有最高百分比的在第60天显示4倍血清转化的受试者(97.3%)。对于毒素B(66.2%)和对于毒素A和B的组合物(63.5%)，与第0天相比，第4组受试者具有最高百分比的在第60天显示4倍血清转化的受试者。对于毒素A和B的组合物，在第0天与第60、180和210天之间以IgG≥4倍升高进行血清转化的FASI中的各组受试者的数目和百分比见表2所述。

I期结论

未鉴定出安全顾虑，因此，没有基于安全原因从进一步评价中排除治疗组。I期的结果支持疫苗在所有治疗组中的安全性。

总的来说，通过ELISA和毒素中和测定法(TNA)两者测量，较高的剂量诱导最佳的免疫应答。通过ELISA测量，高剂量加佐剂疫苗诱导最佳免疫应答，特别在年龄为65-75岁的组中。选择高剂量加佐剂(第3组)以进行到II期，因为耐受性概况是可接受的，且总体免疫应答被视为优选的，特别在年龄为65-75岁的组中。因为年长个体可能是给予针对症状性艰难梭菌感染(CDI)的疫苗的目标群体的主要部分，选择该剂量可能提供最大的疫苗保护。

基于在I期期间测定的直到第60天的安全性和免疫原性结果(包括自助分析)，选择制剂100μg+ALOH(第3组)作为待结转到II期的优选制剂。这个选择受免疫原性符合方案分析集(PPSI)中的所有受试者的组合ELISA排序分析的影响。特别是免疫原性全分析集(FASI)中年龄为65-75岁的受试者，第3组(高剂量疫苗加佐剂)被确定为最佳制剂。重要的是，与其它组相比，高剂量加佐剂组中更多的受试者(数目和百分比)显示在第0天和第60天之间的4倍血清转化。

从第0天到第210天第3组的数据连同第6组和第7组的数据被列在标题“2期”之下。在选择II期制剂后，继续收集第1组到第5组在第60天和第210天之间的安全性数据。获得2个额外的血样用于在第180天和第210天的免疫原性测试。对于第1、2和4组，毒素A和毒素B两者的GMC(通过ELISA测量)和GMT(通过TNA测量)从第0天到第60天增加，到第60天达到峰值，然后到第210天降低。然而，与基线相比，第210天的值仍然高。在第210天，对于毒素A，GMC与第30天的GMC大致相等，对于毒素B，GMC与第14天的GMC大致相等。在第210天，对于毒素A和毒素B，GMT大致是第60天的GMT的一半。测量了各组的GMT第0天基线值。对于在第5组(安慰剂)中测量的GMC或GMT，与基线几乎没有改变。

在第1、2和4组各组中，相对于第0天，在第60天观察到毒素A和B的ELISA组合物的血清转化最高≥4倍升高。虽然在第60天后血清转化降低，但它在第210天仍然高，第1组中有68.9%(51/74)的受试者，第2组中有47.4%(36/76)的受试者，第4组中有64.9%(48/74)的受试者。在第1、2和4组各组中，相对于第0天，在第60天观察到毒素A和B的TNA组合物的血清转化最高≥4倍升高。虽然血清转化在第60天之后降低，但它在第210天仍然高，第1组有39.7%(29/73)的受试者，第2组中有40.8%(31/76)的受试者，第4组中有58.1%(43/74)的受试者。根据直到第210天的所有I期数据，在第60天之后得出的总体结论是所选择的制剂是安全的和具有免疫性的。低剂量(即50μg/剂量，以3:2比率的类毒素A和B，A:B)、含或不含佐剂特别在较年轻年龄组(即40-64岁)中提供良好的免疫应答。

C.II期

在II期研究期间，采用另外2个方案(第0、7、180天和第0、30、180天)，对高剂量加佐剂制剂(100μg+ALOH)进行了评价。将数据(到第210天)与第3组获得的数据进行比较—即，将数据与采用I期方案(第0、7、30天)给予相同制剂的I期中的受试者组获得的数据进行比较。

1.安全性评价-—概述

总的来说，以3种不同方案给予的疫苗制剂(100μg+ALOH)具有可接受的安全特性，其中无鉴定的完全性信号。对任何治疗组中的受试者没有报告的相关SAE。在治疗组间，报告诱发或非诱发的3级反应的受试者数相似且极少。诱发的AR和非诱发的AE一般为短期的强度1级，不导致研究中止，并且不被视为在临床上是重大的。3个组中以相似的受试者数目和百分比报告了在任何疫苗注射后诱发的反应。各组中以相似的受试者数目和百分比报告了非诱发的非严重AR(其包括注射部位和全身AR两者)。较大岁龄组(年龄为65-75岁)中的受试者没有经历诱发的AR或非诱发的AE增加；安全性概要与年龄为40-64岁的较年轻受试者的相似。总的来说，未鉴定出安全顾虑。

免疫原性评价

ELISA结果

对于毒素A和毒素B两者，第3和7组中的最高GMC(EU/mL)从第0天到第60天增加，而在第6组中，在第30天测到最高GMC。在第3组中，GMC在第210天降低，而在第6和7组中，GMC在第180天第3次接种之后在第210天增加。在年龄为40-64岁的受试者和年龄为65-75岁的受试者中观察到这种相同模式。对于毒素B在基线呈血清反应阳性(定义为对于毒素A≥1.5EU/mL，对于毒素B≥0.8EU/mL)的受试者数比对于毒素A的高。在第3和7组中在第60天或在第6组中第30天，基线的血清阳性提高对毒素A和B的免疫应答。

对于第3组和第7组，对于包括在第210天分析内PPSI中的受试者，毒素A的GMC(通过ELISA测量)从第0天到第60天增加，在该点上它们分别为96.44EU/mL和80.37EU/mL。对于第6组，在第210天前的最高GMC在第30天(而不是第60天)就达到，在该点上其为23.33EU/mL。在第3组中，在第180天的第3次接种后，GMC在第210天降低至20.74EU/mL，而在第6和7组中，GMC在第210天分别增加至266.2EU/mL和252.1EU/mL。对于第3和7组，对于包括在第210天分析内PPSI中的受试者，毒素B的GMC(通过ELISA测量)从第0天到第60天增加，在该点上它们分别为142.1EU/mL和87.65EU/mL。对于第6组，第210天前的最高GMC在第30天(而不是第60天)时达到，在该点其为93.59EU/mL。在第3组中，在第180天的第3次接种后，GMC在第210天降低至26.57EU/mL，而在第6和7组中，在第210天，GMC分别增加至119.6EU/mL和124.7EU/mL。

在包括在第210天分析内的第3、6和7组，在FASI中，年龄为40-64岁的受试者和65-75岁的受试者的ELISAGMC没有显著差异。

对于在基线呈血清反应阳性的受试者，虽然对于在第3、6和7组中的受试者，在第0天毒素A(3.75EU/mL、3.55EU/mL和2.99EU/mL)和B(8.65EU/mL、5.65EU/mL和4.68EU/mL)两者的基线GMC分别是低的，但是与基线呈血清反应阴性的受试者的GMC相比，在第30或60天GMC往往达到较高的峰值。

在第60天，对于包括在第210天分析内PPSI中的受试者，自助分析鉴定出第3组具有对于毒素B(91.5%)和毒素A和B的组合物(84.7%)排名第1的至少80%概率。在第60天，对于毒素A，未达到80%概率，虽然第3组为72.1%，排序比第6或7组高。

对于毒素A(通过ELISA测量)，对于包括在第210天分析内PPSI中的受试者，在第3组中，与第0天相比，GMFR在第60天最高(57.0)。在第6组中，与第0天相比，GMFR在第30天为14.4，与第0天相比在第60天为11.3，但之后与第0天相比，在第210天达到158.8。在第7组中，与第0天相比，GMFR在第60天为48.8，但之后与第0天相比，在第210天达到151.4。对于毒素B(通过ELISA测量)，对于包括在第210天分析内PPSI中的受试者，在第3组中，与第0天相比，GMFR在第60天为最高(64.2)。在第6组中，与第0天相比，GMFR在第30天为43.0，与第0天相比，在第60天为34.5，与第0天相比，在第210天达到52.5。在第7组中，与第0天相比，GMFR在第30天为23.0，与第0天相比，在第60天为40.1，与第0天相比，在第210天达到53.6。

ELISA结果—血清转化

在第60天，对于毒素A，通过ELISA测量，第3组中97.0%(64/66)的受试者、第6组中65.6%(40/61)的受试者和第7组中91.2%(52/57)的受试者，存在血清转化≥4倍升高。(第3组和第7组的受试者在第30天接受接种；第6组最后一次接种在第7天)。相比之下，在第60天，对于毒素B，通过ELISA测量，血清转化≥4倍升高在以下治疗组间类似：第3组中92.4%(61/66)的受试者、第6组中85.2%(52/61)的受试者和第7组中89.5%(51/57)的受试者。在第60天，对于毒素A和B的组合物，通过ELISA测量，第3组中90.9%(60/66)的受试者、第6组中60.7%(37/61)的受试者和第7组中84.2%(48/57)的受试者，存在血清转化≥4倍升高。表3提供了在包括在第210天分析内的PPSI中的受试者中，对于第60天/第0天、第180天/第0天和第210天/第0天毒素A和B和毒素A和B的组合物的≥4倍血清转化率(通过ELISA测量)的汇总。在包括在第210天分析内的第3、6和7组中，在FASI中，年龄为40-64岁的受试者和年龄为65-75岁的受试者的ELISA血清转化率没有显著差异。

在基线，对于毒素A，呈血清反应阳性且与第0天相比在第60天具有≥4倍血清转化的包括在第210天分析内的FASI中受试者的百分比在第3组中为受试者的100%、在第6组为受试者的92.3%(12/13)、在第7组中为受试者的87.5%(7/8)。在基线，对于毒素B，呈血清反应阳性且与第0天相比在第60天具有≥4倍血清转化的包括在第210天分析内的FASI中受试者的百分比在第3组为受试者的94.6%(35/37)、在第6组为受试者的91.5%(43/47)、在第7组为受试者的94.1%(48/51)。

TNA结果—GMT

对于第3和7组，毒素A和B的GMT从第0天到第60天增加。对于第6组，在第30天达到最高GMT。在第3组中，在第180天的第3次接种后，GMT在第210天降低，而在第6和7组中，GMT在第210天增加。在年龄为40-64岁的受试者和年龄为65-75岁的受试者中观察到这种相同模式。在基线呈血清反应阳性的受试者数，对于毒素B比对于毒素A的高。在第3和7组中在第60天或在第6组中第30天，基线的血清阳性提高针对毒素A和B的免疫应答。

对于第3和7组，对于包括在第210天分析内PPSI中的受试者，毒素A的GMT(通过TNA测量)，从第0天到第60天增加，在该点它们分别为628.6l/dil和553.7l/dil。对于第6组，第210天前的最高GMT在第30天(而不是第60天)达到，在该点其为158.6l/dil。在第180天第3次接种之后，在第3组中，GMT在第210天降低至270.2l/dil，而在第6和7组中，GMT在第210天分别显著增加至8939.4l/dil和9015.6l/dil。对于第3和7组，毒素B的GMT(通过TNA测量)从第0天到第60天增加，在该点它们分别为466.3l/dil和415.0l/dil。对于第6组，第210天前的最高GMT在第30天(而不是第60天)达到，在该点其为351.1l/dil。在第180天第3次接种之后，在第3组中，GMT在第210天降低至164.4l/dil，而在第6和7组中，GMT在第210天分别增加至1488.4l/dil和2070.3l/dil。

在包括在第210天分析中的第3、6和7组中，在年龄为40-64岁的受试者和年龄为65-75岁的受试者中，毒素A或B的TNAGMT没有显著差异。

对于在基线呈血清反应阳性的受试者，第3、6和7组中的受试者在第0天毒素A的基线GMT分别为72.07l/dil、44.55l/dil和59.94l/dil，毒素B的分别为161.8l/dil、79.31l/dil和76.35l/dil。在第30或60天，GMT往往比在基线呈血清反应阴性的受试者的GMT高许多倍地达到峰值。

对于包括在第210天分析内PPSI中的受试者，对第3、6和7组进行了TNA自助排序分析(表4)。在第60天，第3组的毒素A(66.9%)、毒素B(58.7%)和毒素A和B的组合物(63.0%)的概率比第6或7组的排序高。

表5中提供了在包括在第210天分析内的PPSI中第3、6和7组的受试者的GMFR(通过TNA测量)的概况。

对于在第210天分析内的PPSI中的受试者，对于毒素A(通过TNA测量)，在第3组中与第0天相比，GMFR在第60天为最高(31.6)。第6组中，与第0天相比，GMFR在第30天为8.5，与第0天相比，在第60天中为6.1，但之后与第0天相比，在第210天达到419.8。第7组中，与第0天相比，GMFR在第60天为26.0，但之后与第0天相比，在第210天达到412.6。对于在第210天分析内的PPSI中的受试者，对于毒素B(通过TNA测量)，在第3组中，与第0天相比，GMFR在第30天为14.6，与第0天相比，在第60天为17.0。在第6组中，与第0天相比，GMFR在第30天为17.8，与第0天相比，在第60天为13.3，与第0天相比，在第210天达到60.2。在第7组中，与第0天相比，GMFR在第30天为14.2，与第0天相比，在第60天为16.7，与第0天相比，在第210天达到70.2。

TNA结果—血清转化

在第60天，对于毒素A，对于第3组中97.0%(64/66)的受试者、第6组中41.0%(25/61)的受试者和第7组中82.5%(47/57)的受试者，存在血清转化≥4倍升高。(第3和7组中的受试者在第30天接受接种；第6组的第2次接种在第7天)。相比之下，在第60天，对于毒素B，在以下治疗组间血清转化≥4倍升高相似：第3组中63.6%(42/66)的受试者、第6组中57.4%(35/61)的受试者和第7组中63.2%(36/57)的受试者。在第60天，对于毒素A和B的组合物，第3组中62.1%(41/66)的受试者、第6组中31.1%(19/61)的受试者和第7组中56.1%(32/57)的受试者，存在血清转化≥4倍升高。表6中提供了在包括在第210天分析内PPSI中的受试者中第60天/第0天、第180天/第0天和第210天/第0天对于毒素A和B的组合物的≥4倍血清转化率(通过TNA测量)的汇总。

在包括在第210天分析内的第3、6和7组的FASI中，年龄为40-64岁的受试者和年龄为65-75岁的受试者的TNA血清转化率没有显著差异(附录15，表15.56)。

在包括在第210天分析内的FASI中，在基线对毒素A呈血清反应阳性且与第0天相比在第60天具有≥4倍血清转化的受试者的百分比，在第3组中为受试者的100%、在第6组中为受试者的96.0%(24/25)，在第7组中为受试者的100%(附录15，表15.59)。包括在第210天分析内的FASI中，在基线对毒素B呈血清反应阳性且与第0天相比在第60天具有≥4倍血清转化的受试者的百分比，在第3组中为受试者的96.2%(25/26)，在第6和7组中为受试者的100%。在包括在第210天分析内的FASI中，在基线对毒素A呈血清反应阴性且与第0天相比在第60天具有≥4倍血清转化的受试者的百分比，在第3组中为受试者的95.1%(78/82)，在第6组中为受试者的25.0%(17/68)，在第7组中为受试者的80.0%(60/75)。包括在第210天分析内的FASI中，在基线对毒素B呈血清反应阴性且与第0天相比在第60天具有≥4倍血清转化的受试者的百分比，第7组中为45.6%(31/68)。

II期结论

如在I期中一样，在II期中的结果继续支持疫苗的安全性。未鉴定出安全性信号，总体耐受性概况是可接受的，并且与I期相当。具体地说，报告SAE的受试者数在组间相当；没有被视为与接种有关的SAE。4名受试者在研究期间死亡，但是不认为死亡与接种有关。少数受试者报告了导致研究中止的AE。诱发的反应(具体地说注射部位疼痛和肌痛的全身反应)在第180天最后一次接种后在第6和7组中稍微较高。生物学上重要的实验室参数大多与基础医学病况有关。

在所有3个方案，通过ELISA和TNA，疫苗制剂对于毒素A和B是免疫原性的。免疫应答是稳健的，并且在第3和7组中继续增加直到第60天，和在第6组中直到第30天。免疫应答在第3组中在第210天仍然高。与毒素A相比，有更多在基线对毒素B呈血清反应阳性的受试者。总的来说，在受试者可能有最大CDI风险期间，通过ELISA和TNA两者测量，方案第0、7、30天(第3组)诱导最佳免疫应答。

最后，最优疫苗方案应符合在住院治疗前、住院治疗期间和住院治疗之后的时间段内快速开始保护和方案的高度顺应性。研究表明CDI的最高风险在暴露于医院孢子后约3-5天开始。此外，已表明，70%的CDI病例发生在出院的1个月内，病例的其余部分发生在出院后3个月(Premier数据库)。总体上估计计划手术的平均等候时间为2周至5个月(31)。在选择方案期间，给予用于第60天免疫应答的顺序决定优先权，因为第60天应答应发生在最大CDI风险期间。虽然免疫学保护的特殊相关性尚未知，但在第60天显示良好免疫应答和直到第180天的持续应答，在选择可预期在计划的住院治疗期间和之后为受试者提供保护的优选疫苗方案时是重要的标准。

对于所测试的3种疫苗注射方案(第0、7、30天；第0、7、180天；第0、30、180天)，在所有时间点并对于成人(年龄为40-64岁)和老年人(年龄为65-75岁)受试者两者，100μg+ALOH的疫苗制剂是免疫原性的。在第7和14天，在成人和老年人受试者中，免疫应答对于3种测试方案是相似的。第3组中受试者在第60和180天的ELISAGMC和TNAGMT比第6或7组中的高。如所预期的一样，在第6和7组中受试者在第210天具有最高GMC和GMT，因为他们在第180天前30天已接种疫苗(与在第3组中的受试者不一样)。在第60和180天，第3组中受试者的血清转化(通过ELISA或TNA测量)比第6或7组中的高。基于主要集中在前60天时间内的免疫应答的自助排序分析，选择第3组作为最佳方案。重要的是，当在180天时间(即第0天+180天=第180天)内(期间最新进入CDI的规定风险期的患者会需要最大疫苗保护)观察时，与考虑在第30、60和180天测量的免疫应答的其它2个方案(第6或7组)相比，以0、7和30天方案给予3个剂量(第3组)总体提供最佳免疫应答。这段时间代表了患者可能具有发生CDI的最大风险时的时间。用第0、7和30天的疫苗方案的整个第3组在第30、60和180天产生良好的免疫应答。重要的是，II期的结果也表明第3组中受试者有更好的顺应性，因为与其第3次疫苗在第180天的组相比，这些受试者的更多受试者接受了所有3次疫苗注射。预期可在门诊患者背景下，或许通过全科医生或主治医生、尤其照顾老年人或患有慢性基础医学病况的那些人的那些给予疫苗。因为可通过采用第0、7和30天疫苗方案，在疾病发作前使个体免疫，早在第2次疫苗剂量(例如第14天)后1周，可最佳的达到保护性免疫应答。还发现甚至对血清反应阴性个体(例如幼稚个体)，该方案诱导对毒素A和B两者的持续的中和性Ab效价达至少30个月(例如1000天)，其中效价在到第14天所达到的那些或超过那些。注意到对于两种毒素的免疫应答可持续超过30个月。

研究还显示，与血清反应阴性个体(例如幼稚个体)相比，第0天血清反应阳性个体显示在接种后血清转化大于2-4倍增加。在接种后(第0和7天给药)14天，血清反应阳性个体以血清反应阴性个体的约2-3倍的频率进行血清转化(2和4倍增加，通过ELISA或TNA测量)。在接种后30天(在第2剂量后并在第3剂量之前约21天)，血清反应阳性个体以比血清反应阴性个体高但差异不太大的频率进行血清转化(2和4倍增加，通过ELISA测量)。例如，在血清反应阳性个体中在第30天，通过ELISA测量的血清转化(毒素A和毒素B)约20-30%更频繁。如通过TNA测量的，血清反应阳性个体保持血清反应阴性个体的2-3倍的血清转化频率。然而注意到，对于基线血清反应阳性和血清反应阴性两者，在各剂量后显示抗体效价增加。

还发现在成人(年龄为40-65岁)和老年人(年龄为65-75岁)受试者中，该方案诱导针对抗毒素A和抗毒素B两者的相当的血清转化率(例如自第0天具有4倍升高的%受试者，通过ELISA测量)。

结论

结果表明，在所评价的剂量水平下的疫苗能够诱导对毒素A和B两者的完全血清转化。这种应答对于针对毒素A阴性/毒素B阳性艰难梭菌致病株和针对产生较大量的毒素A和B的艰难梭菌流行株的功效是有用的。这种应答还可用于预定目标群体，这包括老年人个体和免疫功能受损的受试者。在早期人临床研究，诱导对毒素A的良好应答，但对毒素B的应答比预期的低。结果表明，100μg剂量的抗原增加对毒素B的血清转化率超过用50μg剂量观察到的转化率。类毒素A和B两者的较高剂量与对两种毒素的血清转化的更快应答时间有关。给予第60天免疫应答优先权，因为按照流行病学数据，当受试者暴露于医院环境时，这是最大CDI风险的时期。已确定，70%的CDI病例发生在出院30天内，其余发生在出院后3个月。在I期选出且以3种不同方案(第0、7、30天；第0、7、180天；第0、30、180天)评价的疫苗制剂(100μg+ALOH)具有可接受的安全特性，其中无鉴定的完全性信号。疫苗当以不同方案给予时在成人和老年人受试者中诱导强的免疫应答，如通过IgG抗体的GM测量和血清转化率及毒素A和B的TNA结果所证实的那样。结果表明，到第14天可建立免疫应答。在第210天还保持应答持续性。总的来说，第0、7、30天的方案最好地满足直到第60天的目标期内所需的最大保护特征。就安全性和免疫原性两者而言，制剂(100μg+ALOH)和第0、7、30天的方案的组合得到最佳结果。

虽然依据优选的实施方案描述了某些实施方案，但是要了解，本领域技术人员会想到各种变化和修改。因此，预期随附权利要求书包括落入随附权利要求书范围的所有这类等同的变化。

Claims (37)

1.一种用于在处于原发症状性艰难梭菌感染的风险的成人受试者中，诱导针对艰难梭菌毒素A和毒素B的免疫应答的方法，所述方法包括至少3次将包含艰难梭菌类毒素A和类毒素B的组合物给予受试者，每次给予相隔约7天。

2.权利要求1的方法，其中所诱导的免疫应答足以防止和/或降低成人受试者的原发症状性艰难梭菌感染。

3.权利要求1的方法，其中所诱导的免疫应答足以防止成人受试者的症状性艰难梭菌感染的发作。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中第二次给予为第一次给予后约7天，第三次给予为第一或第二次给予后约30天。

5.权利要求4的方法，其中第三次给予为第一次给予后约30天。

6.权利要求1-3中任一项的方法，其中第二次给予为第一次给予后约7天，第三次给予为第一或第二次给予后约180天。

7.权利要求6的方法，其中第三次给予为第一次给予后约180天。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述组合物包含纯度为至少约90%或更大、比率为约3:1-约1:1的艰难梭菌类毒素A和类毒素B的每一种。

9.权利要求8的方法，其中艰难梭菌类毒素A和类毒素B的比率为约3:2。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述组合物包含组合的共约40-500μg的艰难梭菌类毒素A和类毒素B。

11.权利要求1-10的方法，其中所述组合物包含佐剂。

12.权利要求11的方法，其中所述组合物包含铝佐剂。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述处于风险的受试者为至少40岁，且

(i)在第一次给予前的12个月时间内有至少2次留院，每次持续至少约24或72小时，并接受了全身(非局部)抗生素，或

(ii)预期具有用于在第一次给予60天内进行计划的外科手术的住院患者的住院治疗。

14.权利要求13的方法，其中计划预期的住院治疗持续至少约24或72小时，并且用于涉及下列系统中至少一个的手术：

(i)肾/膀胱/泌尿系统；

(ii)肌骨骼系统；

(iii)呼吸系统；

(iv)循环系统；和

(v)中枢神经系统。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述成人受试者为至少约65岁或更年长。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约60天。

17.权利要求16的方法，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约210天。

18.权利要求17的方法，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约1000天。

19.在制备药物中应用包含艰难梭菌类毒素A和类毒素B的组合物，所述药物用于通过至少3次将所述组合物给予受试者，每次给予相隔约7天，在处于原发症状性艰难梭菌感染风险的成人受试者中，诱导针对艰难梭菌毒素A和毒素B的免疫应答。

20.权利要求19的用途，其中所诱导的免疫应答足以防止和/或降低成人受试者中的原发症状性艰难梭菌感染的风险。

21.权利要求19的用途，其中所诱导的免疫应答足以防止成人受试者的症状性艰难梭菌感染的发作。

22.权利要求19-21中任一项的用途，其中第二次给予为第一次给予后约7天，第三次给予为第一或第二次给予后约30天。

23.权利要求22的用途，其中第三次给予为第一次给予后约30天。

24.权利要求19-21中任一项的用途，其中第二次给予为第一次给予后约7天，第三次给予为第一或第二次给予后约180天。

25.权利要求24的用途，其中第三次给予为第一次给予后约180天。

26.权利要求19-25中任一项的用途，其中所述组合物包含纯度为至少约90%或更大、比率为约3:1-约1:1的艰难梭菌类毒素A和类毒素B的每一种。

27.权利要求26的用途，其中艰难梭菌类毒素A和类毒素B的比率为约3:2。

28.权利要求19-27中任一项的用途，其中所述组合物包含组合的共约40-500μg的艰难梭菌类毒素A和类毒素B。

29.权利要求19-28中任一项的用途，其中所述组合物包含佐剂。

30.权利要求29的用途，其中所述组合物包含铝佐剂。

31.权利要求19-30中任一项的用途，其中所述处于风险的受试者为至少40岁，且：

(i)在第一次给予前的12个月时间内有至少2次留院，每次持续至少约24或72小时，并接受了全身(非局部)抗生素，或

(ii)预期具有用于在第一次给予60天内进行计划的外科手术的住院患者的住院治疗。

32.权利要求31的用途，其中计划预期的住院治疗持续至少约24或72小时，并用于涉及下列系统中至少一个的手术：(i)肾/膀胱/泌尿系统；(ii)肌骨骼系统；(iii)呼吸系统；(iv)循环系统；和(v)中枢神经系统。

33.权利要求19-32中任一项的用途，其中所述成人受试者为至少约65岁或更年长。

34.权利要求19-33中任一项的用途，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约60天。

35.权利要求34的用途，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约210天。

36.权利要求34的用途，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约1000天。

37.一种包含艰难梭菌类毒素A和类毒素B的组合物，所述组合物用于在人类受试者中诱导针对艰难梭菌毒素A和毒素B的免疫应答的方法，所述方法包括至少3次将所述组合物给予受试者，每次给予相隔约7天。