CN111629750B - 用于引发针对艰难梭菌的免疫应答的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

在一个方面，本发明涉及包括艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B的免疫原性组合物及其使用方法。在另一个方面，本发明涉及用于在人中引发针对艰难梭菌感染的免疫应答的方法。该方法包括向人施用有效剂量的组合物，所述组合物包括艰难梭菌类毒素，其中所述组合物施用至少两次，其中第二次施用是在第一次施用后约30天，并且其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答是持续的。

Description

用于引发针对艰难梭菌的免疫应答的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年9月28日提交的美国临时申请号62/577,661，于2017年10月24日提交的美国临时申请号62/576,603，于2017年10月26日提交的美国临时申请号62/577,661，以及于2017年8月21日提交的美国临时申请号62/720,617的优先权。这些专利申请各自整体引入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及与艰难梭菌(Clostridium difficile)类毒素及其方法有关的组合物和方法。
背景技术
艰难梭菌(Clostridium difficile)(艰难梭菌(C.difficile))是革兰氏阳性厌氧菌，其与人中的胃肠道疾病相关。如果天然肠道菌群通过用抗生素的治疗而减少，则艰难梭菌的定殖通常在结肠中发生。感染可以通过糖基化毒素，毒素A和毒素B(分别为308kDa和270kDa)(其为艰难梭菌的主要毒力因子)的分泌而导致抗生素相关的腹泻，以及有时的假膜性结肠炎。
在过去的十年中，医院、疗养院和其它长期护理设施中的艰难梭菌爆发的次数和严重性急剧增加。这种升级中的关键因素包括高毒力致病菌株的出现，增加的抗生素使用，改善的检测方法，以及卫生保健设施中对空气传播的孢子的暴露增加。
甲硝唑和万古霉素代表目前公认的用于艰难梭菌相关疾病(CDAD)的抗生素治疗的护理标准。然而，接受此类治疗的约20％患者在CDI的首次发作后经历感染的复发，并且这些患者中的高达约50％遭受另外的复发。复发的治疗代表非常重大的挑战，且大多数复发通常在前一次发作的一个月内发生。
对艰难梭菌毒素的体液免疫应答在预防人中疾病的更严重结果或复发中起重要作用。临床研究提示抗毒素A免疫球蛋白G的高血清浓度(如通过酶联免疫吸附测定测量的)与免于CDI的保护或原发CDI后的复发之间的关联。用灭活毒素的主动免疫和用抗毒素抗体的被动免疫已证实使动物免于致命攻击。另外，与用万古霉素加上抗毒素抗体治疗的仓鼠相比，用单独的万古霉素治疗的仓鼠具有更高的死亡率，指示疫苗接种可以提供超过抗生素的优点。
不存在批准用于复杂艰难梭菌感染(CDI)的高度有效的非侵入性治疗。相应地，存在关于针对艰难梭菌的免疫原性和/或治疗性组合物及其方法的需要。
发明内容
为了满足这些和其它需要，本发明涉及艰难梭菌类毒素及其使用方法。如本文使用的，除非另有说明，否则术语“类毒素”、“突变型毒素”和“多肽”是同义词并且可互换使用。在一个方面，本发明涉及目前在处于关于CDI的危险中的对象中评估功效和安全性的艰难梭菌疫苗。最佳疫苗接种剂量和方案的选择基于研究，考虑了免疫原性、安全性、以及用于短期和长期保护的潜力。
在一个方面，本发明涉及用于在人中引发针对艰难梭菌感染的免疫应答的方法。该方法包括向人施用有效剂量的组合物，所述组合物包括艰难梭菌类毒素，即多肽，其中所述组合物施用至少两次。在一个实施方案中，第二次施用是在第一次施用后至少7天，并且第三次施用是在第一次施用后约30天。在一个实施方案中，第三次施用是在第一次施用后约180天。在一个实施方案中，组合物施用至少三次。在一个实施方案中，第二次施用是在第一次施用后约30天，并且第三次施用是在第一次施用或第二次施用后约180天。在一个实施方案中，第三次施用是在第一次施用后至少180天。
在一个实施方案中，引发的免疫应答包括抗毒素A中和性单克隆抗体。在一个实施方案中，引发的免疫应答包括抗毒素B中和性单克隆抗体。在一个实施方案中，引发的免疫应答包括抗毒素A中和性单克隆抗体和抗毒素B中和性单克隆抗体，其中所述中和性单克隆抗体的浓度为至少10μg/mL。
在一个实施方案中，组合物包括艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B，其各自具有至少90％或更高的纯度。在一个实施方案中，组合物包括以约3:1至约1:1比率的艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B。根据本发明的方法，其中所述组合物包括以1:1比率的艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B。在一个实施方案中，组合物包括佐剂。在一个实施方案中，组合物包括铝佐剂。
在一个实施方案中，针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约60天。在一个实施方案中，在第一个剂量后，针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约180天。在一个实施方案中，在第二个剂量后，针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约180天。在一个实施方案中，在第一个剂量后，针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约365天。在一个实施方案中，在第二个剂量后，针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约365天。在一个实施方案中，在第一个剂量后，针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约540天。在一个实施方案中，在第二个剂量后，针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约540天。
在一个实施方案中，第二次施用是在第一次施用后至少7天，并且第三次施用是在第一次施用后至少30天。在一个实施方案中，第三次施用是在第一次施用后至少30天。在一个实施方案中，第二次施用是在第一次施用后至少7天，并且第三次施用是在第一次施用或第二次施用后至少180天。在一个实施方案中，第三次施用是在第一次施用后至少180天。在一个实施方案中，组合物包括艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B，其各自具有至少90％或更高的纯度。
在一个实施方案中，组合物包括以约3∶1至约1∶1比率的艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B。在一个实施方案中，组合物包括以1∶1比率的艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B。在一个实施方案中，组合物包括佐剂。在一个实施方案中，组合物包括铝佐剂。在一个实施方案中，针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约60天。在一个实施方案中，针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约180天。在一个实施方案中，针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约365天。
在一个实施方案中，艰难梭菌类毒素A与铝佐剂结合。在一个实施方案中，艰难梭菌类毒素B与铝佐剂结合。在一个实施方案中，艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B是冻干的。
在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少4倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少8倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少16倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少4倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少8倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少16倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少4倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少8倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少16倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少4倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少8倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少16倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少4倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少8倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少16倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少4倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少8倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少16倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第一个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第二个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天测量时，组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第三个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第一个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第二个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天测量时，组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第三个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天中任何一天测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第三个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天中任何一天测量时，组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度。
在一个实施方案中，人对于毒素B呈血清阴性。在一个实施方案中，人对于毒素A呈血清阴性。在一个实施方案中，人对于毒素A和毒素B呈血清阴性。在一个实施方案中，人对于毒素B呈血清阳性。在一个实施方案中，人对于毒素A呈血清阳性。在一个实施方案中，人对于毒素A和毒素B呈血清阳性。
在一个实施方案中，类毒素是包括SEQ ID NO：4的多肽，其中不存在甲硫氨酸。在一个实施方案中，类毒素是包括SEQ ID NO：6的多肽，其中不存在甲硫氨酸。在一个实施方案中，类毒素包括甲醛接触的艰难梭菌毒素A。在一个实施方案中，类毒素包括甲醛接触的艰难梭菌毒素B。在另一个实施方案中，类毒素不是甲醛接触的多肽。
在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型002。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型003。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型004。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型012。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型015。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型017。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型020。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型023。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型027。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型029。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型046。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型053。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型059。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型070。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型075。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型078。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型081。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型087。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型106。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型117。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型126。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型131。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌核糖体型154。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌毒素型0。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌毒素型I。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌毒素型VIII。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌毒素型IV。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌毒素型III。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌毒素型XIII。在一个实施方案中，感染来自艰难梭菌毒素型V。
附图说明
图1A-D：图1A-B-高于阈值*的对象比例-第0、1、6个月方案(可评估的免疫原性群体)。星号(*)对于毒素A的≥219中和单位/mL(图1A)和对于毒素B的≥2586中和单位/mL(图1B)。在月方案中的第8天和第15天和第4个月时未收集血清。图1C和图1D-高于阈值*的对象比例-第1、8、30天方案(可评估的免疫原性群体)。星号(*)对于毒素A的≥219中和单位/mL(图1C)和对于毒素B的≥2586中和单位/mL(图1D)。在月方案中的第8天和第15天和第4个月时未收集血清。
图2A-2D-图2A-B几何平均浓度-第0、1、6个月方案(可评估的免疫原性群体)。虚线(--)代表对于毒素A的≥219中和单位/mL(图2A)和对于毒素B的2586中和单位/mL(图2B)。在月方案中的第8天和第15天和第4个月时未收集血清。图2C-D几何平均浓度-第1、8、30天方案(可评估的免疫原性群体)。虚线(--)代表对于毒素A的≥219中和单位/mL(图2C)和对于毒素B的2586中和单位/mL(图2D)。在月方案中的第8天和第15天和第4个月时未收集血清。
图3A-B-不良事件的概述(安全群体)。上图涉及第0、1、6个月方案(图3A)。下图涉及第1、8、30天方案(图3B)。注意方案指定的不良事件报告期：直到剂量3后1个月不严重，直到剂量3后6个月严重(即，报告期对于月方案长了5个月)。
图4A-B-几何平均浓度-毒素A(可评估的免疫原性群体)。上图涉及第0、1、6个月方案(图4A)。下图涉及第1、8、30天方案(图4B)。虚线表示对于毒素A的219中和单位/mL；在月方案中的第8天和第15天和第4个月时未收集血清；在天方案的第6个月和第187天时未收集血清。
图5A-B-几何平均浓度-毒素B(可评估的免疫原性群体)。上图涉及第0、1、6个月方案(图5A)。下图涉及第1、8、30天方案。虚线表示对于毒素B的2586中和单位/mL(图5B)。在月方案中的第8天和第15天和第4个月时未收集血清；在天方案的第6个月和第187天时未收集血清。
图6A-B-通过基线血清状况的几何平均浓度-毒素A(可评估的免疫原性群体)。上图涉及第0、1、6个月方案(图6A)。下图涉及第1、8、30天方案(图6B)。虚线表示对于毒素A的219中和单位/mL；在月方案中的第8天和第15天和第4个月时未收集血清；在天方案的第6个月和第187天时未收集血清。
图7A-B-通过基线血清状况的几何平均浓度-毒素B(可评估的免疫原性群体)。上图涉及第0、1、6个月方案(图7A)。下图涉及第1、8、30天方案(图7B)。虚线表示对于毒素B的2586中和单位/mL。在月方案中的第8天和第15天和第4个月时未收集血清；在天方案的第6个月和第187天时未收集血清。
图8A-B-通过基线血清状况的几何平均浓度-(月方案)-毒素A和毒素B(可评估的免疫原性群体)。上图涉及毒素A(图8A)。虚线表示对于毒素A的219中和单位/mL。下图涉及毒素B(图8B)。虚线表示对于毒素B的2586中和单位/mL。在月方案中的第8天和第15天和第4个月时未收集血清；在天方案的第6个月和第187天时未收集血清。
图9A-B-通过基线血清状况的几何平均浓度-(天方案)-毒素A和毒素B(可评估的免疫原性群体)。上图涉及毒素A(图9A)。虚线表示对于毒素A的219中和单位/mL。下图涉及毒素B(图9B)。虚线表示对于毒素B的2586中和单位/mL。在月方案中的第8天和第15天和第4个月时未收集血清；在天方案的第6个月和第187天时未收集血清。
序列标识符
SEQ ID NO：1列出了关于野生型艰难梭菌630毒素A(TcdA)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2列出了关于野生型艰难梭菌630毒素B(TcdB)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3列出了关于与SEQ ID NO；1相比，在位置285和287处具有突变的突变型TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4列出了关于与SEQ ID NO：1相比，在位置285、287和700处具有突变的突变型TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5列出了关于与SEQ ID NO：2相比，在位置286和288处具有突变的突变型TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6列出了关于与SEQ ID NO：2相比，在位置286、288和698处具有突变的突变型TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7列出了关于与SEQ ID NO：1相比，在位置269、272、285、287、460、462和700处具有突变的突变型TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8列出了关于与SEQ ID NO：2相比，在位置270、273、286、288、461、463和698处具有突变的突变型TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9列出了编码野生型艰难梭菌630毒素A(TcdA)的DNA序列。
SEQ ID NO：10列出了编码野生型艰难梭菌630毒素B(TcdB)的DNA序列。
SEQ ID NO：11列出了编码SEQ ID NO：3的DNA序列。
SEQ ID NO：12列出了编码SEQ ID NO：4的DNA序列。
SEQ ID NO：13列出了编码SEQ ID NO：5的DNA序列。
SEQ ID NO：14列出了编码SEQ ID NO：6的DNA序列。
SEQ ID NO：15列出了关于野生型艰难梭菌R20291 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16列出了编码SEQ ID NO：15的DNA序列。
SEQ ID NO：17列出了关于野生型艰难梭菌CD196 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18列出了编码SEQ ID NO：17的DNA序列。
SEQ ID NO：19列出了关于野生型艰难梭菌VPI10463 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20列出了编码SEQ ID NO：19的DNA序列。
SEQ ID NO：21列出了关于野生型艰难梭菌R20291TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22列出了编码SEQ ID NO：21的DNA序列。
SEQ ID NO：23列出了关于野生型艰难梭菌CD196 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24列出了编码SEQ ID NO：23的DNA序列。
SEQ ID NO：25列出了关于野生型艰难梭菌VPI10463 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26列出了编码SEQ ID NO：25的DNA序列。
SEQ ID NO：27列出了关于野生型艰难梭菌VPI10463的致病性基因座的DNA序列。
SEQ ID NO：28列出了关于SEQ ID NO：1的残基101至293的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29列出了关于SEQ ID NO：1的残基1至542的氨基酸序列。
SEQ ID NO：30列出了关于SEQ ID NO：2的残基101至293的氨基酸序列。
SEQ ID NO：31列出了关于SEQ ID NO：2的残基1至543的氨基酸序列。
SEQ ID NO：32列出了关于SEQ ID NO：1的残基543至809的氨基酸序列。
SEQ ID NO：33列出了关于SEQ ID NO：2的残基544至767的氨基酸序列。
SEQ ID NO：34列出了关于突变型TcdA的氨基酸序列，其中残基101、269、272、285、287、460、462、541、542、543、589、655和700可以是任何氨基酸。
SEQ ID NO：35列出了关于突变型TcdB的氨基酸序列，其中102、270、273、286、288、384、461、463、520、543、544、587、600、653、698和751可以是任何氨基酸。
SEQ ID NO：36列出了关于艰难梭菌TcdA(A3-25 mAb)的中和性抗体的可变轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：37列出了关于艰难梭菌TcdA(A3-25 mAb)的中和性抗体的可变重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：38列出了关于艰难梭菌TcdA(A3-25 mAb)的中和性抗体的可变轻链的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：39列出了关于艰难梭菌TcdA(A3-25 mAb)的中和性抗体的可变轻链的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：40列出了关于艰难梭菌TcdA(A3-25 mAb)的中和性抗体的可变轻链的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41列出了关于艰难梭菌TcdA(A3-25 mAb)的中和性抗体的可变重链的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：42列出了关于艰难梭菌TcdA(A3-25 mAb)的中和性抗体的可变重链的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：43列出了关于艰难梭菌TcdA(A3-25 mAb)的中和性抗体的可变重链的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：44列出了编码SEQ ID NO：3的DNA序列。
SEQ ID NO：45列出了编码SEQ ID NO：4的DNA序列。
SEQ ID NO：46列出了编码SEQ ID NO：5的DNA序列。
SEQ ID NO：47给出了编码SEQ ID NO：6的DNA序列。
SEQ ID NO：48列出了免疫刺激性寡核苷酸ODN CpG 24555的核苷酸序列。
SEQ ID NO：49列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B8-26 mAb)的可变重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：50列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B8-26 mAb)的可变重链的信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：51列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B8-26 mAb)的可变重链的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：52列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B8-26 mAb)的可变重链的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：53列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B8-26 mAb)的可变重链的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：54列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B8-26 mAb)的可变重链的恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：55列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B8-26 mAb)的可变轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：56列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B8-26 mAb)的可变轻链的信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：57列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B8-26 mAb)的可变轻链的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：58列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B8-26 mAb)的可变轻链的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：59列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B8-26 mAb)的可变轻链的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：60列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B59-3 mAb)的可变重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：61列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B59-3 mAb)的可变重链的信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：62列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B59-3 mAb)的可变重链的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：63列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B59-3 mAb)的可变重链的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：64列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B59-3 mAb)的可变重链的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：65列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B59-3 mAb)的可变重链的恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：66列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B59-3 mAb)的可变轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：67列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B59-3 mAb)的可变轻链的信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：68列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B59-3 mAb)的可变轻链的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：69列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B59-3 mAb)的可变轻链的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：70列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B59-3 mAb)的可变轻链的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：71列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B9-30 mAb)的可变重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：72列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B9-30 mAb)的可变重链的信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：73列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B9-30 mAb)的可变重链的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：74列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B9-30 mAb)的可变重链的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：75列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B9-30 mAb)的可变重链的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：76列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B9-30 mAb)的可变重链的恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：77列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B9-30 mAb)的可变轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：78列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B9-30 mAb)的可变轻链的信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：79列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B9-30 mAb)的可变轻链的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：80列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B9-30 mAb)的可变轻链的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：81列出了关于艰难梭菌TcdB中和性抗体(B9-30 mAb)的可变轻链的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：82列出了关于突变型TcdB的氨基酸序列，其中在位置102、270、273、286、288、384、461、463、520、543、544、587、600、653、698和751处的残基可以是任何氨基酸。
SEQ ID NO：83列出了关于与SEQ ID NO：1相比，在位置269、272、285、287、460、462和700处具有突变的突变型TcdA的氨基酸序列，其中在位置1处的甲硫氨酸不存在。
SEQ ID NO：84列出了关于与SEQ ID NO：1相比，在位置285、287和700处具有突变的突变型艰难梭菌毒素A的氨基酸序列，其中在位置1处的甲硫氨酸不存在。
SEQ ID NO：85列出了关于与SEQ ID NO：2相比，在位置270、273、286、288、461、463和698处具有突变的突变型艰难梭菌毒素B的氨基酸序列，其中在位置1处的甲硫氨酸不存在。
SEQ ID NO：86列出了关于与SEQ ID NO：2相比，在位置286、288和698处具有突变的突变型艰难梭菌毒素B的氨基酸序列，其中在位置1处的甲硫氨酸不存在。
SEQ ID NO：87列出了关于野生型艰难梭菌2004013 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：88列出了关于野生型艰难梭菌2004111TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：89列出了关于野生型艰难梭菌2004118 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：90列出了关于野生型艰难梭菌2004205 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：91列出了关于野生型艰难梭菌2004206 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：92列出了关于野生型艰难梭菌2005022 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：93列出了关于野生型艰难梭菌2005088 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：94列出了关于野生型艰难梭菌2005283 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：95列出了关于野生型艰难梭菌2005325 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：96列出了关于野生型艰难梭菌2005359 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：97列出了关于野生型艰难梭菌2006017 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：98列出了关于野生型艰难梭菌2007070 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：99列出了关于野生型艰难梭菌2007217 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：100列出了关于野生型艰难梭菌2007302 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：101列出了关于野生型艰难梭菌2007816 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：102列出了关于野生型艰难梭菌2007838 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：103列出了关于野生型艰难梭菌2007858 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：104列出了关于野生型艰难梭菌2007886 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：105列出了关于野生型艰难梭菌2008222 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID N O：106列出了关于野生型艰难梭菌2009078 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：107列出了关于野生型艰难梭菌2009087 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：108列出了关于野生型艰难梭菌2009141 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：109列出了关于野生型艰难梭菌2009292 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：110列出了关于野生型艰难梭菌2004013 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：111列出了关于野生型艰难梭菌2004111 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：112列出了关于野生型艰难梭菌2004118 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：113列出了关于野生型艰难梭菌2004205 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：114列出了关于野生型艰难梭菌2004206 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：115列出了关于野生型艰难梭菌2005022 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：116列出了关于野生型艰难梭菌2005088 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：117列出了关于野生型艰难梭菌2005283 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：118列出了关于野生型艰难梭菌2005325 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：119列出了关于野生型艰难梭菌2005359 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：120列出了关于野生型艰难梭菌2006017 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：121列出了关于野生型艰难梭菌2006376 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：122列出了关于野生型艰难梭菌2007070 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：123列出了关于野生型艰难梭菌2007217 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：124列出了关于野生型艰难梭菌2007302 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：125列出了关于野生型艰难梭菌2007816 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：126列出了关于野生型艰难梭菌2007838 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：127列出了关于野生型艰难梭菌2007858 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：128列出了关于野生型艰难梭菌2007886 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：129列出了关于野生型艰难梭菌2008222 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：130列出了关于野生型艰难梭菌2009078 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：131列出了关于野生型艰难梭菌2009087 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：132列出了关于野生型艰难梭菌2009141 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：133列出了关于野生型艰难梭菌2009292 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：134列出了关于野生型艰难梭菌014 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：135列出了关于野生型艰难梭菌015 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：136列出了关于野生型艰难梭菌020 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：137列出了关于野生型艰难梭菌023 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：138列出了关于野生型艰难梭菌027 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：139列出了关于野生型艰难梭菌029 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：140列出了关于野生型艰难梭菌046 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：141列出了关于野生型艰难梭菌014 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：142列出了关于野生型艰难梭菌015 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：143列出了关于野生型艰难梭菌020 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：144列出了关于野生型艰难梭菌023 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：145列出了关于野生型艰难梭菌027 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：146列出了关于野生型艰难梭菌029 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：147列出了关于野生型艰难梭菌046 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：148列出了关于野生型艰难梭菌001 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：149列出了关于野生型艰难梭菌002 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：150列出了关于野生型艰难梭菌003 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：151列出了关于野生型艰难梭菌004 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：152列出了关于野生型艰难梭菌070 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：153列出了关于野生型艰难梭菌075 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：154列出了关于野生型艰难梭菌077 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：155列出了关于野生型艰难梭菌081 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：156列出了关于野生型艰难梭菌117 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：157列出了关于野生型艰难梭菌131 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：158列出了关于野生型艰难梭菌001 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：159列出了关于野生型艰难梭菌002 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：160列出了关于野生型艰难梭菌003 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：161列出了关于野生型艰难梭菌004 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：162列出了关于野生型艰难梭菌070 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：163列出了关于野生型艰难梭菌075 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：164列出了关于野生型艰难梭菌077 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：165列出了关于野生型艰难梭菌081 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：166列出了关于野生型艰难梭菌117 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：167列出了关于野生型艰难梭菌131 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：168列出了关于野生型艰难梭菌053 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：169列出了关于野生型艰难梭菌078 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：170列出了关于野生型艰难梭菌087 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：171列出了关于野生型艰难梭菌095 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：172列出了关于野生型艰难梭菌126 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：173列出了关于野生型艰难梭菌053 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：174列出了关于野生型艰难梭菌078 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：175列出了关于野生型艰难梭菌087 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：176列出了关于野生型艰难梭菌095 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：177列出了关于野生型艰难梭菌126 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：178列出了关于野生型艰难梭菌059 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：179列出了关于野生型艰难梭菌059 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：180列出了关于野生型艰难梭菌106 TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：181列出了关于野生型艰难梭菌106 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：182列出了关于野生型艰难梭菌017 TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：183列出了关于与SEQ ID NO：1相比，在位置285、287、700、972和978处具有突变的突变型TcdA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：184列出了关于与SEQ ID NO：2相比，在位置286、288、698、970和976处具有突变的突变型TcdB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：185到SEQ ID NO：195各自列出了关于示例性突变型毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO：196到SEQ ID NO：212各自列出了关于示例性突变型毒素A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：213到SEQ ID NO：222各自列出了关于示例性突变型毒素B的氨基酸序列。
SEQ ID NO：223到SEQ ID NO：236各自列出了关于示例性突变型毒素A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：237到SEQ ID NO：243各自列出了关于示例性突变型毒素B的氨基酸序列。
SEQ ID NO：244到SEQ ID NO：245各自列出了关于示例性突变型毒素A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：246到SEQ ID NO：249各自列出了关于示例性突变型毒素B的氨基酸序列。
SEQ ID NO：250到SEQ ID NO：253各自列出了关于示例性突变型毒素A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：254列出了关于示例性突变型毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO：255到SEQ ID NO：263各自列出了关于示例性突变型毒素A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：264到SEQ ID NO：269各自列出了关于示例性突变型毒素B的氨基酸序列。
SEQ ID NO：270到SEQ ID NO：275各自列出了关于示例性突变型毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO：276到SEQ ID NO：323各自列出了关于示例性突变型毒素A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：324到SEQ ID NO：373各自列出了关于示例性突变型毒素B的氨基酸序列。
SEQ ID NO：374到SEQ ID NO：421各自列出了关于示例性突变型毒素A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：422到SEQ ID NO：471各自列出了关于示例性突变型毒素B的氨基酸序列。
SEQ ID NO：472到SEQ ID NO：519各自列出了关于示例性突变型毒素A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：568到SEQ ID NO：615各自列出了关于示例性突变型毒素B的氨基酸序列。
SEQ ID NO：520到SEQ ID NO：567各自列出了关于示例性突变型毒素A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：616到SEQ ID NO：663各自列出了关于示例性突变型毒素B的氨基酸序列。
SEQ ID NO：664到SEQ ID NO：711各自列出了关于示例性突变型毒素A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：712到SEQ ID NO：761各自列出了关于示例性突变型毒素B的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明人令人惊讶地开发了高度免疫原性和良好耐受的组合物和方法，其可以用于治疗、改善、减少通过艰难梭菌感染的危险和/或预防通过艰难梭菌的感染。更具体而言，例如，除其它事项外，本发明人发现，当作为3剂量方案(第1、8和30天)施用于年龄65至85岁的健康成人时，艰难梭菌疫苗的两个抗原剂量水平(100μg和200μg总类毒素)的免疫原性，如通过在第37天(在剂量3后7天)时的艰难梭菌毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平测量的。除其它事项外，本发明人还发现，当作为3剂量方案(第0、1和6个月)施用于年龄65至85岁的健康成人时，艰难梭菌疫苗的2个抗原剂量水平(100μg和200μg总类毒素)的免疫原性，如通过在第7个月(在剂量3后1个月)时的艰难梭菌毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平测量的。除其它事项外，本发明人进一步发现，当以3剂量方案(第1、8和30天或第0、1和6个月)施用于年龄65至85岁的健康成人时，艰难梭菌疫苗的2个抗原剂量水平(100μg和200μg总类毒素)的免疫原性，如通过在疫苗接种后的多重时间点的艰难梭菌毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平测量的；对于3个剂量的艰难梭菌疫苗施用后至少直到12个月，年龄65至85岁的健康成人中的免疫应答动力学；艰难梭菌疫苗的第四个剂量的免疫原性，如通过在疫苗接种后的多重时间点的艰难梭菌毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平测量的；以及对于第四个剂量的艰难梭菌疫苗施用后至少直到36个月，年龄65至85岁的健康成人中的免疫应答动力学。
提供了示例性的组合物。例如，提供了包含有效量的艰难梭菌类毒素A和类毒素B的组合物(例如，约40至约500μg/剂量，例如约40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500μg/剂量中的任一种，例如约50至约100μg/剂量(w/w，组合物中的类毒素A和B总量))，以有效的类毒素A∶B比率(例如，按重量计约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、3∶1、3∶2或1∶1的类毒素A/类毒素B中的任一种)，并且具有足够的纯度(例如，至少约80至约100％，例如约80、85、90、95或90-100％(w/w)中的任一种)，使用通过任何合适途径(例如，肌内)的一次或多次施用(例如，至少两次、三次施用或剂量)，多剂量施用方案的每个剂量彼此适当地分开(例如，至少约一至约十天，例如约一、二、三、四、五、六、七、八、九或十天的任一种，例如约七天)。普通技术人员将理解剂量之间的时间长度(时间间隔)取决于个体而变，并且该间隔应该足够长(例如，如以天测量的)，使得来自先前剂量的免疫应答具有时间发展(例如，待引发)，并且不以任何方式被后续剂量(例如，一个或多个加强剂量)抑制。
在一个实施方案中，用于本发明的疫苗接种方案中的组合物包括约40至约500μg/剂量的艰难梭菌类毒素A。在一个实施方案中，组合物包括约50至约400μg/剂量的艰难梭菌类毒素A。在一个实施方案中，组合物包括约50至约200μg/剂量的艰难梭菌类毒素A。在一个实施方案中，组合物包括约50至约150μg/剂量。在一个实施方案中，组合物包括约40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500μg/剂量的艰难梭菌类毒素A中的任一种。在一个实施方案中，组合物包括约50μg/剂量的艰难梭菌类毒素A。在另一个实施方案中，组合物包括约100μg/剂量的艰难梭菌类毒素A。
在一个实施方案中，用于本发明的疫苗接种方案中的组合物包括约40至约500μg/剂量的艰难梭菌类毒素B。在一个实施方案中，组合物包括约50至约400μg/剂量的艰难梭菌类毒素B。在一个实施方案中，组合物包括约50至约200μg/剂量的艰难梭菌类毒素B。在一个实施方案中，组合物包括约50至约150μg/剂量。在一个实施方案中，组合物包括约40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500μg/剂量的艰难梭菌类毒素B中的任一种。在一个实施方案中，组合物包括约50μg/剂量的艰难梭菌类毒素B。在另一个实施方案中，组合物包括约100μg/剂量的艰难梭菌类毒素B。
在一个实施方案中，用于本发明的疫苗接种方案中的组合物包括以本文公开剂量的艰难梭菌类毒素A和B。在一个实施方案中，类毒素A/B比率为按重量计3∶1、3∶2或1∶1的类毒素A/类毒素B。在一个实施方案中，类毒素A/B比率为按重量计1∶3、2∶3或1∶1的类毒素A/类毒素B。在一个实施方案中，类毒素A/B比率为按重量计1∶1的类毒素A/类毒素B。
在一个实施方案中，用于本发明的疫苗接种方案中的组合物包括艰难梭菌类毒素A和B，其纯度为至少约80％至约100％。在一个实施方案中，用于本发明的疫苗接种方案中的组合物包括艰难梭菌类毒素A和B，其纯度为至少约90％至约100％。在一个实施方案中，用于本发明的疫苗接种方案中的组合物包括艰难梭菌类毒素A和B，其纯度为约80、85、90、95或100％(w/w)。
在一个实施方案中，本文公开的组合物施用一次。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用两次。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用三次。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用四次。
在一个实施方案中，本文公开的组合物以相同剂量施用两次。在一个实施方案中，本文公开的组合物以相同剂量施用三次。在一个实施方案中，本文公开的组合物以相同剂量施用四次。
在一个实施方案中，本发明的组合物通过任何合适的途径施用。在一个实施方案中，本文公开的组合物通过肌内、腹膜内、皮内或皮下途径施用。在一个实施方案中，本文公开的组合物皮下或肌内施用。在一个实施方案中，本文公开的组合物肌内施用。
在本发明的一个实施方案中，多剂量施用方案的每个剂量彼此适当地分开。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用两次，每个剂量彼此分开约一至约十天。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用两次，每个剂量彼此分开约二至九天。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用两次，每个剂量彼此分开约一、二、三、四、五、六、七、八、九或十天。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用两次，每个剂量彼此分开约六天。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用两次，每个剂量彼此分开约七天。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用两次，每个剂量彼此分开约八天。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用两次，每个剂量彼此分开约一至约四个月。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用两次，每个剂量彼此分开约一、二、三或四个月。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用两次，每个剂量彼此分开约一个月。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用两次，每个剂量彼此分开约两个月。
在一个实施方案中，本文公开的组合物施用三次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约一至约十天，并且第三个剂量与第一个剂量彼此分开约15至45天。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用三次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约5至约8天，并且第三个剂量与第一个剂量彼此分开约20至35天。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用三次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约6至约7天，并且第三个剂量与第一个剂量彼此分开约25至35天。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用三次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约七天，并且第三个剂量与第一个剂量彼此分开约30天。
在一个实施方案中，本文公开的组合物施用三次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约一至约四个月，并且第三个剂量与第一个剂量彼此分开约5至10个月。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用三次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约一至两个月，并且第三个剂量与第一个剂量彼此分开约5至8个月。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用三次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约一个月，并且第三个剂量与第一个剂量彼此分开约6个月。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用三次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约一个月，并且第三个剂量与第一个剂量彼此分开约5个月。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用三次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约一个月，并且第三个剂量与第一个剂量彼此分开约7个月。
在一个实施方案中，本文公开的组合物施用四次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约一至约十天，第三个剂量与第一个剂量彼此分开约15至45天，并且第四个剂量和第三个剂量彼此分开约6个月至约2年。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用四次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约5至约8天，第三个剂量与第一个剂量彼此分开约20至35天，并且第四个剂量和第三个剂量彼此分开约10个月至约1.5年。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用四次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约6至约7天，第三个剂量与第一个剂量彼此分开约25至35天，并且第四个剂量和第三个剂量彼此分开约11个月至约13个月。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用四次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约七天，第三个剂量与第一个剂量彼此分开约30天，并且第四个剂量和第三个剂量彼此分开约1年。
在一个实施方案中，本文公开的组合物施用四次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约一至约四个月，第三个剂量与第一个剂量彼此分开约5至10个月，并且第四个剂量和第三个剂量彼此分开约6个月至2年。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用四次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约一至两个月，第三个剂量与第一个剂量彼此分开约5至8个月，并且第四个剂量和第三个剂量彼此分开约10个月至1.5年。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用四次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约一个月，第三个剂量与第一个剂量彼此分开约6个月，并且第四个剂量和第三个剂量彼此分开约11个月至13个月。在一个实施方案中，本文公开的组合物施用四次，第一个剂量和第二个剂量彼此分开约一个月，第三个剂量与第一个剂量彼此分开约6个月，并且第四个剂量和第三个剂量彼此分开约12个月。
在一个实施方案中，本文公开的任何多剂量方案中给予的组合物以相同剂量(即，相同数量的艰难梭菌类毒素A和/或B)给予。在一个实施方案中，本文公开的任何多剂量方案中给予的组合物以相同(即，相同剂量和相同成分)给予。
在一个实施方案中，本文公开的任何多剂量方案中给予的组合物以不同剂量给予。在一个实施方案中，本文公开的任何多剂量方案中给予的组合物以相同剂量的抗原(即，相同数量的艰难梭菌类毒素A和/或B)给予，但是可以包含不同的成分(例如不同的佐剂)。
在一些实施方案中，第二次施用是在第一次施用(例如，第0天)后至少一、二、三、四、五、六、七、八、九或十天，并且第三次施用是在第一次施用至少约20-200(例如，约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200，例如约30或约180天)天。例如，该方法可以包括第一次施用、第二次施用和/或第三次施用，其中第二次施用是在第一次施用后至少7天，并且第三次施用是在第一次施用或第二次施用后至少约30天和/或至少约180天。在一些实施方案中，第二次施用是在第一次施用后约七天，并且第三次施用是在第一次施用后约30天。
在使用此类方法向宿主/对象施用此类组合物后，通常观察到免疫应答，其通常包括体液免疫应答并且可能涉及细胞免疫应答。
在某些实施方案中，该方法可以包括将免疫原性组合物施用于处于感染的风险中的人对象。在一些实施方案中，人对象可以是至少约40、50、65岁或更老中的任一种。在一些实施方案中，人对象可以是约40至约65岁。在一些实施方案中，人对象可以是65-75岁。因此，还提供了用于施用组合物的方法。用于制备组合物的方法在本文中描述，并且对于本领域普通技术人员是可用的。
在一个方面，本发明涉及通过向对象(例如，人类)施用包含艰难梭菌的一种或多种抗原的组合物，使其针对艰难梭菌免疫的方法。在一个方面，本发明涉及本文公开的组合物，其用于使对象针对艰难梭菌免疫的方法中。在一个方面，本发明涉及本文公开的组合物，其用于使人对象针对艰难梭菌免疫的方法中。在一个实施方案中，人对象为40-90岁。在一个实施方案中，人对象为50-85岁。在一个实施方案中，人对象为60-85岁。在一个实施方案中，人对象为65-85岁。在一个实施方案中，人对象为65-69岁。在一个实施方案中，人对象为70-79岁。在一个实施方案中，人对象为75-79岁。在一个实施方案中，人对象为至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90岁。在一个实施方案中，人对象为至少65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85岁。
例如，合适的组合物可以包含总共约50或约100μg(或约50-100μg)的艰难梭菌类毒素(类毒素A和类毒素B)，以约3∶2的大致类毒素A/类毒素B比率，连同或不连同佐剂(例如氢氧化铝)。为了比较的目的，可以将含有抗原的组合物施用于一组对象，并且将安慰剂组合物(例如0.9％生理盐水)施用(例如，按相同的时间表)于另一组。免疫学数据和安全性数据可以在特定天(例如，在第一次施用后的第0、14、30、60、180和/或210天、和/或至多1000天)时从对象中获得。组合物的施用可以在例如第0天(第一次施用)、约第7天(第二次施用)、约第30天(第三次施用)和/或约180天(可替代的第三次施用或第四次施用)时发生。
组合物可以包含以足够的纯度(例如，约90％或更高的纯度(w/w))，以有效的类毒素A∶B比率(例如，按重量计约3∶1、3∶2或1∶1的类毒素A/类毒素B中的任一种)的艰难梭菌类毒素A和类毒素B。例如，组合物可以包含高度纯化的(例如，＞90％(w/w/))艰难梭菌类毒素A和B制剂，以约3∶2的大致类毒素A/类毒素B比率。可以使用任何可用的制备方法来制备此类组合物，所述制备方法例如如WIPO专利申请WO/2012/143902、美国专利号9187536和WIPO专利申请WO/2014/060898中所述，所述专利各自以其分别的整体引入本文作为参考。
术语“艰难梭菌类毒素”在本文中用于指已部分或完全灭活的艰难梭菌毒素(毒素A或毒素B)。如果毒素具有比未处理的毒素更少的毒性(例如100％、99％、98％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少的毒性或其间的任何值)，如通过例如体外细胞毒性测定或动物毒性测量的，则它是灭活的。可以通过纯化来自艰难梭菌培养物的毒素，以及通过化学制品(例如甲醛、戊二醛、过氧化物或氧处理)灭活毒素，来产生艰难梭菌类毒素。可替代地，可以使用重组方法和/或可替代的化学交联试剂，来产生缺乏毒性或具有减少的毒性的野生型或突变型艰难梭菌毒素。例如，可以制备导致毒性减少的遗传突变。也可以制备缺乏特定区域，以减少毒性的野生型或突变型艰难梭菌毒素。
艰难梭菌类毒素或突变型艰难梭菌毒素指显示出与相应的野生型结构或序列不同的结构或序列的分子，例如，与相应的野生型结构相比具有交联，和/或当例如通过程序GAP或BESTFIT使用缺省缺口权重进行最佳比对时，与相应的野生型序列相比，具有至少一个突变。如本文使用的，术语类毒素或突变型毒素进一步显示出不同于相应的野生型分子的功能特性(例如，取消的葡糖基转移酶和/或取消的半胱氨酸蛋白酶活性)。
如本文使用的，类毒素可以是如WIPO专利申请WO/2012/143902、美国专利号9187536和WIPO专利申请WO/2014/060898中所述的任何类毒素或突变型艰难梭菌毒素，所述专利各自以其分别的整体引入本文作为参考。即，如本文使用的，类毒素可以是如WIPO专利申请WO/2012/143902、美国专利号9187536和WIPO专利申请WO/2014/060898中所述的任何多肽，所述专利各自以其分别的整体引入本文作为参考。来自上述野生型菌株中任一种的艰难梭菌毒素可以用作类毒素或突变型艰难梭菌毒素由其产生的来源。优选地，艰难梭菌630是艰难梭菌类毒素由其产生的来源。
在一个实施方案中，类毒素指具有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：761中的任何一个序列的多肽，其中不存在起始甲硫氨酸，并且其中所述多肽已与化学交联剂例如如本文所述的甲醛或EDC接触，和/或已进行遗传突变。更具体而言，在一个实施方案中，类毒素是具有SEQ ID NO：1-8、15、17、19、21、23、25、28-35、82-761中任何一个中所示的氨基酸序列的多肽。
突变可以涉及通常位于该位置处的野生型氨基酸残基的取代、缺失、截短或修饰。优选地，突变是非保守氨基酸取代。本发明的突变型毒素可以通过本领域已知的用于制备突变的技术来制备，所述技术例如定点诱变、使用诱变剂(例如UV光)的诱变等。优选地，使用定点诱变。可替代地，可以直接合成具有目标序列的核酸分子。此类化学合成方法是本领域已知的。
在本发明中，相对于相应的野生型艰难梭菌毒素，突变型艰难梭菌毒素包括在葡糖基转移酶结构域中的至少一个突变。在一个实施方案中，葡糖基转移酶结构域包括至少两个突变。优选地，与相应的野生型艰难梭菌毒素的葡糖基转移酶活性相比，该突变降低或取消了毒素的葡糖基转移酶活性。
示例性的艰难梭菌类毒素A包括葡糖基转移酶结构域和半胱氨酸蛋白酶结构域，相对于相应的野生型艰难梭菌毒素A，所述葡糖基转移酶结构域包括在位置285和287处具有氨基酸取代的SEQ ID NO：29，所述半胱氨酸蛋白酶结构域包含在位置158处具有氨基酸取代的SEQ ID NO：32。例如，此类突变型艰难梭菌TcdA包括SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列，其中不存在起始甲硫氨酸。在另一个实施方案中，突变型艰难梭菌毒素A包括SEQ IDNO：84中所示的氨基酸序列。艰难梭菌类毒素A的进一步实例包括SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO：1相比，其具有D269A、R272A、D285A、D287A、E460A、R462A和C700A突变，其中任选地不存在起始甲硫氨酸。在另一个实施方案中，突变型艰难梭菌毒素A包括SEQID NO：83中所示的氨基酸序列。
示例性的艰难梭菌类毒素B包括SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列，其中不存在起始甲硫氨酸。在另一个实施方案中，突变型艰难梭菌毒素A包括SEQ ID NO：86中所示的氨基酸序列。突变型艰难梭菌TcdB的进一步实例包括SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列，与SEQID NO：2相比，其具有D270A、R273A、D286A、D288A、D461A、K463A和C698A突变，并且其中任选地不存在SEQ ID NO：8中的起始甲硫氨酸。在另一个实施方案中，突变型艰难梭菌毒素B包括SEQ ID NO：85中所示的氨基酸序列。
除在哺乳动物中生成免疫应答之外，与相应的野生型艰难梭菌毒素相比，本文所述的类毒素还具有减少的细胞毒性。优选地，对于在哺乳动物中的施用，相对于分别的野生型毒素的细胞毒性，免疫原性组合物是安全的，并且具有最低限度的细胞毒性(例如约6-8log10的减少)至无细胞毒性。
如本文使用的，术语细胞毒性是本领域理解的术语，并且指与相同条件下的相同细胞，但不存在细胞毒性剂的情况下相比，凋亡性细胞死亡和/或其中细胞的一种或多种通常的生物化学或生物学功能异常受损的状态。毒性可以例如在细胞或哺乳动物中定量为诱导50％细胞死亡所需的试剂量(即，分别为EC50或ED50)，或通过本领域已知的其它方法进行定量。
用于指示细胞毒性的测定是本领域已知的，例如细胞变圆测定。本领域已知的另外的示例性细胞毒性测定包括与用[14C]葡萄糖测定标记的Ras的磷光成像有关的葡糖基化测定，并且优选WIPO专利申请WO/2012/143902、美国专利号9187536和WIPO专利申请WO/2014/060898中所述的体外细胞毒性测定，所述专利各自以其分别的整体引入本文作为参考，其中EC50可以指与不存在毒素的情况下，在相同条件下的相同细胞相比，在细胞优选人二倍体成纤维细胞(例如，IMR90细胞(ATCC CCL-186TM)中，显示出至少约50％的致细胞病变效应(CPE)的免疫原性组合物浓度。体外细胞毒性测定也可以用于评价与不存在毒素的情况下，在相同条件下的相同细胞相比，在细胞优选人二倍体成纤维细胞(例如，IMR90细胞(ATCC CCL-186TM)中，抑制至少约50％的野生型艰难梭菌毒素诱导的致细胞病变效应(CPE)的组合物浓度。
在一个实施方案中，与相应的野生型艰难梭菌毒素相比，免疫原性组合物的细胞毒性减少了至少约1000、2000、3000、4000、5000-、6000-、7000-、8000-、9000-、10000-、11000-、12000-、13000倍、14000倍、15000倍或更多。
在另一个实施方案中，相对于在相同条件下的相应野生型毒素，免疫原性组合物的细胞毒性减少了至少约2-log10，更优选约3-log10，且最优选约4-log10或更多。例如，如在标准致细胞病变效应测定(CPE)中测量的，与可以具有至少约10-12g/ml的EC50值的示例性的野生型艰难梭菌TcdB相比，突变型艰难梭菌TcdB可以具有约10-9g/ml的EC50值。
在再一个实施方案中，突变型艰难梭菌毒素的细胞毒性具有至少约50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml或更大的EC50，如通过例如体外细胞毒性测定测量的。相应地，在一个优选的实施方案中，免疫原性组合物和突变型毒素对于施用于哺乳动物是生物学安全的。
在一个实施方案中，类毒素是具有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：761中的任何一个序列的多肽，更具体而言，类毒素是具有SEQ ID NO：1-8、15、17、19、21、23、25、28-35、82-761中任何一个中所示的氨基酸序列的多肽，其中不存在起始甲硫氨酸，并且其中所述多肽已与化学交联剂例如如本文所述的甲醛或EDC接触。交联(在本文中也称为“化学灭活”或“灭活”)是通过共价键将两个或更多个分子化学连接的过程。术语“交联反应物”、“交联试剂”和“交联剂”指这样的分子，其能够与肽、多肽和/或蛋白质上的特定官能团(伯胺、巯基、羧基、羰基等)反应和/或化学附着。在一个实施方案中，分子可以含有两个或更多个反应性末端，其能够与肽、多肽和/或蛋白质上的特定官能团(伯胺、巯基、羧基、羰基等)反应和/或化学附着。优选地，化学交联试剂是水溶性的。在另一个优选的实施方案中，化学交联试剂是异双功能交联剂。在另一个实施方案中，化学交联试剂不是双功能交联剂。化学交联试剂是本领域已知的。
示例性的合适化学交联试剂包括甲醛；福尔马林；乙醛；丙醛；水溶性碳二亚胺(RN＝C＝NR’)，其包括1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐、1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(CMC)、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)及其衍生物；和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；苯乙二醛；和/或UDP-二醛。
优选地，交联试剂是EDC。当突变型艰难梭菌毒素多肽通过EDC进行化学修饰(例如，通过使多肽与EDC接触)时，在一个实施方案中，多肽包括(a)在多肽的天冬氨酸残基的侧链与多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联。在一个实施方案中，多肽包括(b)在多肽的谷氨酸残基的侧链与多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联。在一个实施方案中，多肽包括(c)在多肽的C末端处的羧基与多肽的N末端的氨基之间的至少一个交联。在一个实施方案中，多肽包括(d)在多肽的C末端处的羧基与多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联。在一个实施方案中，多肽包括(e)在多肽的天冬氨酸残基的侧链与第二分离的多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联。在一个实施方案中，多肽包括(f)在多肽的谷氨酸残基的侧链与第二分离的多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联。在一个实施方案中，多肽包括(g)在多肽的C末端处的羧基与第二分离的多肽的N末端的氨基之间的至少一个交联。在一个实施方案中，多肽包括(h)在多肽的C末端处的羧基与第二分离的多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联。
“第二分离的多肽”指与在EDC反应期间存在的任何分离的多肽。在一个实施方案中，第二分离的多肽是突变型艰难梭菌毒素多肽，其具有与第一分离的多肽相同的序列。在另一个实施方案中，第二分离的多肽是突变型艰难梭菌毒素多肽，其具有与第一分离的多肽不同的序列。
在一个实施方案中，多肽包括选自(a)-(d)修饰的至少两种修饰。在一个示例性的实施方案中，多肽包括(a)在多肽的天冬氨酸残基的侧链与多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联，以及(b)在多肽的谷氨酸残基的侧链与多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联。在一个进一步的实施方案中，多肽包括选自(a)-(d)修饰的至少三种修饰。在再一个进一步的实施方案中，多肽包括(a)、(b)、(c)和(d)修饰。
当在通过EDC的化学修饰期间存在多于一种突变型多肽时，在一个实施方案中，所得到的组合物包括任何(a)-(h)修饰中的至少一种。在一个实施方案中，组合物包括选自(a)-(h)修饰的至少两种修饰。在一个进一步的实施方案中，组合物包括选自(a)-(h)修饰的至少三种修饰。在再一个进一步的实施方案中，组合物包括选自(a)-(h)修饰的至少四种修饰。在另一个实施方案中，组合物包括(a)-(h)修饰各自中的至少一个。
在一个示例性的实施方案中，所得到的组合物包括(a)在多肽的天冬氨酸残基的侧链与多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联；以及(b)在多肽的谷氨酸残基的侧链与多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联。在一个实施方案中，组合物进一步包括(c)在多肽的C末端处的羧基与多肽的N末端的氨基之间的至少一个交联；以及(d)在多肽的C末端处的羧基与多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联。
在另一个示例性的实施方案中，所得到的组合物包括(e)在多肽的天冬氨酸残基的侧链与第二分离的多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联；(f)在多肽的谷氨酸残基的侧链与第二分离的多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联；(g)在多肽的C末端处的羧基与第二分离的多肽的N末端的氨基之间的至少一个交联；以及(h)在多肽的C末端处的羧基与第二分离的多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联。
在一个进一步的示例性实施方案中，所得到的组合物包括(a)在多肽的天冬氨酸残基的侧链与多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联；(b)在多肽的谷氨酸残基的侧链与多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联；(e)在多肽的天冬氨酸残基的侧链与第二分离的多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联；以及(f)在多肽的谷氨酸残基的侧链与第二分离的多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联。
在一个优选的实施方案中，化学交联试剂包括甲醛，更优选地，在不存在赖氨酸的情况下包括甲醛的试剂。甘氨酸或具有伯胺的其它适当化合物可以用作交联反应中的猝灭剂。相应地，在另一个优选的实施方案中，化学试剂包括甲醛和甘氨酸的使用。
在再一个优选的实施方案中，化学交联试剂包括EDC和NHS。如本领域中已知的，NHS可以包括在EDC偶联方案中。然而，本发明人令人惊讶地发现，与相应的野生型毒素相比、与遗传突变的毒素相比、以及与已通过EDC化学交联的遗传突变的毒素相比，NHS可以促进突变型艰难梭菌毒素的细胞毒性的进一步降低。参见例如，WIPO专利申请WO/2012/143902、美国专利号9187536和WIPO专利申请WO/2014/060898中所述的实施例22，所述专利各自以其分别的整体引入本文作为参考。相应地，不受机制或理论的束缚，与例如其中不存在β-丙氨酸部分的艰难梭菌毒素(野生型或突变型)相比，具有与多肽的至少一个赖氨酸残基的侧链连接的β-丙氨酸部分的突变型毒素多肽(例如，起因于突变型毒素多肽、EDC和NHS的反应)，可以促进突变型毒素的细胞毒性的进一步降低。
EDC和/或NHS的使用还可以包括使用甘氨酸或具有伯胺的其它适当化合物作为猝灭剂。具有伯胺的任何化合物都可以用作猝灭剂，例如甘氨酸甲酯和丙氨酸。在一个优选的实施方案中，猝灭剂化合物是非聚合的亲水性伯胺。非聚合的亲水性伯胺的实例包括例如氨基糖、氨基醇和氨基多元醇。非聚合的亲水性伯胺的具体实例包括甘氨酸、乙醇胺、葡糖胺、胺官能化的聚乙二醇和胺官能化的乙二醇寡聚物。在一个实施方案中，化学交联试剂不包括甲醛。在一个实施方案中，化学交联试剂不包括福尔马林。
在一个方面，本发明涉及突变型艰难梭菌毒素，即多肽，其具有通过EDC化学修饰的至少一个氨基酸侧链和非聚合的亲水性伯胺，优选甘氨酸。与相应的野生型毒素相比，所得到的甘氨酸加合物(例如，来自用EDC、NHS处理并用甘氨酸猝灭的三重突变型毒素的反应)可以促进突变型毒素的细胞毒性降低。
在一个实施方案中，当突变型艰难梭菌毒素即多肽通过EDC和甘氨酸进行化学修饰时，多肽包括当多肽通过EDC进行修饰时的至少一种修饰(例如，上述任何(a)-(h)修饰中的至少一种)，以及下述示例性修饰中的至少一种：(i)与在多肽的C末端处的羧基连接的甘氨酸部分；(j)与多肽的至少一个天冬氨酸残基的侧链连接的甘氨酸部分；以及(k)与多肽的至少一个谷氨酸残基的侧链连接的甘氨酸部分。
在一个实施方案中，突变型艰难梭菌TcdA，即多肽的至少一个氨基酸是化学交联的和/或突变型艰难梭菌TcdB，即多肽的至少一个氨基酸是化学交联的。本文所述的任何突变型毒素，即多肽，可以是化学交联的。在另一个实施方案中，具有SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8的多肽的至少一个氨基酸是化学交联的。在一个实施方案中，具有SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：761中任一个的氨基酸序列的多肽的至少一个氨基酸残基是交联的。例如，在一个实施方案中，具有SEQ ID NO：1-8、15、17、19、21、23、25、28-35、82-761中任何一个中所示的氨基酸序列的多肽的至少一个氨基酸残基是交联的。在另一个实施方案中，具有SEQ ID NO：183到SEQ ID NO：761中任一个的氨基酸序列的多肽的至少一个氨基酸残基包括如上所述的修饰，例如，(a)-(k)修饰中的任一种，例如(a)在多肽的天冬氨酸残基的侧链与多肽的赖氨酸残基的侧链之间的至少一个交联。
例如，至少一个氨基酸可以通过包括碳二亚胺的试剂例如EDC进行化学交联。碳二亚胺可以在游离羧基(例如，来自天冬氨酸和/或谷氨酸的侧链)和氨基(例如，在赖氨酸残基的侧链中)之间形成共价键，以形成稳定的酰胺键。
作为另一个例子，至少一个氨基酸可以通过包括NHS的试剂进行化学交联。NHS酯活化的交联剂可以与伯胺(例如，在每个多肽链的N末端处和/或在赖氨酸残基的侧链中)反应，以得到酰胺键。
在另一个实施方案中，至少一个氨基酸可以通过包括EDC和NHS的试剂进行化学交联。例如，在一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列的分离的多肽，其中在位置1处的甲硫氨酸残基任选地不存在，其中所述多肽包括通过EDC和NHS化学修饰的至少一个氨基酸侧链。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列的分离的多肽，其中在位置1处的甲硫氨酸残基任选地不存在，其中所述多肽包括通过EDC和NHS化学修饰的至少一个氨基酸侧链。在再一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的分离的多肽。通过使多肽与EDC和NHS接触来修饰多肽。
当突变型艰难梭菌毒素即多肽通过EDC和NHS(例如，通过接触)进行化学修饰时，在一个实施方案中，多肽包括当多肽通过EDC进行修饰时的至少一种修饰(例如，上述任何(a)-(h)修饰中的至少一种)，以及(1)与多肽的至少一个赖氨酸残基的侧链连接的β-丙氨酸部分。
在另一个方面，本发明涉及突变型艰难梭菌毒素，即多肽，其中所述多肽包括通过EDC、NHS和非聚合的亲水性伯胺，优选甘氨酸进行化学修饰的至少一个氨基酸侧链。在一个实施方案中，多肽包括当多肽通过EDC进行修饰时的至少一种修饰(例如，上述任何(a)-(h)修饰中的至少一种)，当多肽通过甘氨酸进行修饰时的至少一种修饰(例如，上述任何(i)-(k)修饰中的至少一种)，以及(1)与多肽的至少一个赖氨酸残基的侧链连接的β-丙氨酸部分。
在一个方面，本发明涉及突变型艰难梭菌毒素，即多肽，其中所述多肽的至少一个赖氨酸残基的侧链与β-丙氨酸部分连接。在一个实施方案中，多肽的第二赖氨酸残基的侧链与天冬氨酸残基的侧链和/或谷氨酸残基的侧链连接。多肽的“第二”赖氨酸残基包括未与β-丙氨酸部分连接的多肽的赖氨酸残基。第二赖氨酸残基与之连接的天冬氨酸的侧链和/或谷氨酸的侧链可以是形成分子内交联的多肽的侧链，或形成分子间交联的第二多肽的侧链。在另一个实施方案中，多肽的至少一个天冬氨酸残基的侧链和/或至少一个谷氨酸残基的侧链与甘氨酸部分连接。与甘氨酸部分连接的天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基也不与赖氨酸残基连接。
在另一个方面，本发明涉及突变型艰难梭菌毒素，即多肽，其中野生型艰难梭菌毒素的至少一个氨基酸侧链是化学修饰的。在一个实施方案中，野生型艰难梭菌毒素A的至少一个氨基酸侧链和/或野生型艰难梭菌毒素B的至少一个氨基酸侧链通过EDC进行化学修饰。例如，在一个实施方案中，TcdA(SEQ ID NO：1)和/或Tcdb(SEQ ID NO：2)通过EDC进行化学修饰。在另一个实施方案中，野生型毒素通过EDC和NHS进行化学修饰。在一个实施方案中，突变型毒素，即多肽，包括化学修饰的野生型毒素A，其中所述野生型毒素A是表1中描述的任何一种。在另一个实施方案中，突变型毒素，即多肽，包括化学修饰的野生型毒素B，其中所述野生型毒素B是表2描述的任何一种。
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作为化学交联的突变型艰难梭菌毒素即多肽的再一个例子，至少一个氨基酸可以通过包括甲醛的试剂进行化学交联。甲醛可以与N末端氨基酸残基的氨基，以及精氨酸、半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸的侧链反应。甲醛和甘氨酸可以形成席夫碱加合物，其可以与主要的N末端氨基、精氨酸和酪氨酸残基附着，并且在较低的程度上与天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和色氨酸残基附着。
如果在相同条件下，处理的毒素具有比未处理的毒素更少的毒性(例如约100％、99％、95％、90％、80％、75％、60％、50％、25％或10％更少的毒性)，如例如通过体外细胞毒性测定或动物毒性测量的，则化学交联试剂被说成减少毒素的细胞毒性。
优选地，相对于在相同条件下，但不存在化学交联试剂的情况下的突变型毒素，化学交联试剂使突变型艰难梭菌毒素的细胞毒性减少至少约2-log10减少，更优选约3-log10减少，且最优选约4-log10或更多。与野生型毒素相比，化学交联试剂优选使突变型毒素的细胞毒性减少至少约5-log10减少，约6-log10减少，约7-log10，约8-log10减少或更多。
在另一个优选的实施方案中，化学灭活的突变型艰难梭菌毒素，即多肽，显示出大于或至少约50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml或更高的EC50值，如通过例如体外细胞毒性测定，例如本文所述的那种测量的。
用于使突变型毒素与化学交联试剂接触的反应条件在本领域技术人员的专业知识范围内，并且该条件可以取决于所使用的试剂而变。然而，本发明人令人惊讶地发现了用于使突变型艰难梭菌毒素即多肽与化学交联试剂接触的最佳反应条件，与相应的野生型毒素相比，同时保留了功能表位并降低了突变型毒素的细胞毒性。
优选地，选择反应条件用于使突变型毒素与交联试剂接触，其中所述突变型毒素具有约0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0mg/ml的最小浓度至约3.0、2.5、2.0、1.5或1.25mg/ml的最大浓度。可以将任何最小值与任何最大值组合，以限定用于反应的突变型毒素的合适浓度范围。最优选地，突变型毒素具有约1.0-1.25mg/ml的浓度用于反应。
在一个实施方案中，反应中使用的试剂具有约1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM或50mM的最小浓度，以及约100mM、90mM、80mM、70mM、60mM或50mM的最大浓度。可以将任何最小值与任何最大值组合，以限定用于反应的化学试剂的合适浓度范围。
在其中试剂包括甲醛的优选实施方案中，所使用的浓度优选为约2mM至80mM之间的任何浓度，最优选约40mM。在其中试剂包括EDC的另一个优选实施方案中，所使用的浓度优选为约1.3mM至约13mM之间的任何浓度，更优选约2mM至3mM，最优选约2.6mM。在一个实施方案中，EDC的浓度为基于总反应体积至多5g/L、4g/L、3g/L、2.5g/L、2g/L、1.5g/L、1.0g/L、0.5g/L，优选至多1g/L，更优选至多0.5g/L。
其中突变型毒素与化学交联试剂接触的示例性反应时间包括最少约0.5、1、2、3、4、5、6、12、24、36、48或60小时，以及最多约14天、12天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小时。可以将任何最小值与任何最大值组合，以限定合适的反应时间范围。
在一个优选的实施方案中，使突变型毒素与化学交联试剂接触的步骤进行一段时间，与在不存在交联试剂的情况下的相同突变型毒素相比，在标准的体外细胞毒性测定中，在合适的人细胞例如IMR-90细胞中，所述时间足以将突变型艰难梭菌毒素的细胞毒性减少到至少约1000μg/ml的EC50值。更优选地，反应步骤进行的时间是在合适的人细胞中，足以将突变型毒素的细胞毒性减少到至少约1000μg/ml的EC50值的时间段的至少两倍，且最优选至少三倍或更长。在一个实施方案中，反应时间不超过约168小时(或7天)。
例如，在其中试剂包括甲醛的一个实施方案中，优选使突变型毒素与试剂接触约12小时，与在不存在交联试剂的情况下的相同突变型毒素相比，在标准的体外细胞毒性测定中，在合适的人细胞例如IMR-90细胞中，所述时间显示为足以将突变型艰难梭菌毒素的细胞毒性减少到至少约1000μg/ml的EC50值的示例性时间段。在一个更优选的实施方案中，反应进行约48小时，其是反应的足够时间段的至少约三倍。在此类实施方案中，反应时间优选不大于约72小时。
在其中试剂包括EDC的另一个实施方案中，突变型毒素优选与试剂接触约0.5小时，更优选至少约1小时，或最优选约2小时。在一个实施方案中，使突变型毒素与EDC接触至多约5小时，优选至多约3小时，更优选至多约2小时。在此类实施方案中，反应时间优选不大于约6小时。
在其下突变型毒素与化学交联试剂接触的示例性pH包括约pH 5.5、6.0、6.5、7.0或7.5的最小值，以及约pH 8.5、8.0、7.5、7.0或6.5的最大值。可以将任何最小值与任何最大值组合，以限定合适的pH范围。优选地，反应在pH 6.5至7.5下，优选在pH7.0下发生。
在其下突变型毒素与化学交联试剂接触的示例性温度包括约2℃、4℃、10℃、20℃、25℃或37℃的最小值，以及约40℃、37℃、30℃、27℃、25℃或20℃的最高温度。可以将任何最小值与任何最大值组合，以限定合适的反应温度范围。优选地，反应在约20℃至30℃下，最优选在约25℃下发生。
上述的免疫原性组合物可以包括一种突变型艰难梭菌毒素(A或B)，即多肽。相应地，免疫原性组合物可以在制剂或试剂盒中占据分开的小瓶(例如，对于包括突变型艰难梭菌毒素A的组合物分开的小瓶，以及对于包括突变型艰难梭菌毒素B的组合物分开的小瓶)。免疫原性组合物可以预期用于同时、序贯或分开使用。
在另一个实施方案中，上述免疫原性组合物可以包括两种突变型艰难梭菌毒素(A和B)，即多肽。突变型艰难梭菌毒素A和突变型艰难梭菌毒素B的任何组合可以组合用于免疫原性组合物。相应地，可以将免疫原性组合物组合在单个小瓶(例如，含有包括突变型艰难梭菌TcdA的组合物和包括突变型艰难梭菌TcdB的组合物两者的单个小瓶)中。优选地，免疫原性组合物包括突变型艰难梭菌TcdA和突变型艰难梭菌TcdB，即多肽。
例如，在一个实施方案中，免疫原性组合物包括SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6，其中SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6各自的至少一个氨基酸是化学交联的。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包括突变型艰难梭菌毒素A，其包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7，以及突变型艰难梭菌毒素B，其包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8，其中所述突变型艰难梭菌毒素各自的至少一个氨基酸是化学交联的。
在另一个实施方案中，免疫原性组合物包括选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：83的任何序列，以及选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：85的任何序列。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包括SEQ ID NO：84和包括SEQ ID NO：86的免疫原性组合物。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包括SEQ ID NO：83和包括SEQ ID NO：85的免疫原性组合物。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包括SEQ ID NO：84、SEQ IDNO：83、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：85。
在另一个实施方案中，免疫原性组合物包括具有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：761中的任何一个序列的多肽，以及具有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：761中的任何一个序列的第二多肽，其中所述多肽已与化学交联剂例如如本文所述的甲醛或EDC接触。例如，在一个实施方案中，免疫原性组合物包括具有SEQ ID NO：1-8、15、17、19、21、23、25、28-35、82-761中任何一个中所示的氨基酸序列的第一多肽，以及具有SEQ ID NO：1-8、15、17、19、21、23、25、28-35、82-761中任何一个中所示的氨基酸序列的第二多肽，其中所述第一多肽和第二多肽已与化学交联剂例如如本文所述的甲醛或EDC接触。
在某些实施方案中，优选在适当施用于对象后，本文所述的组合物显示出免疫原性特性(例如，诱导可检测和/或中和性和/或保护性免疫应答)。中和性和/或保护性免疫应答的存在可以如上所述和/或通过显示以下进行证实：与材料未施用于其的个体相比，本文所述材料已施用于其的个体(例如人或其它动物)中，通过病原体(例如艰难梭菌)的感染受影响(例如降低)。例如，一个或多个测试对象(例如，人或非人)可以通过任何合适的途径和时间表来施用本文描述的组合物，然后在合适的时间量(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周)后通过致病性生物进行攻击。在施用和/或攻击后，可以监测动物的免疫功能(例如，抗体产生、T细胞活性)。可以使用例如抗体ELISA和/或病原体中和测定，来分析血清的总抗体应答或特定亚型的表达。T细胞活性可以通过例如在用抗原再刺激后测量IFN-γ产生来测量。然后可以对数据执行统计分析(例如费希尔精确检验、威尔科克森检验、曼怀二氏检验)，以确定材料在影响免疫应答方面是否有效。
如本文所述的艰难梭菌类毒素A和/或B可以与一种或多种药学上可接受的载体组合，以在施用于宿主之前提供组合物。药学上可接受的载体是并非生物学上或其它方面不期望的材料，例如，该材料可以施用于对象，而不引起任何不期望的生物学效应、或以有害的方式与它包含在其中的药物组合物中的任何其它组分相互作用。如本领域技术人员众所周知的，天然地选择载体以使活性成分的任何降解降到最低，并且使对象中的任何不利副作用降到最低。合适的药物载体及其制剂在例如Remington′s：The Science and Practiceof Pharmacy，274′Edition，David B.Troy编辑，Lippicott Williams&Wilkins(2005)中描述，并且可能是适当的。通常，在制剂中使用适当量的药学上可接受的盐，以致使制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于无菌水、盐水、缓冲溶液如林格氏溶液和右旋糖溶液。溶液的pH一般为约5至约8或约7至约7.5。其它载体包括持续释放制剂，例如含有多肽或其片段的固体疏水性聚合物的半透性基质。基质可以是成形制品的形式，例如薄膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员显而易见的是，取决于例如施用途径和待施用组合物的浓度，某些载体可能是更优选的。载体是适合于施用于人或其它对象的那些。
如上文提及的，免疫学组合物通常是这样的组合物，其包含艰难梭菌抗原，并且在施用于宿主(例如动物)后，诱导或增强针对该抗原(例如艰难梭菌)的免疫应答。此类应答可以包括抗体的生成(例如，通过B细胞的刺激)或基于T细胞的应答(例如，细胞溶解应答)，如上所述，其可以是保护性和/或中和性的。保护性或中和性免疫应答可以是这样的免疫应答，其对于对应于抗原的感染性生物(例如，抗原源自于其)有害，并且对于宿主有益(例如，通过减少或预防感染)。如本文使用的，尤其是当以有效量和/或时间表施用时，保护性或中和性抗体和/或细胞应答可以与此处所述的艰难梭菌抗原反应。当在动物中进行测试时，那些抗体和/或细胞应答可以减少或抑制艰难梭菌感染的严重性、时间和/或致死性。如实施例中所示，本文所述的组合物可以用于诱导针对艰难梭菌的免疫应答。在施用于宿主后，导致治疗性(例如，通常在活动性感染期间施用)和/或保护性(例如，通常在活动性感染之前或之后施用)和/或中和性免疫应答的免疫学组合物可以是被视为疫苗。
在一个实施方案中，组合物诱导免疫应答。在一个优选的实施方案中，组合物的使用减少了艰难梭菌感染的首次原发性发作的发病率。与组合物的第一次施用之前的发病率相比，在组合物的第一次施用之后、在组合物的第二次施用之后、和/或在组合物的第三次施用之后，发病率可以减少。在另一个实施方案中，组合物的使用减少了复发性艰难梭菌感染的发病率。在组合物的第一次施用之后、在组合物的第二次施用之后、和/或在组合物的第三次施用之后，复发性感染的发病率可以减少。
在另一个实施方案中，组合物的使用减少了艰难梭菌感染的严重性。例如，与组合物的第一次施用之前的发病率相比，在组合物的第一次施用之后、在组合物的第二次施用之后、和/或在组合物的第三次施用之后，艰难梭菌感染发作的持续时间可以减少。艰难梭菌感染的发作可以包括例如至少两天排出至少三次未成形的大便，和/或需要用于艰难梭菌感染的抗生素治疗。如果患者已至少两天没有排出至少三次或更多次未成形的大便，和/或不再需要针对用于艰难梭菌感染的抗生素治疗，则艰难梭菌感染发作的持续时间可以视为减少。
在一些实施方案中，还提供了用于预防、改善、减少通过艰难梭菌感染的风险和/或治疗(例如，影响)通过艰难梭菌的感染的方法。用于治疗对象中由艰难梭菌引起或涉及艰难梭菌的一种或多种疾病状况的方法，包括向对象施用至少一个或多个有效剂量的本文所述的组合物(例如，包含艰难梭菌抗原，例如类毒素A、类毒素B)。抗原可以以约1至约300μg的剂量(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20，30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290和/或300μg中的任一个)施用。抗原可以相同或不同的剂量施用多于一次。在某些实施方案中，艰难梭菌抗原可以通过相同或不同的合适途径施用于对象一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。当施用多重剂量时，剂量可以在每个剂量中包含大约相同或不同类型和/或量的艰难梭菌抗原。剂量也可以在时间上彼此分开相同或不同的间隔。例如，剂量可以分开以下中的任一：约6、12、24、36、48、60、72、84或96小时、七天、14天、21天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、200天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、10个月、11个月、12个月、1.5年、2年、3年、4年、5年，或任何这些时间段之前、之后和/或之间的任何时间段。在一些实施方案中，艰难梭菌抗原可以单独施用或与其它试剂(例如抗生素)结合施用。此类其它试剂可以与相同或不同的艰难梭菌抗原同时(或大约同时)施用，或以不同的时间和/或频率施用。此类方法的其它实施例也可以是适当的，如可以由本领域普通技术人员容易地确定的。
还提供的是通过向对象(例如人)施用任何此类组合物，用于免疫对象的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括向对象施用包含有效量(例如，至少约40至约500，例如约50至约100μg)的艰难梭菌类毒素A和类毒素B(组合的w/w)的免疫原性组合物(例如，疫苗)，以有效的类毒素A∶B比率(例如，按重量计(w/w)3∶1、3∶2、1∶1)，并且具有足够的纯度(例如，至少90％(w/w))，使用一次或多次施用(例如至少三次，每个剂量彼此适当地分开(例如，至少约7天))。有效的类毒素A∶B比率是任何比率，其可以包括在组合物中，并且诱导针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的有效免疫应答。
在一个实施方案中，该方法可以包括第一次施用、第二次施用和第三次施用，其中第二次施用是在第一次施用后至少7天，并且第三次施用是在第一次施用和/或第二次施用后至少约30天和/或至少约180天。
在一些实施方案中，该方法可以增强和/或诱导先前暴露于艰难梭菌的人类中的现有免疫应答(例如血清阳性的人类、回忆免疫应答)。
在一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内已具有计划外的住院治疗。在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内已具有专业护理设施(通常在出院后提供专业护理和康复服务的住宅机构)逗留。在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内已具有疗养院(例如，通常在出院后提供专业护理和康复服务的住宅机构)逗留。在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内已具有两次或更多次急诊室就诊。在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内已具有10次或更多次门诊就诊(初级和/或二级护理就诊，但排除药房和心理健康就诊)。
在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个周内已施用全身性抗生素使用。在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内已患有显著的共病或与卫生保健系统接触。在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内已具有1次住院治疗≥2晚。在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内已具有≥2次急诊室就诊。在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内已具有≥10次门诊就诊。在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内具有在专业护理设施中的居住。在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内具有在疗养院中的居住。在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内具有在随机化后≥37天计划的≥2晚住院治疗。在另一个实施方案中，所述人在组合物的第一次施用之前的12个月内的任何时间已接受了全身性抗生素。
在某些实施方案中，人在组合物的第一次施用之前的12个月内在以下场所工作或已与之接触：医院、专业护理设施(通常在出院后提供专业护理和康复服务的住宅机构)、疗养院(例如，通常在出院后提供专业护理和康复服务的住宅机构)、急诊室和门诊设施(初级和/或二级护理就诊，但排除药房和心理健康就诊)。
在某些实施方案中，人类可以在第一次施用之前的12个月时期内已具有至少一次或两次住院期，各自持续至少约24、48或72小时或更长时间，和/或已接受了全身性(非局部)抗生素；和/或预计在第一次施用后约60天内具有住院治疗用于计划的外科手术。在一些实施方案中，预计/即将的住院逗留/住院治疗可以计划为约24、48至72小时或更长时间，并且可以用于涉及肾脏/膀胱/泌尿系统、肌肉骨骼系统、呼吸系统、循环系统和中枢神经系统中的至少一种的手术。
优选通过这些方法引发的免疫应答足以预防和/或改善和/或减少有症状的艰难梭菌感染的风险。在某些实施方案中，该方法可以包括将免疫原性组合物施用于处于有症状感染的风险中的人对象，其为至少约40、50或65、70、75、80或85岁。在一些实施方案中，该方法可以包括向年龄在约40至约65岁和/或约65至约75岁之间的组的每个个体施用该组合物。在一些实施方案中，该方法可以在第一次施用前被视为血清阳性的个体群体的约80、85、90、95或100％中的任一种中，诱导针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的基于抗体的免疫应答的约二至四倍增强，如通过例如ELISA和/或TNA测量的。在一些实施方案中，该方法可以在组合物施用前被视为血清阴性的个体群体的约20、25、30、35、40、45或50％中的任一种中，诱导针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的基于抗体的免疫应答的约二至四倍增强，如在第一次施用后(例如，在第0、7和30天施用后)14天通过例如ELISA和/或TNA测量的。在一些实施方案中，该方法可以在组合物施用前被视为血清阴性的个体群体的约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80％中的任一种中，诱导针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的基于抗体的免疫应答的约二至四倍增强，如在第一次施用后(例如，在第0、7和30天施用后)60天通过例如ELISA和/或TNA测量的。在一些实施方案中，此类群体中的个体为约40至约65岁。在一些实施方案中，此类群体中的个体为约50至75岁或约50至约65岁。在一些实施方案中，这种增强在第一次施用后(在第0天)约30天观察到，通常在约第7天的第二次施用后观察到，并且通常在第三次施用之前(例如在约第30天或第180天)观察到。在一些实施方案中，在多方案施用方案中，在第一次施用、第二次施用和/或第三次施用后直到约30个月(例如，约1000天)，可以检测到针对毒素A和/或毒素B的免疫应答。在一些实施方案中，在第0天(第一次施用)、约第7天(第二次施用)和约第30天(第三次施用)向人对象施用本文所述的组合物，增强或诱导针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答高达约30个月或约1000天，如通过例如ELISA和/或TNA，优选通过细胞毒性测定测量的。在一些实施方案中，免疫应答的水平可以与在第一次施用后约第1000天时，与三剂量施用方案的第一次施用后约第14天时约至少一样高，如通过例如ELISA和/或TNA，优选通过细胞毒性测定测量的。在一些实施方案中，免疫应答的水平可以与在第一次施用后约第100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000天中的任一天时，与第一次施用后约第14天时约至少一样高，如通过例如ELISA和/或TNA，优选通过细胞毒性测定测量的。在一些实施方案中，免疫应答可以是在第一次施用之前的基线(例如，在第0天时的抗毒素A和/或毒素B抗体水平)的约2至8倍，如通过例如ELISA和/或TNA测量的。在一些实施方案中，免疫应答可以是基线的约2.5倍至约6.8倍，如通过例如ELISA和/或TNA，优选通过细胞毒性测定测量的。在一些实施方案中，血清阳性个体(例如非首次用于实验)中的免疫应答从基线增加到在约第7天的约三倍；在约第14天的约10至约70倍；在约第30天的约30至约200倍；以及在第约60天的约100至约200倍，如通过关于毒素A和/或B的ELISA测量的(例如，在第0、7和30天施用后)。在一些实施方案中，血清阳性个体(例如非首次用于实验)中的免疫应答从基线增加到在约第7天的约三倍；在约第14天的约10至约100倍；在约第30天的约15至约130倍；以及在第约60天的约100至约130倍，如通过关于毒素A和/或B的TNA测量的(例如，在第0、7和30天施用后)。在一些实施方案中，血清阴性个体(例如首次用于实验)中的免疫应答从基线增加到在约第14天的约2倍；在约第30天的约5至约10倍；以及在第约60天的约25至约60倍，如通过关于毒素A和/或B的ELISA测量的(例如，在第0、7和30天施用后)。在一些实施方案中，血清阴性个体(例如首次用于实验)中的免疫应答从基线增加到在约第14天的约2至约3倍；在约第30天的约2至约5倍；以及在第约60天的约5至约40倍，如通过关于毒素A和/或B的TNA测量的(例如，在第0、7和30天施用后)。在一些实施方案中，在第0天(例如，在第一次施用之前)，在视为血清阳性或血清阴性的个体中检测本文所述的免疫应答。在一些实施方案中，对于艰难梭菌毒素A和毒素B两者均检测到此类免疫应答，如通过例如ELISA和/或TNA，优选通过细胞毒性测定测量的。还提供的是用于产生此类艰难梭菌抗原(例如，类毒素A和/或B)的方法(例如，体外或体内)，以及包含其的组合物。此类方法可以包括例如本领域普通技术人员可获得和/或已知的任何方法，和/或在WIPO专利申请WO/2012/143902、美国专利号9187536和WIPO专利申请WO/2014/060898中描述的方法，所述专利各自以其分别的整体引入本文作为参考。
如本文使用的，对象或宿主意指个体。对象可以包括驯养动物，例如猫和犬、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊和山羊)、实验动物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠)和鸟类。在一个方面，对象是哺乳动物，例如灵长类动物或人。
组合物和疫苗
在一个实施方案中，组合物是免疫原性组合物。在一个实施方案中，组合物是用于人的免疫原性组合物。在另一个实施方案中，组合物是疫苗。“疫苗”指包括抗原的组合物，所述抗原含有至少一个表位，所述表位诱导对于该抗原特异性的免疫应答。疫苗可以通过皮下、经口、口鼻或鼻内施用途径直接施用到对象内。优选地，疫苗肌内施用。在一个实施方案中，组合物是人疫苗。在一个实施方案中，组合物是针对艰难梭菌的免疫原性组合物。
在某些实施方案中，组合物可以进一步包含一种或多种艰难梭菌抗原、一种或多种药学上可接受的载体和/或一种或多种佐剂(例如铝盐、乳剂、阳离子脂质体、阴离子聚合物、Toll样受体激动剂、及其组合)。
在一个实施方案中，可以是疫苗的组合物可以作为冻干制剂提供，所述冻干制剂可以在临床场所用稀释剂重构，并且当指定时，与佐剂(例如铝佐剂，例如磷酸铝或氢氧化铝或注射用水(WFI))混合。
在一个实施方案中，组合物包括药学上可接受的载体，其指生理上合适的任何溶剂、分散介质、稳定剂、稀释剂和/或缓冲液。示例性的稳定剂包括碳水化合物，例如山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、右旋糖酐、蔗糖、海藻糖、乳糖和/或葡萄糖；惰性蛋白质，例如白蛋白和/或酪蛋白；和/或其它大的、缓慢代谢的大分子，例如多糖，例如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如乳胶官能化的SEPHAROSETM琼脂糖、琼脂糖、纤维素等)、氨基酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。另外，这些载体可以充当免疫刺激剂(即佐剂)。
优选地，该组合物包括海藻糖。海藻糖的优选量(按重量计％)包括约1％、2％、3％或4％的最小值至约10％、9％、8％、7％、6％或5％的最大值。可以将任何最小值与任何最大值组合，以限定合适的范围。在一个实施方案中，例如，每0.5mL剂量，组合物包括约3％-6％的海藻糖，最优选4.5％的海藻糖。
合适稀释剂的实例包括蒸馏水、盐水、生理磷酸盐缓冲盐水、甘油、醇(如乙醇)、林格氏溶液、右旋糖溶液、Hanks平衡盐溶液和/或冻干赋形剂。稀释剂可以是例如任何药学上可接受的稀释剂(例如20mM柠檬酸钠、5％蔗糖和0.016％甲醛；10mM柠檬酸盐、4％蔗糖、0.008％甲醛、0.57％氯化钠)。在一个优选的实施方案中，组合物包括10mM Tris、4.5％、海藻糖，0.01％聚山梨醇酯80(PS80)，pH 7.4。
示例性的缓冲液包括磷酸盐(例如磷酸钾、磷酸钠)；乙酸盐(例如乙酸钠)；琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)；甘氨酸；组氨酸；碳酸盐、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)和/或碳酸氢盐(例如碳酸氢铵)缓冲液。优选地，该组合物包括tris缓冲液。tris缓冲液的优选量包括约1mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM的最小值至约100mM、50mM、20mM、19mM、18mM、17mM、16mM、15mM、14mM、13mM、12mM或11mM的最大值。可以将任何最小值与任何最大值组合，以限定合适的范围。在一个实施方案中，例如，每0.5mL剂量，组合物包括约8mM至12mM tris缓冲液，最优选10mM tris缓冲液。
在另一个优选的实施方案中，组合物包括组氨酸缓冲液。组氨酸缓冲液的优选量包括约1mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM的最小值至约100mM、50mM、20mM、19mM、18mM、17mM、16mM、15mM、14mM、13mM、12mM或11mM的最大值。可以将任何最小值与任何最大值组合，以限定合适的范围。在一个实施方案中，例如，每0.5mL剂量，组合物包括约8mM至12mM组氨酸缓冲液，最优选10mM组氨酸缓冲液。
在再一个优选的实施方案中，组合物包括磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液的优选量包括约1mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM的最小值至约100mM、50mM、20mM、19mM、18mM、17mM、16mM、15mM、14mM、13mM、12mM或11mM的最大值。可以将任何最小值与任何最大值组合，以限定合适的范围。在一个实施方案中，例如，每0.5mL剂量，组合物包括约8mM至12mM磷酸盐缓冲液，最优选10mM磷酸盐缓冲液。
缓冲液的pH一般选择为稳定所选择的活性材料，并且可以由本领域技术人员通过已知方法确定。优选地，缓冲液的pH将在生理pH的范围内。因此，优选的pH范围为约3至约8；更优选约6.0至约8.0；再更优选约6.5至约7.5；且最优选约7.0至约7.2。
在另一个实施方案中，本文所述的组合物可以包括佐剂，如下所述。优选的佐剂加强了对免疫原的固有免疫应答，而不引起免疫原中的构象变化，所述构象变化可能影响免疫应答的定性形式。示例性佐剂包括3脱-O-酰化的单磷酰基脂质A(MPLTM)(参见GB 2220211(GSK))；氢氧化铝凝胶，例如ALHYDROGELTM(Brenntag Biosector，丹麦)；铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝)，其可以连同或不连同免疫刺激剂(例如MPL或3-DMP、QS-21)、聚合氨基酸或单体氨基酸(例如聚谷氨酸或聚赖氨酸)一起使用。再一种示例性佐剂是免疫刺激性寡核苷酸，例如CpG寡核苷酸(参见例如，WO 1998/040100、WO2010/067262)，或皂苷和免疫刺激性寡核苷酸，例如CpG寡核苷酸(参见例如，WO 00/062800)。在一个优选的实施方案中，佐剂是CpG寡核苷酸，最优选CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。优选的CpG ODN是优先激活B细胞的B类。在本发明的方面，CpG ODN具有核酸序列5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’(SEQ ID NO：48)，其中*指示硫代磷酸酯键合。这个序列的CpG ODN称为CpG24555，其在WO2010/067262中描述。在一个优选的实施方案中，CpG 24555连同氢氧化铝盐例如ALHYDROGEL一起使用。示例性佐剂的进一步类别包括皂苷佐剂，例如STIMULONTM(QS-21，其是三萜糖苷或皂苷，Aquila，Framingham，Mass.)或由其生成的颗粒，例如ISCOM(免疫刺激复合物)和佐剂。相应地，本发明的组合物可以ISCOM、含有CTB的ISCOMS、脂质体的形式递送，或封装在化合物如丙烯酸酯或聚(DL-丙交酯-共-糖苷)中，以形成大小适合于吸附的微球。通常，术语“ISCOM”指在糖苷如三萜类皂苷(特别是Quil A)与含有疏水区的抗原之间形成的免疫原性复合物。在一个优选的实施方案中，佐剂是ISCOMATRIX佐剂。其它示例性佐剂包括RC-529、GM-CSF和弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)。示例性佐剂的再一个类别是糖脂类似物，包括N-糖基酰胺、N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯，其各自在糖残基中被氨基酸取代。任选地，药物组合物包含两种或更多种不同的佐剂。佐剂的优选组合包括佐剂的任何组合，包括例如下述佐剂中的至少两种：明矾、MPL、QS-21、ISCOMATRIX、CpG和ALHYDROGEL。佐剂的示例性组合包括CpG和ALHYDROGEL的组合。
佐剂可以包含例如合适浓度(例如约800-1600μg/mL中的任一种)的佐剂，例如包含在WFI中的铝(例如氢氧化铝或磷酸铝)的佐剂。例如，佐剂(例如在0.57％的氯化钠中的800-1600g/mL的氢氧化铝)可以用作稀释剂，以重构冻干的制剂。WFI可以用于稀释用于无佐剂制剂的冻干疫苗。最终的给药溶液可以包含例如组合物/疫苗、稀释剂和佐剂。
可替代地，在一个实施方案中，在不存在佐剂的情况下，将组合物施用于哺乳动物。即，该组合物不包含佐剂。
在一些实施方案中，组合物包括表面活性剂。任何表面活性剂都是合适的，无论它是两性的、非离子的、阳离子的还是阴离子的。示例性的表面活性剂包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(例如)，例如聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为BRIJ表面活性剂)，例如三乙二醇单月桂基醚(BRIJ 30)；TRITON X 100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇；以及脱水山梨醇酯(通常称为SPAN)，例如脱水山梨糖醇三油酸酯(SPAN 85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯，及其组合。优选的表面活性剂包括聚山梨醇酯80(聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。
聚山梨醇酯80(PS-80)是非离子表面活性剂。在一个实施方案中，组合物包括范围为0.0005％至1％的PS-80浓度。例如，组合物中的PS-80浓度可以为至少0.0005％、0.005％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％或1.1％PS-80。在一个实施方案中，组合物中的PS-80浓度可以为至多2.0％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％或0.7％PS-80。可以将本文描述的任何最小值与任何最大值组合，以限定范围。优选地，该组合物包含0.01％的PS-80。
在一个示例性的实施方案中，免疫原性组合物包括海藻糖和磷酸盐80。在另一个示例性的实施方案中，免疫原性组合物包括tris缓冲液和聚山梨酸酯80。在另一个示例性的实施方案中，免疫原性组合物包括组氨酸缓冲液和聚山梨酸酯80。在再一个示例性的实施方案中，免疫原性组合物包括磷酸盐缓冲液和聚山梨醇酯80。
在一个示例性的实施方案中，免疫原性组合物包括海藻糖、tris缓冲液和聚山梨酸酯80。在另一个示例性的实施方案中，免疫原性组合物包括海藻糖、组氨酸缓冲液和聚山梨酸酯80。在再一个示例性的实施方案中，免疫原性组合物包括海藻糖、磷酸盐缓冲液和聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，药物组合物进一步包括甲醛。例如，在一个优选的实施方案中，进一步包括甲醛的药物组合物具有免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物的突变型艰难梭菌毒素已与包括甲醛的化学交联试剂接触。存在于药物组合物中的甲醛的量可以从约0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.010％、0.013％或0.015％的最小值到约0.020％、0.019％、0.018％、0.017％0.016％、0.015％、0.014％、0.013％、0.012％0.011％或0.010％的最大值不等。可以将任何最小值与任何最大值组合，以限定合适的范围。在一个实施方案中，药物组合物包括约0.010％的甲醛。
在一些替代实施方案中，本文所述的药物组合物不包括甲醛。例如，在一个优选的实施方案中，不包括甲醛的药物组合物具有免疫原性组合物，其中所述突变型艰难梭菌毒素的至少一个氨基酸通过包括EDC的试剂进行化学交联。更优选地，在此类实施方案中，突变型艰难梭菌毒素没有与包括甲醛的化学交联试剂接触。作为另一个示例性的实施方案，冻干形式的药物组合物不包括甲醛。
本文还提供的是用于施用艰难梭菌抗原的试剂盒。在一个实施方案中，一种或多种艰难梭菌抗原可以形成试剂盒的一部分和/或作为用于施用于对象的试剂盒提供。关于施用艰难梭菌抗原的说明书也可以由试剂盒提供。如本文所述的包含艰难梭菌抗原的组合物可以包括在试剂盒(例如疫苗试剂盒)中。例如，试剂盒可以包括第一容器和第二容器，所述第一容器含有以干燥或冻干形式的本文所述的组合物，并且第二容器含有用于重构组合物的水溶液。试剂盒可以任选地包括用于施用重构的液体形式的组合物的装置(例如，皮下注射器、微针阵列)和/或使用说明书。用于施用的装置可以预填充有用于重构组合物的水溶液供应。
研究药物(疫苗或安慰剂)的每个递送剂量的体积可以约0.5mL。本文公开的组合物的每个递送剂量的体积可以为约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7；0.8、0.9或1mL。本文公开的组合物的每个递送剂量的体积可以为约0.4、0.5、0.6ml。本文公开的组合物的每个递送剂量的体积可以为约0.5mL。本文公开的组合物的每个递送剂量的体积可以为约1mL。可以通过任何合适的途径(例如，皮下、静脉内、肌内、腹膜内、皮内、结节内、鼻内、经口)施用制剂。
毒素中和活性
可以使用毒素中和测定(TNA)、ELISA、或更优选地细胞毒性测定(例如在WIPO专利申请WO/2012/143902、美国专利号9187536和WIPO专利申请WO/2014/060898中描述的那种，所述专利各自以其分别的整体引入本文作为参考)，测定通过将组合物施用于人诱导的免疫应答。
体外细胞毒性测定是开发用于测试原料药材料中的任何潜在的残留细胞毒性的关键安全性测定。使用基于IMR-90细胞的测定，完成类毒素A中的任何潜在的残留细胞毒性的测量。野生型艰难梭菌毒素A显示出有力的体外细胞毒性，其中少量毒素足以引起对哺乳动物细胞的各种作用，例如细胞变圆(致细胞病变效应或CPE)和缺乏代谢活性(如通过ATP水平测量的)。通过使类毒素材料与培养中的IMR90细胞一起在37℃下以500mcg/mL进行温育，并且在24小时后评估细胞变圆，来进行CPE测定。CPE测定需要CPE通过受过训练的分析员的主观视觉评价，并且因此无法容易地验证。基于由ATP生成的发光信号量的测量，已开发了细胞毒性释放测定，所述发光信号量与用类毒素A或野生型毒素处理后的代谢活性细胞的数目成比例。结果表示为EC50，其定义为引起ATP水平中的50％减少的毒素或类毒素的量，如以相对光单位测量的。类毒素以100mcg/mL的浓度进行测试。选择这种方法用于释放和稳定性(有限的时间点)测试，因为它比替代的致细胞病变效应(CPE)测定更稳定、更客观且更适合于GMP测试。细胞毒性测定仅对类毒素运行，因为与药物产品材料相比，它可以在更高浓度下进行测试，而无基质干扰。这确保了在艰难梭菌疫苗生产周期过程中的最浓缩阶段进行测量。另外，对稳定性进行细胞毒性测定，以监测任何潜在的毒性逆转。
体外细胞毒性测定是开发用于测试原料药材料中的任何潜在的残留细胞毒性的关键安全性测定。使用基于IMR-90细胞的测定，完成类毒素B中的任何潜在的残留细胞毒性的测量。野生型艰难梭菌毒素B显示出有力的体外细胞毒性，其中少量毒素足以引起对哺乳动物细胞的各种作用，例如细胞变圆(致细胞病变效应或CPE)和缺乏代谢活性(如通过ATP水平测量的)。通过使DS材料与培养中的IMR90细胞一起在37℃下以500mcg/mL进行温育，并且在24小时后评估细胞变圆，来进行CPE测定。CPE测定需要CPE通过受过训练的分析员的主观视觉评价，并且因此无法容易地验证。基于由ATP生成的发光信号量的测量，已开发了细胞毒性释放测定，所述发光信号量与用类毒素B或野生型毒素B处理后的代谢活性细胞的数目成比例。结果表示为EC50，其定义为引起ATP水平中的50％减少的毒素或类毒素的量，如以相对光单位测量的。这个测定中最初测试的类毒素的最大浓度为200mcg/mL。然而，在一段时间内的方法性能提示可以一致地支持仅100mcg/mL的上限浓度。选择这种方法用于释放和稳定性(有限的时间点)测试，因为它比替代的CPE测定更稳定、更客观且更适合于GMP测试。细胞毒性测定仅对类毒素B原料药材料运行，因为与药物产品材料相比，它可以在更高浓度下进行测试，而无基质干扰。这确保了在艰难梭菌疫苗生产周期过程中的最浓缩阶段进行测量。另外，对稳定性进行细胞毒性测定，以监测任何潜在的毒性逆转。
为了使50％中和滴度测定对于临床使用合格，为测定提供进一步的可靠性，并且确保在临床开发中的一致长期性能，将参考标准和适当的对照加入测定中，从而允许中和滴度作为由参考标准定义的中和单位/mL读出。在当前研究的分析之前，当执行中和测定时，使用接种疫苗的人的血清样品来证实50％中和滴度与中和单位/mL之间的线性关系。基于这些相关性研究，计算了“保护性”中和阈值，并且用于分析这个研究中的临床数据。
在一个实施方案中，TNA是基于发光读出的自动化和灵敏的测定。基于参考标准计算测试样品的中和滴度。在一个实施方案中，关于Txd A的测定LLOQ为158.0U/ml；Txd B＝249.5U/ml。优选地，TNA
对于免疫原性分析，关于抗毒素A和毒素B中和性抗体应答的“保护性”阈值分别为219和2586中和单位/mL。基于这些“保护性”阈值评价了关于研究B5091009的几个免疫原性终点。
如本文使用的，除非另有明确定义，否则“指定阈值”值定义为对于毒素A的219中和单位/mL、以及对于毒素B的2586中和单位/mL。
在一个实施方案中，在人中诱导的免疫应答针对艰难梭菌菌株是中和性的，所述艰难梭菌菌株表达具有氨基酸序列的毒素A，所述氨基酸序列与组合物的类毒素A具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在另一个实施方案中，在人中诱导的免疫应答针对艰难梭菌菌株是中和性的，所述艰难梭菌菌株表达包括氨基酸序列的毒素B，所述氨基酸序列与组合物的类毒素B具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
本文所述的任何材料(例如，组合物)和/或方法的有用性(例如，免疫原性)可以通过本领域技术人员已知的各种方法中的任一种来测定。本文所述的任何一种或多种测定、或任何其它一种或多种合适的测定，可以用于确定本文所述的任何材料对于预期目的的适合性。应理解，这些方法是示例性的而非限制性的；其它测定也可能是合适的。例如，本文所述的组合物通常在施用于对象后诱导和/或增强针对艰难梭菌的抗体的产生。可以使用本领域普通技术人员可用的任何方法在对象中检测此类抗体。例如，如实施例节段中所述，血清可以从对象中获得，并且通过ELISA测试，以检测针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫球蛋白G型(IgG)抗体(例如，“主要免疫原性数据”)。测试血清中存在的抗体可以与吸附至微量滴定板的各个孔的毒素A或B抗原反应。在次级抗IgG(例如，抗人IgG)抗体-酶缀合物结合后，可以使用比色底物反应来确定与抗原包被的孔结合的抗体量。然后通常添加关于酶的底物，所述底物引起比色变化，所述比色变化与抗原结合的抗体成正比。血清中的抗体浓度可以通过从标准曲线外推而得出，所述标准曲线由具有定义的IgG单位(ELISA单位(EU)/mL)的参考标准血清的多重稀释物生成。毒素中和测定(TNA)也可以用于定量针对艰难梭菌毒素的中和性抗体。在这个测定中，可以使连续稀释的血清与固定量的艰难梭菌毒素A或B一起温育。然后可以加入测试细胞(例如Vero细胞)，并且在适当条件下(例如37℃共6天)温育血清-毒素-细胞混合物。血清中和艰难梭菌毒素的细胞毒性效应的能力可以由细胞的活力确定并且与之相关联。该测定利用酸性代谢产物在封闭培养孔中的积累作为正常细胞呼吸的指示。在暴露于毒素的细胞中，新陈代谢和CO2产生减少；因而，如由细胞培养基中的酚红pH指示剂所指示的，pH上升(例如至7.4或更高)。在这个pH下，培养基看起来是红色。然而，细胞对照或暴露于已被抗体中和的毒素的细胞代谢并产生正常量的CO2；结果，pH得到维持(例如在7.0或更低下)，并且在这个pH下，培养基看起来是黄色。因此，艰难梭菌毒素中和性抗体与血清中和艰难梭菌毒素对细胞的代谢作用的能力相关联，如通过其维持一定pH(例如7.0或更低)的能力所证明的。可以使用板阅读器测量培养基的颜色变化(例如，在562nm至630nm下)，以进一步计算在艰难梭菌毒素介导的细胞毒性的50％抑制下的抗毒素中和性抗体滴度。在一个实施方案中，当在毒素中和测定中在相同条件下测量时，组合物诱导的毒素中和性抗体滴度在接受组合物的剂量后的人中是在接受所述剂量前的人中的毒素中和性抗体滴度的至少大于1倍，例如至少1.01倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、32倍或更高。
滴度
在一个实施方案中，当在例如细胞毒性测定中在相同条件下测量时，与组合物剂量施用之前的人中的毒素中和性抗体滴度相比，该组合物在人中诱导毒素中和性抗体滴度中的增加。在一个实施方案中，当在例如细胞毒性测定中在相同条件下测量时，与第一个剂量的组合物施用之前的人中的毒素中和滴度相比，与第一个剂量的组合物施用前的人中的毒素中和滴度相比，毒素中和滴度增加。在另一个实施方案中，当在例如细胞毒性测定中在相同条件下测量时，与第一个剂量的组合物施用之前的人中的毒素中和滴度相比，在组合物的第二个剂量之后观察到滴度中的增加。在另一个实施方案中，当在例如细胞毒性测定中在相同条件下测量时，与第一个剂量的组合物施用之前的人中的毒素中和滴度相比，在组合物的第三个剂量之后观察到毒素中和滴度中的增加。在另一个实施方案中，当在例如细胞毒性测定中在相同条件下测量时，与第二个剂量的组合物施用之前的人中的毒素中和滴度相比，在组合物的第二个剂量之后观察到滴度中的增加。在另一个实施方案中，当在例如细胞毒性测定中在相同条件下测量时，与第三个剂量的组合物施用之前的人中的毒素中和滴度相比，在组合物的第三个剂量之后观察到毒素中和滴度中的增加。
在一个实施方案中，当剂量施用后，该组合物在人中诱导毒素中和滴度，其中当在例如细胞毒性测定中在相同条件下测量时，毒素中和滴度比在剂量施用之前的人中的毒素中和滴度高至少大于1倍。例如，当在例如细胞毒性测定中在相同条件下测量时，与剂量施用之前的人中的毒素中和滴度相比，毒素中和滴度在接受组合物剂量后的人中可以高至少1.01倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、32倍或64倍。
在一个实施方案中，“应答者”指人，其中所述组合物在剂量施用后的人中诱导毒素中和滴度，其中所述毒素中和滴度比剂量施用之前的人中的毒素中和滴度高至少大于1倍。在一个优选的实施方案中，与剂量施用之前的人中的毒素中和滴度相比，应答者达到毒素中和滴度中的至少≥4倍上升。此类响应者可以被称为具有保护性滴度。
在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在接受第一个剂量后的人中诱导毒素中和滴度，其比在接受第一个剂量之前的人中的毒素中和滴度高至少2倍(例如，高于在不存在第一个剂量的情况下在人中的毒素中和滴度)。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在人中诱导的毒素中和滴度比在接受第一个剂量之前的人中的毒素中和滴度高至少4倍。在一个实施方案中，当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，组合物在人中诱导的毒素中和滴度比在接受第一个剂量之前的人中的毒素中和滴度高至少8倍。
在一个实施方案中，在第一个剂量的组合物施用后，所述人具有例如等于或大于细胞毒性测定的定量下限(LLOQ)的毒素中和滴度。在另一个实施方案中，在第二个剂量的组合物施用后，所述人具有例如等于或大于细胞毒性测定的LLOQ的细胞毒性测定滴度。在另一个实施方案中，在第三个剂量的组合物施用后，所述人具有例如等于或大于细胞毒性测定的LLOQ的毒素中和滴度。
方法与施用
在一个方面，本发明涉及在人中诱导针对艰难梭菌的免疫应答的方法。在另一个方面，本发明涉及给人接种疫苗的方法。在一个实施方案中，该方法包括向人施用至少一个剂量的上述组合物。在一个优选的实施方案中，该方法包括向人施用至多一个剂量的上述组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向人施用至少第一个剂量和第二个剂量的上述组合物。
在一个实施方案中，第二个剂量在第一个剂量后至少20、30、50、60、100、120、160、170或180天施用，并且在第一个剂量后至多250、210、200或190天施用。可以将本文描述的任何最小值与任何最大值组合，以限定范围。
在另一个实施方案中，在第一个剂量后约30天施用第二个剂量。在另一个实施方案中，在第一个剂量后约60天施用第二个剂量，例如以0、2个月的免疫时间表。在另一个实施方案中，在第一个剂量后约180天施用第二个剂量，例如以0、6个月的免疫时间表。在再一个实施方案中，在第一个剂量后约120天施用第二个剂量，例如以2、6个月的免疫时间表。
在一个实施方案中，该方法包括向人施用两个剂量的组合物和至多两个剂量。在一个实施方案中，在第一个剂量后约6个月的时期内施用两个剂量。在一个实施方案中，该方法不包括向人进一步施用加强。如本文使用的，“加强”指将组合物对人的另外施用。向人施用至多两个剂量的组合物可以是有利的。此类优点包括例如促进人遵守完整的施用时间表，以及促进时间表的成本效益。
在一个实施方案中，第一个剂量和第二个剂量经过在第一个剂量后约5天、7天、14天、21、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200天，以及至多400、390、380、370、365、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210或200天的时期施用于人。在一个实施方案中，在第一个剂量施用后至少8、14、21、25或30天，以及至多100、90、80、70、60、50、45、40、35或30天后，将第二个剂量施用于人。例如，在一个实施方案中，在第一个剂量施用后至少21天和至多40天，将第二个剂量施用于人。可以将本文描述的任何最小值与任何最大值组合，以限定范围。优选地，第一个剂量和第二个剂量经过约8天的时期施用于人。更优选地，第一个剂量和第二个剂量经过约30天的时期施用于人。最优选地，第一个剂量和第二个剂量经过至少约30天的时期施用于人。
在一个实施方案中，第一个剂量和第二个剂量经过约30天的时期施用于人。在另一个实施方案中，第一个剂量和第二个剂量经过约60天的时期施用于人。在另一个实施方案中，第一个剂量和第二个剂量经过约180天的时期施用于人。
在一个实施方案中，第一个剂量和第二个剂量经过至多30天的时期施用于人。在另一个实施方案中，第一个剂量和第二个剂量经过至多60天的时期施用于人。在另一个实施方案中，第一个剂量和第二个剂量经过至多180天的时期施用于人。
剂量
在一个实施方案中，该方法包括向人施用三个剂量的该组合物。在另一个实施方案中，该方法包括施用至多三个剂量的组合物。在一个实施方案中，在第一个剂量后约6个月的时期内施用三个剂量。在一个实施方案中，该方法包括在第三个剂量后向人施用加强剂量。在另一个实施方案中，该方法不包括在第三个剂量后向人施用加强剂量。在另一个实施方案中，该方法不进一步包括向人施用第四个剂量或加强剂量的组合物。在另一个实施方案中，向人施用在约6个月的时期内的至多三个剂量。
在一个示例性实施方案中，第二个剂量在第一个剂量后约30天施用，并且第三个剂量在第二个剂量后约150至180天施用，例如以0、1、6个月的免疫时间表。在另一个示例性实施方案中，第二个剂量在第一个剂量后约60天施用，并且第三个剂量在第二个剂量后约120天施用，例如以0、2、6个月的免疫时间表。
在一个实施方案中，经过约150、160、170或180天，以及至多240、210、200或190天的时期，将第一个剂量、第二个剂量和第三个剂量施用于人。可以将本文描述的任何最小值与任何最大值组合，以限定范围。优选地，经过约180天或6个月的时期，将第一个剂量、第二个剂量和第三个剂量施用于人。例如，第二个剂量可以在第一个剂量后约60天施用于人，并且第三个剂量可以在第二个剂量后约120天施用于人。相应地，示例性的施用时间表包括在约第0、2和6个月将剂量施用于人。
如上所述，可以向人施用多重剂量的免疫原性组合物，并且每个剂量之间的天数可以变化。该方法的优点包括例如人遵守施用时间表的灵活性。
在一个实施方案中，该方法包括向人施用至多三个剂量的相同的免疫原性组合物。例如，在一个优选的实施方案中，该方法不包括向人施用第一个剂量的第一组合物，向人施用第二个剂量的第二组合物，并且向人施用第三个剂量的第三组合物，其中所述第一组合物、第二组合物和第三组合物是不同的。在另一个实施方案中，该方法包括向人施用至多四个剂量的相同的免疫原性组合物。
实施例
下述实施例示出了本发明的实施方案。除非本文另有说明，否则在下述实施例中提及疫苗候选物或免疫原性组合物，其包括遗传修饰的艰难梭菌类毒素A(即多肽)(包含SEQ ID NO：4，其中不存在起始甲硫氨酸)、以及遗传修饰的艰难梭菌类毒素B(即多肽)(包含SEQ ID NO：6，其中不存在起始甲硫氨酸)的混合物，所述多肽通过1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行进一步化学灭活，以消除残留的细胞毒性，但保留天然抗原结构并生成中和性抗体反应，如WIPO专利申请WO/2012/143902的实施例21、美国专利号9187536和WIPO专利申请WO/2014/060898、WIPO专利申请WO/2012/143902、美国专利号9187536和WIPO专利申请WO/2014/060898中所述，所述专利各自以其分别的整体引入本文作为参考。简言之，在纯化后，使用0.5mg EDC和0.5mg NHS/mg纯化的基因突变型毒素A和B(分别为大约2.6mM和4.4mM)，在25℃下灭活基因突变型毒素(SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：6)2小时。通过添加甘氨酸至100mM的最终浓度来猝灭反应，并且反应在25℃下温育另外2小时。灭活在7.0±0.5下在10mM磷酸盐、150mM氯化钠缓冲液中进行。灭活时期设定为超过将IMR90细胞中的EC50减少至大于1000ug/mL所需的时期的三倍。在2小时后，相对于天然毒素，生物活性减少了7至8log10。4小时温育后，通过渗滤将灭活的突变型毒素交换到最终的原料药缓冲液内。例如，使用100kD再生乙酸纤维素超滤盒，将灭活的毒素浓缩至1-2mg/mL，并进行缓冲液交换。更具体而言，疫苗组合物包括(a)第一多肽，其包括SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列，其中不存在SEQ ID NO：4的位置1处的甲硫氨酸残基，其中所述第一多肽的赖氨酸残基的侧链与β-丙氨酸部分交联，并且其中所述第一多肽进一步包括在第一多肽的天冬氨酸残基的侧链与甘氨酸部分之间的交联，以及在第一多肽的谷氨酸残基的侧链与甘氨酸部分之间的交联；以及(b)第二多肽，其包括SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列，其中不存在SEQ ID NO：6的位置1处的甲硫氨酸残基，其中所述第二多肽的赖氨酸残基的侧链与β-丙氨酸部分交联，并且其中所述第二多肽进一步包括在第二多肽的天冬氨酸残基的侧链与甘氨酸部分之间的交联，以及在第二多肽的谷氨酸残基的侧链与甘氨酸部分之间的交联。
研究用的艰难梭菌疫苗由以等量的2种类毒素(A和B)组成。疫苗作为无菌冻干粉末提供，其剂量强度为每剂量组合的100μg和200μg类毒素A和B。通过在使用前立即用氢氧化铝稀释剂重悬浮冻干的疫苗，来制备用于注射的疫苗。氢氧化铝稀释剂作为1-mg铝/mL(作为氢氧化铝)液体悬浮液供应。
在临床前实验中，疫苗候选物单独或与佐剂组合进行研究。在仓鼠模型中，所有疫苗制剂都证实存活益处，在免疫的仓鼠中提供免于由艰难梭菌孢子的致死性攻击的至少90％保护。在非人灵长类动物中，测试的所有类毒素疫苗制剂都诱导针对艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B两者的强中和性抗毒素抗体应答。
实施例1-1期，首次人体研究，在第0、1、6个月的3剂量方案(B5091001)
在美国进行的首次人体(FIH)B50910011期研究中评价了示例性的艰难梭菌疫苗候选物，其中招募了192个年龄50至85岁的健康成人。这是剂量递增、安慰剂对照、随机化、观察者设盲的研究，以评估在第0、1和6个月作为3剂量方案施用的艰难梭菌疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。疫苗候选物的三(3)个抗原剂量水平(50、100和200μg)或单独或与氢氧化铝组合进行评价。
安全性分析证实，两种制剂和所有3种剂量水平一般都是良好耐受的。局部反应占优势地为轻度或中度的，并且主要由注射部位疼痛组成。没有报告实际的严重或4级局部反应。在65至85岁的队列中，在200-μg剂量水平下，与含有氢氧化铝的剂量组相比，局部反应趋于在单独的类毒素中更频繁地发生。在所有3个剂量后，对于任何剂量组，局部反应的频率和严重性并不随着剂量水平或剂量数目的增加而增加。全身性事件占优势地为轻度到中度的，并且主要由头痛和疲劳组成。对于任何剂量组，不存在随着剂量水平或剂量数目的增加，全身性事件的频率增加的证据。
免疫原性分析证实，在剂量1后有限的抗体应答，但在剂量2后，存在针对毒素A和毒素B两者的抗体滴度中的显著增加，其一般在剂量2后7天最大，且在剂量2后1个月稳定。在剂量3施用后的七(7)天，明显的加强应答是显而易见，其在剂量3后1个月再次轻微地更显著。总体上，通过两种制剂均引发了强抗毒素中和应答，尽管在单独的类毒素制剂的接受者中存在更大应答的趋势。例如，在65至85岁的队列中在剂量3后1个月，类毒素A特异性中和性抗体滴度中距离基线(在剂量1前)的几何平均倍数上升(GMFR)范围为单独的类毒素剂量组中的131至254，以及含有氢氧化铝的剂量组中的42至80。关于毒素B特异性中和性抗体滴度的相应范围分别为2953至4922和136至484。
在恒河猴中生成的临床前数据支持艰难梭菌疫苗的3剂量方案的使用，所述3剂量方案在第0、2和4周连同或不连同氢氧化铝一起施用。此外，在兔毒理学研究中，在第1、8、22和36天给予的艰难梭菌疫苗的4剂量方案(直到400-μg的剂量水平)并未证实不利的毒理学发现，并且导致抗毒素A和抗毒素B中和性抗体滴度中的增加，确认了预计的通过动物对所施用的免疫原的免疫应答。
这些临床前和毒理学数据，以及在B5091001 1期研究中的3个剂量后观察到的令人鼓舞的免疫应答，支持了2期研究B5091003。
实施例2-2期研究，在第1、8和30天的3剂量方案(B5091003)
2期研究B5091003设计为评估在50至85岁的健康成人中，在第1、8和30天施用的3剂量方案中，单独的类毒素艰难梭菌疫苗的100-和200-μg抗原剂量水平(对于类毒素A和B总计)的安全性、耐受性和免疫原性。
在注射部位红斑出现后，停止研究B5091003中的疫苗接种。在对象中不存在伴随的严重的全身症状，没有报告表明发红影响了他们的日常活动，并且所有局部反应都完全消退。用单独的类毒素制剂观察到的局部反应原性可能是由于游离类毒素与引发的免疫应答相互作用。
实施例3-2期研究，在第1、8和30天(日方案)或第0、1和6个月(月方案)的3剂量方案(B5091009)
吸附到铝上已显示结合疫苗组成成分，并且从注射部位缓慢释放疫苗组成成分。另外，存在关于免疫应答的快速诱导以及不受CDI的保护的延长持续时间的潜在需要。相应地，研究B5091009在2种不同的给药方案中评估了选自FIH B5091001研究含有氢氧化铝的疫苗的2种抗原剂量水平(即100μg和200μg总类毒素)的安全性、耐受性和免疫原性：第1、8和30天或第0、1和6个月。
基于疫苗诱导毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平大于或等于关于每种艰难梭菌疫苗类毒素的指定阈值估计量的能力，评价了主要的免疫原性终点。这些指定的阈值衍生自2期功效研究，证实针对毒素A和B毒素的2种mRNA的被动施用与不受CDI的保护相关。除显示抗毒素mAb针对复发性CDI的功效之外，2期功效研究还提示，高于10μg/mL的阈值(“保护性”阈值水平)的抗毒素A和抗毒素B中和mAb水平与不受CDI复发的保护相关。
为了将来自2期功效研究的毒素A和毒素B“保护性”阈值转变成由疫苗候选物引发的50％中和滴度，利用了以下观察：(1)相同的细胞毒性测定用于测量毒素中和，以及(2)已公开了中和50％毒素的抑制mAb浓度(IC50[50％抑制浓度])(关于毒素A和毒素B mAb的IC50值分别为100ng/mL和15ng/mL)。因此，关于每种抗毒素抗体的“保护性”50％中和滴度计算为在10μg/mL的保护性阈值下的抗体浓度除以分别的mAb IC50。
为了使50％中和滴度测定对于临床使用合格，为测定提供进一步的可靠性，并且确保在临床开发中的一致长期性能，将参考标准和适当的对照加入测定中，从而允许中和滴度作为由参考标准定义的中和单位/mL读出。在当前研究的分析之前，当执行中和测定时，使用接种疫苗的人的血清样品来证实50％中和滴度与中和单位/mL之间的线性关系。基于这些相关性研究，计算了“保护性”中和阈值，并且用于分析这个研究中的临床数据。
对于免疫原性分析，关于抗毒素A和毒素B中和性抗体应答的“保护性”阈值分别为219和2586中和单位/mL。基于这些“保护性”阈值评价了关于研究B5091009的几个免疫原性终点。
如本文使用的，除非另有明确定义，否则“指定阈值”值定义为对于毒素A的219中和单位/mL、以及对于毒素B的2586中和单位/mL。
由于为接种疫苗的对象提供延长的不受CDI的保护是非常重要的，并且由于靶向用于疫苗接种的个体可能具有降低了产生且维持免疫应答的能力，因此，本研究中的对象在其第三次接种疫苗后进行监测，以评价抗体的持久性和对第四次疫苗接种的应答。因此，在两种给药方案中接受前3个剂量的艰难梭菌疫苗(100μg或200μg)的对象被要求进入延长阶段，并且以1∶1的比率重新随机化，以接受艰难梭菌疫苗或安慰剂。在其第三个剂量后大约一年，这些对象接受与他们先前接受的相同的抗原剂量水平(100μg或200μg)的第四个剂量的艰难梭菌疫苗或安慰剂。跟踪这些对象，以评价抗体的持久性。最初在任一给药方案中随机化至安慰剂的对象不继续进入延长阶段。
当所有对象都已完成就诊9(对于在第1、8和30天方案[日方案]的对象为第13个月，并且对于在第0、1和6月方案[月方案]的对象为第18个月)时，执行用于这个临床研究的分析，并且直到就诊9且包括就诊9的所有免疫原性和安全性数据均可获得。
分析方法。对于低于定量下限(LLOQ)的任何艰难梭菌毒素A或毒素B特异性中和性抗体水平，分配定义为0.5×LLOQ的LOD。关于毒素A和毒素B特异性中和测定的LLOQ分别为158.0中和单位/mL和249.5中和单位/mL。分析中没有估算其它缺失的测定数据。在估算低于LLOQ的抗体水平后，执行所有免疫原性分析。如果毒素A特异性中和性抗体水平对于毒素A为≥LLOQ，则该对象被视为对于毒素A呈血清阳性。如果毒素B特异性中和性抗体水平对于毒素B为≥LLOQ，则该对象被视为对于毒素B呈血清阳性。相反，如果抗体水平为＜LLOQ，则该对象被视为呈血清阴性。免疫原性数据根据随机化的疫苗剂量进行概括。对于最初的计划阶段，对于每种分配的给药方案(第1、8和30天以及第0、1和6个月)，分开概括所有免疫原性数据。在每个分配的给药方案中，存在3个疫苗组(100μg艰难梭菌、200μg艰难梭菌和安慰剂)。
实施例4：2期研究，在第1、8和30天(日方案)或第0、1和6个月(月方案)的3剂量方案(B5091009)-总体研究设计和计划
计划在美国大约15个场所招募大约854个65至85岁的健康成人。将对象分配至2种给药方案中的1种，然后以3∶1的比率平行地随机分配，以接受艰难梭菌疫苗(100μg或200μg)或安慰剂(盐水)(表3)。
表3.疫苗组以及每组和每个剂量方案的计划对象数目
a.这些组中的对象被要求进入延长阶段。
来源：统计分析计划(版本2.0)，表4。
这是2期、安慰剂对照、随机化、观察者设盲的研究，以评价在65至85岁的健康成人中，在第1、8和30天或第0、1和6个月作为3剂量方案施用的，含有氢氧化铝的艰难梭菌疫苗的两种抗原剂量水平(100μg和200μg总类毒素)的安全性、耐受性和免疫原性。对于这个研究选择100-μg抗原剂量水平(对于类毒素A和B总计)和200-μg抗原剂量水平(对于类毒素A和B总计)，因为来自FIH研究(B5091001)的免疫原性和安全性结果显示100和200μg的抗原剂量水平诱导类似的免疫应答。对于对照组，安慰剂由以0.5-mL剂量的注射用无菌生理盐水溶液(0.9％氯化钠)组成。选择氢氧化铝作为稀释剂是因为吸附到铝上已显示结合疫苗组成成分，并且从注射部位缓慢释放疫苗组成成分。
该研究是安慰剂对照的(尽管在最初计划阶段的随机化针对活性制剂进行加权)，以提供研究用疫苗制剂的安全性和耐受性的比较评价，以及控制针对艰难梭菌毒素A和B的抗体的天然背景滴度在一段时间内的任何潜在变化。
按日方案的对象在就诊1(第1天)、就诊2(第8天)和就诊4(第30天)接受1个剂量的艰难梭菌疫苗/安慰剂。按月方案的对象在就诊1(第1天)、就诊2(第30天)和就诊5(第6个月)接受1个剂量的艰难梭菌疫苗/安慰剂。
主要免疫原性终点-在第37天(对于按日方案的对象在剂量3后7天)和在第7个月(对于按月方案的对象在剂量3后1个月)，每个疫苗组中具有以下的对象比例：毒素A特定性中和性抗体水平(中和单位/mL)≥关于毒素A的指定阈值；毒素B特异性中和性抗体水平(中和单位/mL)≥关于毒素B的指定阈值；并且毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平(中和单位/mL)分别≥关于毒素A的指定阈值和关于毒素B的指定阈值。阈值定义为对于毒素A的219中和单位/mL以及对于毒素B的2586中和单位/mL。
次要免疫原性终点-在第37天(对于按日方案的对象在剂量3后7天)和在第7个月(对于按月方案的对象在剂量3后1个月)：毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平，表示为几何平均浓度(GMC)(中和单位/mL)。以下中的距离基线(在剂量1前)的GMFR：毒素A特异性；以及毒素B特异性中和性抗体水平(中和单位/mL)。以下中的每个疫苗组中距离基线≥4倍、≥8倍、≥16倍和≥32倍上升的对象比例：毒素A特异性；毒素B特异性；以及毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平(中和单位/mL)。对于按日方案的对象，在第1天(紧在剂量1前)、第8天(紧在剂量2前)、第15天(在剂量2后7天)、第30天(紧在剂量3前)、第2个月(在剂量3后1个月)、第4个月(在剂量3后3个月)、第7个月(在剂量3后6个月)和第13个月(在剂量3后12个月)时；或对于按月方案的对象，在第1天(紧在剂量1前)、第30天(紧在剂量2前)、第37天(在剂量2后7天)、第2个月(在剂量2后1个月)、第6个月(紧在剂量3前)、第187天(在剂量3后7天)、第12个月(在剂量3后6个月)和第18个月(在剂量3后12个月)时：每个疫苗组中具有以下的对象比例：毒素A特定性中和性抗体水平(中和单位/mL)≥关于毒素A的指定阈值；毒素B特异性中和性抗体水平(中和单位/mL)≥关于毒素B的指定阈值；并且毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平(中和单位/mL)分别≥关于毒素A的指定阈值和关于毒素B的指定阈值(这些参数还在基线时进行评价)。阈值定义为对于毒素A的219中和单位/mL以及对于毒素B的2586中和单位/mL。毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平表示为GMC(中和单位/mL)。以下中的距离基线的GMFR：毒素A特异性；以及毒素B特异性中和性抗体水平(中和单位/mL)。以下中的每个疫苗组中距离基线≥4倍、≥8倍、≥16倍和≥32倍上升的对象比例：毒素A特异性；毒素B特异性；以及毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平(中和单位/mL)。上述终点中的基线是在第1天时的第一次疫苗接种之前相关的最后一次测量。
免疫原性分析。当所有对象都已完成就诊9(对于按日方案的对象为第13个月，并且对于按月方案的对象为第18个月)时，执行此处的分析，并且直到就诊9且包括就诊9的所有免疫原性和安全性数据均可获得。在这个节段中，对于月方案和日方案分开呈现免疫原性结果。
主要免疫原性终点是在第37天(对于按日方案的对象在剂量3后7天)和在第7个月(对于按月方案的对象在剂量3后1个月)，每个疫苗组中具有毒素A、毒素B、以及毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值(对于毒素A特异性抗体的219中和单位/mL和对于毒素B特异性抗体的2586中和单位/mL)的对象比例。次要免疫原性终点如下：在所有采样时间点的毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平，表示为GMC。在所有采样时间点的毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平，表示为GMFR。在所有采样时间点，毒素A、毒素B、以及毒素A和毒素B特异中和性抗体水平距离基线达到限定倍数上升的每个疫苗组中的对象比例。
免疫原性结论。与日方案相比，月方案对于毒素A和毒素B在第187天和第7个月达到更高的免疫应答。与月方案相比，日方案对于毒素A在第37天和第2个月达到更高的较早期免疫应答，但应答对于毒素B在这些时间点是相似的。两种方案中200-μg剂量水平比100-μg剂量水平更具免疫原性。对于毒素A，基线血清阳性可能已在剂量1后不久增强了免疫应答的量级(特别是对于100-μg剂量水平)，但在两种方案中，与在基线时对于毒素A呈血清阴性的对象的应答相比，在剂量3后的免疫应答中存在很少的差异。对于毒素B，在两种方案中，基线血清阳性增强了免疫应答的量级。当从65到85岁按年龄五分位数分层时(尽管80至85岁的对象数目很小)，在月方案中的第7个月或在日方案中的第37天，达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平≥阈值的对象比例是相似的。
这是2期、安慰剂对照、随机化、观察者设盲的研究，以评价作为3剂量方案施用的，含有氢氧化铝的艰难梭菌疫苗的两种抗原剂量水平(100μg和200μg总类毒素)的安全性、耐受性和免疫原性：在第1、8和30天(日方案)或第0、1和6个月(月方案)。总之，艰难梭菌疫苗是高度免疫原性、良好耐受的，并且显示出可接受的安全性概况。
免疫原性讨论。这项研究的主要免疫原性目的是描述当作为3剂量方案(在第1、8和30天或第0、1和6个月)施用于65至85岁的健康成人时，艰难梭菌疫苗的2种抗原剂量水平(100μg和200μg总类毒素)的免疫原性，如对于日方案在第37天(在剂量3后7天)的艰难梭菌毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平测量的，以及如对于月方案在第7个月(在剂量3后1个月)的艰难梭菌毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平测量的。在研究过程自始至终，通过测量毒素A和毒素B特异性中和性抗体的滴度来评价免疫原性。结果表示为GMC，达到各种倍数上升的对象比例，以及对于每种毒素达到高于指定阈值水平的滴度的对象比例。
当与安慰剂相比时，在月方案和日方案两者中，100-μg和200-μg艰难梭菌组是免疫原性的。基于应答的量级和持久性，200-μg剂量水平比100-μg剂量水平更具免疫原性。
在月方案中，对于每种毒素达到高于指定阈值水平的滴度的对象比例对于在毒素A和毒素B在第187天(在剂量3后1周)和第7个月(在剂量3后1个月)最高。
在日方案中，对于毒素A达到高于指定阈值水平的滴度的对象比例对于毒素A在第37天和第2个月较高，但对于毒素B，比例在这些时间点是相似的。
在疫苗接种之前，两种给药方案中的大多数对象对于毒素A和毒素B呈血清阴性。在月方案中，69.8％的对象呈血清阴性，8.7％的对象仅对于毒素A呈血清阳性，19.0％的对象仅对于毒素B呈血清阳性，并且2.6％的对象对于毒素A和毒素B均呈血清阳性。在日方案中，75.4％的对象呈血清阴性，4.9％的对象仅对于毒素A呈血清阳性，16.4％的对象仅对于毒素B呈血清阳性，并且3.0％的对象对于毒素A和毒素B均呈血清阳性。
对于毒素A，基线血清阳性可能已在剂量1后不久增强了免疫应答的量级(特别是对于100-μg剂量水平)，但在两种方案中，与在基线时对于毒素A呈血清阴性的对象的应答相比，在剂量3后的免疫应答中存在很少的差异。
对于毒素B，在两种方案中，基线血清阳性增强了免疫应答的量级。对于在基线时对于毒素B呈血清阴性的对象，只有在第6个月施用的第三个剂量才导致大量比例的对象达到指定阈值。
当从65到85岁按年龄五分位数分层时(尽管80至85岁的对象数目很小)，在月方案中的第7个月或在日方案中的第37天，达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平≥阈值的对象比例是相似的。
在两种给药方案中，200-μg剂量水平在数目上比100-μg剂量水平更具免疫原性。
月方案对于100-μg和200-μg剂量水平均导致较高的剂量后3应答，特别是对于在基线时呈血清阴性的对象中的毒素B。
当从65到85岁按年龄五分位数分层时(尽管80至85岁的对象数目很小)，达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平≥阈值的对象比例是相似的。
实施例5：2期研究，在第1、8和30天(日方案)或第0、1和6个月(月方案)的3剂量方案(B5091009)-免疫原性评估，月方案
月方案。对于月方案评价达到毒素A、毒素B以及毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥通过对象的基线血清状况的指定阈值的对象比例。所有(100.0％)随机化对象都对于基线血清状况进行评估。大多数对于毒素A和毒素B均呈基线血清阴性。在基线血清阴性对象中，达到毒素A特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的比例，在100-μg艰难梭菌组中在第7个月达到98.0％，并且在200-μg艰难梭菌组中在第7个月达到95.0％。达到毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的比例，在100-μg艰难梭菌组中在第7个月达到69.4％，并且在200-μg艰难梭菌组中在第7个月达到85.0％。对于基线血清阳性对象，达到毒素A特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的比例，在100-μg艰难梭菌组中在第7个月达到100.0％，并且在200-μg艰难梭菌组中在第7个月达到100.0％。达到毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的比例，在100-μg艰难梭菌组中在第187天和第7个月达到100.0％，并且在200-μg艰难梭菌组中在第37天、第2个月和第7个月达到96.8％。
对于毒素A，在月方案中的第7个月，与安慰剂组中的1个对象(95％CI：0.0％；10.1％)相比，100-μg艰难梭菌组中的160个对象(95％CI：94.7％；99.6％)、以及200-μg艰难梭菌组中的151个对象(95％CI：91.1％；98.2％)达到指定阈值。
对于毒素B，在月方案中的第7个月，与安慰剂组中的4个(7.5％)对象(95％CI：2.1％；18.2％)相比，100-μg艰难梭菌组中的122个(74.8％)对象(95％CI：67.5％；81.3％)、以及200-μg艰难梭菌组中的138个(87.3％)对象(95％CI：81.1％；92.1％)达到指定阈值。
对于毒素A和毒素B，在月方案中的第7个月，与安慰剂组中无对象(95％CI：0.0％；6.7％)相比，100-μg艰难梭菌组中的121个(74.2％)对象(95％CI：66.8％；80.8％)、以及200-μg艰难梭菌组中的136个(86.1％)对象(95％CI：79.7％；91.1％)达到指定阈值。
在月方案中，100-μg艰难梭菌组中的1个对象、200-μg艰难梭菌组中的2个(1.3％)对象、以及安慰剂组中的1个对象在基线时具有毒素A特异性中和性抗体水平≥指定阈值。在剂量1和2之后但在剂量3之前，达到毒素A特定阈值的对象比例是有限的，在第37天具有在100-μg艰难梭菌组中的71个(43.6％)对象(95％CI：35.8％；51.5％)、以及在200-μg艰难梭菌组中的89个(56.7％)对象(95％CI：48.6％；64.6％)。在剂量3后，达到这个阈值的对象比例在第187天增加。对于100-μg艰难梭菌组，在第7个月，160个(98.2％)对象达到毒素A特定阈值，并且在第18个月，达到该阈值的对象比例降低至75个(48.7％)对象。对于200-μg艰难梭菌组，在第7个月，151个(95.6％)对象达到毒素A特定阈值，并且在第18个月，达到这个阈值的对象比例降低至81个(53.3％)对象。
在月方案中，100-μg艰难梭菌组中的4个(2.5％)对象、200-μg艰难梭菌组中的7个(4.4％)对象、以及安慰剂组中的2个(3.8％)对象在基线时具有毒素B特异性中和性抗体水平≥指定阈值。在剂量1和2之后但在剂量3之前，在100-μg艰难梭菌组中的47个(28.8％)对象(95％CI：22.0％；36.4％)在第37天和第2个月达到阈值，并且在200-μg艰难梭菌组中的60个(38.2％)对象(95％CI：30.6％；46.3％)在第37天达到阈值。在剂量3后，达到这个阈值的对象比例在第187天增加。对于100-μg艰难梭菌组，在第7个月，122个(74.8％)对象达到毒素B特定阈值，并且在第18个月，达到该阈值的对象比例降低至53个(34.4％)对象。对于200-μg艰难梭菌组，在第7个月，138个(87.3％)对象达到毒素B特定阈值，并且在第18个月，达到这个阈值的对象比例降低至72个(47.4％)对象。
总之，关于达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平≥特定阈值的对象比例的结果与毒素B的那些相似。
评价关于每个时间点的毒素A和毒素B特异性中和性抗体的几何平均浓度(GMC)。对于月方案，在基线时，毒素A特异性中和性抗体GMC对于在100-μg艰难梭菌组、200-μg艰难梭菌组和安慰剂组中的对象低于LLOQ(158.0中和单位/mL)。与基线相比，对于100-μg艰难梭菌组中的对象，在第30天观察到GMC中的增加(137中和单位/mL)，在第7个月达到最大(1245中和单位/mL)，并且在第18个月降低至214中和单位/mL。与基线相比，对于200-μg艰难梭菌组中的对象，在第30天观察到GMC中的增加(149中和单位/mL)，在第7个月达到最大(1380中和单位/mL)，并且在第18个月降低至257中和单位/mL。关于安慰剂组的毒素A特异性中和性抗体GMC在所有时间点都≤93中和单位/mL。
对于月方案，在基线时，毒素B特异性中和性抗体GMC对于在100-μg艰难梭菌组、200-μg艰难梭菌组和安慰剂组中的对象低于LLOQ(249.5中和单位/mL)。与基线相比，对于100-μg艰难梭菌组中的对象，在第30天观察到GMC中的增加(570中和单位/mL)，在第7个月达到最大(6255中和单位/mL)，并且在第18个月降低至1248中和单位/mL。与基线相比，对于200-μg艰难梭菌组中的对象，在第30天观察到GMC中的增加(909中和单位/mL)，在第7个月达到最大(9549中和单位/mL)，并且在第18个月降低至2178中和单位/mL。关于安慰剂组的毒素A特异性中和性抗体GMC在所有时间点都≤263中和单位/mL。
对于月方案，在所有基线后就诊中，与100-μg艰难梭菌组相比，毒素A特异性中和性抗体GMC在200-μg艰难梭菌组中更高。100-μg和200-μg艰难梭菌组均具有比安慰剂组更高的基线后GMC；然而，在100-μg和200-μg艰难梭菌组之间不存在明显的剂量应答。对于月方案，在所有基线后就诊中，与100-μg艰难梭菌组相比，毒素B特异性中和性抗体GMC在200-μg艰难梭菌组中更高。100-μg和200-μg艰难梭菌组均具有比安慰剂组更高的基线后GMC。在剂量3后(第12和18个月)，在100-μg和200-μg艰难梭菌组之间不存在明显的剂量应答。对于月方案概括了按对象的基线血清状况的毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMC。对于日方案概括了按对象的年龄和基线血清状况的毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMC。
对于月方案，在第30天、第37天、第2个月、第6个月、第187天、第7个月、第12个月和第18个月，计算了距离基线的毒素A和毒素B特异性中和性抗体的几何平均倍数上升(GMFR)。
在剂量2后，在第37天观察到毒素A特异性中和性抗体GMFR中的增加(100-μg艰难梭菌组，2.70；200-μg艰难梭菌组，3.78)。在剂量3后，加强应答在第187天显而易见(100-μg艰难梭菌组，5.85；200-μg艰难梭菌组，8.54)。这种加强应答在第7个月(在剂量3后1个月)达到最大，其中GMFR对于100-μg艰难梭菌组为14.58，并且对于200-μg艰难梭菌组为15.85。在第18个月，GMFR对于100-μg艰难梭菌组降低至2.51，并且对于200-μg艰难梭菌组降低至2.95。
在剂量2后，在第37天观察到毒素B特异性中和性抗体GMFR中的增加(100-μg艰难梭菌组，3.75；200-μg艰难梭菌组，5.59)。在剂量3后，显著的加强应答在第187天显而易见(100-μg艰难梭菌组，15.85；200-μg艰难梭菌组，24.44)。这种加强应答在第7个月(在剂量3后1个月)达到最大，其中GMFR对于100-μg艰难梭菌组为35.43，并且对于200-μg艰难梭菌组为49.98。在第18个月，GMFR对于100-μg艰难梭菌组降低至7.07，并且对于200-μg艰难梭菌组降低至11.21。
在第30天至第18个月之间，与100-μg艰难梭菌组相比，毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMFR对于200-μg艰难梭菌组更高。
对于月方案评价了对于每个时间点按对象的基线血清状况的毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMFR。在基线血清阴性对象中，在第37天观察到毒素A特异性中和性抗体GMFR中的增加(100-μg艰难梭菌组，2.74；200-μg艰难梭菌组，4.07)。在剂量3后，加强应答在第187天显而易见(100-μg艰难梭菌组，6.29；200-μg艰难梭菌组，9.37)。这种加强应答在第7个月达到最大，其中GMFR对于100-μg艰难梭菌组为15.88，并且对于200-μg艰难梭菌组为17.32。在第18个月，GMFR对于100-μg艰难梭菌组降低至2.59，并且对于200-μg艰难梭菌组降低至3.12。在剂量2后，毒素B特异性中和性抗体GMFR对于100-μg艰难梭菌组(第30天：2.45；第37天：2.67；第2个月：2.79)和200-μg艰难梭菌组(第30天：3.40；第37天：3.95；第2个月：3.94)趋于稳定。在剂量3后，显著的加强应答在第187天显而易见(100-μg艰难梭菌组，16.00；200-μg艰难梭菌组，26.67)。这种加强应答在第7个月达到最大，其中GMFR对于100-μg艰难梭菌组为39.29，并且对于200-μg艰难梭菌组为61.04。在第18个月，GMFR对于100-μg艰难梭菌组降低至6.95，并且对于200-μg艰难梭菌组降低至11.57。
在基线血清阳性对象中，在第37天观察到毒素A特异性中和性抗体GMFR中的增加(100-μg艰难梭菌组，2.37；200-μg艰难梭菌组，2.13)。在剂量3后，加强应答在第187天显而易见(100-μg艰难梭菌组，3.03；200-μg艰难梭菌组，4.18)。这种加强应答在第7个月达到最大，其中GMFR对于100-μg艰难梭菌组为6.65，并且对于200-μg艰难梭菌组为7.96。在第18个月，GMFR对于100-μg艰难梭菌组降低至1.87，并且对于200-μg艰难梭菌组降低至1.91。在剂量2后，在第37天观察到毒素B特异性中和性抗体GMFR中的增加(100-μg艰难梭菌组，17.97；200-μg艰难梭菌组，23.01)。在剂量3后，显著的加强应答在第7个月显而易见(100-μg艰难梭菌组，21.96；200-μg艰难梭菌组，21.99)。这种加强应答在第7个月达到最大。在第18个月，GMFR对于100-μg艰难梭菌组降低至7.68，并且对于200-μg艰难梭菌组降低至9.91。
在第30天至第18个月之间，与100-μg艰难梭菌组相比，毒素A特异性中和性抗体GMFR对于200-μg艰难梭菌组更高，除了对于基线血清阳性对象在第30天和第37天之外。在第187天后，与基线血清阳性对象相比，毒素A特异性中和性抗体GMFR对于两个剂量组中的基线血清阴性对象均更高。在第30天至第18个月之间，与100-μg艰难梭菌组相比，关于基线血清阴性和血清阳性对象的毒素B特异性中和性抗体GMFR对于200-μg艰难梭菌组更高。在第30天至第6个月之间，与基线血清阴性对象相比，毒素B特异性中和性抗体GMFR对于基线血清阳性对象更高，但是从187天到第18个月，与基线血清阳性对象相比，毒素B特异性中和性抗体GMFR对于基线血清阴性对象更高。
概括了在第37天和其它采血时间点，毒素A、毒素B以及毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平距离基线达到限定倍数上升的对象比例。
总之，与100-μg艰难梭菌组相比，对于200-μg艰难梭菌组观察到距离基线毒素A特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的更大的对象比例。对于100-μg艰难梭菌组，从第37天开始观察到达到≥4倍上升的对象比例中的增加，其中125个(76.7％)对象在第7个月达到≥8倍上升。对于100-μg艰难梭菌组，在第7个月，77个(47.2％)对象达到毒素A特异性中和性抗体水平中的≥16倍上升，并且33个(20.2％)对象达到≥32倍上升。对于200-μg艰难梭菌组，从第37天开始观察到达到≥4倍上升的对象比例中的增加，具有在第187天达到≥8倍上升的对象比例中的显著增加。对于200-μg艰难梭菌组，在第7个月，89个(56.3％)对象达到毒素A特异性中和性抗体水平中的≥16倍上升，并且34个(21.5％)对象达到≥32倍上升。
总之，与100-μg艰难梭菌组相比，对于200-μg艰难梭菌组观察到距离基线毒素B特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的更大的对象比例。对于100-μg艰难梭菌组，从第37天开始观察到达到≥4倍上升的对象比例中的增加，其中138个(84.7％)对象在第7个月达到≥8倍上升。对于100-μg艰难梭菌组，在第187天，85个(52.5％)对象达到毒素B特异性中和性抗体水平中的≥16倍上升，并且52个(32.1％)对象达到≥32倍上升。对于200-μg艰难梭菌组，从第37天开始观察到达到≥4倍上升的对象比例中的增加，具有在第187天达到≥8倍上升的对象比例中的显著增加。对于200-μg艰难梭菌组，在第7个月，200-μg艰难梭菌组中的105个(66.5％)对象达到毒素B特异性中和性抗体水平中的≥32倍上升。
总之，对于毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平，关于距离基线达到限定倍数上升的对象比例的结果与毒素A的那些相似。
对于月方案评价了反向累积分布曲线(RCDC)，其展示关于通过疫苗组在第1天、第30天、第37天、第2个月、第6个月、第187天、第7个月、第12个月和第18个月测量的毒素A特异性中和性抗体水平的数据。对于月方案评价了RCDC，其展示关于通过疫苗组在第1天、第30天、第37天、第2个月、第6个月、第187天、第7个月、第12个月和第18个月测量的毒素B特异性中和性抗体水平的数据。总之，观察到的曲线对于接种疫苗的组向右移动，指示用类毒素疫苗的免疫增加了滴度水平超过用安慰剂可见的那种。这与GMC中显示的模式以及达到≥指定阈值的对象比例是一致的。
实施例6：2期研究，在第1、8和30天(日方案)或第0、1和6个月(月方案)的3剂量方案(B5091009)-免疫原性评估，日方案
日方案。对于日方案评价达到毒素A、毒素B以及毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥通过对象的基线血清状况的指定阈值的对象比例。大多数对于毒素A和毒素B均呈基线血清阴性。在基线血清阴性对象中，达到毒素A特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的比例，在100-μg艰难梭菌组中在第37天达到67.7％，并且在200-μg艰难梭菌组中在第37天和第2个月达到85.2％。达到毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的比例，在100-μg艰难梭菌组中在第15天和第37天达到14.0％，并且在200-μg艰难梭菌组中在第37天达到25.2％。对于基线血清阳性对象，达到毒素A特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的比例，在100-μg艰难梭菌组中在第37天达到80.0％，并且在200-μg艰难梭菌组中在第37天和第2个月达到86.7％。达到毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的比例，在100-μg艰难梭菌组中在第30天达到97.1％，并且在200-μg艰难梭菌组中在第37天和第2个月达到93.9％。
对于毒素A，在日方案中的第37天，与安慰剂组中的7个(12.5％)个对象(95％CI：5.2％；24.1％)相比，100-μg艰难梭菌组中的117个(68.4％)个对象(95％CI：60.9％；75.3％)、以及200-μg艰难梭菌组中的141个(85.5％)对象(95％CI：79.1％；90.5％)达到指定阈值。
对于毒素B，在日方案中的第37天，与安慰剂组中的1个对象(95％CI：0.0％；9.6％)相比，100-μg艰难梭菌组中的51个(29.8％)对象(95％CI：23.1％；37.3％)、以及200-μg艰难梭菌组中的64个(38.8％)对象(95％CI：31.3％；46.7％)达到指定阈值。
对于毒素A和毒素B，在日方案中的第37天，与安慰剂组中无对象(95％CI：0.0％；6.4％)相比，100-μg艰难梭菌组中的45个(26.3％)对象(95％CI：19.9％；33.6％、以及200-μg艰难梭菌组中的64个(38.8％)对象(95％CI：31.3％；46.7％)达到指定阈值。
在日方案中，100-μg艰难梭菌组中的2个(1.2％)对象、以及200-μg艰难梭菌组中的1个对象在基线时具有毒素A特异性中和性抗体水平≥指定阈值。在剂量1和2之后但在剂量3之前，达到毒素A特定阈值的对象比例是有限的，在第15天具有在100-μg艰难梭菌组中的29个(17.0％)对象(95％CI：11.7％；23.4％)、以及在200-μg艰难梭菌组中的41个(25.0％)对象(95％CI：18.6％；32.3％)。在剂量3后，达到这个阈值的对象比例在第37天增加。对于100-μg艰难梭菌组，在第37天，117个(68.4％)对象达到毒素A特定阈值，并且在第13个月，达到该阈值的对象比例降低至16个(10.1％)对象。对于200-μg艰难梭菌组，在第37天和第2个月，141个(85.5％)对象达到毒素A特定阈值，并且在第13个月，达到这个阈值的对象比例降低至40个(25.8％)对象。
在日方案中，100-μg艰难梭菌组中的8个(4.7％)个对象、200-μg艰难梭菌组中的6个(3.7％)对象、以及安慰剂组中的3个(5.4％)对象在基线时具有毒素B特异性中和性抗体水平≥指定阈值。在剂量1和剂量2之后但在剂量3之前，在100-μg艰难梭菌组中的52个(30.4％)对象(95％CI：23.6％；37.9％)和在200-μg艰难梭菌组中的61个(37.2％)对象(95％CI：29.8％；45.1％)在第15天达到阈值。在剂量3后，达到这个阈值的对象比例保持稳定，直到第37天。对于100-μg艰难梭菌组，在第30天和第37天，51个(29.8％)对象达到毒素B特定阈值，并且在第13个月，达到该阈值的对象比例降低至31个(19.6％)对象。对于200-μg艰难梭菌组，在第37天，64个(38.8％)对象达到毒素B特定阈值，并且在第13个月，达到这个阈值的对象比例降低至48个(31.0％)对象。
总之，关于达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平≥特定阈值的对象比例的结果与毒素B的那些相似。
评价关于每个时间点的毒素A和毒素B特异性中和性抗体的GMC。对于日方案，在基线时，毒素A特异性中和性抗体GMC对于在100-μg艰难梭菌组、200-μg艰难梭菌组和安慰剂组中的对象低于LLOQ(158.0中和单位/mL)。与基线相比，对于100-μg艰难梭菌组中的对象，在第15天观察到GMC中的增加(143中和单位/mL)，在第37天达到最大(368中和单位/mL)，并且在第13个月降低至105中和单位/mL。与基线相比，对于200-μg艰难梭菌组中的对象，在第15天观察到GMC中的增加(192中和单位/mL)，在第37天达到最大(556中和单位/mL)，并且在第13个月降低至138中和单位/mL。关于安慰剂组的毒素A特异性中和性抗体GMC在所有时间点都≤102中和单位/mL。
对于日方案，在基线时，毒素B特异性中和性抗体GMC对于在100-μg艰难梭菌组、200-μg艰难梭菌组和安慰剂组中的对象低于LLOQ(249.5中和单位/mL)。与基线相比，对于100-μg艰难梭菌组中的对象，在第8天观察到GMC中的增加(273中和单位/mL)，在第15天达到最大(807中和单位/mL)，并且在第13个月降低至447中和单位/mL。与基线相比，对于200-μg艰难梭菌组中的对象，在第8天观察到GMC中的增加(290中和单位/mL)，在第37天达到最大(1219中和单位/mL)，并且在第13个月降低至828中和单位/mL。关于安慰剂组的毒素A特异性中和性抗体GMC在所有时间点都≤211中和单位/mL。
对于日方案，在所有基线后就诊中，与100-μg艰难梭菌组相比，毒素A特异性中和性抗体GMC在200-μg艰难梭菌组中更高。100-μg和200-μg艰难梭菌组均具有比安慰剂组更高的基线后GMC，并且在100-μg和200-μg艰难梭菌组之间不存在明显的剂量应答。
对于日方案，在所有基线后就诊中，与100-μg艰难梭菌组相比，毒素B特异性中和性抗体GMC在200-μg艰难梭菌组中更高。100-μg和200-μg艰难梭菌组均具有比安慰剂组更高的基线后GMC；然而，在100-μg和200-μg艰难梭菌组之间不存在明显的剂量应答。
对于日方案概括了按对象的基线血清状况的毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMC。对于日方案概括了按对象的年龄和基线血清状况的毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMC。
对于日方案，在第8天、第15天、第30天、第37天、第2个月、第4个月、第7个月和第13个月，计算了距离基线的毒素A和毒素B特异性中和性抗体的几何平均倍数上升(GMFR)。在剂量2后，在第15天观察到毒素A特异性中和性抗体GMFR中的增加(100-μg艰难梭菌组，1.73；200-μg艰难梭菌组，2.27)。在剂量3后，加强应答在第37天显而易见(100-μg艰难梭菌组，4.45；200-μg艰难梭菌组，6.56)。这种加强应答在第37天(在剂量3后7天)达到最大，并且在第2个月，对于100-μg艰难梭菌组为3.56，且对于200-μg艰难梭菌组为5.71。在第13个月，GMFR对于100-μg艰难梭菌组降低至1.26，并且对于200-μg艰难梭菌组降低至1.64。
在剂量2后，在第15天观察到毒素B特异性中和性抗体GMFR中的显著增加(100-μg艰难梭菌组，4.31；200-μg艰难梭菌组，5.86)。在剂量3后，加强应答对于200-μg艰难梭菌组在第37天显而易见(6.57的GMFR)，但GMFR对于100-μg艰难梭菌组趋于稳定(第30天：3.76；第37天：3.89；第2个月：3.61)。这种加强应答对于200-μg艰难梭菌组在第37天(在剂量3后7天)达到最大。在第13个月，GMFR对于100-μg艰难梭菌组降低至2.40，并且对于200-μg艰难梭菌组降低至4.44。
在第8天至第13个月之间，与100-μg艰难梭菌组相比，毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMFR对于200-μg艰难梭菌组更高。
对于日方案评价了对于每个时间点按对象的基线血清状况的毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMFR。在基线血清阴性对象中，在第30天观察到毒素A特异性中和性抗体GMFR中的增加(100-μg艰难梭菌组，2.01；200-μg艰难梭菌组，2.95)。在剂量3后，加强应答在第37天显而易见(100-μg艰难梭菌组，4.48；200-μg艰难梭菌组，6.95)。这种加强应答在第37天达到最大。在第13个月，GMFR对于100-μg艰难梭菌组降低至1.28，并且对于200-μg艰难梭菌组降低至1.75。在剂量2后，在第15天观察到毒素B特异性中和性抗体GMFR中的增加(100-μg艰难梭菌组，2.57；200-μg艰难梭菌组，3.81)。在剂量3后，GMFR对于100-μg艰难梭菌组(第30天：2.37；第37天：2.56；第2个月：2.42)和200-μg艰难梭菌组(第30天：3.68；第37天：4.55；第2个月：4.22)趋于稳定。在第13个月，GMFR对于100-μg艰难梭菌组降低至2.01，并且对于200-μg艰难梭菌组降低至4.00。
在基线血清阳性对象中，在第30天观察到毒素A特异性中和性抗体GMFR中的增加(100-μg艰难梭菌组，2.47；200-μg艰难梭菌组，1.20)。在剂量3后，加强应答在第37天显而易见(100-μg艰难梭菌组，3.97；200-μg艰难梭菌组，3.68)。这种加强应答在第37天达到最大。在第13个月，GMFR对于100-μg艰难梭菌组降低至0.99，并且对于200-μg艰难梭菌组降低至0.81。在剂量2后，在第15天观察到毒素B特异性中和性抗体GMFR中的显著增加(100-μg艰难梭菌组，32.18；200-μg艰难梭菌组，32.14)。加强应答在剂量3后并不显而易见，因为GMFR对于100-μg艰难梭菌组(第30天：22.86；第37天：19.74；第2个月：17.23)和200-μg艰难梭菌组(第30天：27.50；第37天：28.23；第2个月：25.54)趋于稳定。在第13个月，GMFR对于100-μg艰难梭菌组降低至4.72，并且对于200-μg艰难梭菌组降低至6.70。
在第8天至第13个月之间，与100-μg艰难梭菌组相比，关于基线血清阴性对象的毒素A特异性中和性抗体GMFR对于200-μg艰难梭菌组更高。在第8天至第13个月之间，与100-μg艰难梭菌组相比，关于基线血清阳性对象的毒素A特异性中和性抗体GMFR对于200-μg艰难梭菌组更低，除了在第4个月之外。与基线血清阳性对象相比，毒素A特异性中和性抗体GMFR对于两个剂量组中的基线血清阴性对象均更高。在第8天至第13个月之间，与100-μg艰难梭菌组相比，关于基线血清阴性和血清阳性对象的毒素B特异性中和性抗体GMFR对于200-μg艰难梭菌组更高，除了对于基线血清阳性对象在第15天之外。在第8天至第13个月之间，与基线血清阴性对象相比，毒素B特异性中和性抗体GMFR对于基线血清阳性对象更高。
概括了在第37天和其它采血时间点，毒素A、毒素B以及毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平距离基线达到限定倍数上升的对象比例。
总之，与100-μg艰难梭菌组相比，对于200-μg艰难梭菌组观察到距离基线毒素A特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的更大的对象比例。对于100-μg艰难梭菌组，从第15天开始观察到达到≥4倍上升的对象比例中的增加，其中43个(25.1％)对象在第37天达到≥8倍上升。对于100-μg艰难梭菌组，在第37天，15个(8.8％)对象达到毒素A特异性中和性抗体水平中的≥16倍上升，并且6个(3.5％)对象达到≥32倍上升。对于200-μg艰难梭菌组，从第15天开始观察到达到≥4倍上升的对象比例中的增加，具有在第37天达到≥8倍上升的对象比例中的显著增加(67个[40.0％])。对于200-μg艰难梭菌组，在第15天，23个(14.1％)对象达到毒素A特异性中和性抗体水平中的≥16倍上升，并且15个(9.2％)对象达到≥32倍上升。
总之，直到第4个月对于100-μg和200-μg艰难梭菌组，观察到距离基线毒素B特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的相似的对象比例。在第7个月和13个月时，与100-μg艰难梭菌组相比，对于200-μg艰难梭菌组观察到距离基线毒素A特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的更大的对象比例。对于100-μg艰难梭菌组，从第15天开始观察到达到≥4倍上升的对象比例中的增加，其中57个(33.3％)对象在第15天和第30天达到≥8倍上升。对于100-μg艰难梭菌组，在第15天，45个(26.3％)对象达到毒素A特异性中和性抗体水平中的≥16倍上升，并且35个(20.5％)对象达到≥32倍上升。对于200-μg艰难梭菌组，从第15天开始观察到达到≥4倍上升的对象比例中的增加，具有在第37天达到≥8倍上升的对象比例中的显著增加(66个[40.2％])。对于200-μg艰难梭菌组，在第30天和第37天，61个(37.4％)对象达到毒素A特异性中和性抗体水平中的≥16倍上升，并且45个(27.4％)对象达到≥32倍上升。
总之，对于毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平，关于距离基线达到限定倍数上升的对象比例的结果与毒素A的那些相似。
对于日方案评价了反向累积分布曲线(RCDC)，其展示关于通过疫苗组在第1天、第8天、第15天、第30天、第37天、第2个月、第4个月、第7个月和第13个月测量的毒素A特异性中和性抗体水平的数据。对于日方案评价了RCDC，其展示关于通过疫苗组在第1天、第8天、第15天、第30天、第37天、第2个月、第4个月、第7个月和第13个月测量的毒素B特异性中和性抗体水平的数据。总之，观察到的曲线对于接种疫苗的组向右移动，指示用类毒素疫苗的免疫增加了滴度水平超过用安慰剂可见的那种。这与GMC中显示的模式以及达到≥指定阈值的对象比例是一致的。
实施例7：2期研究，在第1、8和30天(日方案)或第0、1和6个月(月方案)的3剂量方案(B5091009)-免疫原性评估，按年龄组的结果
还评估了按年龄组(65至69岁、70至74岁、75至79岁和80至85岁)的免疫应答。
在月方案中，在第7个月，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的对象比例为65至69岁的70个对象中的80.0％、70至74岁的48个对象中的68.8％、75至79岁的34个对象中的73.5％、以及80至85岁的11个对象中的63.6％。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的64个对象中的90.6％、70至74岁的56个对象中的83.9％、75至79岁的29个对象中的89.7％、以及80至85岁的9个对象中的55.6％。
在月方案中，在第7个月，对于100-μg艰难梭菌组中的对象，毒素A特异性中和性抗体GMC对于65至69岁的对象为1304中和单位/mL，对于70至74岁的对象为1182中和单位/mL，对于75至79岁的对象为1254中和单位/mL，并且对于80至85岁的对象为1132中和单位/mL。关于200-μg艰难梭菌组中的对象的相应GMC对于65至69岁的对象为1690中和单位/mL，对于70至74岁的对象为1073中和单位/mL，对于75至79岁的对象为1627中和单位/mL，并且对于80至85岁的对象为925中和单位/mL。
在月方案中，在第7个月，对于100-μg艰难梭菌组中的对象，毒素B特异性中和性抗体GMC对于65至69岁的对象为7608中和单位/mL，对于70至74岁的对象为5688中和单位/mL，对于75至79岁的对象为5446中和单位/mL，并且对于80至85岁的对象为4178中和单位/mL。关于200-μg艰难梭菌组中的对象的相应GMC对于65至69岁的对象为11835中和单位/mL，对于70至74岁的对象为8750中和单位/mL，对于75至79岁的对象为10533中和单位/mL，并且对于80至85岁的对象为2608中和单位/mL。
在月方案中，在第7个月，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的基线血清阴性对象的比例为65至69岁的46个对象中的73.9％、70至74岁的39个对象中的64.1％、75至79岁的28个对象中的67.9％、以及80至85岁的8个对象中的62.5％。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的46个对象中的91.3％、70至74岁的37个对象中的81.1％、75至79岁的22个对象中的86.4％、以及80至85岁的9个对象中的55.6％。
在月方案中，在第7个月，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的基线血清阳性对象的比例为65至69岁的2个对象中的100.0％、70至74岁的1个对象中的100.0％、对于75至79岁的对象无法估计、以及对于80至85岁的对象无法估计。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的3个对象中的66.7％、70至74岁的2个对象中的100.0％、对于75至79岁的对象无法估计、以及对于80至85岁的对象无法估计。
在月方案中，在第7个月，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的基线血清阴性对象的比例为65至69岁的46个对象中的73.9％、70至74岁的39个对象中的64.1％、75至79岁的28个对象中的67.9％、以及80至85岁的8个对象中的62.5％。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的46个对象中的91.3％、70至74岁的37个对象中的81.1％、75至79岁的22个对象中的86.4％、以及80至85岁的9个对象中的55.6％。
在月方案中，在第7个月，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的基线血清阳性对象的比例为65至69岁的2个对象中的100.0％、70至74岁的1个对象中的100.0％、对于75至79岁的对象无法估计、以及对于80至85岁的对象无法估计。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的3个对象中的66.7％、70至74岁的2个对象中的100.0％、对于75至79岁的对象无法估计、以及对于80至85岁的对象无法估计。
在月方案中，在第7个月，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值中距离基线的≥4倍上升的基线血清阴性对象的比例为65至69岁的46个对象中的84.8％、70至74岁的39个对象中的87.2％、75至79岁的28个对象中的78.6％、以及80至85岁的8个对象中的100.0％。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的46个对象中的91.3％、70至74岁的37个对象中的81.1％、75至79岁的22个对象中的100.0％、以及80至85岁的9个对象中的77.8％。
在月方案中，在第7个月，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值中距离基线的≥4倍上升的基线血清阳性对象的比例为65至69岁的2个对象中的100.0％、70至74岁的1个对象中的100％、对于75至79岁的对象无法估计、以及对于80至85岁的对象无法估计。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的3个对象中的66.7％、70至74岁的2个对象中的50.0％、对于75至79岁的对象无法估计、以及对于80至85岁的对象无法估计。
在日方案中，在第37天，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的对象比例为65至69岁的74个对象中的23.0％、70至74岁的53个对象中的30.2％、75至79岁的28个对象中的28.6％、以及80至85岁的16个对象中的25.0％。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的71个对象中的38.0％、70至74岁的50个对象中的30.0％、75至79岁的29个对象中的48.3％、以及80至85岁的15个对象中的53.3％。
在日方案中，在第37天，对于100-μg艰难梭菌组中的对象，毒素A特异性中和性抗体GMC对于65至69岁的对象为422中和单位/mL，对于70至74岁的对象为389中和单位/mL，对于75至79岁的对象为282中和单位/mL，并且对于80至85岁的对象为262中和单位/mL。关于200-μg艰难梭菌组中的对象的相应GMC对于65至69岁的对象为569中和单位/mL，对于70至74岁的对象为558中和单位/mL，对于75至79岁的对象为496中和单位/mL，并且对于80至85岁的对象为616中和单位/mL。
在日方案中，在第37天，对于100-μg艰难梭菌组中的对象，毒素B特异性中和性抗体GMC对于65至69岁的对象为653中和单位/mL，对于70至74岁的对象为809中和单位/mL，对于75至79岁的对象为566中和单位/mL，并且对于80至85岁的对象为1309中和单位/mL。关于200-μg艰难梭菌组中的对象的相应GMC对于65至69岁的对象为1192中和单位/mL，对于70至74岁的对象为805中和单位/mL，对于75至79岁的对象为2404中和单位/mL，并且对于80至85岁的对象为1449中和单位/mL。
在日方案中，在第37天，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的基线血清阴性对象的比例为65至69岁的59个对象中的11.9％、70至74岁的38个对象中的13.2％、75至79岁的22个对象中的9.1％、以及80至85岁的11个对象中的9.1％。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的49个对象中的22.4％、70至74岁的38个对象中的21.1％、75至79岁的22个对象中的36.4％、以及80至85岁的13个对象中的46.2％。
在日方案中，在第37天，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的基线血清阳性对象的比例为65至69岁的2个对象中的100.0％、70至74岁的1个对象中的50.0％、对于75至79岁的对象无法估计、以及对于80至85岁的对象无法估计。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的3个对象中的100.0％、70至74岁的3个对象中的100.0％、对于75至79岁的对象无法估计、以及对于80至85岁的对象无法估计。
在日方案中，在第37天，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的基线血清阴性对象的比例为65至69岁的59个对象中的11.9％、70至74岁的38个对象中的13.2％、75至79岁的22个对象中的9.1％、以及80至85岁的11个对象中的9.1％。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的49个对象中的22.4％、70至74岁的38个对象中的21.1％、75至79岁的22个对象中的36.4％、以及80至85岁的13个对象中的46.2％。
在日方案中，在第37天，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值的基线血清阳性对象的比例为65至69岁的2个对象中的100.0％、70至74岁的1个对象中的50.0％、对于75至79岁的对象无法估计、以及对于80至85岁的对象无法估计。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的3个对象中的100.0％、70至74岁的3个对象中的100.0％、对于75至79岁的对象无法估计、以及对于80至85岁的对象无法估计。
在日方案中，在第37天，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值中距离基线的≥4倍上升的基线血清阴性对象的比例为65至69岁的59个对象中的15.3％、70至74岁的38个对象中的18.4％、75至79岁的22个对象中的18.2％、以及80至85岁的11个对象中的18.2％。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的49个对象中的24.5％、70至74岁的38个对象中的26.3％、75至79岁的22个对象中的36.4％、以及80至85岁的13个对象中的46.2％。
在日方案中，在第37天，在100-μg艰难梭菌组中达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体滴度≥指定阈值中距离基线的≥4倍上升的基线血清阳性对象的比例为65至69岁的2个对象中的100.0％、70至74岁的2个对象中的50.0％、对于75至79岁的对象无法估计、以及对于80至85岁的对象无法估计。在200-μg艰难梭菌组中的相应的对象比例为65至69岁的3个对象中的33.3％、70至74岁的3个对象中的0.0％、对于75至79岁的对象无法估计、以及对于80至85岁的对象无法估计。
实施例8：2期、安慰剂对照、随机化、观察者设盲的研究，以评估剂量3后直到12个月，65至85岁的健康成人中的艰难梭菌疫苗的两个3剂量方案的安全性、耐受性和免疫原性。
艰难梭菌(Clostridium difficile)(艰难梭菌(C.difficile))是抗生素相关的医院腹泻的常见原因。迄今为止，尚无疫苗可用于预防艰难梭菌感染(CDI)。在这项2期研究中，我们在美国的855个65至85岁的健康的免疫功能正常的成人中探索了基于类毒素的艰难梭菌疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。
方法。这个试验的最初计划阶段从2015年7月16日至2017年3月7日进行。招募对象并且随机化以接受两种抗原剂量水平(100-μg或200-μg)之一或安慰剂和两种3剂量方案之一：第1、8和30天(日方案)或第0、1和6个月(月方案)。对在九次研究就诊各自获得的血液样品进行免疫原性测试。在每次疫苗接种后收集局部和全身反应原性。在剂量3后直到1个月发生了非严重不良事件(AE)报告。在剂量3后直到6个月发生了严重不良事件(SAE)报告。855个健康的、免疫功能正常的对象参与研究，并且以3∶3∶1的比率平行地随机分配，以接受以2种给药方案之一的3个剂量的艰难梭菌疫苗(100μg或200μg总类毒素)或安慰剂(盐水)：第1、8和30天(日方案)或第0、1和6个月(月方案)。免疫原性测试对在以下9次研究就诊各自获得的血清样品进行：对于日方案在第1、8、15、30、37天，第2、4、7和13个月，以及对于月方案在第1、30、37、187天，第2、6、7、12和18个月。在每次预定的研究就诊时，测量毒素A和毒素B特异性中和免疫球蛋白G(IgG)的浓度(中和单位/mL)。计算几何平均浓度(GMC)，并且对于毒素A和毒素B建立中和阈值(图2A、图2B、图2C和图2D)。对于每次疫苗接种后的14天(对于日方案在剂量1后7天)，通过电子日记收集局部反应和全身性事件。不良事件报告从签署知情同意书直到剂量3后1个月发生。严重不良事件(SAE)报告在剂量3后直到6个月发生。在每个疫苗接种方案内，按剂量(100μg和200μg)和安慰剂描述性地分析安全性、反应原性和免疫原性。
结果。总体免疫原性在3个剂量后在200μg月方案中更高。局部反应原性证实在日方案中在剂量#2后的增加。与日方案相比，由于另外的5个月随访，月方案中的不良事件率在数目上更高。
对于月方案和日方案，分别在剂量3之后的第7个月和第37天，观察到对疫苗接种的峰值抗体免疫应答(图2A、图2B、图2C和图2D)。
在剂量3后12个月，不考虑剂量组，与日方案相比，月方案证实高于预定中和阈值的更高的对象比例(图1A、图1B、图1C和图1D)。
在剂量3后12个月，与关于毒素B(高4倍)和毒素A(高2倍)的日方案GMC相比，关于月方案的几何平均浓度(GMC)更高(图2A、图2B、图2C和图2D)。
在剂量3后12个月，毒素AGMC在200μg月方案中保持高于中和阈值(图2A和图2B)。
毒素B GMC在200μg月方案中高于中和阈值，直到剂量3后大约9个月(图2A和图2B)。
疼痛是最常见的报告的局部反应；在两种方案中，在每个剂量后，任何发红和肿胀的发病率＜10％。
在研究期间未报告4级局部或全身反应原性。
在月方案中，在剂量组和安慰剂之间的聚集不良事件中未观察到明显的数目差异(图3A和图3B)。
在任何方案或剂量组中，在试验期间都没有报告与艰难梭菌疫苗接种有关的严重不良事件(SAE)(图3A和图3B)。
结论。在3个剂量的艰难梭菌疫苗接种后，月方案比日方案更具免疫原性。在第8天给予的剂量2后，观察到局部反应原性增加，特别是在200-μg剂量水平下。在主动疫苗接种组中，相关不良事件、严重不良事件和由于不良事件的撤出在数目上更大，但不存在可辨别的模式以提示安全性关注。总体不良事件频率和类型是一般群体中的这个年龄队列的特征。艰难梭菌疫苗接种是免疫原性和良好耐受的。艰难梭菌疫苗候选物是高度免疫原性、良好耐受的，并且证实可接受的安全性概况。200μg月方案证实总体更大的免疫原性，并且选择用于3期开发。
200μg剂量水平始终比100μg剂量水平更具免疫原性。
日方案对于毒素A而不是毒素B在第37天/第2个月驱动优良的更早的免疫应答。参见例如，图4A、图4B、图5A和图5B。对于毒素A，基线血清阳性促成早期免疫应答的量级(特别是对于100μg剂量水平)，但在两种方案中，在剂量3后存在很少的差异。对于毒素B基线血清阴性对象(总共～80％)，只有在第6个月给予的第3个剂量才导致显著比例达到阈值。参见例如，图6A、图6B、图7A和图7B。对于所有全身性事件，在安慰剂和艰难梭菌疫苗之间、或在100-μg和200-μg剂量水平之间没有观察到显著差异。在主动疫苗接种组中，相关不良事件、严重不良事件和由于不良事件的撤出在数目上更大，但不存在可辨别的模式以提示安全性关注。选择在0、1和6个月施用的200μg剂量水平用于3期。
关于在剂量3后第12个月的结果，在剂量#3后12个月，关于针对毒素A的中和，两个剂量组中大约50％的对象高于预先设定的阈值。在剂量#3之后12个月，月方案，200-μg剂量组几何平均浓度(GMC)高于针对毒素A的中和阈值。在剂量#3后12个月，关于针对毒素B的中和，47％的对象在月方案的200μg剂量组中高于预先设定的阈值。关于针对毒素B的中和，在这两种方案中，血清阳性的GMC均高于中和阈值。关于月方案，毒素B GMC在剂量#3后6个月高于中和阈值(2993中和单位/mL)，并且在剂量#3后12个月保持相似(2178中和单位/mL)。参见例如，图1A-D、图2A-D、图8A、图8B、以及图9A和图9B。
实施例9：1期、安慰剂对照、随机化、观察者设盲的研究，以评估在65至85岁的健康日本成人中施用的艰难梭菌疫苗的两种3剂量方案的安全性、耐受性和免疫原性(B5091010)
这是1期、安慰剂对照、随机化、观察者设盲的研究，以评价在65至85岁的健康日本成人中，以2种不同给药方案(第0、1和6个月[月方案]或第1、8和30天[日方案])，含有氢氧化铝的疫苗的2种抗原剂量水平(即100-μg和200-μg)的安全性、耐受性和免疫原性。
总共128个65至85岁的健康日本成人参与。对象以3∶3∶2的比率随机分配，以接受在每种给药方案中的艰难梭菌疫苗(100μg或200μg总类毒素)或安慰剂(盐水)。
在接受其最后一次疫苗接种后，对象进行随访共6个月。因此，分配至月方案的对象参加大约12个月，并且分配至并完成日方案的对象参加大约7个月。这项研究计划在大约14个月内完成。研究结束是最后一个对象的最后一次就诊。
艰难梭菌疫苗先前未在日本对象中进行评估。因此，呈现的首次日本人体研究B5091010与研究B5091009相似设计，以评估当作为两种3剂量方案(第1、8和30天或第0、1和6个月)施用于65至85岁的健康日本成人时，含有氢氧化铝的艰难梭菌疫苗的2种抗原剂量水平(100μg和200μg总类毒素)的安全性、耐受性和免疫原性。
在研究B5091010进行期间，分析2期研究B5091009，并且证实施用的两种方案和两种剂量水平一般都是良好耐受的。局部反应占优势地为轻度至中度的，其中注射部位疼痛是最频繁的表现。在剂量2后，与第1个月相比，在第8天施用疫苗时，局部反应原性更大，特别是对于200-μg剂量水平。全身性事件也占优势地为轻度至中度的，并且个别事件的发病率在安慰剂组、100-μg剂量组和200-μg剂量组中是相似的。在每种方案内，总体不良事件(AE)发生率在安慰剂、100-μg和200-μg剂量组中也是相似的。对于两种方案，严重不良事件(SAE)在100-μg和200-μg剂量组中在数目上高于安慰剂组。然而，不存在这些事件的模式，并且没有鉴定安全关注。两种研究剂量水平均导致显著的中和性抗毒素A和B滴度，其中在第0、1和6个月施用的3个剂量之后的免疫原性概况是优选的。另外，200-μg剂量水平比100-μg剂量水平更具免疫原性。在这个基础上，决定用在第0、1和6个月施用的200-μg剂量水平进展到3期开发内。
对于每种给药方案，将对象随机化至如表4中所列出的3个研究组之一。计划大约24个对象接受以100或200μg总类毒素剂量水平的艰难梭菌疫苗，并且大约16个对象接受安慰剂(盐水)。
表4.疫苗组以及每组和每个剂量方案的计划对象数目
获得血清样品用于免疫原性测试。对于月方案，在第1天(在疫苗施用之前)、第15天(在剂量1后14天)、第30天(紧在剂量2前)、第37天(在剂量2后7天)、第2个月(在剂量2后1个月)、第6个月(紧在剂量3前)、第187天(在剂量3后7天)、第7个月(在剂量3后1个月)和第12个月(在剂量3后6个月)时。
对于日方案，在第1天(在疫苗施用之前)、第8天(紧在剂量2前)、第15天(在剂量2后7天)、第30天(紧在剂量3前)、第37天(在剂量3后7天)、第2个月(在剂量3后1个月)、第4个月(在剂量3后3个月)和第7个月(在剂量3后6个月)时。
测量了毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平。
毒素A和毒素B特异性中和性抗体几何平均浓度-对于月方案，第7个月(在剂量3后1个月)被指定为主要时间点，因为它反映了在疫苗的第三个剂量后的免疫应答。总之，对于100-和200-μg剂量组两者，毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMC在剂量2后增加，但在剂量3后(第7个月)最高。在第7个月，与100-μg剂量组相比，毒素A和B特异性中和性抗体GMC在200-μg剂量组中更高。对于两个剂量水平，毒素A和B特异性中和性抗体GMC从第7个月下降直到第12个月。在第12个月，对于200-μg剂量组的毒素A和毒素B特异性中和性抗体、以及对于100-μg剂量组的毒素A特异性中和性抗体，GMC保持高于阈值。200-μg剂量组中的毒素A特异性中和性抗体GMC在剂量2后(第37天)增加至347.17中和单位/mL，并且在第37天在100-μg剂量组中增加至125.46中和单位/mL。在100-和200-μg剂量组中的毒素A特异性中和性抗体GMC到第6个月(在剂量3前)分别降低至88.89中和单位/mL和148.44中和单位/mL。在剂量3后，毒素A特异性中和性抗体GMC对于100-和200-μg剂量组再次增加，并且在第7个月，当与100-μg剂量组(1137.50中和单位/mL)相比时，在200-μg剂量组(1692.38中和单位/mL)中在数目上更高。毒素A特异性中和性抗体GMC然后降低直到第12个月(在剂量3后6个月)，尽管与在第6个月的GMC相比，100-和200-μg剂量组一般保持较高(分别为248.97中和单位和587.46中和单位/mL)。100-和200-μg剂量组的毒素B特异性中和性抗体GMC在剂量2后(第37天)分别增加至337.54中和单位/mL和901.16中和单位/mL。毒素B特异性中和性抗体GMC到第6个月(在剂量3前)分别降低至274.13中和单位/mL和689.74中和单位/mL。在剂量3后(第187天)，毒素B特异性中和性抗体GMC对于100-和200-μg剂量组再次增加，并且在第7个月，当与100-μg剂量组(7903.68中和单位/mL)相比时，毒素B特异性中和性抗体GMC在200-μg剂量组(13756.54中和单位/mL)中在数目上更高。在第12个月，毒素B特异性中和性抗体GMC降低，但与在第6个月的GMC相比，对于200-μg剂量组(6298.18中和单位/mL)而不是100-μg剂量组(1887.24中和单位/mL)一般保持较高。在安慰剂组中，毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMC从基线到第12个月保持不变。对于月方案，在可评估的免疫原性群体中的65至69岁和70至74岁的对象中，毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMC是基本上相似的。
在月方案中，在每个可用的基线后时间点，计算了距离基线的毒素A和毒素B特异性中和性抗体的几何平均倍数上升(GMFR)：第15天(在剂量1后14天)、第30天(紧在剂量2前)、第37天(在剂量2后7天)、第2个月(在剂量2后1个月)、第6个月(紧在剂量3之前)、第187天(在剂量3后7天)、第7个月(在剂量3后1个月，主要时间点)、以及第12个月(在剂量3后6个月)。
在剂量2后(第37天；4.26)，在200-μg剂量组中观察到毒素A特异性中和性抗体GMFR增加，但到第6个月降低至1.82。在剂量3后，在第187天(分别为7.42和16.07)，对于100-和200-μg剂量组，存在毒素A特异性中和性抗体GMFR中的进一步增加，以及在第7个月的进一步增加(分别为12.58和20.77)。到第12个月，在100-和200-μg剂量组中，毒素A特异性中和性抗体GMFR分别降低至2.70和7.20。在每个采血时间点，200-μg剂量组中的毒素A特异性中和性抗体GMFR一致地高于100-μg剂量组的那些。在研究自始至终，毒素A特异性中和性抗体GMFR在安慰剂组中保持不变。
在剂量1(第15天；分别为2.81和5.21)和剂量2(第37天；分别为2.53和5.35)后，对于100-和200-μg剂量组观察到毒素B特异性中和性抗体GMFR中的增加，伴随到第6个月观察到的轻微降低(分别为2.06和4.10)。在第187天(分别为32.00和54.81)，对于100-和200-μg剂量组，在剂量3后观察到毒素B特异性中和性抗体GMFR中的进一步增加，以及在第7个月的进一步增加(分别为59.28和81.71)。到第12个月，对于100-和200-μg剂量组，毒素B特异性中和性抗体GMFR分别降低至14.01和36.90。在每个采血时间点，200-μg剂量组的毒素B特异性中和性抗体GMFR一致地高于100-μg剂量组的那些。在研究自始至终，毒素B特异性中和性抗体GMFR在安慰剂组中保持不变。
对于可评估的免疫原性群体，评价在月方案中达到高于指定阈值(219中和单位/mL[毒素A]和2586中和单位/mL[毒素B])的毒素A、毒素B以及毒素A和B特异性中和性抗体水平的对象比例。
总之，跨越所有采血时间点，当与100-μg剂量组相比时，达到高于阈值的毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平的对象比例在200-μg剂量组中更高。对于两个剂量组，具有高于阈值的毒素A、毒素B以及毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平的对象比例在剂量2后增加，并且在剂量3后(第7个月)最高。
对于毒素A特异性中和性抗体，在剂量3后(第187天)，与安慰剂组中无对象相比，100-μg剂量组中78.3％(18/23，95％CI：56.3，92.5)的对象、以及200-μg剂量组中95.7％(22/23，95％CI：78.1，99.9)的对象达到高于阈值的毒素A特异性中和性抗体水平。在第7个月，与安慰剂组中无对象相比，100-μg剂量组中91.3％(21/23，95％CI：72.0，98.9)的对象、以及200-μg剂量组中100.0％(23/23，95％CI：85.2，100.0)的对象达到高于阈值的毒素A特异性中和性抗体水平。对于高于阈值的毒素A特异性中和性抗体水平的对象比例，对于200-μg剂量组(95.5％[21/22]的对象，95％CI：77.2，99.9)在第12个月保持很高，但在100剂量组(55.0％[9/20]的对象，95％CI：31.5，76.9)中下降。安慰剂组中无对象在第12个月具有高于阈值的毒素A特异性中和性抗体水平。
对于毒素B特异性中和性抗体，在剂量3后(第187天)，与安慰剂组中无对象相比，100-μg剂量组中52.2％(12/23，95％CI：30.6，73.2)的对象、以及200-μg剂量组中91.3％(21/23，95％CI：72.0，98.9)的对象达到高于阈值的毒素B特异性中和性抗体水平。在第7个月，与安慰剂组中无对象相比，100-μg剂量组中91.3％(21/23，95％CI：72.0，98.9)的对象、以及200-μg剂量组中100.0％(23/23，95％CI：85.2，100.0)的对象达到高于阈值的毒素B特异性中和性抗体水平。对于高于阈值的毒素B特异性中和性抗体水平的对象比例，对于200-μg剂量组(81.8％[18/22]的对象，95％CI：59.7，94.8)在第12个月保持很高，但在100剂量组(45.0％[11/20]的对象，95％CI：23.1，68.5)中下降。安慰剂组中无对象在第12个月具有高于阈值的毒素B特异性中和性抗体水平。
对于月方案，对于可评估的免疫原性群体，评价了毒素A、毒素B、以及毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平距离基线达到限定倍数(≥4倍、≥8倍、≥16倍和≥32倍)的对象比例。总之，与100-μg剂量组相比，在200-μg剂量组中观察到距离基线毒素A特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的更大的对象比例。在剂量3后(第187天)，观察到在100-和200-μg剂量组中距离基线达到≥32倍上升的对象比例中的增加。到第7个月，100-μg剂量组中69.6％(16/23)的对象和200-μg剂量组中91.3％(21/23)的对象达到距离基线的≥8倍上升。进一步在第7个月，200-μg剂量组中69.6％(16/23)的对象也达到距离基线的≥16倍上升。安慰剂组中距离基线的毒素A特异性中和性抗体倍数上升在每个时间点保持不变。与第7个月相比，距离基线毒素A特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的对象比例在第12个月下降，其中100μg剂量组中5.0％(1/20)的对象和200-μg剂量组中13.6％(3/22)的对象达到距离基线的≥16倍上升。
总之，与100-μg剂量组相比，在200-μg剂量组中观察到距离基线毒素B特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的更大的对象比例。在剂量3后(第187天)，观察到在100-和200-μg剂量组中距离基线达到≥32倍上升的对象比例中的增加。到第7个月，100-μg剂量组中73.9％(17/23)的对象和200-μg剂量组中82.6％(19/23)的对象达到距离基线的≥≥32倍上升。安慰剂组中距离基线的毒素B特异性中和性抗体倍数上升在每个时间点保持不变。与第7个月相比，距离基线毒素B特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的对象比例在第12个月下降，其中100μg剂量组中25.0％(5/20)的对象和200-μg剂量组中45.5％(10/22)的对象达到距离基线的≥≥32倍上升。
在剂量3后(第187天)，观察到在100-和200-μg剂量组中关于毒素A和B特异性中和性抗体水平距离基线达到≥8倍上升的对象比例中的增加。到第7个月，100-μg剂量组中69.6％(16/23)的对象和200-μg剂量组中87.0％(20/23)的对象达到距离基线的≥8倍上升。进一步在第7个月，200-μg剂量组中65.2％(15/23)的对象达到距离基线的≥16倍上升。安慰剂组中距离基线的毒素A和B特异性中和性抗体倍数上升在每个时间点保持不变。
评价了关于月方案具有毒素A和B特异性中和性抗体水平≤LLOQ的对象比例。总之，在100-和200-μg剂量组中低比例的对象在第7个月和第12个月具有毒素A或毒素B特异性中和性抗体水平＜LLOQ。安慰剂组中的大多数对象在所有时间点具有毒素A、毒素B、以及毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平＜LLOQ。
对于日方案，第37天(在剂量3后7天)被指定为主要时间点，因为它反映了在疫苗的第三个剂量后的免疫应答；然而，由于起因于在停止规则之后的中止后续给药的决定，招募对象的数目有限，因此无法在第30天及以后进行推断。关于100-和200-μg剂量组的毒素A特异性中和性抗体GMC在剂量1和剂量2后增加，但当与100-μg剂量组(在第15天的79.00中和单位/mL和在第30天的116.21中和单位/mL)相比时，在200-μg剂量组中在第15天(515.67中和单位/mL)和第30天(673.00中和单位/mL)至更大的程度。毒素A特异性中和性抗体GMC在安慰剂组中在研究自始至终保持不变。与毒素A相似，关于100-和200-μg剂量组的毒素B特异性中和性抗体GMC在剂量1和剂量2后增加，但当与100-μg剂量组(692.98中和单位/mL和682.09中和单位/mL)相比时，在200-μg剂量组中在第15天(3531.69中和单位/mL)和第30天(4666.51中和单位/mL)至更大的程度。毒素B特异性中和性抗体GMC在安慰剂组中在研究自始至终保持不变。
在日方案中，在每个可用的基线后时间点，计算了距离基线的毒素A和毒素B特异性中和性抗体的GMFR：第8天(紧在剂量2前)、第15天(在剂量2后7天)、第30天(紧在剂量3前)、第37天(在剂量3后7天，主要时间点)、第2个月(在剂量3后1个月)、第4个月(在剂量3后3个月)和第7个月(在剂量3后6个月)。由于通过在停止规则之后的中止后续给药的决定造成的对象数目有限，因此无法在第30天及以后进行推断。在第15天(6.11)时，在剂量2后在200-μg剂量组中观察到毒素A特异性中和性抗体GMFR增加，以及在第30天(7.79)的进一步增加。在第30天(1.47)，在100-μg剂量组在剂量2后观察到毒素A特异性中和性抗体GMFR中的增加，但在所有时间点总体上低于200-μg剂量组中观察到的GMFR。毒素A特异性中和性抗体GMFR在安慰剂组中在所有时间点保持不变。
在剂量1后(第8天：分别为1.41和1.78)，在100-和200-μg剂量组均观察到毒素B特异性中和性抗体GMFR中的增加，伴随在第15天(分别为4.37和9.01)和第30天(分别为4.59和10.63)在两个剂量组中观察到的进一步增加。当与100-μg剂量组中的那些相比时，毒素B特异性中和性抗体GMFR在200-μg剂量组中一致地更高。毒素B特异性中和性抗体GMFR在安慰剂组中在所有时间点保持不变。
在日方案中，评价了mITT群体中达到高于指定阈值(219中和单位/mL[毒素A]和2586中和单位/mL[毒素B])的毒素A、毒素B、以及毒素A和B特异性中和性抗体水平的对象比例。到日方案中的第30天，与100-μg剂量组(20.0％[1/5]的对象，95％CI：0.5，71.6)相比，200-μg剂量组中更高百分比的对象(62.5％[5/8]的对象，95％CI：24.5，91.5)，达到高于阈值的毒素A特异性中和性抗体水平。
类似地，对于毒素B特异性中和性抗体，在第30天，与100-μg剂量组(20.0％[1/5]的对象，95％CI：0.5，71.6)相比，200-μg剂量组中更高百分比的对象(62.5％[5/8]的对象，95％CI：24.5，91.5)，达到高于阈值的毒素B特异性中和性抗体水平。
对于毒素A和毒素B特异性中和性抗体，在200-μg剂量组(50.0％[4/8]的对象，95％CI：15.7，84.3)中，一半的对象到第30天达到高于阈值的水平，而在100-μg剂量组(0.0％[0/5]的对象)中，没有一个对象对于毒素A和毒素B两者达到高于阈值的水平。
在日方案中，评价了毒素A、毒素B、以及毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平中，距离基线达到限定倍数上升(≥4倍、≥8倍、≥16倍和≥32倍)的对象比例。总之，与100-μg剂量组相比，在200-μg剂量组中观察到距离基线毒素A特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的日方案中更大的对象比例。直至第30天，100-μg剂量组中没有对象达到毒素A特异性中和性抗体水平中的≥4倍或更高的上升。在剂量2后(第15天)，在200-μg剂量组中存在达到距离基线的≥32倍上升的对象比例中的增加，其持续直至第30天(200-μg剂量组中25.0％[2/8]的对象达到距离基线的≥32倍上升)。安慰剂组中距离基线的毒素A特异性中和性抗体倍数上升在每个时间点保持不变。
与毒素A特异性中和性抗体相似，与100-μg剂量组相比，在200-μg剂量组中观察到距离基线毒素B特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的日方案中更大的对象比例。在剂量2后(第15天)，在100-和200-μg剂量组中存在达到距离基线的≥32倍上升的对象比例中的增加，其持续直至第30天。在第30天，100-μg剂量组中的5个对象中只有1个达到任何限定的倍数上升。相反，200-μg剂量组中62.5％[5/8]的对象在第30天达到≥16倍上升。安慰剂组中距离基线的毒素B特异性中和性抗体倍数上升在每个时间点保持不变。
直到第30天且包括第30天，100-μg剂量组中没有对象达到毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平中的≥4倍或更高的上升。在剂量2后(第15天)，在200-μg剂量组中，存在对于毒素A和B两者达到距离基线的≥32倍上升的对象比例中的增加，其持续直至第30天(200-μg剂量组中12.5％[1/8]的对象达到距离基线的≥32倍上升)。安慰剂组中距离基线的毒素A和毒素B特异性中和性抗体倍数上升在每个时间点保持不变。
评价了关于日方案具有毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平＜LLOQ的对象比例。在100-和200-μg剂量组中的对象在第15天(分别为100.0％[11/11]的对象和54.5％[6/11]的对象)在剂量2后具有毒素A特异性中和性抗体水平＜LLOQ，并且在第30天(分别为60.0％[3/5]的对象和25.0％[2/8]的对象)减少。到第30天，在100-和200-μg剂量组中的对象具有毒素B特异性中和性抗体水平＜LLOQ(分别为40.0％[2/5]的对象和37.5％[3/8]的对象)、以及毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平＜LLOQ(分别为20.0％[1/5]的对象和12.5％[1/8]的对象)。
结论。免疫原性终点被视为这个研究中的次要终点。免疫原性终点包括距离基线的毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMC和GMFR，以及具有高于阈值的毒素A、毒素B、或毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平的对象比例，以及具有距离基线≥4倍、≥8倍、≥16倍和≥32倍上升的比例。由于终止日方案，在30天后对于这个队列仅获得了有限量的免疫原性数据。因此，从得自月方案的数据得出下述结论。总之，在100-和200-μg剂量组中，关于毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平的GMC在剂量1后增加，在第7个月达到最大，并且直到第12个月才下降。在第7个月，当与100-μg剂量组(分别为1137.50和7903.68中和单位/mL)相比时，毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMC在200-μg剂量组(分别为1692.38和13756.54中和单位/mL)中在数目上更高。到第12个月，毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMC下降，但与在第6个月的GMC相比，在200-μg剂量组(分别为587.46和6298.18中和单位/mL)中保持较高。在每个采血时间点，200-μg剂量组中的毒素A特异性中和性抗体GMFR一致地高于100-μg剂量组的那些。在剂量3后，在100-和200-μg剂量组中均观察到距离基线的GMFR增加。当与100-μg剂量组(分别为12.58和59.28)相比时，毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMFR在第7个月最高，并且在200-μg剂量组(分别为20.77和81.71)中在数目上更高。毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMFR然后在两个疫苗组中到第12个月下降。跨越所有采血时间点，当与100-μg剂量组相比时，达到高于阈值的毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平的对象比例在200-μg剂量组中一般更高。到第7个月，200-μg剂量组中100.0％的对象达到高于阈值的毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平，而100-μg剂量组中多于90％的对象达到高于阈值的水平。对于毒素A和毒素B特异性中和性抗体水平高于阈值的对象比例在第12个月对于200-μg剂量组(分别为95.5％和81.8％)保持很高，但在100剂量组(分别为55.0％和45.0％)中下降。安慰剂组中没有对象在第12个月时具有高于阈值的毒素A或毒素B特异性中和性抗体水平。对于毒素A特异性中和性抗体，100-μg剂量组中69.6％(16/23)的对象和200-μg剂量组中91.3％(21/23)的对象到第7个月达到距离基线的≥8倍上升，而200-μg剂量组中的大多数对象(69.6％；16/23)到第7个月也达到距离基线的≥16倍上升。与第7个月相比，距离基线毒素A特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的对象比例在第12个月下降，其中100-μg剂量组中5.0％(1/20)的对象和200-μg剂量组中13.6％(3/22)的对象达到距离基线的≥16倍上升。对于毒素B特异性中和性抗体，在100-和200-μg剂量组中的大多数对象到第7个月达到距离基线的≥32倍上升(分别为73.9％[17/23]的对象和82.6％[19/23]的对象)。与第7个月相比，距离基线毒素B特异性中和性抗体水平达到限定倍数上升的对象比例在第12个月下降，其中100-μg剂量组中25.0％(5/20)的对象和200-μg剂量组中45.5％(10/22)的对象达到距离基线的≥32倍上升。由于在基线时跨越100-μg、200-μg和安慰剂剂量，在月方案和日方案中在基线时血清阳性对象的极少数目，无法考虑基线血清状况对GMC的作用。如月方案RCDC中显而易见的，当在第7个月以及一般而言跨越所有时间点与100-μg剂量组相比时，200-μg剂量组具有更高的毒素A和毒素B特异性中和性抗体浓度。总之，这些结果证实，在月方案中，在艰难梭菌疫苗的剂量3后大约1个月(第7个月)出现峰值免疫原性。另外，如通过毒素A和毒素B特异性中和性抗体GMC和GMFR评价的，与100-μg剂量相比，200-μg剂量诱导更高和更持久的抗体应答。
实施例10：由免疫原性组合物诱导的抗体能够中和来自各种艰难梭菌菌株的毒素
使用来自用免疫原性组合物免疫的非人灵长类动物的血清，在体外中和测定中，测试了含有来自各种菌株的分泌毒素的培养上清液，以测定免疫原性组合物的覆盖，并且测定免疫原性组合物保护不受来自循环临床菌株的多种毒素的能力。
IMR-90细胞用于测试由各种艰难梭菌菌株表达的毒素的中和。基于参考标准计算测试样品的中和滴度。测定LLOQ：Txd A＝158.0U/ml；Txd B＝249.5U/ml。表5中的结果显示，在中和测定中，来自免疫的非人灵长类动物的血清能够中和来自分别培养上清液各自的艰难梭菌毒素。
表5.
实施例11：支持3期艰难梭菌疫苗功效研究的诊断测定
Clover(B5091007)是多国关键性3期研究，其在具有增加的CDI风险的50岁或以上的对象中，评估了基于类毒素的艰难(C)梭菌疫苗的功效、安全性和耐受性。涉及23个国家的大约400个调查场所，该研究靶向招募近16,000个对象。这项3期研究的主要目的是基于临床和实验室诊断标准，证实疫苗在减少CDI的首次主要发作的发病率中的功效。评估疫苗的功效必须跟踪对象何时经历腹泻，在其腹泻时收集粪便样品，将这些样品在温度可控的条件下运送到中央实验室，并且测试引起疾病的艰难梭菌和毒素的存在。为了确保CDI的准确实验室诊断，使用了两步算法来测试粪便样品。这种算法基于通过PCR检测带有毒素B基因的艰难梭菌菌株/孢子，随后为使用有专利权的毒素检测测试(CCNA)检测游离毒素(A和B)。选择这种方法是因为流行病学研究清楚地证实，游离毒素的检测是比单独的PCR更好的CDI疾病预测物。i，ii另外，两步测试算法已经在EU由欧洲临床微生物与传染病学会(European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases)，并且在US由美国传染病学会(Infectious Diseases Society of America)和美国医疗保健流行病学学会(Society for Healthcare Epidemiology of America)推荐。描述了进行这项研究以及PCR鉴定和CCNA验证/临床验证的操作/执行挑战的重点。两种测定均符合所有预先指定的验收标准，并且适合于其作为艰难梭菌疫苗功效和流行病学研究中的诊断的预期用途。
CEPHEID艰难梭菌/Epi PCR测试验证和CCNA的临床验证的合格
艰难梭菌/Epi PCR测试和CCNA是灵敏，稳固且可重现的。精确度、线性、准确性和/或特异性的测定合格和验证确认/>艰难梭菌/Epi PCR测试和CCNA适合于其预期目的。每种测定均针对CDI真阳性和真阴性粪便样品进行测试，并且评估其临床准确性。通过适当地对阳性和阴性样品进行分类，/>艰难梭菌/Epi PCR测试和CCNA两者均为临床上准确的。
特异性：用艰难梭菌/Epi PCR评估了50种非产毒和非艰难梭菌菌株。没有观察到交叉反应，其对应于100％的分析特异性。
灵敏度：测定了在粪便中掺料的10种艰难梭菌菌株的检测限(LOD)。关于这10种菌株的LOD范围为344至2175个菌落形成单位(CFU)。
精确度：9种输入样品通过2个分析员，在10个测试日内使用3批测试试剂进行测试。在这些条件下，样品变异性是＜2％相对标准差。
准确性：在浓度增加10倍时，测量值与参考值之间的一致性由斜率＝-3.3Ct指示。
CEPHEID艰难梭菌/Epi PCR测试在临床验证中正确鉴定了所有93个CDI病例样品；在测定验证期间观察到极佳的CCNA精确度；当与参考方法相比时，CCNA证实100％的临床特异性；并且当与另一种参考方法相比时，CCNA证实95.7％的临床灵敏度。
结论：基于艰难梭菌生物的检测，随后为毒素的检测，两步算法用于CDI的实验室确认。在用于CLOVER中之前，艰难梭菌/Epi PCR测试和CCNA两者均为合格的和/或验证的，并且两者均证实极佳的分析特异性、灵敏度和精确度。在临床验证期间，两种诊断测定在检测假定的CDI病例方面是临床上特异和灵敏的。与可靠的临床样品样本收集策略结合使用的每种测定目前用于艰难梭菌疫苗3期临床试验中。
下述条款描述了本发明的另外实施方案：
C1.一种用于在人中引发针对艰难梭菌感染的免疫应答的方法，该方法包括向人施用有效剂量的组合物，所述组合物包括艰难梭菌类毒素，其中所述组合物施用至少两次。
C2.根据条款C1的方法，其中第二次施用是在第一次施用后至少7天，并且第三次施用是在第一次施用后约30天。
C3.根据条款C1的方法，其中第三次施用是在第一次施用后约180天。
C4.根据条款C1的方法，其中所述组合物施用至少三次。
C5.根据条款C2的方法，其中第二次施用是在第一次施用后约30天，并且第三次施用是在第一次施用或第二次施用后约180天。
C6.根据条款C2的方法，其中第三次施用是在第一次施用后至少180天。
C7.根据条款C1的方法，其中所述引发的免疫应答包含抗毒素A中和性单克隆抗体。
C8.根据条款C1的方法，其中所述引发的免疫应答包含抗毒素B中和性单克隆抗体。
C9.根据条款C1的方法，其中所述引发的免疫应答包含抗毒素A中和性单克隆抗体和抗毒素B中和性单克隆抗体，其中所述中和性单克隆抗体的浓度为至少10μg/mL。
C10.根据条款C1的方法，其中所述组合物包含艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B，其各自具有至少90％或更高的纯度。
C11.根据条款C1的方法，其中所述组合物包含以约3∶1至约1∶1比率的艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B。
C12.根据条款C1的方法，其中所述组合物包含以1∶1比率的艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B。
C13.根据条款C1的方法，其中所述组合物包含佐剂。
C14.根据条款C1的方法，其中所述组合物包含铝佐剂。
C15.根据条款C1的方法，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫反应持续至少约60天。
C16.根据条款C1的方法，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫反应持续至少约180天。
C17.根据条款C1的方法，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫反应持续至少约365天。
C18.根据条款C1的方法，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫应答持续至少约540天。
C19.根据条款C1的方法，其中第二次施用是第一次施用后至少7天，并且第三次施用是第一次施用后至少30天。
C20.根据条款C1的方法，其中第三次施用是在第一次施用后至少30天。
C21.根据条款C1的方法，其中第二次施用是在第一次施用后至少7天，并且第三次施用是在第一次施用或第二次施用后至少180天。
C22.根据条款C1的方法，其中第三次施用是在第一次施用后至少180天。
C23.根据条款C1的方法，其中所述组合物包含艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B，其各自具有至少90％或更高的纯度。
C24.根据条款C1的方法，其中所述组合物包含以约3∶1至约1∶1比率的艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B。
C25.根据条款C1的方法，其中所述组合物包含以1∶1比率的艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B。
C26.根据条款C1的方法，其中所述组合物包含佐剂。
C27.根据条款C1的方法，其中所述组合物包含铝佐剂。
C28.根据条款C1的方法，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫反应持续至少约60天。
C29.根据条款C1的方法，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫反应持续至少约180天。
C30.根据条款C1的方法，其中针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的免疫反应持续至少约365天。
C31.根据条款C1的方法，其中所述艰难梭菌类毒素A与铝佐剂结合。
C32.根据条款C1的方法，其中所述艰难梭菌类毒素B与铝佐剂结合。
C33.根据条款C1的方法，其中所述艰难梭菌类毒素A和/或艰难梭菌类毒素B是冻干的。
C34.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
C35.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少4倍。
C36.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少8倍。
C37.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少16倍。
C38.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
C39.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
C40.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少4倍。
C41.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少8倍。
C42.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少16倍。
C43.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
C44.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
C45.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少4倍。
C46.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少8倍。
C47.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少16倍。
C48.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
C49.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
C50.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少4倍。
C51.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少8倍。
C52.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少16倍。
C53.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
C54.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
C55.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少4倍。
C56.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少8倍。
C57.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少16倍。
C58.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
C59.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
C60.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少4倍。
C61.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少8倍。
C62.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少16倍。
C63.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
C64.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第一个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
C65.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第二个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
C66.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第三个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
C67.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第一个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
C68.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第二个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
C69.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第三个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天中任何一天测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
C70.根据条款C1的方法，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，当在第三个剂量后约7、30、60、90、120、365或540天中任何一天测量时，所述组合物在接受第三个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度。
C71.根据条款C1的方法，其中所述人对毒素B呈血清阴性。
C72.根据条款C1的方法，其中所述人对毒素A呈血清阴性。
C73.根据条款C1的方法，其中所述人对毒素A和毒素B呈血清阴性。
C74.根据条款C1的方法，其中所述人对毒素B呈血清阳性。
C75.根据条款C1的方法，其中所述人对毒素A呈血清阳性。
C76.根据条款C1的方法，其中所述人对毒素A和毒素B呈血清阳性。
C77.根据条款C1的方法，其中所述类毒素包含SEQ ID NO：4，其中不存在甲硫氨酸。
C78.根据条款C1的方法，其中所述类毒素包含SEQ ID NO：6，其中不存在甲硫氨酸。
C79.根据条款C1的方法，其中所述类毒素包含SEQ ID NO：1-8、15、17、19、21、23、25、28-35、82-761中的任何一个，其中不存在甲硫氨酸。
C80.根据条款C1的方法，其中所述类毒素包含甲醛接触的艰难梭菌毒素A。
C81.根据条款C1的方法，其中所述类毒素包括甲醛接触的艰难梭菌毒素B。
C82.根据条款C1的方法，其中所述类毒素不与甲醛接触。
C83.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型002。
C84.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型003。
C85.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型004。
C86.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型012。
C87.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型015。
C88.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型017。
C89.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型020。
C90.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型023。
C91.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型027。
C92.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型029。
C93.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型046。
C94.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型053。
C95.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型059。
C96.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型070。
C97.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型075。
C98.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型078。
C99.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型081。
C100.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型087。
C101.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型106。
C102.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型117。
C103.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型126。
C104.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型131。
C105.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌核糖体型154。
C106.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌毒素型0。
C107.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌毒素型I。
C108.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌毒素型VIII。
C109.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌毒素型IV。
C110.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌毒素型III。
C111.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌毒素型XIII。
C112.根据条款C1的方法，其中所述感染来自艰难梭菌毒素型V。

Claims (27)

1.组合物在制备用于在人中引发针对艰难梭菌(Clostridium difficile)感染的免疫应答的产品中的用途，所述组合物包括氨基酸序列为SEQ ID NO:4的艰难梭菌类毒素，其中在起始处的甲硫氨酸不存在，以及氨基酸序列为SEQ ID NO:6的艰难梭菌类毒素，其中在起始处的甲硫氨酸不存在，其中所述组合物施用至少三次，其中第二次施用是在第一次施用后30天，且第三次施用是在第一次施用后180天，并且其中针对艰难梭菌毒素A的免疫应答持续至少12个月和针对艰难梭菌毒素B的免疫应答持续至少9个月，其中在接受第一次施用后180天的第三次施用后的人中在第三次施用后30天的毒素B特异性中和性抗体浓度相比在接受第一次施用后30天的第三次施用后的人中在第三次施用后30天的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
2.根据权利要求1的用途，其中所述引发的免疫应答包含抗毒素A中和性单克隆抗体。
3.根据权利要求1的用途，其中所述引发的免疫应答包含抗毒素B中和性单克隆抗体。
4.根据权利要求1的用途，其中所述引发的免疫应答包含抗毒素A中和性单克隆抗体和抗毒素B中和性单克隆抗体，其中所述中和性单克隆抗体的浓度为至少10μg/mL。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含艰难梭菌类毒素A和艰难梭菌类毒素B，其各自具有至少90％或更高的纯度。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含3：1至1：1比率的艰难梭菌类毒素A和艰难梭菌类毒素B。
7.根据权利要求1的用途，其中所述组合物包含1：1比率的艰难梭菌类毒素A和艰难梭菌类毒素B。
8.根据权利要求1的用途，其中所述组合物包含佐剂。
9.根据权利要求1的用途，其中所述组合物包含铝佐剂。
10.根据权利要求1的用途，其中针对艰难梭菌毒素A和毒素B的免疫应答持续至少180天。
11.根据权利要求1的用途，其中针对艰难梭菌毒素A和毒素B的免疫应答持续至少365天。
12.根据权利要求1的用途，其中针对艰难梭菌毒素A和毒素B的免疫应答持续至少540天。
13.根据权利要求1的用途，其中所述艰难梭菌类毒素A和艰难梭菌类毒素B是冻干的。
14.根据权利要求1的用途，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
15.根据权利要求1的用途，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
16.根据权利要求1的用途，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
17.根据权利要求1的用途，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第一个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
18.根据权利要求1的用途，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
19.根据权利要求1的用途，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素A特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素A特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
20.根据权利要求1的用途，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少2倍。
21.根据权利要求1的用途，其中当在细胞毒性测定中在相同条件下测量时，所述组合物在接受第二个剂量后的人中诱导的毒素B特异性中和性抗体浓度比在接受第一个剂量前的人中的毒素B特异性中和性抗体浓度高至少32倍。
22.根据权利要求1的用途，其中所述人对毒素B呈血清阴性。
23.根据权利要求1的用途，其中所述人对毒素A呈血清阴性。
24.根据权利要求1的用途，其中所述人对毒素A和毒素B呈血清阴性。
25.根据权利要求1的用途，其中所述人对毒素B呈血清阳性。
26.根据权利要求1的用途，其中所述人对毒素A呈血清阳性。
27.根据权利要求1的用途，其中所述人对毒素A和毒素B呈血清阳性。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5917682B2 (ja) 2011-04-22 2016-05-18 ワイス・エルエルシー 変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素に関する組成物およびその方法
BR122016023101B1 (pt) 2012-10-21 2022-03-22 Pfizer Inc Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile
WO2021255690A2 (en) * 2020-06-19 2021-12-23 Pfizer Inc. Immunogenic compositions against clostridioides (clostridium) difficile and methods thereof
WO2023242817A2 (en) 2022-06-18 2023-12-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2
WO2024127215A2 (en) 2022-12-13 2024-06-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions and methods for eliciting an immune response against clostridioides (clostridium) difficile

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104797706A (zh) * 2012-10-21 2015-07-22 辉瑞公司 涉及突变型艰难梭菌毒素的组合物和方法
CN105611942A (zh) * 2013-06-14 2016-05-25 圣诺菲·帕斯图尔公司 针对艰难梭菌免疫的组合物和方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DK1005368T3 (da) 1997-03-10 2010-01-04 Ottawa Hospital Res Inst Anvendelse af nukleinsyrer, der indeholder ikke-metyleret CpG dinukleotid i kombination med alun som hjælpestoffer
EP1024826B1 (en) * 1997-10-20 2005-03-16 Acambis, Inc. Passive immunization against clostridium difficile disease
EP1568378B1 (en) * 1997-10-20 2016-03-16 Sanofi Pasteur Biologics, LLC Immunization against Clostridium difficile disease
AU764969B2 (en) 1999-04-19 2003-09-04 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccines
ES2481040T3 (es) 2008-12-09 2014-07-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Oligonucleótidos inmunoestimulantes
JP5917682B2 (ja) 2011-04-22 2016-05-18 ワイス・エルエルシー 変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素に関する組成物およびその方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104797706A (zh) * 2012-10-21 2015-07-22 辉瑞公司 涉及突变型艰难梭菌毒素的组合物和方法
CN105611942A (zh) * 2013-06-14 2016-05-25 圣诺菲·帕斯图尔公司 针对艰难梭菌免疫的组合物和方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A phase1,placebo-controlled,randomized study of the safety,tolerability,and immunogenicity of a Clostridium difficile vaccine administered with or without aluminum hydroxide in healthy adults;Eric Sheldon，et al;《Vaccine》;第34卷;第2082页摘要、第2083页第2.1至2.2节、第2083至2086页第3.2.1至3.2.2节、图1 *
Eric Sheldon，et al.A phase1，placebo-controlled，randomized study of the safety，tolerability，and immunogenicity of a Clostridium difficile vaccine administered with or without aluminum hydroxide in healthy adults.《Vaccine》.2016,第34卷第2082页摘要、第2083页第2.1至2.2节、第2083至2086页第3.2.1至3.2.2节、图1. *

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