JP2019065001A - クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答を惹起するための組成物および方法 - Google Patents

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答を惹起するための組成物および方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2019065001A
JP2019065001A JP2018179963A JP2018179963A JP2019065001A JP 2019065001 A JP2019065001 A JP 2019065001A JP 2018179963 A JP2018179963 A JP 2018179963A JP 2018179963 A JP2018179963 A JP 2018179963A JP 2019065001 A JP2019065001 A JP 2019065001A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
toxin
dose
difficile
subjects
neutralizing antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2018179963A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7355490B2 (ja
Inventor
シビル アンダーソン アナリサ
Sybil Anderson Annaliesa
シビル アンダーソン アナリサ
ジー．ケイ．ドナルド ロバート
G K Donald Robert
ジー．ケイ．ドナルド ロバート
ジェームズ フリント マイケル
James Flint Michael
ジェームズ フリント マイケル
ウテ ジャンセン キャスリン
Ute Jansen Kathrin
ウテ ジャンセン キャスリン
ランドルフ エヴァラード キッチン ニコラス
Randolph Everard Kitchin Nicholas
ランドルフ エヴァラード キッチン ニコラス
キース モラン ジャスティン
Keith Moran Justin
キース モラン ジャスティン
ペドネオールト ルイス
Pedneault Louise
ペドネオールト ルイス
ダブリュ． プライド マイケル
W Pride Michael
ダブリュ． プライド マイケル
エドワード ルッペン マーク
Edward Ruppen Mark
エドワード ルッペン マーク
フレデリック ウェッバー クリストファー
Frederick Webber Christopher
フレデリック ウェッバー クリストファー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Inc
Original Assignee
Pfizer Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Inc filed Critical Pfizer Inc
Publication of JP2019065001A publication Critical patent/JP2019065001A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7355490B2 publication Critical patent/JP7355490B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

【課題】ヒトにおいてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に対する免疫応答を惹起するための組成物及び方法の提供。【解決手段】ヒトにおいてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に対する免疫応答を惹起するための方法であって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを含む組成物の有効用量をヒトに投与するステップを含み、組成物が少なくとも２回投与され、２回目の投与が、１回目の投与の約３０日後であり、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答が、少なくとも約６０日間持続する、方法。【選択図】図１−１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月２８日出願の米国仮特許出願第６２／５６５，０９６号、２０１７年１０月２４日出願の米国仮特許出願第６２／５７６，６０３号、２０１７年１０月２６日出願の米国仮特許出願第６２／５７７，６６１号、および２０１８年８月２１日出願の米国仮特許出願第６２／７２０，６１７号に対する優先権を主張する。これらの特許出願の各々は、その全体が本明細書で参照により組み込まれる。
本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドに関する組成物および方法、ならびにその方法に関する。
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））は、ヒトにおける胃腸疾患と関連するグラム陽性嫌気性細菌である。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のコロニー形成は通常、天然の腸内フローラが抗生物質による処置によって衰える場合に、結腸において生じる。感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の主な病原因子であるグルコシル化性毒素、毒素Ａおよび毒素Ｂ（それぞれ、３０８および２７０ｋＤａ）の分泌を介して、抗生物質関連下痢、および時折は偽膜性大腸炎をもたらし得る。
過去十年で、病院、介護施設および他の長期ケア施設におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の大流行の回数および重症度は、劇的に増加した。この深刻化における重要な因子には、高毒性（hypervirulent）病原性株の出現、抗生物質の使用の増加、改善された検出方法、および医療施設における風媒性の芽胞への曝露の増加が含まれる。
メトロニダゾールおよびバンコマイシンは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患（ＣＤＡＤ）の抗生物質処置のための現在受け入れられている標準治療を示す。しかし、かかる処置を受けている患者の約２０％は、ＣＤＩの最初のエピソード後の感染症の再発を経験し、そのような患者の最大で約５０％が、さらなる再発を被る。再発の処置は、非常に重要な課題を示し、再発の大部分は通常、先行するエピソードの１カ月以内に生じる。
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に対する体液性免疫応答は、ヒトにおける疾患のより重症の転帰または再発を予防することにおいて重要な役割を果たす。臨床研究は、抗毒素Ａ免疫グロブリンＧ（酵素結合免疫吸着アッセイによって測定される）の高い血清濃度とＣＤＩまたは原発性ＣＤＩ後の再発からの保護との間の相関を示唆する。不活性化された毒素による能動的免疫化および抗毒素抗体による受動的免疫化は、致死チャレンジから動物を保護することが実証されている。さらに、バンコマイシン単独で処置したハムスターは、バンコマイシン＋抗毒素抗体で処置したハムスターと比較して、より高い死亡率を有し、これは、ワクチン接種が抗生物質を超える利点を提供し得ることを示している。
米国仮特許出願第６２／５７７，６６１号 米国仮特許出願第６２／５７６，６０３号 米国仮特許出願第６２／７２０，６１７号 ＷＯ／２０１２／１４３９０２号 米国特許第９１８７５３６号 ＷＯ／２０１４／０６０８９８号 ＧＢ ２２２０２１１号 ＷＯ１９９８／０４０１００号 ＷＯ２０１０／０６７２６２号 ＷＯ００／０６２８００号
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２７４’版、Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ編、Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）
複雑性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症（ＣＤＩ）に対する承認された高度に有効な非侵襲性処置は、存在しない。したがって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫原性および／または治療組成物ならびにその方法が必要とされている。
上述および他の必要を満たすために、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドおよびその使用の方法に関する。本明細書で使用する場合、用語「トキソイド」、「変異体毒素」および「ポリペプチド」は、同義であり、特記しない限り、相互交換可能に使用される。一態様では、本発明は、ＣＤＩの危険性がある対象において有効性および安全性について現在評価されているクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンに関する。最適なワクチン接種用量およびレジメンの選択は、免疫原性、安全性、ならびに短期および長期保護の可能性を考慮して、研究に基づいた。
一態様では、本発明は、ヒトにおいてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に対する免疫応答を惹起するための方法に関する。この方法は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイド、即ちポリペプチドを含む組成物の有効用量をヒトに投与するステップを含み、この組成物は少なくとも２回投与される。一実施形態では、２回目の投与は、１回目の投与の少なくとも７日後であり、３回目の投与は、１回目の投与の約３０日後である。一実施形態では、３回目の投与は、１回目の投与の約１８０日後である。一実施形態では、組成物は、少なくとも３回投与される。一実施形態では、２回目の投与は、１回目の投与の約３０日後であり、３回目の投与は、１回目または２回目の投与の約１８０日後である。一実施形態では、３回目の投与は、１回目の投与の少なくとも１８０日後である。
一実施形態では、惹起される免疫応答は、抗毒素Ａ中和モノクローナル抗体を含む。一実施形態では、惹起される免疫応答は、抗毒素Ｂ中和モノクローナル抗体を含む。一実施形態では、惹起される免疫応答は、抗毒素Ａ中和モノクローナル抗体および抗毒素Ｂ中和モノクローナル抗体を含み、中和モノクローナル抗体の濃度は、少なくとも１０μｇ／ｍＬである。
一実施形態では、組成物は、少なくとも９０％以上の純度を各々が有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む。一実施形態では、組成物は、約３：１〜約１：１の比でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む。一実施形態では、組成物は、１：１の比でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む。一実施形態では、組成物はアジュバントを含む。一実施形態では、組成物はアルミニウムアジュバントを含む。
一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答は、少なくとも約６０日間持続する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答は、第１の用量の後少なくとも約１８０日間持続する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答は、第２の用量の後少なくとも約１８０日間持続する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答は、第１の用量の後少なくとも約３６５日間持続する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答は、第２の用量の後少なくとも約３６５日間持続する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答は、第１の用量の後少なくとも約５４０日間持続する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答は、第２の用量の後少なくとも約５４０日間持続する。
一実施形態では、２回目の投与は、１回目の投与の少なくとも７日後であり、３回目の投与は、１回目の投与の少なくとも３０日後である。一実施形態では、３回目の投与は、１回目の投与の少なくとも３０日後である。一実施形態では、２回目の投与は、１回目の投与の少なくとも７日後であり、３回目の投与は、１回目または２回目の投与の少なくとも１８０日後である。一実施形態では、３回目の投与は、１回目の投与の少なくとも１８０日後である。一実施形態では、組成物は、少なくとも９０％以上の純度を各々が有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む。
一実施形態では、組成物は、約３：１〜約１：１の比でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む。一実施形態では、組成物は、１：１の比でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む。一実施形態では、組成物はアジュバントを含む。一実施形態では、組成物はアルミニウムアジュバントを含む。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答は、少なくとも約６０日間持続する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答は、少なくとも約１８０日間持続する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答は、少なくとも約３６５日間持続する。
一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡは、アルミニウムアジュバントに結合される。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢは、アルミニウムアジュバントに結合される。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢは、凍結乾燥される。
一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも４倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも８倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも１６倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。
一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも４倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも８倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも１６倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。
一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも４倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも８倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも１６倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。
一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも４倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも８倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも１６倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。
一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも４倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも８倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも１６倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。
一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも４倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも８倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも１６倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。
一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後に測定した場合、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後に測定した場合、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後に測定した場合、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後に測定した場合、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後に測定した場合、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後のいずれか１つで測定した場合、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。
一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後のいずれか１つで測定した場合、第３の用量を受けた後のヒトにおいて毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する。
一実施形態では、ヒトは、毒素Ｂについて血清陰性である。一実施形態では、ヒトは、毒素Ａについて血清陰性である。一実施形態では、ヒトは、毒素Ａおよび毒素Ｂについて血清陰性である。一実施形態では、ヒトは、毒素Ｂについて血清陽性である。一実施形態では、ヒトは、毒素Ａについて血清陽性である。一実施形態では、ヒトは、毒素Ａおよび毒素Ｂについて血清陽性である。
一実施形態では、トキソイドは、メチオニンが存在しない配列番号４を含むポリペプチドである。一実施形態では、トキソイドは、メチオニンが存在しない配列番号６を含むポリペプチドである。一実施形態では、トキソイドは、ホルムアルデヒド接触したクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａを含む。一実施形態では、トキソイドは、ホルムアルデヒド接触したクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂを含む。別の実施形態では、トキソイドは、ホルムアルデヒド接触したポリペプチドではない。
一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ００２由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ００３由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ００４由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０１２由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０１５由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０１７由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０２０由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０２３由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０２７由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０２９由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０４６由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０５３由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０５９由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０７０由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０７５由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０７８由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０８１由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０８７由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ１０６由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ１１７由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ１２６由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ１３１由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ１５４由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型（toxinotype）０由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型Ｉ由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型ＶＩＩＩ由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型ＩＶ由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型ＩＩＩ由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型ＸＩＩＩ由来である。一実施形態では、感染症は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型Ｖ由来である。
図１Ａ〜Ｄ：図１Ａ〜Ｂ−閾値＊を上回る対象の割合−０、１、６カ月目レジメン（評価可能免疫原性集団）。アスタリスク（＊）≧毒素Ａについて２１９中和単位／ｍＬ（図１Ａ）および毒素Ｂについて≧２５８６中和単位／ｍＬ（図１Ｂ）。血清は、月レジメン中の８および１５日目ならびに４カ月目には収集しなかった。図１Ｃおよび図１Ｄ−閾値＊を上回る対象の割合−１、８、３０日目レジメン（評価可能免疫原性集団）。アスタリスク（＊）毒素Ａについて≧２１９中和単位／ｍＬ（図１Ｃ）および毒素Ｂについて≧２５８６中和単位／ｍＬ（図１Ｄ）。血清は、月レジメン中の８および１５日目ならびに４カ月目には収集しなかった。 図２Ａ〜２Ｄ−図２Ａ〜Ｂ 幾何平均濃度−０、１、６カ月目レジメン（評価可能免疫原性集団）。点線（−−）は、毒素Ａについて２１９中和単位／ｍＬ（図２Ａ）および毒素Ｂについて２５８６中和単位／ｍＬ（図２Ｂ）を示す。血清は、月レジメン中の８および１５日目ならびに４カ月目には収集しなかった。図２Ｃ〜Ｄ 幾何平均濃度−１、８、３０日目レジメン（評価可能免疫原性集団）。点線（−−）は、毒素Ａについて２１９中和単位／ｍＬ（図２Ｃ）および毒素Ｂについて２５８６中和単位／ｍＬ（図２Ｄ）を示す。血清は、月レジメン中の８および１５日目ならびに４カ月目には収集しなかった。 図３Ａ〜Ｂ−有害事象の概要（安全性集団）。上のパネルは、０、１、６カ月目レジメンに関する（図３Ａ）。下のパネルは、１、８、３０日目レジメンに関する（図３Ｂ）。プロトコールにより特定された有害事象報告期間に留意されたい：用量３の後最大で１カ月間非重篤、用量３の後最大で６カ月間重篤（即ち、報告期間は、月レジメンについては５カ月間、より長かった）。 図４Ａ〜Ｂ−幾何平均濃度−毒素Ａ（評価可能免疫原性集団）。上のパネルは、０、１、６カ月目レジメンに関する（図４Ａ）。下のパネルは、１、８、３０日目レジメンに関する（図４Ｂ）。破線は、毒素Ａについて２１９中和単位／ｍＬを示す。血清は、月レジメン中の８および１５日目ならびに４カ月目には収集しなかった。血清は、日レジメン中の６カ月目および１８７日目には収集しなかった。 図５Ａ〜Ｂ−幾何平均濃度−毒素Ｂ（評価可能免疫原性集団）。上のパネルは、０、１、６カ月目レジメンに関する（図５Ａ）。下のパネルは、１、８、３０日目レジメンに関する。破線は、毒素Ｂについて２５８６中和単位／ｍＬを示す（図５Ｂ）。血清は、月レジメン中の８および１５日目ならびに４カ月目には収集しなかった。血清は、日レジメン中の６カ月目および１８７日目には収集しなかった。 図６Ａ〜Ｂ−ベースライン血清状態（serostatus）による幾何平均濃度−毒素Ａ（評価可能免疫原性集団）。上のパネルは、０、１、６カ月目レジメンに関する（図６Ａ）。下のパネルは、１、８、３０日目レジメンに関する（図６Ｂ）。破線は、毒素Ａについて２１９中和単位／ｍＬを示す。血清は、月レジメン中の８および１５日目ならびに４カ月目には収集しなかった。血清は、日レジメン中の６カ月目および１８７日目には収集しなかった。 図７Ａ〜Ｂ−ベースライン血清状態による幾何平均濃度−毒素Ｂ（評価可能免疫原性集団）。上のパネルは、０、１、６カ月目レジメンに関する（図７Ａ）。下のパネルは、１、８、３０日目レジメンに関する（図７Ｂ）。破線は、毒素Ｂについて２５８６中和単位／ｍＬを示す。血清は、月レジメン中の８および１５日目ならびに４カ月目には収集しなかった。血清は、日レジメン中の６カ月目および１８７日目には収集しなかった。 図８Ａ〜Ｂ−ベースライン血清状態による幾何平均濃度−（月レジメン）−毒素Ａおよび毒素Ｂ（評価可能免疫原性集団）。上のパネルは、毒素Ａに関する（図８Ａ）。破線は、毒素Ａについて２１９中和単位／ｍＬを示す。下のパネルは、毒素Ｂに関する（図８Ｂ）。破線は、毒素Ｂについて２５８６中和単位／ｍＬを示す。血清は、月レジメン中の８および１５日目ならびに４カ月目には収集しなかった。血清は、日レジメン中の６カ月目および１８７日目には収集しなかった。 図９Ａ〜Ｂ−ベースライン血清状態による幾何平均濃度−（日レジメン）−毒素Ａおよび毒素Ｂ（評価可能免疫原性集団）。上のパネルは、毒素Ａに関する（図９Ａ）。破線は、毒素Ａについて２１９中和単位／ｍＬを示す。下のパネルは、毒素Ｂに関する（図９Ｂ）。破線は、毒素Ｂについて２５８６中和単位／ｍＬを示す。血清は、月レジメン中の８および１５日目ならびに４カ月目には収集しなかった。血清は、日レジメン中の６カ月目および１８７日目には収集しなかった。
本発明者らは驚くべきことに、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による感染症を処置する、寛解させる、その危険性を低減させる、および／または感染症を予防するために使用され得る、高度に免疫原性で十分に耐容される組成物および方法を発見した。より具体的には、例えば、本発明者らは、とりわけ、３７日目（用量３の７日後）においてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルによって測定した場合、６５〜８５歳の健康な成人への３用量レジメン（１、８および３０日目）として投与される場合のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの２つの抗原用量レベル（１００μｇおよび２００μｇの総トキソイド）の免疫原性を発見した。本発明者らは、とりわけ、７カ月目（用量３の１カ月後）においてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルによって測定した場合、６５〜８５歳の健康な成人への３用量レジメン（０、１および６カ月目）として投与される場合のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの２つの抗原用量レベル（１００μｇおよび２００μｇの総トキソイド）の免疫原性もまた発見した。本発明者らは、とりわけ、ワクチン接種後の複数の時点においてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルによって測定した場合、６５〜８５歳の健康な成人への３用量レジメン（１、８および３０日目または０、１および６カ月目のいずれか）で投与される場合のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの２つの抗原用量レベル（１００μｇおよび２００μｇの総トキソイド）の免疫原性；３用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの投与の後少なくとも最大で１２カ月間にわたる、６５〜８５歳の健康な成人における免疫応答の動態学；ワクチン接種後の複数の時点においてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルによって測定した場合、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの第４の用量の免疫原性；ならびにクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの第４の用量の投与の後少なくとも最大で３６カ月間にわたる、６５〜８５歳の健康な成人における免疫応答の動態学、をさらに発見した。
例示的な組成物が提供される。例えば、任意の適切な経路（例えば、筋肉内）による１または複数回の投与（例えば、少なくとも２回、３回の投与または用量）を使用して、有効なトキソイドＡ：Ｂ比（例えば、重量で約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、３：１、３：２または１：１のいずれかのトキソイドＡ対トキソイドＢ）で、十分な純度（例えば、少なくとも約８０〜約１００％、例えば、約８０、８５、９０、９５または９０〜１００％（ｗ／ｗ）のいずれか）で有効量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびトキソイドＢ（例えば、約４０〜約５００μｇ／用量、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００μｇ／用量のいずれか、例えば、約５０〜約１００μｇ／用量（ｗ／ｗ、組成物中のトキソイドＡおよびＢの総量））を含む組成物が提供され、多重用量投与レジメンの各用量は、互いに適切に（例えば、少なくとも約１〜約１０日間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日間のいずれか、例えば約７日間）分離される。用量間の時間の長さ（時間間隔）は、個体に依存して変動することが当業者に理解され、その間隔は、以前の用量からの免疫応答が、発達する（例えば、プライミングされる）ための時間を有すると共に、引き続く用量（例えば、ブースト用量（単数または複数））によって決して阻害されないように、十分に長くあるべきである（例えば、日で測定して）。
一実施形態では、本発明のワクチン接種レジメンにおいて使用される組成物は、約４０〜約５００μｇ／用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡを含む。ある実施形態では、組成物は、約５０〜約４００μｇ／用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡを含む。一実施形態では、組成物は、約５０〜約２００μｇ／用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡを含む。一実施形態では、組成物は、約５０〜約１５０μｇ／用量を含む。一実施形態では、組成物は、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００μｇ／用量のいずれかのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡを含む。一実施形態では、組成物は、約５０μｇ／用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡを含む。別の実施形態では、組成物は、約１００μｇ／用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡを含む。
一実施形態では、本発明のワクチン接種レジメンにおいて使用される組成物は、約４０〜約５００μｇ／用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む。一実施形態では、組成物は、約５０〜約４００μｇ／用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む。一実施形態では、組成物は、約５０〜約２００μｇ／用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む。一実施形態では、組成物は、約５０〜約１５０μｇ／用量を含む。一実施形態では、組成物は、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００μｇ／用量のいずれかのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む。一実施形態では、組成物は、約５０μｇ／用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む。別の実施形態では、組成物は、約１００μｇ／用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む。
一実施形態では、本発明のワクチン接種レジメンにおいて使用される組成物は、本明細書に開示される用量で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびＢを含む。一実施形態では、トキソイドＡ対Ｂ比は、重量で３：１、３：２または１：１のトキソイドＡ対トキソイドＢである。一実施形態では、トキソイドＡ対Ｂ比は、重量で１：３、２：３または１：１のトキソイドＡ対トキソイドＢである。一実施形態では、トキソイドＡ対Ｂ比は、重量で１：１のトキソイドＡ対トキソイドＢである。
一実施形態では、本発明のワクチン接種レジメンにおいて使用される組成物は、少なくとも約８０〜約１００％の純度を有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびＢを含む。一実施形態では、本発明のワクチン接種レジメンにおいて使用される組成物は、少なくとも約９０〜約１００％の純度を有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびＢを含む。一実施形態では、本発明のワクチン接種レジメンにおいて使用される組成物は、約８０、８５、９０、９５または１００％（ｗ／ｗ）の純度を有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびＢを含む。
一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、１回投与される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、２回投与される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、３回投与される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、４回投与される。
一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、同じ用量で２回投与される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、同じ用量で３回投与される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、同じ用量で４回投与される。
一実施形態では、本発明の組成物は、任意の適切な経路によって投与される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、筋肉内、腹腔内、真皮内または皮下経路によって投与される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、皮下または筋肉内投与される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、筋肉内投与される。
本発明の一実施形態では、多重用量投与レジメンの各用量は、互いに適切に分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、２回投与され、各用量は、約１〜約１０日間互いに分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、２回投与され、各用量は、約２〜９日間互いに分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、２回投与され、各用量は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日間互いに分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、２回投与され、各用量は、約６日間互いに分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、２回投与され、各用量は、約７日間互いに分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、２回投与され、各用量は、約８日間互いに分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、２回投与され、各用量は、約１〜約４カ月間互いに分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、２回投与され、各用量は、約１、２、３または４カ月間互いに分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、２回投与され、各用量は、約１カ月間互いに分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、２回投与され、各用量は、約２カ月間互いに分離される。
一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、３回投与され、第１および第２の用量は、約１〜約１０日間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約１５〜４５日間分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、３回投与され、第１および第２の用量は、約５〜約８日間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約２０〜３５日間分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、３回投与され、第１および第２の用量は、約６〜約７日間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約２５〜３５日間分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、３回投与され、第１および第２の用量は、約７日間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約３０日間分離される。
一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、３回投与され、第１および第２の用量は、約１〜約４カ月間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約５〜１０カ月間分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、３回投与され、第１および第２の用量は、約１〜２カ月間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約５〜８カ月間分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、３回投与され、第１および第２の用量は、約１カ月間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約６カ月間分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、３回投与され、第１および第２の用量は、約１カ月間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約５カ月間分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、３回投与され、第１および第２の用量は、約１カ月間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約７カ月間分離される。
一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、４回投与され、第１および第２の用量は、約１〜約１０日間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約１５〜４５日間分離され、第４および第３の用量は、約６カ月間〜約２年間互いに分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、４回投与され、第１および第２の用量は、約５〜約８日間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約２０〜３５日間分離され、第４および第３の用量は、約１０カ月間〜約１．５年間互いに分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、４回投与され、第１および第２の用量は、約６〜約７日間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約２５〜３５日間分離され、第４および第３の用量は、約１１カ月間〜約１３カ月間互いに分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、４回投与され、第１および第２の用量は、約７日間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約３０日間分離され、第４および第３の用量は、１年間互いに分離される。
一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、４回投与され、第１および第２の用量は、約１〜約４カ月間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約５〜１０カ月間分離され、第４の用量は、第３の用量から約６カ月間〜２年間分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、４回投与され、第１および第２の用量は、約１〜２カ月間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約５〜８カ月間分離され、第４の用量は、第３の用量から約１０カ月間〜１．５年間分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、４回投与され、第１および第２の用量は、約１カ月間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約６カ月間分離され、第４の用量は、第３の用量から約１１カ月間〜１３カ月間分離される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、４回投与され、第１および第２の用量は、約１カ月間互いに分離され、第３の用量は、第１の用量から約６カ月間分離され、第４の用量は、第３の用量から約１２カ月間分離される。
一実施形態では、本明細書に開示される多用量レジメンのいずれかで与えられる組成物は、同じ用量（即ち、同じ量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはＢ）で与えられる。一実施形態では、本明細書に開示される多用量レジメンのいずれかで与えられる組成物は、同じ（即ち、同じ用量および同じ成分）で与えられる。
一実施形態では、本明細書に開示される多用量レジメンのいずれかで与えられる組成物は、異なる用量で与えられる。一実施形態では、本明細書に開示される多用量レジメンのいずれかで与えられる組成物は、同じ用量の抗原（即ち、同じ量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはＢ）で与えられるが、異なる成分（例えば、異なるアジュバント）を含み得る。
一部の実施形態では、２回目の投与は、１回目の投与（例えば、０日目）の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日後であり、３回目の投与は、１回目の投与の少なくとも約２０〜２００日（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００、例えば、約３０または約１８０日）後である。例えば、この方法は、１回目、２回目および／または３回目の投与を含み得、２回目の投与は、１回目の投与の少なくとも７日後であり、３回目の投与は、１回目または２回目の投与の少なくとも約３０日および／または少なくとも約１８０日後である。一部の実施形態では、２回目の投与は、１回目の投与の約７日後であり、３回目の投与は、１回目の投与の約３０日後である。
かかる方法を使用した宿主／対象へのかかる組成物の投与の際に、免疫応答が典型的には観察され、これは、典型的には体液性免疫応答を含み、細胞性免疫応答を含み得る。
ある特定の実施形態では、この方法は、感染症の危険性があるヒト対象に免疫原性組成物を投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、ヒト対象は、少なくとも約４０、５０、６５歳またはそれ以上のいずれかであり得る。一部の実施形態では、ヒト対象は、約４０〜約６５歳であり得る。一部の実施形態では、ヒト対象は、６５〜７５歳であり得る。したがって、組成物を投与するための方法もまた提供される。組成物を作製するための方法は、本明細書に記載され、当業者に利用可能である。
一態様では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の１つまたは複数の抗原を含む組成物を対象（例えば、ヒト）に投与することによって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対してそれを免疫化するための方法に関する。一態様では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対して対象を免疫化するための方法における使用のための、本明細書に開示される組成物に関する。一態様では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対してヒト対象を免疫化するための方法における使用のための、本明細書に開示される組成物に関する。一実施形態では、ヒト対象は、４０〜９０歳である。一実施形態では、ヒト対象は、５０〜８５歳である。一実施形態では、ヒト対象は、６０〜８５歳である。ある実施形態では、ヒト対象は、６５〜８５歳である。一実施形態では、ヒト対象は、６５〜６９歳である。ある実施形態では、ヒト対象は、７０〜７９歳である。一実施形態では、ヒト対象は、７５〜７９歳である。一実施形態では、ヒト対象は、少なくとも６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０歳である。一実施形態では、ヒト対象は、少なくとも６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４または８５歳である。
例えば、適切な組成物は、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）ありまたはなしで、約３：２のおよそのトキソイドＡ対トキソイドＢ比で、合計で約５０または約１００μｇ（または約５０〜１００μｇ）のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイド（トキソイドＡおよびトキソイドＢ）を含み得る。比較目的のために、抗原含有組成物が対象の一方の群に投与され得、プラセボ組成物（例えば、０．９％の通常の食塩水）が他方の群に（例えば、同じスケジュールで）投与され得る。免疫学的データおよび安全性データは、特定の日（例えば、１回目の投与の０、１４、３０、６０、１８０および／もしくは２１０日後、ならびに／または最大で１０００日後）に、対象から取得され得る。組成物の投与は、例えば、０日目（１回目の投与）、約７日目（２回目の投与）、約３０日目（３回目の投与）および／または約１８０日目（代替的な３回目の投与または４回目の投与）に行われ得る。
組成物は、十分な純度（例えば、約９０％以上の純度（ｗ／ｗ））で、有効なトキソイドＡ：Ｂ比（例えば、重量で約３：１、３：２または１：１のいずれかのトキソイドＡ対トキソイドＢ）で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびトキソイドＢを含み得る。例えば、組成物は、約３：２のおよそのトキソイドＡ対トキソイドＢ比で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびＢの高度に精製された（例えば、＞９０％（ｗ／ｗ））調製物を含み得る。かかる組成物は、例えば、そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に各々組み込まれる、ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１２／１４３９０２号、米国特許第９１８７５３６号およびＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１４／０６０８９８号に記載されるような、利用可能な調製方法のいずれかを使用して調製され得る。
用語「クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイド」は、部分的にまたは完全に不活性化されたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素（毒素Ａまたは毒素Ｂ）を指すために本明細書で使用される。毒素は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイによってまたは動物毒性によって測定した場合、未処理の毒素よりも低い毒性（例えば、１００％、９９％、９８％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％もしくはそれ未満の毒性またはそれらの間の任意の値）を有する場合、不活性化されている。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養物からの毒素の精製、および化学物質（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、過酸化物または酸素処理）による毒素の不活性化によって産生され得る。あるいは、野生型、または毒性を欠くもしくは低減された毒性を有する変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、組換え方法および／または代替的な化学的架橋剤を使用して産生され得る。例えば、低減された毒性を生じる遺伝子変異が作成され得る。野生型、または毒性を低減させるために特定の領域を欠く変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素もまた作製され得る。
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドまたは変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素とは、例えば、対応する野生型構造と比較して架橋を有することによって、および／またはデフォルトギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰもしくはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインされた場合に対応する野生型配列と比較して少なくとも１つの変異を有することによって、対応する野生型構造または配列とは異なる構造または配列を示す分子を指す。用語トキソイドまたは変異体毒素は、本明細書で使用する場合、対応する野生型分子とは異なる機能的特性（例えば、抑止されたグルコシルトランスフェラーゼおよび／または抑止されたシステインプロテアーゼ活性）をさらに示す。
トキソイドは、本明細書で使用する場合、そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に各々組み込まれる、ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１２／１４３９０２号、米国特許第９１８７５３６号およびＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１４／０６０８９８号に記載されるようなトキソイドまたは変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素のいずれかであり得る。即ち、トキソイドは、本明細書で使用する場合、そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に各々組み込まれる、ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１２／１４３９０２号、米国特許第９１８７５３６号およびＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１４／０６０８９８号に記載されるようなポリペプチドのいずれかであり得る。上記野生型株のいずれか由来のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、トキソイドまたは変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素が産生される供給源として使用され得る。好ましくは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドが産生される供給源である。
一実施形態では、トキソイドとは、最初のメチオニンが存在しない、配列番号１〜配列番号７６１から選択されるいずれか１つの配列を有するポリペプチドを指し、このポリペプチドは、本明細書に記載される化学的クロスリンカー、例えば、ホルムアルデヒドもしくはＥＤＣなどと接触しており、および／または遺伝子変異している。より具体的には、一実施形態では、トキソイドは、配列番号１〜８、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８〜３５、８２〜７６１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
変異は、通常その位置に位置する野生型アミノ酸残基の置換、欠失、トランケーションまたは改変を含み得る。好ましくは、変異は、非保存的アミノ酸置換である。本発明の変異体毒素は、例えば、部位特異的変異誘発、変異原（例えば、ＵＶ光）を使用する変異誘発などの、変異を調製するための当該分野で公知の技術によって調製され得る。好ましくは、部位特異的変異誘発が使用される。あるいは、目的の配列を有する核酸分子は、直接合成され得る。かかる化学的合成方法は、当該分野で公知である。
本発明では、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素と比較して、グルコシルトランスフェラーゼドメイン中に少なくとも１つの変異を含む。一実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼドメインは、少なくとも２つの変異を含む。好ましくは、変異は、対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素のグルコシルトランスフェラーゼ酵素活性と比較して、毒素のグルコシルトランスフェラーゼ酵素活性を減少させるまたは抑止する。
例示的なクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡは、対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａと比較して、２８５および２８７位にアミノ酸置換を有する配列番号２９を含むグルコシルトランスフェラーゼドメイン、ならびに１５８位にアミノ酸置換を有する配列番号３２を含むシステインプロテアーゼドメインを含む。例えば、かかる変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡは、最初のメチオニンが存在しない、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａは、配列番号８４に示されるアミノ酸配列を含む。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡのさらなる例には、最初のメチオニンが場合により存在しない、配列番号１と比較してＤ２６９Ａ、Ｒ２７２Ａ、Ｄ２８５Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ４６０Ａ、Ｒ４６２ＡおよびＣ７００Ａ変異を有する、配列番号７に示されるアミノ酸配列が含まれる。別の実施形態では、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａは、配列番号８３に示されるアミノ酸配列を含む。
例示的なクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢは、最初のメチオニンが存在しない、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａは、配列番号８６に示されるアミノ酸配列を含む。変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢのさらなる例には、配列番号８の最初のメチオニンが場合により存在しない、配列番号２と比較してＤ２７０Ａ、Ｒ２７３Ａ、Ｄ２８６Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｄ４６１Ａ、Ｋ４６３ＡおよびＣ６９８Ａ変異を有する、配列番号８に示されるアミノ酸配列が含まれる。別の実施形態では、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂは、配列番号８５に示されるアミノ酸配列を含む。
哺乳動物において免疫応答を生じさせることに加えて、本明細書に記載されるトキソイドはまた、対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素と比較して、低減された細胞毒性を有する。好ましくは、免疫原性組成物は、安全であり、哺乳動物における投与について、それぞれの野生型毒素の細胞毒性と比較して、最小限（例えば、約６〜８ ｌｏｇ１０の低減）の細胞毒性を有する〜細胞毒性を有さない。
本明細書で使用する場合、用語細胞毒性は、当該分野で理解される用語であり、アポトーシス細胞死、および／または細胞の１つもしくは複数の通常の生化学的もしくは生物学的機能が、細胞毒性剤の非存在下であるが同一の条件下の同一の細胞と比較して異常に損なわれた状態を指す。毒性は、例えば、細胞もしくは哺乳動物において、５０％の細胞死を誘導するのに必要な薬剤の量（即ち、それぞれＥＣ５０またはＥＤ５０）として、または当該分野で公知の他の方法によって、定量化され得る。
細胞球状化（rounding）アッセイなどの細胞毒性を示すためのアッセイが、当該分野で公知である。当該分野で公知のさらなる例示的な細胞毒性アッセイには、［１４Ｃ］グルコースアッセイを用いる標識されたＲａｓのホスホイメージング（phosphorimaging）に関するグルコシル化アッセイ、ならびに好ましくは、そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に各々組み込まれる、ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１２／１４３９０２号、米国特許第９１８７５３６号およびＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１４／０６０８９８号に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイが含まれ、ここで、ＥＣ５０とは、毒素の非存在下の同一の条件下の同一の細胞と比較して、細胞、好ましくは、ヒト二倍体線維芽細胞（例えば、ＩＭＲ９０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８６（商標））において少なくとも約５０％の細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す免疫原性組成物の濃度を指し得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイは、毒素の非存在下の同一の条件下の同一の細胞と比較して、細胞、好ましくは、ヒト二倍体線維芽細胞（例えば、ＩＭＲ９０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８６（商標））において野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素誘導された細胞変性効果（ＣＰＥ）の少なくとも約５０％を阻害する組成物の濃度を評価するためにも使用され得る。
一実施形態では、免疫原性組成物の細胞毒性は、対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素と比較して、少なくとも約１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、１００００倍、１１０００倍、１２０００倍、１３０００倍、１４０００倍、１５０００倍またはそれよりも大きく低減される。
別の実施形態では、免疫原性組成物の細胞毒性は、同一の条件下の対応する野生型毒素と比較して、少なくとも約２−ｌｏｇ１０、より好ましくは約３−ｌｏｇ１０、最も好ましくは約４−ｌｏｇ１０またはそれよりも大きく低減される。例えば、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢは、少なくとも約１０−１２ｇ／ｍｌのＥＣ５０値を有し得る例示的な野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと比較して、標準的な細胞変性効果（cytopathic effect）アッセイ（ＣＰＥ）において測定した場合、約１０−９ｇ／ｍｌのＥＣ５０値を有し得る。
なお別の実施形態では、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の細胞毒性は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイによって測定した場合、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌまたはそれよりも大きいＥＣ５０を有する。したがって、好ましい実施形態では、免疫原性組成物および変異体毒素は、哺乳動物への投与にとって生物学的に安全である。
一実施形態では、トキソイドは、配列番号１〜配列番号７６１から選択されるいずれか１つの配列を有するポリペプチドであり、より具体的には、トキソイドは、最初のメチオニンが存在しない、配列番号１〜８、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８〜３５、８２〜７６１のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、このポリペプチドは、本明細書に記載されるように、化学的クロスリンカー、例えば、ホルムアルデヒドまたはＥＤＣなどと接触されている。架橋（本明細書で「化学的不活性化」または「不活性化」とも呼ぶ）は、共有結合によって２つ以上の分子を化学的に連結するプロセスである。用語「架橋試薬」、「架橋剤」および「クロスリンカー」とは、ペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質上の特定の官能基（一級アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニルなど）と反応することが可能なおよび／またはそれに化学的に結合することが可能な分子を指す。一実施形態では、分子は、ペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質上の特定の官能基（一級アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニルなど）と反応することが可能なおよび／またはそれに化学的に結合することが可能な２つ以上の反応性末端を含み得る。好ましくは、化学的架橋剤は、水溶性である。別の好ましい実施形態では、化学的架橋剤は、ヘテロ二官能性クロスリンカーである。別の実施形態では、化学的架橋剤は、二官能性クロスリンカーではない。化学的架橋剤は、当該分野で公知である。
例示的な適切な化学的架橋剤には、ホルムアルデヒド；ホルマリン；アセトアルデヒド；プロピオンアルデヒド；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホナート（ＣＭＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ならびにそれらの誘導体が含まれる水溶性カルボジイミド（ＲＮ＝Ｃ＝ＮＲ’）；およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）；フェニルグリオキサール；ならびに／またはＵＤＰ−ジアルデヒドが含まれる。
好ましくは、架橋剤はＥＤＣである。変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドが、ＥＤＣによって（例えば、ポリペプチドをＥＤＣと接触させることによって）化学的に改変される場合、一実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、（ｂ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、（ｃ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基とポリペプチドのＮ末端のアミノ基との間の少なくとも１つの架橋を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、（ｄ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基とポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、（ｅ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖と第２の単離されたポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、（ｆ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖と第２の単離されたポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、（ｇ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基と第２の単離されたポリペプチドのＮ末端のアミノ基との間の少なくとも１つの架橋を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、（ｈ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基と第２の単離されたポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋を含む。
「第２の単離されたポリペプチド」とは、ＥＤＣとの反応の間に存在する任意の単離されたポリペプチドを指す。一実施形態では、第２の単離されたポリペプチドは、第１の単離されたポリペプチドと同一の配列を有する変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドである。別の実施形態では、第２の単離されたポリペプチドは、第１の単離されたポリペプチドとは異なる配列を有する変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドである。
一実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）〜（ｄ）の改変から選択される少なくとも２つの改変を含む。例示的な実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋、および（ｂ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）〜（ｄ）の改変から選択される少なくとも３つの改変を含む。なおさらなる実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の改変を含む。
１つよりも多い変異体ポリペプチドが、ＥＤＣによる化学的改変の間に存在する場合、一実施形態では、得られた組成物は、（ａ）〜（ｈ）の改変のいずれかのうち少なくとも１つを含む。一実施形態では、組成物は、（ａ）〜（ｈ）の改変から選択される少なくとも２つの改変を含む。さらなる実施形態では、組成物は、（ａ）〜（ｈ）の改変から選択される少なくとも３つの改変を含む。なおさらなる実施形態では、組成物は、（ａ）〜（ｈ）の改変から選択される少なくとも４つの改変を含む。別の実施形態では、組成物は、（ａ）〜（ｈ）の改変の各々のうち少なくとも１つを含む。
例示的な実施形態では、得られた組成物は、（ａ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋；および（ｂ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋を含む。一実施形態では、組成物は、（ｃ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基とポリペプチドのＮ末端のアミノ基との間の少なくとも１つの架橋；および（ｄ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基とポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋をさらに含む。
別の例示的な実施形態では、得られた組成物は、（ｅ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖と第２の単離されたポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋；（ｆ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖と第２の単離されたポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋；（ｇ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基と第２の単離されたポリペプチドのＮ末端のアミノ基との間の少なくとも１つの架橋；および（ｈ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基と第２の単離されたポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋を含む。
さらなる例示的な実施形態では、得られた組成物は、（ａ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋；（ｂ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋；（ｅ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖と第２の単離されたポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋；および（ｆ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖と第２の単離されたポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋を含む。
好ましい実施形態では、化学的架橋剤には、ホルムアルデヒド、より好ましくは、リジンの非存在下のホルムアルデヒドを含む薬剤が含まれる。グリシン、または一級アミンを有する他の適切な化合物が、架橋反応においてクエンチャーとして使用され得る。したがって、別の好ましい実施形態では、化学的薬剤には、ホルムアルデヒド、およびグリシンの使用が含まれる。
なお別の好ましい実施形態では、化学的架橋剤には、ＥＤＣおよびＮＨＳが含まれる。当該分野で公知のように、ＮＨＳは、ＥＤＣカップリングプロトコール中に含まれ得る。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、ＮＨＳが、対応する野生型毒素と比較して、遺伝子変異した毒素と比較して、ＥＤＣによって化学的に架橋された遺伝子変異した毒素と比較して、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の細胞毒性をさらに減少させることを促進し得ることを発見した。例えば、そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に各々組み込まれる、ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１２／１４３９０２号、米国特許第９１８７５３６号およびＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１４／０６０８９８号に記載される実施例２２を参照のこと。したがって、機構にも理論にも束縛されないが、ポリペプチドの少なくとも１つのリジン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分を有する変異体毒素ポリペプチド（例えば、変異体毒素ポリペプチド、ＥＤＣおよびＮＨＳの反応から生じる）は、例えば、ベータ−アラニン部分が存在しないクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素（野生型または変異体）と比較して、変異体毒素の細胞毒性をさらに減少させることを促進し得る。
ＥＤＣおよび／またはＮＨＳの使用は、クエンチャーとしての、グリシンまたは一級アミンを有する他の適切な化合物の使用もまた含み得る。例えば、グリシンメチルエステルおよびアラニンなどの、一級アミンを有する任意の化合物が、クエンチャーとして使用され得る。好ましい実施形態では、クエンチャー化合物は、非ポリマー性親水性一級アミンである。非ポリマー性親水性一級アミンの例には、例えば、アミノ糖、アミノアルコールおよびアミノポリオールが含まれる。非ポリマー性親水性一級アミンの具体例には、グリシン、エタノールアミン、グルカミン、アミン官能化ポリエチレングリコールおよびアミン官能化エチレングリコールオリゴマーが含まれる。一実施形態では、化学的架橋剤は、ホルムアルデヒドを含まない。一実施形態では、化学的架橋剤は、ホルマリンを含まない。
一態様では、本発明は、ＥＤＣおよび非ポリマー性親水性一級アミン、好ましくはグリシンによって化学的に改変された少なくとも１つのアミノ酸側鎖を有する変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素、即ちポリペプチドに関する。得られたグリシン付加物（例えば、ＥＤＣ、ＮＨＳで処理し、グリシンでクエンチした三重変異体毒素の反応からの）は、対応する野生型毒素と比較して、変異体毒素の細胞毒性を減少させることを促進し得る。
一実施形態では、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素、即ちポリペプチドが、ＥＤＣおよびグリシンによって化学的に改変される場合、このポリペプチドは、ポリペプチドがＥＤＣによって改変される場合の少なくとも１つの改変（例えば、上記（ａ）〜（ｈ）の改変のいずれかのうち少なくとも１つ）を含み、以下の例示的な改変のうち少なくとも１つを含む：（ｉ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基に連結されたグリシン部分；（ｊ）ポリペプチドの少なくとも１つのアスパラギン酸残基の側鎖に連結されたグリシン部分；および（ｋ）ポリペプチドの少なくとも１つのグルタミン酸残基の側鎖に連結されたグリシン部分。
一実施形態では、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡ、即ちポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸は、化学的に架橋され、および／または変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ、即ちポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸は、化学的に架橋される。本明細書に記載される変異体毒素、即ちポリペプチドのいずれかは、化学的に架橋され得る。別の実施形態では、配列番号４、配列番号６、配列番号７および／または配列番号８を有するポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸は、化学的に架橋される。一実施形態では、配列番号１〜配列番号７６１のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基は、架橋される。例えば、一実施形態では、配列番号１〜８、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８〜３５、８２〜７６１のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基は、架橋される。別の実施形態では、配列番号１８３〜配列番号７６１のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基は、上記の改変、例えば、（ａ）〜（ｋ）の改変のうちいずれか、例えば、（ａ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とポリペプチドのリジン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋を含む。
例えば、少なくとも１つのアミノ酸は、ＥＤＣなどのカルボジイミドを含む薬剤によって化学的に架橋され得る。カルボジイミドは、遊離カルボキシル基（例えば、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸の側鎖由来）とアミノ基（例えば、リジン残基の側鎖中）との間に共有結合を形成して、安定なアミド結合を形成し得る。
別の例として、少なくとも１つのアミノ酸は、ＮＨＳを含む薬剤によって化学的に架橋され得る。ＮＨＳエステルで活性化されたクロスリンカーは、一級アミン（例えば、各ポリペプチド鎖のＮ末端および／またはリジン残基の側鎖中）と反応して、アミド結合を生じ得る。
別の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、ＥＤＣおよびＮＨＳを含む薬剤によって化学的に架橋され得る。例えば、一実施形態では、本発明は、１位のメチオニン残基が場合により存在しない、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関し、このポリペプチドは、ＥＤＣおよびＮＨＳによって化学的に改変された少なくとも１つのアミノ酸側鎖を含む。別の実施形態では、本発明は、１位のメチオニン残基が場合により存在しない、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関し、このポリペプチドは、ＥＤＣおよびＮＨＳによって化学的に改変された少なくとも１つのアミノ酸側鎖を含む。なお別の実施形態では、本発明は、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８３、配列番号８５、配列番号７または配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関する。ポリペプチドは、ポリペプチドをＥＤＣおよびＮＨＳと接触させることによって改変される。
変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素、即ちポリペプチドが、ＥＤＣおよびＮＨＳによって（例えば、これらを接触させることによって）化学的に改変される場合、一実施形態では、このポリペプチドは、ポリペプチドがＥＤＣによって改変される場合の少なくとも１つの改変（例えば、上記（ａ）〜（ｈ）の改変のいずれかのうち少なくとも１つ）、および（ｌ）ポリペプチドの少なくとも１つのリジン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分を含む。
別の態様では、本発明は、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素、即ちポリペプチドに関し、このポリペプチドは、ＥＤＣ、ＮＨＳおよび非ポリマー性親水性一級アミン、好ましくはグリシンによって化学的に改変された少なくとも１つのアミノ酸側鎖を含む。一実施形態では、このポリペプチドは、ポリペプチドがＥＤＣによって改変される場合の少なくとも１つの改変（例えば、上記（ａ）〜（ｈ）の改変のいずれかのうち少なくとも１つ）、ポリペプチドがグリシンによって改変される場合の少なくとも１つの改変（例えば、上記（ｉ）〜（ｋ）の改変のいずれかのうち少なくとも１つ）、および（ｌ）ポリペプチドの少なくとも１つのリジン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分を含む。
一態様では、本発明は、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素、即ちポリペプチドに関し、このポリペプチドの少なくとも１つのリジン残基の側鎖は、ベータ−アラニン部分に連結される。一実施形態では、ポリペプチドの第２のリジン残基の側鎖は、アスパラギン酸残基の側鎖および／またはグルタミン酸残基の側鎖に連結される。ポリペプチドの「第２の」リジン残基は、ベータ−アラニン部分に連結されない、ポリペプチドのリジン残基を含む。第２のリジン残基が連結されるアスパラギン酸の側鎖および／またはグルタミン酸の側鎖は、分子内架橋を形成するためのポリペプチドの側鎖、または分子間架橋を形成するための第２のポリペプチドの側鎖であり得る。別の実施形態では、ポリペプチドの少なくとも１つのアスパラギン酸残基の側鎖および／または少なくとも１つのグルタミン酸残基の側鎖は、グリシン部分に連結される。グリシン部分に連結されるアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基はまた、リジン残基には連結されない。
別の態様では、本発明は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の少なくとも１つのアミノ酸側鎖が化学的に改変される、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素、即ちポリペプチドに関する。一実施形態では、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａの少なくとも１つのアミノ酸側鎖および／または野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂの少なくとも１つのアミノ酸側鎖は、ＥＤＣによって化学的に改変される。例えば、一実施形態では、ＴｃｄＡ（配列番号１）および／またはＴｃｄｂ（配列番号２）は、ＥＤＣによって化学的に改変される。別の実施形態では、野生型毒素は、ＥＤＣおよびＮＨＳによって化学的に改変される。一実施形態では、変異体毒素、即ちポリペプチドは、化学的に改変された野生型毒素Ａを含み、この野生型毒素Ａは、表１に記載されるいずれか１つである。別の実施形態では、変異体毒素、即ちポリペプチドは、化学的に改変された野生型毒素Ｂを含み、この野生型毒素Ｂは、表２に記載されるいずれか１つである。
Figure 2019065001
Figure 2019065001
Figure 2019065001
Figure 2019065001
化学的に架橋された変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素、即ちポリペプチドのなお別の例として、少なくとも１つのアミノ酸は、ホルムアルデヒドを含む薬剤によって化学的に架橋され得る。ホルムアルデヒドは、Ｎ末端アミノ酸残基のアミノ基、ならびにアルギニン、システイン、ヒスチジンおよびリジンの側鎖と反応し得る。ホルムアルデヒドおよびグリシンは、一級Ｎ末端アミノ基、アルギニンおよびチロシン残基に、ならびにより低い程度までアスパラギン、グルタミン、ヒスチジンおよびトリプトファン残基に結合し得るシッフ塩基付加物を形成し得る。
化学的架橋剤は、処理された毒素が、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイによってまたは動物毒性によって測定した場合、同一の条件下の未処理の毒素よりも低い毒性（例えば、約１００％、９９％、９５％、９０％、８０％、７５％、６０％、５０％、２５％または１０％低い毒性）を有する場合、毒素の細胞毒性を低減させると言われる。
好ましくは、化学的架橋剤は、化学的架橋剤の非存在下であるが同一の条件下の変異体毒素と比較して、少なくとも約２−ｌｏｇ１０の低減、より好ましくは約３−ｌｏｇ１０の低減、最も好ましくは約４−ｌｏｇ１０またはそれよりも大きく、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の細胞毒性を低減させる。野生型毒素と比較して、化学的架橋剤は、好ましくは、少なくとも約５−ｌｏｇ１０の低減、約６−ｌｏｇ１０の低減、約７−ｌｏｇ１０の低減、約８−ｌｏｇ１０の低減またはそれよりも大きく、変異体毒素の細胞毒性を低減させる。
別の好ましい実施形態では、化学的に不活性化された変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素、即ちポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイによって測定した場合、約５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌもしくはそれよりも大きい、または少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌもしくはそれよりも大きいＥＣ５０値を示す。
変異体毒素を化学的架橋剤と接触させるための反応条件は、当業者の経験の範囲内であり、これらの条件は、使用される薬剤に依存して変動し得る。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、機能的エピトープを保持し、対応する野生型毒素と比較して変異体毒素の細胞毒性を減少させつつ、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素、即ちポリペプチドを化学的架橋剤と接触させるための最適な反応条件を発見した。
好ましくは、反応条件は、変異体毒素を架橋剤と接触させるために選択され、この変異体毒素は、約０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０ｍｇ／ｍｌの最小濃度〜約３．０、２．５、２．０、１．５または１．２５ｍｇ／ｍｌの最大を有する。任意の最小値は、反応のための変異体毒素の適切な濃度の範囲を規定するために、任意の最大値と組み合わされ得る。最も好ましくは、変異体毒素は、反応のために約１．０〜１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
一実施形態では、反応で使用される薬剤は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭまたは５０ｍＭの最小濃度および約１００ｍＭ、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭまたは５０ｍＭの最大濃度を有する。任意の最小値は、反応のための化学的薬剤の適切な濃度の範囲を規定するために、任意の最大値と組み合わされ得る。
薬剤がホルムアルデヒドを含む好ましい実施形態では、使用される濃度は、好ましくは約２ｍＭ〜８０ｍＭの間の任意の濃度、最も好ましくは約４０ｍＭである。薬剤がＥＤＣを含む別の好ましい実施形態では、使用される濃度は、好ましくは、約１．３ｍＭ〜約１３ｍＭ、より好ましくは約２ｍＭ〜３ｍＭの間の任意の濃度、最も好ましくは約２．６ｍＭである。一実施形態では、ＥＤＣの濃度は、総反応体積に基づいて多くても５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、好ましくは多くても１ｇ／Ｌ、より好ましくは多くても０．５ｇ／Ｌである。
変異体毒素が化学的架橋剤と接触される例示的な反応時間は、約０．５、１、２、３、４、５、６、１２、２４、３６、４８または６０時間の最小、および約１４日間、１２日間、１０日間、７日間、５日間、３日間、２日間、１日間、または１２時間、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１時間の最大を含む。任意の最小値は、適切な反応時間の範囲を規定するために、任意の最大値と組み合わされ得る。
好ましい実施形態では、変異体毒素を化学的架橋剤と接触させるステップは、架橋剤の非存在下の同一の変異体毒素と比較して、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイにおいて、適切なヒト細胞、例えばＩＭＲ−９０細胞において、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の細胞毒性を少なくとも約１０００μｇ／ｍｌのＥＣ５０値まで低減させるのに十分な期間にわたって行われる。より好ましくは、反応ステップは、適切なヒト細胞において変異体毒素の細胞毒性を少なくとも約１０００μｇ／ｍｌのＥＣ５０値まで低減させるのに十分な期間の少なくとも２倍長い、最も好ましくは少なくとも３倍またはそれよりも長い時間にわたって実施される。一実施形態では、反応時間は、約１６８時間（即ち、７日間）を超えない。
例えば、薬剤がホルムアルデヒドを含む一実施形態では、変異体毒素は、好ましくは、約１２時間にわたって薬剤と接触され、これは、架橋剤の非存在下の同一の変異体毒素と比較して、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイにおいて、適切なヒト細胞、例えばＩＭＲ−９０細胞において、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の細胞毒性を少なくとも約１０００μｇ／ｍｌのＥＣ５０値まで低減させるのに十分な、例示的な期間であることが示された。より好ましい実施形態では、反応は、約４８時間にわたって実施され、これは、反応に十分な期間の少なくとも約３倍の長さである。かかる実施形態では、反応時間は、好ましくは、約７２時間よりも長くはない。
薬剤がＥＤＣを含む別の実施形態では、変異体毒素は、好ましくは約０．５時間、より好ましくは少なくとも約１時間、または最も好ましくは約２時間にわたって薬剤と接触される。一実施形態では、変異体毒素は、多くても約５時間、好ましくは多くても約３時間、より好ましくは多くても約２時間にわたってＥＤＣと接触される。かかる実施形態では、反応時間は、好ましくは、約６時間よりも長くはない。
変異体毒素が化学的架橋剤と接触される例示的なｐＨは、約ｐＨ５．５、６．０、６．５、７．０または７．５の最小および約ｐＨ８．５、８．０、７．５、７．０または６．５の最大を含む。任意の最小値は、適切なｐＨの範囲を規定するために、任意の最大値と組み合わされ得る。好ましくは、反応は、ｐＨ６．５〜７．５、好ましくはｐＨ７．０で行われる。
変異体毒素が化学的架橋剤と接触される例示的な温度は、約２℃、４℃、１０℃、２０℃、２５℃または３７℃の最小、および約４０℃、３７℃、３０℃、２７℃、２５℃または２０℃の最大温度を含む。任意の最小値は、適切な反応温度の範囲を規定するために、任意の最大値と組み合わされ得る。好ましくは、反応は、約２０℃〜３０℃、最も好ましくは約２５℃で行われる。
上記免疫原性組成物は、１つの変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素（ＡまたはＢ）、即ちポリペプチドを含み得る。したがって、免疫原性組成物は、調製物またはキット中の、別々のバイアル（例えば、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａを含む組成物のための別のバイアル、および変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ含む組成物のための別のバイアル）を占有し得る。これらの免疫原性組成物は、同時、逐次または別々の使用のために意図され得る。
別の実施形態では、上記免疫原性組成物は、両方の変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素（ＡおよびＢ）、即ちポリペプチドを含み得る。記載される変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂの任意の組合せが、免疫原性組成物のために組み合わされ得る。したがって、免疫原性組成物は、単一のバイアル（例えば、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡを含む組成物および変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢを含む組成物の両方を含む単一のバイアル）と組み合わされ得る。好ましくは、免疫原性組成物は、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡおよび変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ、即ちポリペプチドを含む。
例えば、一実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号４および配列番号６を含み、配列番号４および配列番号６の各々の少なくとも１つのアミノ酸は、化学的に架橋される。別の実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号４または配列番号７を含む変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ、および配列番号６または配列番号８を含む変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂを含み、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の各々の少なくとも１つのアミノ酸は、化学的に架橋される。
別の実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号４、配列番号８４および配列番号８３から選択される任意の配列、ならびに配列番号６、配列番号８６および配列番号８５から選択される任意の配列を含む。別の実施形態では、この免疫原性組成物は、配列番号８４を含み、ある免疫原性組成物は、配列番号８６を含む。別の実施形態では、この免疫原性組成物は、配列番号８３を含み、ある免疫原性組成物は、配列番号８５を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号８４、配列番号８３、配列番号８６および配列番号８５を含む。
別の実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号１〜配列番号７６１から選択されるいずれか１つの配列を有するポリペプチド、および配列番号１〜配列番号７６１から選択されるいずれか１つの配列を有する第２のポリペプチドを含み、ポリペプチドは、本明細書に記載されるような化学的クロスリンカー、例えば、ホルムアルデヒドまたはＥＤＣなどと接触されている。例えば、一実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号１〜８、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８〜３５、８２〜７６１のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド、および配列番号１〜８、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８〜３５、８２〜７６１のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含み、この第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、本明細書に記載されるような化学的クロスリンカー、例えば、ホルムアルデヒドまたはＥＤＣなどと接触されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、対象への適切な投与後に、免疫原性特性（例えば、検出可能なおよび／または中和および／または保護的免疫応答を誘導する）を示すことが好ましい。中和および／または保護的免疫応答の存在は、上記のように、および／または材料が投与されていない個体と比較して、本明細書に記載される材料が投与された個体（例えば、ヒトまたは他の動物）において、病原体（例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））による感染症が影響を受ける（例えば、減少される）ことを示すことによって、実証され得る。例えば、１つまたは複数の試験対象（例えば、ヒトまたは非ヒト）には、本明細書に記載される組成物が、任意の適切な経路およびスケジュールによって投与され得、次いで、適切な量の時間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０週間）後に、病原性生物によってチャレンジされ得る。動物（複数可）は、投与および／またはチャレンジ後に、免疫機能（例えば、抗体産生、Ｔ細胞活性）についてモニタリングされ得る。血清は、例えば、抗体ＥＬＩＳＡおよび／または病原体中和アッセイを使用して、総抗体応答について、または特定のサブタイプの発現について分析され得る。Ｔ細胞活性は、例えば、抗原による再刺激後のＩＦＮ−γ産生を測定することによって測定され得る。次いで、統計分析（例えば、フィッシャーの正確確率検定、ウィルコクソン検定、マン・ホイットニー検定）が、免疫応答に影響を与えることにおける材料の有効性のいかんを決定するために、データに対して実施され得る。
本明細書に記載されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはＢは、宿主への投与の前に、組成物を提供するために１つまたは複数の薬学的に許容できる担体と組み合わされ得る。薬学的に許容できる担体は、生物学的にも他の点でも望ましくないことのない材料である、例えば、この材料は、いずれの望ましくない生物学的影響を引き起こすことも、それが含まれる医薬組成物の他の構成成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、対象に投与され得る。担体は、当業者に周知のように、活性成分のいずれの分解も最小化するため、および対象におけるいずれの有害な副作用も最小化するために、必然的に選択される。適切な医薬担体およびそれらの製剤化は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２７４’版、Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ編、Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されており、適切であり得る。典型的には、適切な量の薬学的に許容できる塩が、製剤を等張にするために、製剤中で使用される。薬学的に許容できる担体の例には、無菌の水、食塩水、緩衝溶液、例えばリンゲル溶液、およびデキストロース溶液が含まれるがこれらに限定されない。溶液のｐＨは、一般に、約５〜約８または約７〜約７．５である。他の担体には、ポリペプチドまたはその断片を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスなどの徐放性調製物が含まれる。マトリックスは、成形物品、例えばフィルム、リポソームまたは微粒子の形態であり得る。ある特定の担体が、例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に依存してより好ましい場合があることが、当業者に明らかである。担体は、ヒトまたは他の対象への投与に適切な担体である。
上述のように、免疫学的組成物は、典型的には、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原（複数可）を含み、宿主（例えば、動物）への投与の際に、抗原（例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））に対する免疫応答を誘導または増強する組成物である。かかる応答は、保護的および／または中和であり得る、上記のような抗体の生成（例えば、Ｂ細胞の刺激を介する）またはＴ細胞ベースの応答（例えば、細胞溶解応答）を含み得る。保護的または中和免疫応答は、抗原に対応する感染性生物（例えば、抗原が由来した生物）にとって有害であり、宿主にとって（例えば、感染症を低減または予防することによって）有益である免疫応答であり得る。本明細書で使用する場合、保護的もしくは中和抗体および／または細胞性応答は、特に、有効な量および／またはスケジュールで投与した場合、本明細書に記載されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原（複数可）と反応性であり得る。これらの抗体および／または細胞性応答は、動物において試験した場合、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の重症度、時間および／または致死性を低減または阻害し得る。実施例に示すように、本明細書に記載される組成物は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答を誘導するために使用され得る。宿主への投与の際に治療的（例えば、典型的には、活動性感染症の間に投与される）および／または保護的（例えば、典型的には、活動性感染症の前または後に投与される）および／または中和免疫応答を生じる免疫学的組成物は、ワクチンとみなされ得る。
一実施形態では、組成物は、免疫応答を誘導する。好ましい実施形態では、組成物の使用は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の最初の一次エピソードの発生率を低減させる。発生率は、組成物の１回目の投与前の発生率と比較して、組成物の１回目の投与後、組成物の２回目の投与後、および／または組成物の３回目の投与後に低減され得る。別の実施形態では、組成物の使用は、反復性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の発生率を低減させる。反復性感染症の発生率は、組成物の１回目の投与後、組成物の２回目の投与後、および／または組成物の３回目の投与後に低減され得る。
別の実施形態では、組成物の使用は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の重症度を低減させる。例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症のエピソードの持続時間は、組成物の１回目の投与前の発生率と比較して、組成物の１回目の投与後、組成物の２回目の投与後、および／または組成物の３回目の投与後に低減され得る。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症のエピソードには、例えば、少なくとも３回の形を成さない便（unformed stool）を少なくとも２日間経験すること、および／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に対する抗生物質処置の必要性が含まれ得る。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症のエピソードの持続時間は、患者が、少なくとも３回以上の形を成さない便の経験なしの少なくとも２日間を有した場合、および／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に対する抗生物質処置のさらなる必要性が存在しない場合、低減されたとみなされ得る。
一部の実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による感染症を予防する、寛解させるもしくはその危険性を低減させる、および／またはかかる感染症を処置する（例えば、影響を与える）ための方法もまた提供される。対象においてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によって引き起こされるまたはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が関与する１つまたは複数の疾患状態を処置するための方法は、対象に、本明細書に記載される組成物（例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原、例えば、トキソイドＡ、トキソイドＢを含む）の少なくとも１つまたは複数の有効用量を投与するステップを含む。抗原は、約１〜約３００μｇ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、・３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０および／または３００μｇのいずれか）の投薬量で投与され得る。抗原は、同じまたは異なる投薬量で１回よりも多く投与され得る。ある特定の実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原は、同じまたは異なる適切な経路（複数可）によって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの回数、対象に投与され得る。複数の用量が投与される場合、これらの用量は、各用量中に、約同じまたは異なる型および／または量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原を含み得る。これらの用量はまた、同じまたは異なる間隔で、互いに時間的に分離され得る。例えば、これらの用量は、約６、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４もしくは９６時間、７日間、１４日間、２１日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間、７０日間、８０日間、９０日間、１００日間、１１０日間、１２０日間、１３０日間、１４０日間、１５０日間、１６０日間、１７０日間、１８０日間、１９０日間、２００日間、１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１．５年間、２年間、３年間、４年間、５年間のいずれか、またはこれらの期間のいずれかの前、その後および／もしくはそれらの間の任意の期間、分離され得る。一部の実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原は、単独で、または他の薬剤（例えば、抗生物質）と併せて投与され得る。かかる他の薬剤は、同じもしくは異なるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原と同時に（または約同時に）、または異なる時間および／もしくは頻度で投与され得る。かかる方法の他の実施形態もまた、当業者に容易に決定され得るように、適切であり得る。
任意のかかる組成物を対象（例えば、ヒト）に投与することによってそれを免疫化するための方法もまた提供される。一部の実施形態では、これらの方法は、１または複数回の投与（例えば、少なくとも３回、各用量は、互いに適切に（例えば、少なくとも約７日）分離される）を使用して、有効なトキソイドＡ：Ｂ比（例えば、重量（ｗ／ｗ）で３：１、３：２、１：１）で、十分な純度（例えば、少なくとも９０％（ｗ／ｗ））で、有効量（例えば、少なくとも約４０〜約５００、例えば、約５０〜約１００μｇ）のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびトキソイドＢ（組み合わされたｗ／ｗ）を含む免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を対象に投与するステップを含み得る。有効なトキソイドＡ：Ｂ比は、組成物中に含まれ得、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する有効な免疫応答を誘導し得る、任意の比である。
一実施形態では、この方法は、１回目、２回目および３回目の投与を含み得、２回目の投与は、１回目の投与の少なくとも７日後であり、３回目の投与は、１回目および／または２回目の投与の少なくとも約３０日および／または少なくとも約１８０日後である。
一部の実施形態では、これらの方法は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に以前に曝露されたヒトにおける既存の免疫応答を増強および／または誘導し得る（例えば、血清陽性ヒト、既往免疫応答）。
一実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内の予定外の入院を有している。別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内の高度看護施設（通常は病院からの退院後の、専門的看護およびリハビリテーション・サービスを提供する居住型施設）滞在を有している。別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内の介護施設（例えば、通常は病院からの退院後の、専門的看護およびリハビリテーション・サービスを提供する居住型施設）滞在を有している。別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内の、２回以上の救急治療室受診を有している。別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内の、１０回以上の外来患者受診（一次および／または二次医療受診であるが、薬局およびメンタルヘルス受診は除く）を有している。
別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２週間以内に、全身的抗生物質使用を投与されている。別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内に、顕著な併存症または医療制度との接触を有する。別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内の≧２晩の１回の入院患者入院を有している。別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内の≧２回の救急治療室受診を有している。別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内の≧１０回の外来患者受診を有している。別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内の高度看護施設における居住を有する。別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内の介護施設における居住を有する。別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内の、無作為化の≧３７日後に計画された≧２晩の入院患者入院を有する。別の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前の以前の１２週間以内の任意の時点において、全身的抗生物質を受けている。
ある特定の実施形態では、ヒトは、組成物の１回目の投与の前１２カ月以内に、以下の施設のうちいずれか１つにおいて働いている、またはそれと接触している：病院、高度看護施設（通常は病院からの退院後の、専門的看護およびリハビリテーション・サービスを提供する居住型施設）、介護施設（例えば、通常は病院からの退院後の、専門的看護およびリハビリテーション・サービスを提供する居住型施設）、救急治療室、および外来患者施設（一次および／または二次医療受診であるが、薬局およびメンタルヘルス受診は除く）。
ある特定の実施形態では、ヒト（複数可）は、１回目の投与前の１２カ月間の期間に、各々が少なくとも約２４、４８もしくは７２時間またはそれよりも長く持続する少なくとも１回または２回の病院滞在を有していてもよい、および／あるいは全身的（外用ではなく）抗生物質を受けている；ならびに／あるいは１回目の投与の約６０日以内に、予定された外科的手順のために入院患者入院を有すると見込まれる。一部の実施形態では、見込まれた／切迫した病院滞在／入院は、約２４、４８〜７２時間またはそれよりも長い時間にわたるように計画され得、腎臓／膀胱／泌尿器系、筋骨格系、呼吸器系、循環器系および中枢神経系のうち少なくとも１つが関与する手術のためであり得る。
これらの方法によって惹起される免疫応答は、症候性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を予防するおよび／もしくは寛解させるならびに／またはその危険性を低減させるのに十分であることが好ましい。ある特定の実施形態では、この方法は、少なくとも約４０、５０または６５、７０、７５、８０または８５歳である、症候性感染症の危険性があるヒト対象に、免疫原性組成物を投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、この方法は、約４０歳と約６５歳との間および／または約６５歳と約７５歳との間の年齢の群の各個体に、組成物を投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、この方法は、例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴＮＡによって測定した場合、１回目の投与前に血清陽性とみなされた個体の集団の約８０、８５、９０、９５または１００％のいずれかにおいて、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する抗体ベースの免疫応答の、約２倍〜４倍の増強を誘導し得る。一部の実施形態では、この方法は、１回目の投与の１４日後（例えば、０、７および３０日目における投与後）に、例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴＮＡによって測定した場合、組成物の投与前に血清陰性とみなされた個体の集団の約２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％のいずれかにおいて、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する抗体ベースの免疫応答の、約２倍〜４倍の増強を誘導し得る。一部の実施形態では、この方法は、１回目の投与の６０日後（例えば、０、７および３０日目における投与後）に、例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴＮＡによって測定した場合、組成物の投与前に血清陰性とみなされた個体の集団の約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０％のいずれかにおいて、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する抗体ベースの免疫応答の、約２倍〜４倍の増強を誘導し得る。一部の実施形態では、かかる集団中の個体は、約４０〜約６５歳である。一部の実施形態では、かかる集団中の個体は、約５０〜７５歳または約５０歳〜約６５歳である。一部の実施形態では、この増強は、１回目の投与（０日目）の約３０日後に観察され、典型的には、約７日目における２回目の投与の後に続き、典型的には、３回目の投与（例えば、約３０日目または１８０日目における）の前に観察される。一部の実施形態では、毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答は、多重レジメン投与プロトコール中の１回目、２回目および／または３回目の投与後に、最大で約３０カ月間（例えば、約１０００日間）にわたって検出可能であり得る。一部の実施形態では、０日目（１回目の投与）、約７日目（２回目の投与）および約３０日目（３回目の投与）における、ヒト対象への本明細書に記載される組成物の投与は、例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴＮＡによって、好ましくは細胞毒性アッセイによって測定した場合、最大で約３０カ月間または約１０００日間にわたって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答を増強または誘導する。一部の実施形態では、免疫応答のレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴＮＡによって、好ましくは細胞毒性アッセイによって測定した場合、３用量投与レジメンの１回目の投与後約１０００日目に、１回目の投与後約１４日目と約少なくとも同様の高さであり得る。一部の実施形態では、免疫応答のレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴＮＡによって、好ましくは細胞毒性アッセイによって測定した場合、１回目の投与後約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００および１０００日目のいずれかに、１回目の投与後約１４日目と約少なくとも同様の高さであり得る。一部の実施形態では、免疫応答は、例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴＮＡによって測定した場合、１回目の投与前のベースライン（例えば、０日目の抗毒素Ａおよび／または毒素Ｂ抗体レベル）を約２倍〜８倍上回り得る。一部の実施形態では、免疫応答は、例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴＮＡによって、好ましくは細胞毒性アッセイによって測定した場合、ベースラインを約２．５〜約６．８倍上回り得る。一部の実施形態では、血清陽性個体（例えば、非ナイーブ）における免疫応答は、毒素Ａおよび／またはＢについてＥＬＩＳＡによって測定した場合（例えば、０、７および３０日目における投与後）、約７日目に約３倍；約１４日目に約１０〜約７０倍；約３０日目に約３０〜約２００倍；および約６０日目に約１００〜約２００倍、ベースラインから増加する。一部の実施形態では、血清陽性個体（例えば、非ナイーブ）における免疫応答は、毒素Ａおよび／またはＢについてＴＮＡによって測定した場合（例えば、０、７および３０日目における投与後）、約７日目に約３倍；約１４日目に約１０〜約１００倍；約３０日目に約１５〜約１３０倍；および約６０日目に約１００〜約１３０倍、ベースラインから増加する。一部の実施形態では、血清陰性個体（例えば、ナイーブ）における免疫応答は、毒素Ａおよび／またはＢについてＥＬＩＳＡによって測定した場合（例えば、０、７および３０日目における投与後）、約１４日目に約２倍；約３０日目に約５〜約１０倍；および約６０日目に約２５〜約６０倍、ベースラインから増加する。一部の実施形態では、血清陰性個体（例えば、ナイーブ）における免疫応答は、毒素Ａおよび／またはＢについてＴＮＡによって測定した場合（例えば、０、７および３０日目における投与後）、約１４日目に約２〜約３倍；約３０日目に約２〜約５倍；および約６０日目に約５〜約４０倍、ベースラインから増加する。一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫応答は、０日目（例えば、１回目の投与前）に血清陽性または血清陰性のいずれかとみなされた個体において検出される。一部の実施形態では、かかる免疫応答は、例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴＮＡによって、好ましくは細胞毒性アッセイによって測定した場合、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび毒素Ｂの両方について検出される。かかるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原（例えば、トキソイドＡおよび／またはＢ）およびそれを含む組成物を産生するための方法（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）もまた提供される。かかる方法には、例えば、当業者に利用可能なおよび／もしくは当業者に公知の方法のいずれか、ならびに／またはそのそれぞれの全体が参照によって本明細書に各々組み込まれる、ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１２／１４３９０２号、米国特許第９１８７５３６号およびＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１４／０６０８９８号に記載される方法が含まれ得る。
本明細書で使用する場合、対象または宿主とは、個体を意味する。対象には、家畜化動物、例えば、ネコおよびイヌ、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジおよびヤギ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）および鳥類が含まれ得る。一態様では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類またはヒトである。
組成物およびワクチン
一実施形態では、組成物は免疫原性組成物である。一実施形態では、組成物は、ヒトのための免疫原性組成物である。別の実施形態では、組成物はワクチンである。「ワクチン」とは、その抗原に特異的な免疫応答を誘導する少なくとも１つのエピトープを含む抗原を含む組成物を指す。ワクチンは、皮下、経口、口腔鼻または鼻腔内の投与経路によって、対象中に直接投与され得る。好ましくは、ワクチンは、筋肉内投与される。一実施形態では、組成物は、ヒトワクチンである。一実施形態では、組成物は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫原性組成物である。
ある特定の実施形態では、組成物は、１つもしくは複数のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原、１つもしくは複数の薬学的に許容できる担体および／または１つもしくは複数のアジュバント（例えば、アルミニウム塩、エマルジョン、カチオン性リポソーム、アニオン性ポリマー、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、およびそれらの組合せ）をさらに含み得る。
一実施形態では、ワクチンであり得る組成物は、臨床現場において希釈剤で再構成され得、特定の場合には、いずれかのアジュバント（例えば、アルミニウムアジュバント、例えば、リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム、または注射用水（ＷＦＩ）と混合され得る、凍結乾燥された製剤として提供され得る。
一実施形態では、組成物は、生理学的に適切な任意の溶媒、分散媒、安定剤、希釈剤および／または緩衝液を指す、薬学的に許容できる担体を含む。例示的な安定剤には、炭水化物、例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、デキストラン、スクロース、トレハロース、ラクトースおよび／もしくはグルコース；不活性タンパク質、例えば、アルブミンおよび／もしくはカゼイン；ならびに／または他の大きい緩徐に代謝される高分子、例えば、多糖、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えば、ラテックス官能化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）アガロース、アガロース、セルロースなど）、アミノ酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）が含まれる。さらに、これらの担体は、免疫賦活剤（即ち、アジュバント）として機能し得る。
好ましくは、組成物は、トレハロースを含む。トレハロースの好ましい量（重量％）には、約１％、２％、３％または４％の最小〜約１０％、９％、８％、７％、６％または５％の最大が含まれる。任意の最小値は、適切な範囲を規定するために、任意の最大値と組み合わされ得る。一実施形態では、組成物は、例えば、０．５ｍＬ用量当たり、約３％〜６％のトレハロース、最も好ましくは、４．５％のトレハロースを含む。
適切な希釈剤の例には、蒸留水、食塩水、生理的リン酸緩衝溶液、グリセロール、アルコール（例えば、エタノール）、リンゲル溶液、デキストロース溶液、ハンクス平衡塩溶液および／または凍結乾燥賦形剤が含まれる。希釈剤は、例えば、任意の薬学的に許容できる希釈剤（例えば、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５％のスクロースおよび０．０１６％のホルムアルデヒド；１０ｍＭのクエン酸塩、４％のスクロース、０．００８％のホルムアルデヒド、０．５７％の塩化ナトリウム）であり得る。好ましい実施形態では、組成物は、１０ｍＭのトリス、４．５％のトレハロース、０．０１％のポリソルベート８０（ＰＳ８０）、ｐＨ７．４を含む。
例示的な緩衝液には、リン酸塩（例えば、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム）；酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）；コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）；グリシン；ヒスチジン；炭酸塩、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）および／または重炭酸塩（例えば、重炭酸アンモニウム）緩衝液が含まれる。好ましくは、組成物は、トリス緩衝液を含む。トリス緩衝液の好ましい量には、約１ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭの最小〜約１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ、１９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭまたは１１ｍＭの最大が含まれる。任意の最小値は、適切な範囲を規定するために、任意の最大値と組み合わされ得る。一実施形態では、組成物は、例えば、０．５ｍＬ用量当たり、約８ｍＭ〜１２ｍＭのトリス緩衝液、最も好ましくは、１０ｍＭのトリス緩衝液を含む。
別の好ましい実施形態では、組成物は、ヒスチジン緩衝液を含む。ヒスチジン緩衝液の好ましい量には、約１ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭの最小〜約１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ、１９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭまたは１１ｍＭの最大が含まれる。任意の最小値は、適切な範囲を規定するために、任意の最大値と組み合わされ得る。一実施形態では、組成物は、例えば、０．５ｍＬ用量当たり、約８ｍＭ〜１２ｍＭのヒスチジン緩衝液、最も好ましくは、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む。
なお別の好ましい実施形態では、組成物は、リン酸緩衝液を含む。リン酸緩衝液の好ましい量には、約１ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭの最小〜約１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ、１９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭまたは１１ｍＭの最大が含まれる。任意の最小値は、適切な範囲を規定するために、任意の最大値と組み合わされ得る。一実施形態では、組成物は、例えば、０．５ｍＬ用量当たり、約８ｍＭ〜１２ｍＭのリン酸緩衝液、最も好ましくは、１０ｍＭのリン酸緩衝液を含む。
緩衝液のｐＨは一般に、最適な活性材料を安定化するために選択され、公知の方法によって当業者によって確認可能であり得る。好ましくは、緩衝液のｐＨは、生理的ｐＨの範囲内である。したがって、好ましいｐＨ範囲は、約３〜約８；より好ましくは、約６．０〜約８．０；なおより好ましくは、約６．５〜約７．５；最も好ましくは、約７．０〜約７．２である。
別の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、以下に記載されるアジュバントを含み得る。好ましいアジュバントは、免疫応答の質的形態に影響を与え得る、免疫原におけるコンフォメーション変化を引き起こすことなく、免疫原に対する固有の免疫応答を増大させる。例示的なアジュバントには、３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標））（ＧＢ ２２２０２１１号（ＧＳＫ）を参照のこと）；水酸化アルミニウムゲル、例えば、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（商標）（Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｄｅｎｍａｒｋ）；免疫賦活剤、例えば、ＭＰＬまたは３−ＤＭＰ、ＱＳ−２１、ポリマー性またはモノマー性アミノ酸、例えば、ポリグルタミン酸またはポリリジンありまたはなしで使用され得る、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム）が含まれる。なお別の例示的なアジュバントは、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、ＷＯ１９９８／０４０１００号、ＷＯ２０１０／０６７２６２号を参照のこと）、またはサポニンおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチド、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、ＷＯ００／０６２８００号を参照のこと）である。好ましい実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、最も好ましくはＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）である。好ましいＣｐＧ ＯＤＮは、Ｂ細胞を優先的に活性化するＢクラスのものである。本発明の態様では、ＣｐＧ ＯＤＮは、核酸配列５’ Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ ３’（配列番号４８）を有し、＊は、ホスホロチオエート連結を示す。この配列のＣｐＧ ＯＤＮは、ＣｐＧ ２４５５５として公知であり、ＷＯ２０１０／０６７２６２号に記載されている。好ましい実施形態では、ＣｐＧ ２４５５５は、水酸化アルミニウム塩、例えばＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬと一緒に使用される。例示的なアジュバントのさらなるクラスには、サポニンアジュバント、例えば、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（トリテルペン配糖体、即ちサポニンであるＱＳ−２１、Ａｑｕｉｌａ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、Ｍａｓｓ．）またはそれから生成される粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントが含まれる。したがって、本発明の組成物は、吸着に適したサイズのミクロスフェアを形成するために、ＩＳＣＯＭ、ＣＴＢを含むＩＳＣＯＭ、リポソームの形態で、またはアクリレートもしくはポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコシド）などの化合物中にカプセル化されて、送達され得る。典型的には、用語「ＩＳＣＯＭ」とは、トリテルペノイドサポニン（特にＱｕｉｌ Ａ）などの配糖体と疎水性領域を含む抗原との間で形成される免疫原性複合体を指す。好ましい実施形態では、アジュバントはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントである。他の例示的なアジュバントには、ＲＣ−５２９、ＧＭ−ＣＳＦならびにフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）が含まれる。例示的なアジュバントのなお別のクラスは、その各々が糖残基においてアミノ酸によって置換される、Ｎ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシルウレアおよびＮ−グリコシルカルバメートを含む糖脂質アナログである。任意選択により、医薬組成物は、２つ以上の異なるアジュバントを含む。アジュバントの好ましい組合せには、例えば、以下のアジュバントのうち少なくとも２つを含む、アジュバントの任意の組合せが含まれる：ミョウバン、ＭＰＬ、ＱＳ−２１、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＣｐＧおよびＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ。アジュバントの例示的な組合せには、ＣｐＧおよびＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬの組合せが含まれる。
アジュバントは、ＷＦＩ中に、例えば、適切な濃度（例えば、約８００〜１６００μｇ／ｍＬのいずれか）のアジュバント、例えば、アルミニウムを含むアジュバント（例えば、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム）を含み得る。例えば、アジュバント（例えば、０．５７％の塩化ナトリウム中８００〜１６００ｇ／ｍＬの水酸化アルミニウム）は、凍結乾燥された製剤を再構成するための希釈剤として使用され得る。ＷＦＩは、アジュバントなしの（unadjuvanted）製剤のために、凍結乾燥されたワクチンを希釈するために使用され得る。最終投薬溶液は、例えば、組成物／ワクチン、希釈剤およびアジュバントを含み得る。
あるいは、一実施形態では、組成物は、アジュバントの非存在下で哺乳動物に投与される。即ち、組成物は、アジュバントを含まない。
一部の実施形態では、組成物は、界面活性剤を含む。それが両性、非イオン性、カチオン性またはアニオン性であれ、任意の界面活性剤が適切である。例示的な界面活性剤には、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標））、例えば、ポリソルベート２０および／またはポリソルベート８０；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（polyoxyethylene fatty ether）（ＢＲＩＪ界面活性剤として公知）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（ＢＲＩＪ ３０）；ＴＲＩＴＯＮ Ｘ １００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール；およびソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般に公知）、例えば、ソルビタントリオレエート（ＳＰＡＮ ８５）およびソルビタンモノラウレート、ならびにそれらの組合せが含まれる。好ましい界面活性剤には、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が含まれる。
ポリソルベート８０（ＰＳ−８０）は、非イオン性界面活性剤である。一実施形態では、組成物は、０．０００５％〜１％の範囲のＰＳ−８０濃度を含む。例えば、組成物中のＰＳ−８０濃度は、少なくとも０．０００５％、０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１０％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％または１．１％のＰＳ−８０であり得る。一実施形態では、組成物中のＰＳ−８０濃度は、多くても２．０％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％または０．７％のＰＳ−８０であり得る。任意の最小値は、範囲を規定するために、本明細書に記載される任意の最大値と組み合わされ得る。好ましくは、組成物は、０．０１％のＰＳ−８０を含む。
例示的な実施形態では、免疫原性組成物は、トレハロースおよびポリソルベート８０を含む。別の例示的な実施形態では、免疫原性組成物は、トリス緩衝液およびポリソルベート８０を含む。別の例示的な実施形態では、免疫原性組成物は、ヒスチジン緩衝液およびポリソルベート８０を含む。なお別の例示的な実施形態では、免疫原性組成物は、リン酸緩衝液およびポリソルベート８０を含む。
例示的な一実施形態では、免疫原性組成物は、トレハロース、トリス緩衝液およびポリソルベート８０を含む。別の例示的な実施形態では、免疫原性組成物は、トレハロース、ヒスチジン緩衝液およびポリソルベート８０を含む。なお別の例示的な実施形態では、免疫原性組成物は、トレハロース、リン酸緩衝液およびポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態では、医薬組成物は、ホルムアルデヒドをさらに含む。例えば、好ましい実施形態では、ホルムアルデヒドをさらに含む医薬組成物は、免疫原性組成物を有し、この免疫原性組成物の変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、ホルムアルデヒドを含む化学的架橋剤と接触されている。医薬組成物中に存在するホルムアルデヒドの量は、約０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１０％、０．０１３％または０．０１５％の最小から約０．０２０％、０．０１９％、０．０１８％、０．０１７％０．０１６％、０．０１５％、０．０１４％、０．０１３％、０．０１２％ ０．０１１％または０．０１０％の最大まで変動し得る。任意の最小値は、適切な範囲を規定するために、任意の最大値と組み合わされ得る。一実施形態では、医薬組成物は、約０．０１０％のホルムアルデヒドを含む。
一部の代替的な実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、ホルムアルデヒドを含まない。例えば、好ましい実施形態では、ホルムアルデヒドを含まない医薬組成物は、免疫原性組成物を有し、ここで、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の少なくとも１つのアミノ酸は、ＥＤＣを含む薬剤によって化学的に架橋される。より好ましくは、かかる実施形態では、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、ホルムアルデヒドを含む化学的架橋剤と接触されていない。別の例示的な実施形態として、凍結乾燥された形態にある医薬組成物は、ホルムアルデヒドを含まない。
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原を投与するためのキットもまた、本明細書で提供される。一実施形態では、１つまたは複数のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原は、対象への投与のためのキットの一部を形成し得る、および／またはかかるキットとして提供され得る。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原を投与するための指示書もまた、キットによって提供され得る。本明細書に記載されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原を含む組成物は、キット（例えば、ワクチンキット）中に含まれ得る。例えば、キットは、乾燥または凍結乾燥された形態で本明細書に記載される組成物を含む第１の容器、および組成物を再構成するための水溶液を含む第２の容器を含み得る。キットは、再構成された液体形態の組成物の投与のためのデバイス（例えば、皮下シリンジ、マイクロニードルアレイ）および／または使用のための指示書を任意選択により含み得る。投与のためのデバイスは、組成物を再構成するための水溶液で予め充填されて供給され得る。
研究薬物（ワクチンまたはプラセボ）の各送達される用量の体積は、約０．５ｍＬであり得る。本明細書に開示される組成物の各送達される用量の体積は、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７；０．８、０．９または１ｍＬであり得る。本明細書に開示される組成物の各送達される用量の体積は、約０．４、０．５、０．６ｍｌであり得る。本明細書に開示される組成物の各送達される用量の体積は、約０．５ｍＬであり得る。本明細書に開示される組成物の各送達される用量の体積は、約１ｍＬであり得る。製剤は、任意の適切な経路（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、真皮内、リンパ節内（intranodally）、鼻腔内、経口）によって投与され得る。
毒素中和活性
組成物をヒトに投与することによって誘導される免疫応答は、毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）、ＥＬＩＳＡ、またはより好ましくは細胞毒性アッセイ、例えば、そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に各々組み込まれる、ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１２／１４３９０２号、米国特許第９１８７５３６号およびＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１４／０６０８９８号に記載されるアッセイを使用して決定され得る。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイは、薬物物質材料における任意の潜在的な残留細胞毒性の試験のために開発された重要な安全性アッセイである。トキソイドＡにおける任意の潜在的な残留細胞毒性の測定は、ＩＭＲ−９０細胞ベースのアッセイを使用して達成される。野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａは、強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示し、少量の毒素が、哺乳動物細胞に対する種々の効果、例えば、細胞球状化（細胞変性効果（cytopathic effect）即ちＣＰＥ）、および代謝活性の欠如（ＡＴＰレベルによって測定される）を引き起こすのに十分である。ＣＰＥアッセイは、３７℃で５００ｍｃｇ／ｍＬで、トキソイド材料を培養物中のＩＭＲ９０細胞と共にインキュベートし、２４時間後に細胞球状化について評価することによって実施される。ＣＰＥアッセイは、熟練した分析者によるＣＰＥの主観的な視覚的評価を必要とし、したがって、容易には検証できない。細胞毒性放出アッセイは、トキソイドＡまたは野生型毒素のいずれかによる処理後の代謝的に活性な細胞の数と比例する、ＡＴＰから生成された発光シグナルの量の測定に基づいて開発されている。これらの結果は、相対発光量で測定されるＡＴＰレベルにおける５０％の低減を引き起こす毒素またはトキソイドの量として定義されるＥＣ５０として表される。トキソイドは、１００ｍｃｇ／ｍＬの濃度で試験される。この方法は、代替的な細胞変性効果（ＣＰＥ）アッセイよりも、ロバストで客観的であり、ＧＭＰ試験に適切であるので、放出および安定性（限定された時点）試験のために選択された。細胞毒性アッセイは、トキソイドに対してのみ実行されるが、それは、これが、マトリックス干渉なしに、薬物産物材料と比較してより高い濃度で試験できるからである。これは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン産生サイクルの間の最も濃縮された段階において測定がなされることを確実にする。さらに、安定性についての細胞毒性アッセイが、毒性への任意の潜在的な復帰をモニタリングするために実施される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイは、薬物物質材料における任意の潜在的な残留細胞毒性の試験のために開発された重要な安全性アッセイである。トキソイドＢにおける任意の潜在的な残留細胞毒性の測定は、ＩＭＲ−９０細胞ベースのアッセイを使用して達成される。野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂは、強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示し、少量の毒素が、哺乳動物細胞に対する種々の効果、例えば、細胞球状化（細胞変性効果（cytopathic effect）即ちＣＰＥ）、および代謝活性の欠如（ＡＴＰレベルによって測定される）を引き起こすのに十分である。ＣＰＥアッセイは、３７℃で５００ｍｃｇ／ｍＬで、ＤＳ材料を培養物中のＩＭＲ９０細胞と共にインキュベートし、２４時間後に細胞球状化について評価することによって実施される。ＣＰＥアッセイは、熟練した分析者によるＣＰＥの主観的な視覚的評価を必要とし、したがって、容易には検証できない。細胞毒性放出アッセイは、トキソイドＢまたは野生型毒素Ｂのいずれかによる処理後の代謝的に活性な細胞の数と比例する、ＡＴＰから生成された発光シグナルの量の測定に基づいて開発されている。これらの結果は、相対発光量で測定されるＡＴＰレベルにおける５０％の低減を引き起こす毒素またはトキソイドの量として定義されるＥＣ５０として表される。このアッセイにおいて元々試験されたトキソイドの最大濃度は、２００ｍｃｇ／ｍＬであった。しかし、経時的なこの方法の性能は、わずか１００ｍｃｇ／ｍＬの上の濃度が一貫して支持され得ることを示唆した。この方法は、代替的なＣＰＥアッセイよりも、ロバストで客観的であり、ＧＭＰ試験に適切であるので、放出および安定性（限定された時点）試験のために選択された。細胞毒性アッセイは、トキソイドＢ薬物物質材料に対してのみ実行されるが、それは、これが、マトリックス干渉なしに、薬物産物材料と比較してより高い濃度で試験できるからである。これは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン産生サイクルの間の最も濃縮された段階において測定がなされることを確実にする。さらに、安定性についての細胞毒性アッセイが、毒性への任意の潜在的な復帰をモニタリングするために実施される。
臨床的使用のための５０％中和力価アッセイに資格を与え、アッセイにさらなるロバスト性を提供し、臨床開発における一貫した長期性能を保証するために、参照標準および適切な対照をアッセイに追加し、それによって、参照標準によって規定される中和単位／ｍＬとしての中和力価の読み出しを可能にした。本研究の分析の前に、ワクチン接種したヒト由来の血清サンプルを使用して、中和アッセイを実施した場合の５０％中和力価と中和単位／ｍＬとの間の直線関係を実証した。これらの相関研究に基づいて、「保護的」中和閾値値を計算し、この研究において臨床データを分析するために使用した。
一実施形態では、ＴＮＡは、発光読み出しに基づく、自動化された高感度アッセイである。試験サンプルの中和力価は、参照標準に基づいて計算される。一実施形態では、ＴｘｄＡについてのアッセイＬＬＯＱは、１５８．０Ｕ／ｍｌであり、Ｔｘｄ Ｂ＝２４９．５Ｕ／ｍｌである。好ましくは、ＴＮＡ。
免疫原性分析のために、抗毒素Ａ中和抗体応答および抗毒素Ｂ中和抗体応答についての「保護的」閾値は、それぞれ、２１９および２５８６中和単位／ｍＬであった。研究Ｂ５０９１００９のための免疫原性エンドポイントのいくつかを、これらの「保護的」閾値に基づいて評価した。
本明細書で使用する場合、明示的に特記しない限り、「特定された閾値」値は、毒素Ａについて２１９中和単位／ｍＬおよび毒素Ｂについて２５８６中和単位／ｍＬとして規定される。
一実施形態では、ヒトにおいて誘導される免疫応答は、組成物のトキソイドＡに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する毒素Ａを発現するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株に対して中和性である。
別の実施形態では、ヒトにおいて誘導される免疫応答は、組成物のトキソイドＢに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む毒素Ｂを発現するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株に対して中和性である。
本明細書に記載される材料（例えば、組成物）および／または方法のいずれかの有用性（例えば、免疫原性）は、当業者に公知の種々の方法のいずれかによってアッセイされ得る。本明細書に記載されるアッセイのうちいずれか１つもしくは複数、または任意の他の１つもしくは複数の適切なアッセイが、意図した目的のために、本明細書に記載される材料のいずれかの適合性を決定するために使用され得る。これらの方法は、例示的かつ非限定的であることを理解すべきである。他のアッセイもまた適切であり得る。例えば、本明細書に記載される組成物は、典型的には、対象への投与の際に、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する抗体の産生を誘導および／または増強する。かかる抗体は、当業者に利用可能な方法のいずれかを使用して、対象において検出され得る。例えば、実施例のセクションに記載されるように、血清は、対象から取得され得、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）抗体を検出するためにＥＬＩＳＡによって試験され得る（例えば、「一次免疫原性データ」）。試験血清中に存在する抗体は、マイクロタイタープレートの個々のウェルに吸着された毒素ＡまたはＢ抗原と反応し得る。抗原コーティングしたウェルに結合した抗体の量は、二次抗ＩｇＧ（例えば、抗ヒトＩｇＧ）抗体−酵素コンジュゲートの結合後に比色基質反応を使用して決定され得る。次いで、抗原に結合した抗体に正比例した比色変化を引き起こす酵素の基質が、典型的には添加される。血清中の抗体の濃度は、規定されたＩｇＧ単位（ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）／ｍＬ））で、参照標準血清の複数の希釈から生成された検量線からの外挿によって導出され得る。毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に対する中和抗体を定量化するためにも使用され得る。このアッセイでは、段階希釈された血清は、固定量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡまたはＢと共にインキュベートされ得る。次いで、試験細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞）が添加され得、血清−毒素−細胞混合物が、適切な条件下でインキュベートされ得る（例えば、３７℃で６日間）。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の細胞毒性効果を中和する血清の能力は、細胞の生存度によって決定され得、それと相関し得る。アッセイは、正常細胞の呼吸の指標として、密封培養ウェル中の酸代謝物の蓄積を利用する。毒素に曝露された細胞では、代謝およびＣＯ２産生が低減され、結果として、細胞培養培地中のフェノールレッドｐＨ指示薬によって示されるように、ｐＨが上昇する（例えば、７．４以上まで）。このｐＨでは、培地は赤色に見える。しかし、細胞対照、または抗体によって中和された毒素に曝露された細胞は、正常な量でＣＯ２を代謝および産生し、結果として、ｐＨは維持され（例えば、７．０以下で）、このｐＨで、培地は黄色に見える。したがって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素中和抗体は、ある特定のｐＨ（例えば、７．０以下の）を維持するそれらの能力によって明らかなように、細胞に対するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の代謝効果を中和する血清の能力と相関する。培地の色変化は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素媒介性細胞毒性の５０％阻害において抗毒素中和抗体力価をさらに計算するために、プレートリーダーを使用して（例えば、５６２ｎｍ〜６３０ｎｍ）で測定され得る。一実施形態では、組成物は、毒素中和アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、ある用量を受ける前のヒトにおける毒素中和抗体力価よりも、その用量の組成物を受けた後のヒトにおいて、少なくとも１倍よりも高い、例えば、少なくとも１．０１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、３２倍またはそれよりも高いなどの毒素中和抗体力価を誘導する。
力価
一実施形態では、組成物は、例えば、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、ある用量の組成物の投与前のヒトにおける毒素中和抗体力価と比較して、ヒトにおいて毒素中和抗体力価における増加を誘導する。一実施形態では、毒素中和力価における増加は、例えば、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、組成物の第１の用量の投与前のヒトにおける毒素中和力価と比較されるように、組成物の第１の用量の投与前のヒトにおける毒素中和力価と比較される。別の実施形態では、力価における増加は、例えば、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、組成物の第１の用量の投与前のヒトにおける毒素中和力価と比較して、組成物の第２の用量の後に観察される。別の実施形態では、毒素中和力価における増加は、例えば、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、組成物の第１の用量の投与前のヒトにおける毒素中和力価と比較して、組成物の第３の用量の後に観察される。別の実施形態では、力価における増加は、例えば、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、組成物の第２の用量の投与前のヒトにおける毒素中和力価と比較して、組成物の第２の用量の後に観察される。別の実施形態では、毒素中和力価における増加は、例えば、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、組成物の第３の用量の投与前のヒトにおける毒素中和力価と比較して、組成物の第３の用量の後に観察される。
一実施形態では、組成物は、ある用量の投与後にヒトにおいて毒素中和力価を誘導し、この毒素中和力価は、例えば、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、その用量の投与前のヒトにおける毒素中和力価よりも、少なくとも１倍よりも大きく高い。例えば、毒素中和力価は、例えば、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、ある用量の投与前のヒトにおける毒素中和力価と比較して、その用量の組成物を受けた後のヒトにおいて、少なくとも１．０１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、３２倍または６４倍高くてもよい。
一実施形態では、「応答者」とは、組成物がある用量の投与後にヒトにおいて毒素中和力価を誘導するヒトを指し、この毒素中和力価は、その用量の投与前のヒトにおける毒素中和力価よりも、少なくとも１倍よりも大きく高い。好ましい実施形態では、応答者は、その用量の投与前のヒトにおける毒素中和力価と比較して、毒素中和力価における少なくとも≧４倍の上昇を達成する。かかる応答者は、保護的力価を有すると言われ得る。
一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素中和力価よりも少なくとも２倍高い（例えば、第１の用量の非存在下のヒトにおける毒素中和力価よりも高い）毒素中和力価を、第１の用量を受けた後のヒトにおいて誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素中和力価よりも少なくとも４倍高い毒素中和力価を、ヒトにおいて誘導する。一実施形態では、組成物は、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素中和力価よりも少なくとも８倍高い毒素中和力価を、ヒトにおいて誘導する。
一実施形態では、ヒトは、例えば、組成物の第１の用量の投与後に、細胞毒性アッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）と等しいまたはそれよりも高い毒素中和力価を有する。別の実施形態では、ヒトは、例えば、組成物の第２の用量の投与後に、細胞毒性アッセイのＬＬＯＱと等しいまたはそれよりも高い細胞毒性アッセイ力価を有する。別の実施形態では、ヒトは、例えば、組成物の第３の用量の投与後に、細胞毒性アッセイのＬＬＯＱと等しいまたはそれよりも高い毒素中和力価を有する。
方法および投与
一態様では、本発明は、ヒトにおいてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答を誘導する方法に関する。別の態様では、本発明は、ヒトをワクチン接種する方法に関する。一実施形態では、この方法は、上記組成物の少なくとも１つの用量をヒトに投与するステップを含む。好ましい実施形態では、この方法は、上記組成物の多くても１つの用量をヒトに投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、上記組成物の少なくとも第１の用量および第２の用量をヒトに投与するステップを含む。
一実施形態では、第２の用量は、第１の用量の少なくとも２０、３０、５０、６０、１００、１２０、１６０、１７０または１８０日後、および第１の用量の多くても２５０、２１０、２００または１９０日後に投与される。任意の最小値は、範囲を規定するために、本明細書に記載される任意の最大値と組み合わされ得る。
別の実施形態では、第２の用量は、第１の用量の約３０日後に投与される。別の実施形態では、第２の用量は、第１の用量の約６０日後に、例えば、０、２カ月の免疫化スケジュールなどで投与される。別の実施形態では、第２の用量は、第１の用量の約１８０日後に、例えば、０、６カ月の免疫化スケジュールなどで投与される。なお別の実施形態では、第２の用量は、第１の用量の約１２０日後に、例えば、２、６カ月の免疫化スケジュールなどで投与される。
一実施形態では、この方法は、組成物の２つの用量、多くても２つの用量をヒトに投与するステップを含む。一実施形態では、これら２つの用量は、第１の用量の後約６カ月間の期間内に投与される。一実施形態では、この方法は、ヒトへのブースターのさらなる投与を含まない。「ブースター」とは、本明細書で使用する場合、ヒトへの組成物のさらなる投与を指す。組成物の多くても２つの用量をヒトに投与することは、有益であり得る。かかる利点には、例えば、ヒトが完全な投与スケジュールに従うのを促進すること、およびスケジュールの費用対効果を促進することが含まれる。
一実施形態では、第１の用量および第２の用量は、第１の用量の後、約５日間、７日間、１４日間、２１、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００日間、および多くても４００、３９０、３８０、３７０、３６５、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０または２００日間の期間にわたって、ヒトに投与される。一実施形態では、第２の用量は、第１の用量の投与の少なくとも８、１４、２１、２５または３０日後、および多くても１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５または３０日後に、ヒトに投与される。例えば、一実施形態では、第２の用量は、第１の用量の投与の少なくとも２１日後、および多くても４０日後に、ヒトに投与される。任意の最小値は、範囲を規定するために、本明細書に記載される任意の最大値と組み合わされ得る。好ましくは、第１の用量および第２の用量は、約８日間の期間にわたってヒトに投与される。より好ましくは、第１の用量および第２の用量は、約３０日間の期間にわたってヒトに投与される。最も好ましくは、第１の用量および第２の用量は、少なくとも約３０日間の期間にわたってヒトに投与される。
一実施形態では、第１の用量および第２の用量は、約３０日間の期間にわたってヒトに投与される。別の実施形態では、第１の用量および第２の用量は、約６０日間の期間にわたってヒトに投与される。別の実施形態では、第１の用量および第２の用量は、約１８０日間の期間にわたってヒトに投与される。
一実施形態では、第１の用量および第２の用量は、多くても３０日間の期間にわたってヒトに投与される。別の実施形態では、第１の用量および第２の用量は、多くても６０日間の期間にわたってヒトに投与される。別の実施形態では、第１の用量および第２の用量は、多くても１８０日間の期間にわたってヒトに投与される。
用量
一実施形態では、この方法は、組成物の３つの用量をヒトに投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、組成物の多くても３つの用量を投与するステップを含む。一実施形態では、これら３つの用量は、第１の用量の後約６カ月間の期間内に投与される。一実施形態では、この方法は、第３の用量の後のヒトへのブースター用量の投与を含む。別の実施形態では、この方法は、第３の用量の後のヒトへのブースター用量の投与を含まない。別の実施形態では、この方法は、組成物の第４のまたはブースター用量をヒトに投与するステップをさらには含まない。さらなる実施形態では、約６カ月間の期間内に多くても３つの用量がヒトに投与される。
例示的な実施形態では、第２の用量は、第１の用量の約３０日後に投与され、第３の用量は、第２の用量の約１５０〜１８０日後に、例えば、０、１、６カ月の免疫化スケジュールなどで投与される。別の例示的な実施形態では、第２の用量は、第１の用量の約６０日後に投与され、第３の用量は、第２の用量の約１２０日後に、例えば、０、２、６カ月の免疫化スケジュールなどで投与される。
一実施形態では、第１の用量、第２の用量および第３の用量は、約１５０、１６０、１７０または１８０日間、および多くても２４０、２１０、２００または１９０日間の期間にわたってヒトに投与される。任意の最小値は、範囲を規定するために、本明細書に記載される任意の最大値と組み合わされ得る。好ましくは、第１の用量、第２の用量および第３の用量は、約１８０日、即ち６カ月間の期間にわたってヒトに投与される。例えば、第２の用量は、第１の用量の約６０日後にヒトに投与され得、第３の用量は、第２の用量の約１２０日後にヒトに投与され得る。したがって、投与の例示的なスケジュールは、約０、２および６カ月目に、ヒトにある用量を投与することを含む。
上記のように、免疫原性組成物の複数の用量がヒトに投与され得、各用量間の日数は変動し得る。この方法の利点は、例えば、ヒトが投与スケジュールに従う柔軟性を含む。
一実施形態では、この方法は、同一の免疫原性組成物の多くても３つの用量をヒトに投与するステップを含む。例えば、好ましい実施形態では、この方法は、第１の組成物の第１の用量をヒトに投与するステップ、第２の組成物の第２の用量をヒトに投与するステップ、および第３の組成物の第３の用量をヒトに投与するステップを含まず、この第１、第２および第３の組成物は同一ではない。別の実施形態では、この方法は、同一の免疫原性組成物の多くても４つの用量をヒトに投与するステップを含む。
以下の実施例は、本発明の実施形態を例示する。本明細書で特記しない限り、そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に各々組み込まれる、ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１２／１４３９０２号、米国特許第９１８７５３６号およびＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１４／０６０８９８号の実施例２１に記載されるように、残留細胞毒性を排除するために１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によってさらに化学的に不活性化されているが、天然の抗原性構造を保持し、中和抗体応答を生成する、遺伝子改変されたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ、即ちポリペプチド（最初のメチオニンが存在しない配列番号４を含む）および遺伝子改変されたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢ、即ちポリペプチド（最初のメチオニンが存在しない配列番号６を含む）の混合物を含むワクチン候補または免疫原性組成物に対する言及が、以下の実施例においてなされる。簡潔に述べると、精製後、遺伝子変異体毒素（配列番号４および配列番号６）を、１ｍｇの精製された遺伝子変異体毒素ＡおよびＢ当たり、０．５ｍｇのＥＤＣおよび０．５ｍｇのＮＨＳ（それぞれ、およそ２．６ｍＭおよび４．４ｍＭ）を使用して２５℃で２時間にわたって不活性化する。反応を、１００ｍＭの最終濃度までグリシンを添加することによってクエンチし、反応を、２５℃でさらに２時間インキュベートする。不活性化を、１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液中でｐＨ７．０±０．５で実施する。不活性化期間を、ＩＭＲ９０細胞におけるＥＣ５０の、１０００ｕｇ／ｍＬよりも大きい値までの低減に必要な期間の３倍を超えるように設定する。２時間後、生物学的活性は、天然の毒素と比較して、７〜８ ｌｏｇ１０低減される。４時間のインキュベーション後、不活性化された変異体毒素を、ダイアフィルトレーションによって最終薬物物質緩衝液に交換する。例えば、１００ｋＤの再生酢酸セルロース限外濾過カセットを使用して、不活性化された毒素を、１〜２ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、緩衝液交換する。より具体的には、ワクチン組成物は、（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドであって、配列番号４の１位のメチオニン残基が存在せず、第１のポリペプチドのリジン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に架橋され、第１のポリペプチドが、第１のポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とグリシン部分との間の架橋、および第１のポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とグリシン部分との間の架橋をさらに含む、第１のポリペプチド；および（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドであって、配列番号６の１位のメチオニン残基が存在せず、第２のポリペプチドのリジン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に架橋され、第２のポリペプチドが、第２のポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とグリシン部分との間の架橋、および第２のポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とグリシン部分との間の架橋をさらに含む、第２のポリペプチド、を含む。
調査クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンは、等量の２つのトキソイド（ＡおよびＢ）から構成される。ワクチンを、１用量当たり組み合わせたトキソイドＡおよびＢの１００μｇおよび２００μｇの投薬強度で、無菌の凍結乾燥された粉末として提供した。ワクチンを、凍結乾燥されたワクチンを使用の直前に水酸化アルミニウム希釈剤で再懸濁することによって、注射のために調製した。水酸化アルミニウム希釈剤を、１ｍｇアルミニウム／ｍＬ（水酸化アルミニウムとして）液体懸濁物として供給した。
前臨床実験では、ワクチン候補を、単独で、またはアジュバントと組み合わせてのいずれかで研究した。ハムスターモデルでは、全てのワクチン製剤が、免疫化されたハムスターにおいて、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）芽胞による致死チャレンジからの少なくとも９０％の保護を提供する延命効果を実証した。非ヒト霊長類では、試験した全てのトキソイドワクチン製剤が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよびクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂの両方に対するロバストな中和抗毒素抗体応答を誘導した。
（実施例１）
第１相、ファースト・イン・ヒューマン研究、０、１および６カ月目における３用量レジメン（Ｂ５０９１００１）
例示的なクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン候補を、５０〜８５歳の１９２人の健康な成人が登録された、米国で実施したファースト・イン・ヒューマン（ＦＩＨ）Ｂ５０９１００１第１相研究において評価した。これは、０、１および６カ月目における３用量レジメンとして投与されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの安全性、忍容性および免疫原性を評価するための用量漸増、プラセボ対照、無作為化、観察者盲検研究であった。３つの抗原用量レベル（５０、１００および２００μｇ）のワクチン候補を、単独で、または水酸化アルミニウムと組み合わせてのいずれかで評価した。
安全性の分析により、両方の製剤および３つ全ての用量レベルが、一般に十分に耐容されたことが実証された。局所的反応は、優勢に軽度または中程度であり、ほとんどが注射部位疼痛から構成された。実際の重症のまたはグレード４の局所的反応は、報告されなかった。６５〜８５歳コホートでは、２００μｇの用量レベルにおいて、局所的反応は、水酸化アルミニウム含有用量群と比較して、トキソイド単独においてより頻繁に生じる傾向があった。３つ全ての用量の後、局所的反応の頻度および重症度は、用量群のいずれについても、用量レベルまたは用量の数の増加に伴って増加しなかった。全身的事象は、優勢に軽度〜中程度であり、ほとんどが頭痛および疲労を含んだ。用量群のいずれについても、用量レベルまたは用量の数の増加に伴う、全身的事象の頻度の増加の証拠は存在しなかった。
免疫原性の分析により、用量１の後に限定的な抗体応答が実証されたが、用量２の後には、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に対する抗体力価における顕著な増加が存在し、これは一般に、用量２の７日後に最大であり、用量２の１カ月後に安定であった。用量３の７日後、実質的なブースター応答が明らかであり、これは、用量３の１カ月後に再び、僅かにより顕著であった。全体として、ロバストな抗毒素中和応答は、両方の製剤によって惹起されたが、トキソイド単独製剤のレシピエントにおいてより高い応答の傾向があった。例えば、６５〜８５歳コホートにおける用量３の１カ月後、毒素Ａ特異的中和抗体力価におけるベースライン（用量１の前）からの幾何平均上昇倍率（ＧＭＦＲ）は、トキソイド単独用量群において１３１〜２５４の範囲であり、水酸化アルミニウム含有用量群において４２〜８０の範囲であった。毒素Ｂ特異的中和抗体力価についての対応する範囲は、それぞれ、２９５３〜４９２２および１３６〜４８４であった。
アカゲザルにおいて生成された前臨床データは、０、２および４週目において水酸化アルミニウムありまたはなしで投与されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの３用量レジメンの使用を支持している。さらに、ウサギ毒性学研究では、１、８、２２および３６日目に与えられる４用量レジメンのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン（最大で４００μｇの用量レベル）は、有害な毒性学的知見を実証せず、抗毒素Ａ中和抗体力価および抗毒素Ｂ中和抗体力価における増加を生じ、これは、動物による、投与された免疫原に対する予測された免疫性応答を確認する。
これらの前臨床および毒性学データ、ならびにＢ５０９１００１第１相研究において３つの用量の後に観察された有望な免疫応答は、第２相研究Ｂ５０９１００３を支持した。
（実施例２）
第２相研究、１、８および３０日目における３用量レジメン（Ｂ５０９１００３）
第２相研究Ｂ５０９１００３を、５０〜８５歳の健康な成人において１、８および３０日目に投与される３用量レジメンにおける１００および２００μｇの抗原用量レベル（トキソイドＡおよびＢについての合計）のトキソイド単独クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの安全性、忍容性および免疫原性を評価するために設計した。
研究Ｂ５０９１００３におけるワクチン接種は、注射部位の紅斑の発生後に停止させた。これらの対象では、付随する重症の全身的症状は存在せず、発赤が彼らの毎日の活動に影響を与えたという報告は存在せず、全ての局所的反応は完全に解決された。トキソイド単独製剤で観察された局所的反応源性は、惹起された免疫応答と相互作用する遊離トキソイドに起因していた可能性がある。
（実施例３）
第２相研究、１、８および３０日目（日レジメン）または０、１および６カ月目（月レジメン）における３用量レジメン（Ｂ５０９１００９）
アルミニウム上への吸着は、ワクチン成分を結合し、注射部位からワクチン成分を緩徐に放出することが示されている。さらに、ＣＤＩに対する免疫応答の迅速な誘導およびＣＤＩに対する保護の延長された持続時間が、潜在的に必要とされる。したがって、研究Ｂ５０９１００９は、２つの異なる投薬レジメン：１、８および３０日目または０、１および６カ月目での、ＦＩＨ Ｂ５０９１００１研究から選択される水酸化アルミニウム含有ワクチンの２つの抗原用量レベル（即ち、１００μｇおよび２００μｇの総トキソイド）の安全性、忍容性および免疫原性を評価した。
一次免疫原性エンドポイントを、各クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチントキソイドについて、特定された閾値推定よりも高いまたはそれと等しい毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルを誘導するワクチンの能力に基づいて評価した。これらの特定された閾値は、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する２つのｍＡｂの受動的投与がＣＤＩに対する保護と関連したことを実証する第２相有効性研究から導出した。反復性ＣＤＩに対する抗毒素ｍＡｂの有効性を示すことに加えて、第２相有効性研究は、１０μｇ／ｍＬの閾値（「保護的」閾値レベル）を上回る抗毒素Ａ中和ｍＡｂレベルおよび抗毒素Ｂ中和ｍＡｂレベルが、ＣＤＩ再発に対する保護と関連したこともまた示唆した。
第２相有効性研究からの毒素Ａおよび毒素Ｂの「保護的」閾値を、ワクチン候補によって惹起される５０％中和力価に変換するために、（１）同じ細胞毒性アッセイを使用して毒素中和を測定した、および（２）毒素の５０％を中和する阻害ｍＡｂ濃度（ＩＣ５０［５０％阻害濃度］）が公開されていること（毒素Ａ ｍＡｂおよび毒素Ｂ ｍＡｂについてのＩＣ５０値は、それぞれ、１００ｎｇ／ｍＬおよび１５ｎｇ／ｍＬである）、という見解を利用した。したがって、各抗毒素抗体についての「保護的」５０％中和力価は、それぞれのｍＡｂ ＩＣ５０によって除算した、１０μｇ／ｍＬの保護的閾値における抗体濃度であると計算される。
臨床的使用のための５０％中和力価アッセイに資格を与え、アッセイにさらなるロバスト性を提供し、臨床開発における一貫した長期性能を保証するために、参照標準および適切な対照をアッセイに追加し、それによって、参照標準によって規定される中和単位／ｍＬとしての中和力価の読み出しを可能にした。本研究の分析の前に、ワクチン接種したヒト由来の血清サンプルを使用して、中和アッセイを実施した場合の５０％中和力価と中和単位／ｍＬとの間の直線関係を実証した。これらの相関研究に基づいて、「保護的」中和閾値値を計算し、この研究において臨床データを分析するために使用した。
免疫原性分析のために、抗毒素Ａ中和抗体応答および抗毒素Ｂ中和抗体応答についての「保護的」閾値は、それぞれ、２１９および２５８６中和単位／ｍＬであった。研究Ｂ５０９１００９のための免疫原性エンドポイントのいくつかを、これらの「保護的」閾値に基づいて評価した。
本明細書で使用する場合、明示的に特記しない限り、「特定された閾値」値は、毒素Ａについて２１９中和単位／ｍＬおよび毒素Ｂについて２５８６中和単位／ｍＬとして規定される。
ワクチン接種した対象にＣＤＩに対する延長された保護を提供することは重要であり、ワクチン接種のために標的化される個体は、免疫応答を開始および維持する能力が衰えている可能性があるので、本研究中の対象を、３回目のワクチン接種の後にモニタリングして、４回目のワクチン接種に対する抗体持続および応答を評価した。したがって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン（１００μｇまたは２００μｇ）の最初の３用量を受けた両方の投薬レジメン中の対象に拡張段階（extension stage）に参加するように求め、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンまたはプラセボを受けるように１：１の比で再無作為化した。これらの対象は、第３の用量のおよそ１年後に、以前に受けたのと同じ抗原用量レベル（１００μｇまたは２００μｇ）のいずれかのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンまたはプラセボの第４の用量を受ける。これらの対象を追跡して、抗体持続を評価する。いずれかの投薬レジメンにおいて元々プラセボへと無作為化された対象は、拡張段階へは継続させない。
この臨床研究についての分析を、全ての対象が受診９を完了したとき（１、８および３０日目レジメン［日レジメン］にある対象については１３カ月目、および０、１および６カ月レジメン［月レジメン］にある対象については１８カ月目）に実施し、最大で受診９および受診９を含む全ての免疫原性および安全性データが入手可能であった。
分析の方法。定量下限（ＬＬＯＱ）を下回る任意のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ特異的中和抗体レベルまたは毒素Ｂ特異的中和抗体レベルについて、０．５×ＬＬＯＱとして定義されるＬＯＤを割り当てた。毒素Ａ特異的中和アッセイおよび毒素Ｂ特異的中和アッセイについてのＬＬＯＱは、それぞれ、１５８．０中和単位／ｍＬおよび２４９．５中和単位／ｍＬであった。他の失われたアッセイデータは、分析において帰属させなかった。全ての免疫原性分析を、ＬＬＯＱを下回った抗体レベルの補完後に実施した。毒素Ａ特異的中和抗体レベルが毒素Ａについて≧ＬＬＯＱであった場合、その対象を毒素Ａについて血清陽性とみなした。毒素Ｂ特異的中和抗体レベルが毒素Ｂについて≧ＬＬＯＱであった場合、その対象を毒素Ｂについて血清陽性とみなした。逆に、抗体レベルが＜ＬＬＯＱであった場合、その対象は血清陰性とみなした。免疫原性データを、無作為化したワクチン用量に従って要約した。元々の計画した段階について、全ての免疫原性データを、各割り当てられた投薬レジメン（１、８および３０日目および０、１および６カ月目）について別々に要約した。各割り当てられた投薬レジメン内には、３つのワクチン群（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびプラセボ）が存在した。
（実施例４）
第２相研究、１、８および３０日目（日レジメン）または０、１および６カ月目（月レジメン）における３用量レジメン（Ｂ５０９１００９）−全体的な研究設計および計画
６５〜８５歳のおよそ８５４人の健康な成人を、米国のおよそ１５の場所で登録するように計画した。対象を、２つの投薬レジメンのうち１つに割り当て、次いで、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン（１００μｇまたは２００μｇ）またはプラセボ（食塩水）を受けるように、３：３：１の比で並行して無作為に割り当てた（表３）。
Figure 2019065001
これは、６５〜８５歳の健康な成人における１、８および３０日目または０、１および６カ月目のいずれかの３用量レジメンとして投与された水酸化アルミニウム含有クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの２つの抗原用量レベル（１００μｇおよび２００μｇの総トキソイド）の安全性、忍容性および免疫原性を評価するための第２相、プラセボ対照、無作為化、観察者盲検研究であった。１００μｇの抗原用量レベル（トキソイドＡおよびＢについての合計）および２００μｇの抗原用量レベル（トキソイドＡおよびＢについての合計）をこの研究のために選択したが、それは、ＦＩＨ研究（Ｂ５０９１００１）からの免疫原性および安全性結果が、１００および２００μｇの抗原用量レベルが同様の免疫応答を誘導したことを示したからである。対照群について、プラセボは、０．５ｍＬ用量中の注射用の無菌の通常の食塩水溶液（０．９％塩化ナトリウム）からなった。アルミニウム上への吸着がワクチン成分を結合し注射部位からワクチン成分を緩徐に放出することが示されたので、水酸化アルミニウムを希釈剤として選択した。
研究をプラセボ対照して（元々の計画した段階での無作為化は、活性製剤に偏っていたが）、調査ワクチン製剤の安全性および忍容性の比較評価を提供し、ならびにクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡおよびＢに対する抗体の天然の背景力価における経時的な任意の潜在的な変化について照合した。
日レジメンにある対象は、受診１（１日目）、２（８日目）および４（３０日目）の時点で、１用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン／プラセボを受けた。月レジメンにある対象は、受診１（１日目）、２（３０日目）および５（６カ月目）の時点で、１用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン／プラセボを受けた。
一次免疫原性エンドポイント−３７日目（日レジメンにある対象については用量３の７日後）および７カ月目（月レジメンにある対象については用量３の１カ月後）の、毒素Ａ特異的中和抗体レベル（中和単位／ｍＬ）≧毒素Ａについての特定された閾値；毒素Ｂ特異的中和抗体レベル（中和単位／ｍＬ）≧毒素Ｂについての特定された閾値；ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方（中和単位／ｍＬ）≧それぞれ、毒素Ａについての特定された閾値および毒素Ｂについての特定された閾値、を有する各ワクチン群中の対象の割合。これらの閾値を、毒素Ａについて２１９中和単位／ｍＬおよび毒素Ｂについて２５８６中和単位／ｍＬと規定した。
二次免疫原性エンドポイント−３７日目（日レジメンにある対象については用量３の７日後）および７カ月目（月レジメンにある対象については用量３の１カ月後）：幾何平均濃度（ＧＭＣ）（中和単位／ｍＬ）として表される、毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベル。毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベル（中和単位／ｍＬ）におけるベースライン（用量１の前）からのＧＭＦＲ。毒素Ａ特異的、毒素Ｂ特異的、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方（中和単位／ｍＬ）におけるベースラインからの≧４倍、≧８倍、≧１６倍および≧３２倍の上昇を有する各ワクチン群中の対象の割合。日レジメンにある対象について、１日目（用量１の直前）、８日目（用量２の直前）、１５日目（用量２の７日後）、３０日目（用量３の直前）、２カ月目（用量３の１カ月後）、４カ月目（用量３の３カ月後）、７カ月目（用量３の６カ月後）および１３カ月目（用量３の１２カ月後）；または月レジメンにある対象について、１日目（用量１の直前）、３０日目（用量２の直前）、３７日目（用量２の７日後）、２カ月目（用量２の１カ月後）、６カ月目（用量３の直前）、１８７日目（用量３の７日後）、１２カ月目（用量３の６カ月後）および１８カ月目（用量３の１２カ月後）：毒素Ａ特異的中和抗体レベル（中和単位／ｍＬ）≧毒素Ａについての特定された閾値；毒素Ｂ特異的中和抗体レベル（中和単位／ｍＬ）≧毒素Ｂについての特定された閾値；ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方（中和単位／ｍＬ）≧それぞれ、毒素Ａについての特定された閾値および毒素Ｂについての特定された閾値、を有する各ワクチン群中の対象の割合（これらのパラメーターは、ベースラインにおいても評価する）。これらの閾値を、毒素Ａについて２１９中和単位／ｍＬおよび毒素Ｂについて２５８６中和単位／ｍＬと規定した。ＧＭＣ（中和単位／ｍＬ）として表される、毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベル。毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベル（中和単位／ｍＬ）におけるベースラインからのＧＭＦＲ。毒素Ａ特異的、毒素Ｂ特異的、ならびに毒素Ａおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方（中和単位／ｍＬ）におけるベースラインからの≧４倍、≧８倍、≧１６倍および≧３２倍の上昇を有する各ワクチン群中の対象の割合。上記エンドポイントにおけるベースラインは、１日目の１回目のワクチン接種前の関連する最後の測定値であった。
免疫原性分析。本明細書の分析を、全ての対象が受診９を完了したとき（日レジメンにある対象については１３カ月目および月レジメンにある対象にある対象については１８カ月目）に実施し、最大で受診９および受診９を含む全ての免疫原性および安全性データが入手可能であった。このセクションでは、免疫原性結果を、月レジメンおよび日レジメンについて別々に提示する。
一次免疫原性エンドポイントは、３７日目（日レジメンにある対象については用量３の７日後）および７カ月目（月レジメンにある対象については用量３の１カ月後）における、毒素Ａ特異的中和抗体力価、毒素Ｂ特異的中和抗体力価、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値（毒素Ａ特異的抗体について２１９中和単位／ｍＬおよび毒素Ｂ特異的抗体について２５８６中和単位／ｍＬ）を有する各ワクチン群中の対象の割合であった。二次免疫原性エンドポイントは以下のとおりであった：ＧＭＣとして表される、全てのサンプリング時点における毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベル。ＧＭＦＲとして表される、全てのサンプリング時点における毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベル。全てのサンプリング時点における、毒素Ａ特異的中和抗体レベル、毒素Ｂ特異的中和抗体レベル、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方における、ベースラインからの規定された上昇倍率を達成する各ワクチン群中の対象の割合。
免疫原性の結論。日レジメンと比較して、月レジメンは、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方について、１８７日目および７カ月目により高い免疫応答を達成した。月レジメンと比較して、日レジメンは、毒素Ａについて、３７日目および２カ月目により高い早期免疫応答を達成したが、応答は、毒素Ｂについてはこれらの時点において同様であった。２００μｇの用量レベルは、両方のレジメンにおいて、１００μｇの用量レベルよりも免疫原性であった。毒素Ａについて、ベースライン血清陽性は、用量１の直後に免疫応答の大きさを増強していた可能性があるが（特に、１００μｇの用量レベルについて）、両方のレジメンにおいて、ベースラインにおいて毒素Ａについて血清陰性であった対象についての応答と比較して、用量３後の免疫応答には、差異がほとんど存在しなかった。毒素Ｂについて、ベースライン血清陽性は、両方のレジメンにおいて免疫応答の大きさを増強した。月レジメンの７カ月目または日レジメンの３７日目に毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方≧閾値を達成する対象の割合は、６５〜８５歳の年齢五分位値によって階層化した場合、同様であった（８０〜８５歳の対象の数は少なかったが）。
これは、１、８および３０日目（日レジメン）または０、１および６カ月目（月レジメン）のいずれかの３用量レジメンとして投与された水酸化アルミニウム含有クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの２つの抗原用量レベル（１００μｇおよび２００μｇの総トキソイド）の安全性、忍容性および免疫原性を評価するための第２相、プラセボ対照、無作為化、観察者盲検研究であった。全体として、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンは、高度に免疫原性で、十分に耐容され、許容できる安全性プロファイルを示した。
免疫原性の考察。この研究の主要な免疫原性の目的は、日レジメンについては３７日目（用量３の７日後）にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルによって測定し、月レジメンについては７カ月目（用量３の１カ月後）にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルによって測定した、６５〜８５歳の健康な成人に３用量レジメン（１、８および３０日目または０、１および６カ月目のいずれか）として投与された場合のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの２つの抗原用量レベル（１００μｇおよび２００μｇの総トキソイド）の免疫原性を記述することであった。免疫原性を、研究の過程を通じて、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の測定を介して評価した。結果を、ＧＭＣ、種々の上昇倍率を達成する対象の割合、および各毒素について特定された閾値レベルを上回る力価を達成する対象の割合として表した。
月レジメンおよび日レジメンの両方において、１００μｇおよび２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群は、プラセボと比較した場合に免疫原性であった。２００μｇの用量レベルは、応答の大きさおよび永続性に基づいて、１００μｇの用量レベルよりも免疫原性であった。
各毒素について特定された閾値レベルを上回る力価を達成する月レジメン中の対象の割合は、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方について、１８７日目（用量３の１週間後）および７カ月目（用量３の１カ月後）に最も高かった。
毒素Ａについて特定された閾値レベルを上回る力価を達成する日レジメン中の対象の割合は、毒素Ａについて、３７日目および２カ月目においてより高かったが、割合は、毒素Ｂについてはこれらの時点において同様であった。
ワクチン接種の前に、両方の投薬レジメン中の対象の大部分は、毒素Ａおよび毒素Ｂについて血清陰性であった。月レジメンでは、対象の６９．８％は血清陰性であり、対象の８．７％は、毒素Ａについてのみ血清陽性であり、対象の１９．０％は、毒素Ｂについてのみ血清陽性であり、対象の２．６％は、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方について血清陽性であった。日レジメンでは、対象の７５．４％は血清陰性であり、対象の４．９％は、毒素Ａについてのみ血清陽性であり、対象の１６．４％は、毒素Ｂについてのみ血清陽性であり、対象の３．０％は、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方について血清陽性であった。
毒素Ａについて、ベースライン血清陽性は、用量１の直後に免疫応答の大きさを増強していた可能性があるが（特に、１００μｇの用量レベルについて）、両方のレジメンにおいて、ベースラインにおいて毒素Ａについて血清陰性であった対象についての応答と比較して、用量３後の免疫応答には、差異がほとんど存在しなかった。
毒素Ｂについて、ベースライン血清陽性は、両方のレジメンにおいて免疫応答の大きさを増強した。ベースラインにおいて毒素Ｂについて血清陰性であった対象について、６カ月目に与えた第３の用量だけが、特定された閾値を達成する対象の実質的な割合を生じた。
月レジメンの７カ月目または日レジメンの３７日目に毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方≧閾値を達成する対象の割合は、６５〜８５歳の年齢五分位値によって階層化した場合、同様であった（８０〜８５歳の対象の数は少なかったが）。
２００μｇの用量レベルは、両方の投薬レジメンにおいて、１００μｇの用量レベルよりも数値的により免疫原性であった。
月レジメンは、ベースラインにおいて血清陰性であった対象において、特に毒素Ｂについて、１００μｇおよび２００μｇの両方の用量レベルについて、より高い用量３後の応答を生じた。
毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方≧閾値を達成する対象の割合は、６５〜８５歳の年齢五分位値によって階層化した場合、同様であった（８０〜８５歳の対象の数は少なかったが）。
（実施例５）
第２相研究、１、８および３０日目（日レジメン）または０、１および６カ月目（月レジメン）における３用量レジメン（Ｂ５０９１００９）−免疫原性評価、月レジメン
月レジメン。対象のベースライン血清状態による、毒素Ａ特異的中和抗体力価、毒素Ｂ特異的中和抗体力価、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値を達成する対象の割合を、月レジメンについて評価した。全ての（１００．０％）無作為化対象を、ベースライン血清状態について評価した。大部分は、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方についてベースライン血清陰性であった。ベースライン血清陰性対象のうち、毒素Ａ特異的中和抗体力価≧特定された閾値を達成する割合は、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において７カ月目に９８．０％に達し、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において７カ月目に９５．０％に達した。毒素Ｂ特異的中和抗体力価≧特定された閾値を達成する割合は、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において７カ月目に６９．４％に達し、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において７カ月目に８５．０％に達した。ベースライン血清陽性対象について、毒素Ａ特異的中和抗体力価≧特定された閾値を達成する割合は、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において７カ月目に１００．０％に達し、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において７カ月目に１００．０％に達した。毒素Ｂ特異的中和抗体力価≧特定された閾値を達成する割合は、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において１８７日目および７カ月目に１００．０％に達し、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において３７日目、２カ月目および７カ月目に９６．８％に達した。
毒素Ａについて、月レジメンの７カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の１６０人の対象（９５％ＣＩ：９４．７％；９９．６％）および２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の１５１人の対象（９５％ＣＩ：９１．１％；９８．２％）が、プラセボ群中の１人の対象（９５％ＣＩ：０．０％；１０．１％）と比較して、特定された閾値を達成した。
毒素Ｂについて、月レジメンの７カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の１２２人（７４．８％）の対象（９５％ＣＩ：６７．５％；８１．３％）および２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の１３８人（８７．３％）の対象（９５％ＣＩ：８１．１％；９２．１％）が、プラセボ群中の４人（７．５％）の対象（９５％ＣＩ：２．１％；１８．２％）と比較して、特定された閾値を達成した。
毒素Ａおよび毒素Ｂの両方について、月レジメンの７カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の１２１人（７４．２％）の対象（９５％ＣＩ：６６．８％；８０．８％）および２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の１３６人（８６．１％）の対象（９５％ＣＩ：７９．７％；９１．１％）が、プラセボ群中の対象なし（９５％ＣＩ：０．０％；６．７％）と比較して、特定された閾値を達成した。
月レジメンでは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の１人の対象、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の２人（１．３％）の対象、およびプラセボ群中の１人の対象が、ベースラインにおいて毒素Ａ特異的中和抗体レベル≧特定された閾値を有した。用量１および２の後であるが用量３の前に、毒素Ａ特異的閾値値を達成する対象の割合は限定的であり、３７日目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中では７１人（４３．６％）の対象（９５％ＣＩ：３５．８％；５１．５％）、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中では８９人（５６．７％）の対象（９５％ＣＩ：４８．６％；６４．６％）であった。用量３の後、この閾値値を達成する対象の割合は、１８７日目に増加した。７カ月目の１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、１６０人（９８．２％）の対象が毒素Ａ特異的閾値値を達成し、閾値値を達成する対象の割合は、１８カ月目に７５人（４８．７％）の対象まで減少した。７カ月目の２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、１５１人（９５．６％）の対象が毒素Ａ特異的閾値値を達成し、この閾値値を達成する対象の割合は、１８カ月目に８１人（５３．３％）の対象まで減少した。
月レジメンでは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の４人（２．５％）の対象、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の７人（４．４％）の対象、およびプラセボ群中の２人（３．８％）の対象が、ベースラインにおいて毒素Ｂ特異的中和抗体レベル≧特定された閾値を有した。用量１および２の後であるが用量３の前に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の４７人（２８．８％）の対象（９５％ＣＩ：２２．０％；３６．４％）は、３７日目および２カ月目に閾値値を達成し、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の６０人（３８．２％）の対象（９５％ＣＩ：３０．６％；４６．３％）は、３７日目に閾値値を達成した。用量３の後、この閾値値を達成する対象の割合は、１８７日目に増加した。７カ月目の１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、１２２人（７４．８％）の対象が毒素Ｂ特異的閾値値を達成し、閾値値を達成する対象の割合は、１８カ月目に５３人（３４．４％）の対象まで減少した。７カ月目の２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、１３８人（８７．３％）の対象が毒素Ｂ特異的閾値値を達成し、この閾値値を達成する対象の割合は、１８カ月目に７２人（４７．４％）の対象まで減少した。
全体として、毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方≧特定された閾値を達成する対象の割合についての結果は、毒素Ｂのものと同様であった。
各時点についての毒素Ａ特異的中和抗体幾何平均濃度（ＧＭＣ）および毒素Ｂ特異的中和抗体幾何平均濃度（ＧＭＣ）を評価した。月レジメンについて、ベースラインにおいて、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびプラセボ群中の対象について、ＬＬＯＱ（１５８．０中和単位／ｍＬ）を下回った。ベースラインと比較して、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象について、ＧＭＣにおける増加が、３０日目に観察され（１３７中和単位／ｍＬ）、７カ月目に最大であり（１２４５中和単位／ｍＬ）、１８カ月目に２１４中和単位／ｍＬまで減少した。ベースラインと比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象について、ＧＭＣにおける増加が、３０日目に観察され（１４９中和単位／ｍＬ）、７カ月目に最大であり（１３８０中和単位／ｍＬ）、１８カ月目に２５７中和単位／ｍＬまで減少した。プラセボ群についての毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、全ての時点において≦９３中和単位／ｍＬであった。
月レジメンについて、ベースラインにおいて、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびプラセボ群中の対象について、ＬＬＯＱ（２４９．５中和単位／ｍＬ）を下回った。ベースラインと比較して、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象について、ＧＭＣにおける増加が、３０日目に観察され（５７０中和単位／ｍＬ）、７カ月目に最大であり（６２５５中和単位／ｍＬ）、１８カ月目に１２４８中和単位／ｍＬまで減少した。ベースラインと比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象について、ＧＭＣにおける増加が、３０日目に観察され（９０９中和単位／ｍＬ）、７カ月目に最大であり（９５４９中和単位／ｍＬ）、１８カ月目に２１７８中和単位／ｍＬまで減少した。プラセボ群についての毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、全ての時点において≦２６３中和単位／ｍＬであった。
月レジメンについて、ベースライン後受診の全ての時点において、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群においてより高かった。１００μｇおよび２００μｇの両方のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群は、プラセボ群よりも高いベースライン後ＧＭＣを有した。しかし、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群との間で、明確な用量応答は明らかでなかった。月レジメンについて、ベースライン後受診の全ての時点において、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群においてより高かった。１００μｇおよび２００μｇの両方のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群は、プラセボ群よりも高いベースライン後ＧＭＣを有した。明確な用量応答が、用量３の後（１２カ月目および１８カ月目）に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群との間で明らかであった。対象のベースライン血清状態による毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣを、月レジメンについて要約した。対象の年齢およびベースライン血清状態による毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣを、日レジメンについて要約した。
月レジメンについて、ベースラインからの毒素Ａ特異的中和抗体幾何平均上昇倍率（ＧＭＦＲ）および毒素Ｂ特異的中和抗体幾何平均上昇倍率（ＧＭＦＲ）を、３０日目、３７日目、２カ月目、６カ月目、１８７日目、７カ月目、１２カ月目および１８カ月目に計算した。
用量２の後、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける増加が、３７日目に観察された（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２．７０；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、３．７８）。用量３の後、ブースター応答が、１８７日目に明らかであった（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、５．８５；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、８．５４）。このブースター応答は、７カ月目（用量３の１カ月後）に最大であり、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について１４．５８のＧＭＦＲ、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について１５．８５のＧＭＦＲであった。ＧＭＦＲは、１８カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について２．５１まで、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について２．９５まで減少した。
用量２の後、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける増加が、３７日目に観察された（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、３．７５；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、５．５９）。用量３の後、実質的なブースター応答が、１８７日目に明らかであった（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、１５．８５；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２４．４４）。このブースター応答は、７カ月目（用量３の１カ月後）に最大であり、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について３５．４３のＧＭＦＲ、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について４９．９８のＧＭＦＲであった。ＧＭＦＲは、１８カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について７．０７まで、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について１１．２１まで減少した。
３０日目と１８カ月目との間では、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群についてより高かった。
各時点についての対象のベースライン血清状態による毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲを、月レジメンについて評価した。ベースライン血清陰性対象において、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける増加が、３７日目に観察された（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２．７４；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、４．０７）。用量３の後、ブースター応答が、１８７日目に明らかであった（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、６．２９；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、９．３７）。このブースター応答は、７カ月目に最大であり、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について１５．８８のＧＭＦＲ、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について１７．３２のＧＭＦＲであった。ＧＭＦＲは、１８カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について２．５９まで、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について３．１２まで減少した。用量２の後、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群（３０日目：２．４５；３７日目：２．６７；２カ月目：２．７９）および２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群（３０日目：３．４０；３７日目：３．９５；２カ月目：３．９４）について横ばいになった。用量３の後、実質的なブースター応答が、１８７日目に明らかであった（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、１６．００；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２６．６７）。このブースター応答は、７カ月目に最大であり、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について３９．２９のＧＭＦＲ、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について６１．０４のＧＭＦＲであった。ＧＭＦＲは、１８カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について６．９５まで、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について１１．５７まで減少した。
ベースライン血清陽性対象において、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける増加が、３７日目に観察された（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２．３７；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２．１３）。用量３の後、ブースター応答が、１８７日目に明らかであった（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、３．０３；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、４．１８）。このブースター応答は、７カ月目に最大であり、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について６．６５のＧＭＦＲ、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について７．９６のＧＭＦＲであった。ＧＭＦＲは、１８カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について１．８７まで、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について１．９１まで減少した。用量２の後、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける増加が、３７日目に観察された（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、１７．９７；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２３．０１）。用量３の後、実質的なブースター応答が、７カ月目に明らかであった（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２１．９６；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２１．９９）。このブースター応答は、７カ月目に最大であった。ＧＭＦＲは、１８カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について７．６８まで、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について９．９１まで減少した。
３０日目と１８カ月目との間では、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、ベースライン血清陽性対象についての３０日目および３７日目を除いて、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群についてより高かった。１８７日目の後、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、ベースライン血清陽性対象と比較して、両方の用量群においてベースライン血清陰性対象についてより高かった。３０日目と１８カ月目との間では、ベースライン血清陰性および血清陽性対象についての毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群についてより高かった。３０日目と６カ月目との間では、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、ベースライン血清陰性対象と比較して、ベースライン血清陽性対象についてより高かったが、１８７日目〜１８カ月目には、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、ベースライン血清陽性対象と比較して、ベースライン血清陰性対象についてより高かった。
３７日目および他の血液サンプリング時点において、毒素Ａ特異的中和抗体レベル、毒素Ｂ特異的中和抗体レベル、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方におけるベースラインからの規定された上昇倍率を達成する対象の割合を要約した。
全体として、ベースライン毒素Ａ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する対象のより高い割合が、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について観察された。１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、≧４倍の上昇に達する対象の割合における増加が、３７日目から観察され、１２５人（７６．７％）の対象が、７カ月目に≧８倍の上昇に達した。１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、７カ月目に、毒素Ａ特異的中和抗体レベルにおいて、７７人（４７．２％）の対象が≧１６倍の上昇に達し、３３人（２０．２％）の対象が≧３２倍の上昇に達した。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、≧４倍の上昇に達する対象の割合における増加が、３７日目から観察され、≧８倍の上昇に達する対象の割合における顕著な増加が、１８７日目に観察された。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、７カ月目に、毒素Ａ特異的中和抗体レベルにおいて、８９人（５６．３％）の対象が≧１６倍の上昇に達し、３４人（２１．５％）の対象が≧３２倍の上昇に達した。
全体として、ベースライン毒素Ｂ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する対象のより高い割合が、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について観察された。１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、≧４倍の上昇に達する対象の割合における増加が、３７日目から観察され、１３８人（８４．７％）の対象が７カ月目に≧８倍の上昇に達した。１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、１８７日目に、毒素Ｂ特異的中和抗体レベルにおいて、８５人（５２．５％）の対象が≧１６倍に達し、５２人（３２．１％）の対象が≧３２倍の上昇に達した。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、≧４倍の上昇に達する対象の割合における増加が、１８７日目から観察され、≧８倍の上昇に達する対象の割合における顕著な増加が、１８７日目に観察された。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の１０５人（６６．５％）の対象が、７カ月目に、毒素Ｂ特異的中和抗体レベルにおいて≧３２倍の上昇に達した。
全体として、毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方について、ベースラインからの規定された上昇倍率を達成する対象の割合についての結果は、毒素Ａのものと同様であった。
ワクチン群による、１日目、３０日目、３７日目、２カ月目、６カ月目、１８７日目、７カ月目、１２カ月目および１８カ月目に測定した毒素Ａ特異的中和抗体レベルについてのデータを示す逆累積分布曲線（ＲＣＤＣ）を、月レジメンについて評価した。ワクチン群による、１日目、３０日目、３７日目、２カ月目、６カ月目、１８７日目、７カ月目、１２カ月目および１８カ月目に測定した毒素Ｂ特異的中和抗体レベルについてのデータを示すＲＣＤＣを、月レジメンについて評価した。全体として、観察された曲線は、ワクチン接種した群について右にシフトし、これは、トキソイドワクチンを用いた免疫化が、プラセボで見られたものを超えて力価レベルを増加させたことを示している。これは、ＧＭＣにおいて示されたパターンおよび≧特定された閾値を達成する対象の割合と一致している。
（実施例６）
第２相研究、１、８および３０日目（日レジメン）または０、１および６カ月目（月レジメン）における３用量レジメン（Ｂ５０９１００９）−免疫原性評価、日レジメン
日レジメン。対象のベースライン血清状態による、毒素Ａ特異的中和抗体力価、毒素Ｂ特異的中和抗体力価、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値を達成する対象の割合を、日レジメンについて評価した。大部分は、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方についてベースライン血清陰性であった。ベースライン血清陰性対象のうち、毒素Ａ特異的中和抗体力価≧特定された閾値を達成する割合は、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において３７日目に６７．７％に達し、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において３７日目および２カ月目に８５．２％に達した。毒素Ｂ特異的中和抗体力価≧特定された閾値を達成する割合は、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において１５日目および３７日目に１４．０％に達し、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において３７日目に２５．２％に達した。ベースライン血清陽性対象について、毒素Ａ特異的中和抗体力価≧特定された閾値を達成する割合は、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において３７日目に８０．０％に達し、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において３７日目および２カ月目に８６．７％に達した。毒素Ｂ特異的中和抗体力価≧特定された閾値を達成する割合は、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において３０日目に９７．１％に達し、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群において３７日目および２カ月目に９３．９％に達した。
毒素Ａについて、日レジメンの３７日目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の１１７人（６８．４％）の対象（９５％ＣＩ：６０．９％；７５．３％）および２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の１４１人（８５．５％）の対象（９５％ＣＩ：７９．１％；９０．５％）が、プラセボ群中の７人（１２．５％）の対象（９５％ＣＩ：５．２％；２４．１％）と比較して、特定された閾値を達成した。
毒素Ｂについて、日レジメンの３７日目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の５１人（２９．８％）の対象（９５％ＣＩ：２３．１％；３７．３％）および２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の６４人（３８．８％）の対象（９５％ＣＩ：３１．３％；４６．７％）が、プラセボ群中の１人の対象（９５％ＣＩ：０．０％；９．６％）と比較して、特定された閾値を達成した。
毒素Ａおよび毒素Ｂの両方について、日レジメンの３７日目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の４５人（２６．３％）の対象（９５％ＣＩ：１９．９％；３３．６％）および２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の６４人（３８．８％）の対象（９５％ＣＩ：３１．３％；４６．７％）が、プラセボ群中の対象なし（９５％ＣＩ：０．０％；６．４％）と比較して、特定された閾値を達成した。
日レジメンでは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の２人（１．２％）の対象および２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の１人の対象が、ベースラインにおいて毒素Ａ特異的中和抗体レベル≧特定された閾値を有した。用量１および２の後であるが用量３の前に、毒素Ａ特異的閾値値を達成する対象の割合は限定的であり、１５日目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中では２９人（１７．０％）の対象（９５％ＣＩ：１１．７％；２３．４％）であり、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中では４１人（２５．０％）の対象（９５％ＣＩ：１８．６％；３２．３％）であった。用量３の後、この閾値値を達成する対象の割合は、３７日目に増加した。３７日目の１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、１１７人（６８．４％）の対象が毒素Ａ特異的閾値値を達成し、閾値値を達成する対象の割合は、１３カ月目に１６人（１０．１％）の対象まで減少した。３７日目および２カ月目の２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、１４１人（８５．５％）の対象が毒素Ａ特異的閾値値を達成し、この閾値値を達成する対象の割合は、１３カ月目に４０人（２５．８％）の対象まで減少した。
日レジメンでは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の８人（４．７％）の対象、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の６人（３．７％）の対象、およびプラセボ群中の３人（５．４％）の対象が、ベースラインにおいて毒素Ｂ特異的中和抗体レベル≧特定された閾値を有した。用量１および２の後であるが用量３の前に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の５２人（３０．４％）の対象（９５％ＣＩ：２３．６％；３７．９％）および２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の６１人（３７．２％）の対象（９５％ＣＩ：２９．８％；４５．１％）が、１５日目に閾値値を達成した。用量３の後、この閾値値を達成する対象の割合は、３７日目まで安定なままであった。３０日目および３７日目の１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、５１人（２９．８％）の対象が毒素Ｂ特異的閾値値を達成し、この閾値値を達成する対象の割合は、１３カ月目に３１人（１９．６％）の対象まで減少した。３７日目の２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、６４人（３８．８％）の対象が毒素Ｂ特異的閾値値を達成し、この閾値値を達成する対象の割合は、１３カ月目に４８人（３１．０％）の対象まで減少した。
全体として、毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方≧特定された閾値を達成する対象の割合についての結果は、毒素Ｂのものと同様であった。
各時点についての毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣを評価した。日レジメンについて、ベースラインにおいて、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびプラセボ群中の対象について、ＬＬＯＱ（１５８．０中和単位／ｍＬ）を下回った。ベースラインと比較して、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象について、ＧＭＣにおける増加が、１５日目に観察され（１４３中和単位／ｍＬ）、３７日目に最大であり（３６８中和単位／ｍＬ）、１３カ月目に１０５中和単位／ｍＬまで減少した。ベースラインと比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象について、ＧＭＣにおける増加が、１５日目に観察され（１９２中和単位／ｍＬ）、３７日目に最大であり（５５６中和単位／ｍＬ）、１３カ月目に１３８中和単位／ｍＬまで減少した。プラセボ群についての毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、全ての時点において≦１０２中和単位／ｍＬであった。
日レジメンについて、ベースラインにおいて、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびプラセボ群中の対象について、ＬＬＯＱ（２４９．５中和単位／ｍＬ）を下回った。ベースラインと比較して、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象について、ＧＭＣにおける増加が、８日目に観察され（２７３中和単位／ｍＬ）、１５日目に最大であり（８０７中和単位／ｍＬ）、１３カ月目に４４７中和単位／ｍＬまで減少した。ベースラインと比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象について、ＧＭＣにおける増加が、８日目に観察され（２９０中和単位／ｍＬ）、３７日目に最大であり（１２１９中和単位／ｍＬ）、１３カ月目に８２８中和単位／ｍＬまで減少した。プラセボ群についての毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、全ての時点において≦２１１中和単位／ｍＬであった。
日レジメンについて、ベースライン後受診の全ての時点において、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群においてより高かった。１００μｇおよび２００μｇの両方のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群は、プラセボ群よりも高いベースライン後ＧＭＣを有し、明確な用量応答が、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群との間で明らかであった。
日レジメンについて、ベースライン後受診の全ての時点において、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群においてより高かった。１００μｇおよび２００μｇの両方のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群は、プラセボ群よりも高いベースライン後ＧＭＣを有した。しかし、明確な用量応答は、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群との間で明らかでなかった。
対象のベースライン血清状態による毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣを、日レジメンについて要約した。対象の年齢およびベースライン血清状態による毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣを、日レジメンについて要約した。
日レジメンについて、ベースラインからの毒素Ａ特異的中和抗体幾何平均上昇倍率（ＧＭＦＲ）および毒素Ｂ特異的中和抗体幾何平均上昇倍率（ＧＭＦＲ）を、８日目、１５日目、３０日目、３７日目、２カ月目、４カ月目、７カ月目および１３カ月目に計算した。用量２の後、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける増加が、１５日目に観察され（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、１．７３；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２．２７）。用量３の後、ブースター応答が、３７日目に明らかであった（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、４．４５；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、６．５６）。このブースター応答は、３７日目（用量３の７日後）に最大であり、２カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について３．５６、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について５．７１であった。ＧＭＦＲは、１３カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について１．２６まで、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について１．６４まで減少した。
用量２の後、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける顕著な増加が、１５日目に観察された（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、４．３１；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、５．８６）。用量３の後、ブースター応答が、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について３７日目に明らかであった（６．５７のＧＭＦＲ）が、ＧＭＦＲは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群については横ばいになった（３０日目：３．７６；３７日目：３．８９；２カ月目：３．６１）。このブースター応答は、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について３７日目（用量３の７日後）に最大であった。ＧＭＦＲは、１３カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について２．４０まで、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について４．４４まで減少した。
８日目と１３カ月目との間では、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群についてより高かった。
各時点についての対象のベースライン血清状態による毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲを、日レジメンについて評価した。ベースライン血清陰性対象において、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける増加が、３０日目に観察された（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２．０１；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２．９５）。用量３の後、ブースター応答が、３７日目に明らかであった（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、４．４８；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、６．９５）。このブースター応答は、３７日目に最大であった。ＧＭＦＲは、１３カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について１．２８まで、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について１．７５まで減少した。用量２の後、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける増加が、１５日目に観察された（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２．５７；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、３．８１）。用量３の後、ＧＭＦＲは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群（３０日目：２．３７；３７日目：２．５６；２カ月目：２．４２）および２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群（３０日目：３．６８；３７日目：４．５５；２カ月目：４．２２）について横ばいになった。ＧＭＦＲは、１３カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について２．０１まで、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について４．００まで減少した。
ベースライン血清陽性対象において、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける増加が、３０日目に観察された（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、２．４７；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、１．２０）。用量３の後、ブースター応答が、３７日目に明らかであった（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、３．９７；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、３．６８）。このブースター応答は、３７日目に最大であった。ＧＭＦＲは、１３カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について０．９９まで、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について０．８１まで減少した。用量２の後、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける顕著な増加が、１５日目に観察された（１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、３２．１８；２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群、３２．１４）。ＧＭＦＲは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群（３０日目：２２．８６；３７日目：１９．７４；２カ月目：１７．２３）および２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群（３０日目：２７．５０；３７日目：２８．２３；２カ月目：２５．５４）について横ばいになったので、ブースター応答は用量３の後に明らかでなかった。ＧＭＦＲは、１３カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について４．７２まで、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について６．７０まで減少した。
８日目と１３カ月目との間では、ベースライン血清陰性対象についての毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群についてより高かった。８日目と１３カ月目との間では、ベースライン血清陽性対象についての毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、４カ月目を除いて、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群についてより低かった。毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、ベースライン血清陽性対象と比較して、両方の用量群においてベースライン血清陰性対象についてより高かった。８日目と１３カ月目との間では、ベースライン血清陽性対象についての１５日目を除いて、ベースライン血清陰性および血清陽性対象についての毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群についてより高かった。８日目と１３カ月目との間では、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、ベースライン血清陰性対象と比較して、ベースライン血清陽性対象についてより高かった。
３７日目および他の血液サンプリング時点において、毒素Ａ特異的中和抗体レベル、毒素Ｂ特異的中和抗体レベル、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方におけるベースラインからの規定された上昇倍率を達成する対象の割合を要約した。
全体として、ベースライン毒素Ａ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する対象のより高い割合が、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について観察された。１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、≧４倍の上昇に達する対象の割合における増加が、１５日目から観察され、４３人（２５．１％）の対象が、３７日目に≧８倍の上昇に達した。１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、３７日目に、毒素Ａ特異的中和抗体レベルにおいて、１５人（８．８％）の対象が≧１６倍の上昇に達し、６人（３．５％）の対象が≧３２倍の上昇に達した。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、≧４倍の上昇に達する対象の割合における増加が、１５日目から観察され、対象の割合における顕著な増加（６７人［４０．０％］）は、３７日目に≧８倍の上昇に達した。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、１５日目に、毒素Ａ特異的中和抗体レベルにおいて、２３人（１４．１％）の対象が≧１６倍の上昇に達し、１５人（９．２％）の対象が≧３２倍の上昇に達した。
全体として、ベースライン毒素Ｂ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する対象の同様の割合が、最大で４カ月目まで、１００μｇおよび２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について観察された。７カ月目および１３カ月目に、ベースライン毒素Ａ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する対象のより高い割合が、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群と比較して、２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について観察された。１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、≧４倍の上昇に達する対象の割合における増加が、１５日目から観察され、１５日目および３０日目に、５７人（３３．３％）の対象が≧８倍の上昇に達した。１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、１５日目に、毒素Ａ特異的中和抗体レベルにおいて、４５人（２６．３％）の対象が≧１６倍の上昇に達し、３５人（２０．５％）の対象が≧３２倍の上昇に達した。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、≧４倍の上昇に達する対象の割合における増加が、１５日目から観察され、対象の割合における顕著な増加（６６人［４０．２％］）は、３７日目に≧８倍の上昇に達した。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群について、３０日目および３７日目に、毒素Ａ特異的中和抗体レベルにおいて、６１人（３７．４％）の対象が≧１６倍の上昇に達し、４５人（２７．４％）の対象が≧３２倍の上昇に達した。
全体として、毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方について、ベースラインからの規定された上昇倍率を達成する対象の割合についての結果は、毒素Ａのものと同様であった。
ワクチン群による、１日目、８日目、１５日目、３０日目、３７日目、２カ月目、４カ月目、７カ月目および１３カ月目に測定した毒素Ａ特異的中和抗体レベルについてのデータを示す逆累積分布曲線（ＲＣＤＣ）を、日レジメンについて評価した。ワクチン群による、１日目、８日目、１５日目、３０日目、３７日目、２カ月目、４カ月目、７カ月目および１３カ月目に測定した毒素Ｂ特異的中和抗体レベルについてのデータを示すＲＣＤＣを、日レジメンについて評価した。全体として、観察された曲線は、ワクチン接種した群について右にシフトし、これは、トキソイドワクチンを用いた免疫化が、プラセボで見られたものを超えて力価レベルを増加させたことを示している。これは、ＧＭＣにおいて示されたパターンおよび≧特定された閾値を達成する対象の割合と一致している。
（実施例７）
第２相研究、１、８および３０日目（日レジメン）または０、１および６カ月目（月レジメン）における３用量レジメン（Ｂ５０９１００９）−免疫原性評価、年齢群による結果
年齢群（６５〜６９歳、７０〜７４歳、７５〜７９歳および８０〜８５歳）による免疫応答もまた評価した。
月レジメンでは、７カ月目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の割合は、６５〜６９歳の対象７０人のうち８０．０％、７０〜７４歳の対象４８人のうち６８．８％、７５〜７９歳の対象３４人のうち７３．５％、８０〜８５歳の対象１１人のうち６３．６％であった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象６４人のうち９０．６％、７０〜７４歳の対象５６人のうち８３．９％、７５〜７９歳の対象２９人のうち８９．７％、８０〜８５歳の対象９人のうち５５．６％であった。
月レジメンでは、７カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象についての毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、６５〜６９歳の対象について１３０４中和単位／ｍＬ、７０〜７４歳の対象について１１８２中和単位／ｍＬ、７５〜７９歳の対象について１２５４中和単位／ｍＬ、８０〜８５歳の対象について１１３２中和単位／ｍＬであった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象についての対応するＧＭＣは、６５〜６９歳の対象について１６９０中和単位／ｍＬ、７０〜７４歳の対象について１０７３中和単位／ｍＬ、７５〜７９歳の対象について１６２７中和単位／ｍＬ、８０〜８５歳の対象について９２５中和単位／ｍＬであった。
月レジメンでは、７カ月目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象についての毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、６５〜６９歳の対象について７６０８中和単位／ｍＬ、７０〜７４歳の対象について５６８８中和単位／ｍＬ、７５〜７９歳の対象について５４４６中和単位／ｍＬ、８０〜８５歳の対象について４１７８中和単位／ｍＬであった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象についての対応するＧＭＣは、６５〜６９歳の対象について１１８３５中和単位／ｍＬ、７０〜７４歳の対象について８７５０中和単位／ｍＬ、７５〜７９歳の対象について１０５３３中和単位／ｍＬ、８０〜８５歳の対象について２６０８中和単位／ｍＬであった。
月レジメンでは、７カ月目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中のベースライン血清陰性対象の割合は、６５〜６９歳の対象４６人のうち７３．９％、７０〜７４歳の対象３９人のうち６４．１％、７５〜７９歳の対象２８人のうち６７．９％、８０〜８５歳の対象８人のうち６２．５％であった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象４６人のうち９１．３％、７０〜７４歳の対象３７人のうち８１．１％、７５〜７９歳の対象２２人のうち８６．４％、８０〜８５歳の対象９人のうち５５．６％であった。
月レジメンでは、７カ月目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中のベースライン血清陽性対象の割合は、６５〜６９歳の対象２人のうち１００．０％、７０〜７４歳の対象１人のうち１００．０％であり、７５〜７９歳の対象については推定可能でなく、８０〜８５歳の対象については推定可能でなかった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象３人のうち６６．７％、７０〜７４歳の対象２人のうち１００．０％であり、７５〜７９歳の対象については推定可能でなく、８０〜８５歳の対象については推定可能でなかった。
月レジメンでは、７カ月目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中のベースライン血清陰性対象の割合は、６５〜６９歳の対象４６人のうち７３．９％、７０〜７４歳の対象３９人のうち６４．１％、７５〜７９歳の対象２８人のうち６７．９％、８０〜８５歳の対象８人のうち６２．５％であった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象４６人のうち９１．３％、７０〜７４歳の対象３７人のうち８１．１％、７５〜７９歳の対象２２人のうち８６．４％、８０〜８５歳の対象９人のうち５５．６％であった。
月レジメンでは、７カ月目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中のベースライン血清陽性対象の割合は、６５〜６９歳の対象２人のうち１００．０％、７０〜７４歳の対象１人のうち１００．０％であり、７５〜７９歳の対象については推定可能でなく、８０〜８５歳の対象については推定可能でなかった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象３人のうち６６．７％、７０〜７４歳の対象２人のうち１００．０％であり、７５〜７９歳の対象については推定可能でなく、８０〜８５歳の対象については推定可能でなかった。
月レジメンでは、７カ月目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値におけるベースラインからの≧４倍の上昇を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中のベースライン血清陰性対象の割合は、６５〜６９歳の対象４６人のうち８４．８％、７０〜７４歳の対象３９人のうち８７．２％、７５〜７９歳の対象２８人のうち７８．６％、８０〜８５歳の対象８人のうち１００．０％であった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象４６人のうち９１．３％、７０〜７４歳の対象３７人のうち８１．１％、７５〜７９歳の対象２２人のうち１００．０％、８０〜８５歳の対象９人のうち７７．８％であった。
月レジメンでは、７カ月目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値におけるベースラインからの≧４倍の上昇を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中のベースライン血清陽性対象の割合は、６５〜６９歳の対象２人のうち１００．０％、７０〜７４歳の対象１人のうち１００％であり、７５〜７９歳の対象については推定可能でなく、８０〜８５歳の対象については推定可能でなかった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象３人のうち６６．７％、７０〜７４歳の対象２人のうち５０．０％であり、７５〜７９歳の対象については推定可能でなく、８０〜８５歳の対象については推定可能でなかった。
日レジメンでは、３７日目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の割合は、６５〜６９歳の対象７４人のうち２３．０％、７０〜７４歳の対象５３人のうち３０．２％、７５〜７９歳の対象２８人のうち２８．６％、８０〜８５歳の対象１６人のうち２５．０％であった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象７１人のうち３８．０％、７０〜７４歳の対象５０人のうち３０．０％、７５〜７９歳の対象２９人のうち４８．３％、８０〜８５歳の対象１５人のうち５３．３％であった。
日レジメンでは、３７日目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象についての毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、６５〜６９歳の対象について４２２中和単位／ｍＬ、７０〜７４歳の対象について３８９中和単位／ｍＬ、７５〜７９歳の対象について２８２中和単位／ｍＬ、８０〜８５歳の対象について２６２中和単位／ｍＬであった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象についての対応するＧＭＣは、６５〜６９歳の対象について５６９中和単位／ｍＬ、７０〜７４歳の対象について５５８中和単位／ｍＬ、７５〜７９歳の対象について４９６中和単位／ｍＬ、８０〜８５歳の対象について６１６中和単位／ｍＬであった。
日レジメンでは、３７日目に、１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象についての毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、６５〜６９歳の対象について６５３中和単位／ｍＬ、７０〜７４歳の対象について８０９中和単位／ｍＬ、７５〜７９歳の対象について５６６中和単位／ｍＬ、８０〜８５歳の対象について１３０９中和単位／ｍＬであった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象についての対応するＧＭＣは、６５〜６９歳の対象について１１９２中和単位／ｍＬ、７０〜７４歳の対象について８０５中和単位／ｍＬ、７５〜７９歳の対象について２４０４中和単位／ｍＬ、８０〜８５歳の対象について１４４９中和単位／ｍＬであった。
日レジメンでは、３７日目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中のベースライン血清陰性対象の割合は、６５〜６９歳の対象５９人のうち１１．９％、７０〜７４歳の対象３８人のうち１３．２％、７５〜７９歳の対象２２人のうち９．１％、８０〜８５歳の対象１１人のうち９．１％であった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象４９人のうち２２．４％、７０〜７４歳の対象３８人のうち２１．１％、７５〜７９歳の対象２２人のうち３６．４％、８０〜８５歳の対象１３人のうち４６．２％であった。
日レジメンでは、３７日目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中のベースライン血清陽性対象の割合は、６５〜６９歳の対象２人のうち１００．０％、７０〜７４歳の対象２人のうち５０．０％であり、７５〜７９歳の対象については推定可能でなく、８０〜８５歳の対象については推定可能でなかった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象３人のうち１００．０％、７０〜７４歳の対象３人のうち１００．０％であり、７５〜７９歳の対象については推定可能でなく、８０〜８５歳の対象については推定可能でなかった。
日レジメンでは、３７日目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中のベースライン血清陰性対象の割合は、６５〜６９歳の対象５９人のうち１１．９％、７０〜７４歳の対象３８人のうち１３．２％、７５〜７９歳の対象２２人のうち９．１％、８０〜８５歳の対象１１人のうち９．１％であった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象４９人のうち２２．４％、７０〜７４歳の対象３８人のうち２１．１％、７５〜７９歳の対象２２人のうち３６．４％、８０〜８５歳の対象１３人のうち４６．２％であった。
日レジメンでは、３７日目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中のベースライン血清陽性対象の割合は、６５〜６９歳の対象２人のうち１００．０％、７０〜７４歳の対象２人のうち５０．０％であり、７５〜７９歳の対象については推定可能でなく、８０〜８５歳の対象については推定可能でなかった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象３人のうち１００．０％、７０〜７４歳の対象３人のうち１００．０％であり、７５〜７９歳の対象については推定可能でなく、８０〜８５歳の対象については推定可能でなかった。
日レジメンでは、３７日目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値におけるベースラインからの≧４倍の上昇を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中のベースライン血清陰性対象の割合は、６５〜６９歳の対象５９人のうち１５．３％、７０〜７４歳の対象３８人のうち１８．４％、７５〜７９歳の対象２２人のうち１８．２％、８０〜８５歳の対象１１人のうち１８．２％であった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象４９人のうち２４．５％、７０〜７４歳の対象３８人のうち２６．３％、７５〜７９歳の対象２２人のうち３６．４％、８０〜８５歳の対象１３人のうち４６．２％であった。
日レジメンでは、３７日目に、毒素Ａ特異的中和抗体力価および毒素Ｂ特異的中和抗体力価の両方≧特定された閾値におけるベースラインからの≧４倍の上昇を達成する１００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中のベースライン血清陽性対象の割合は、６５〜６９歳の対象２人のうち１００．０％、７０〜７４歳の対象２人のうち５０．０％であり、７５〜７９歳の対象については推定可能でなく、８０〜８５歳の対象については推定可能でなかった。２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）群中の対象の対応する割合は、６５〜６９歳の対象３人のうち３３．３％、７０〜７４歳の対象３人のうち０．０％であり、７５〜７９歳の対象については推定可能でなく、８０〜８５歳の対象については推定可能でなかった。
（実施例８）
用量３の後１２カ月間にわたる、６５〜８５歳の健康な成人においてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの２つの３用量レジメンの安全性、忍容性および免疫原性を評価するための、第２相、プラセボ対照、無作為化、観察者盲検研究。
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））は、抗生物質関連院内下痢の一般的な原因である。今日まで、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症（ＣＤＩ）を予防するために利用可能なワクチンは存在しない。この第２相研究において、本発明者らは、米国において６５〜８５歳の８５５人の健康な免疫適格性成人において、トキソイドベースのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの安全性、忍容性および免疫原性を探求した。
方法。この試験の元々計画した段階を、２０１５年７月１６日から２０１７年３月７日まで実施した。対象を登録し、２つの抗原用量レベル（１００μｇまたは２００μｇ）またはプラセボのうち１つ、および２つの３用量レジメン：１、８および３０日目（日レジメン）または０、１および６カ月目（月レジメン）、のうち１つを受けるように無作為化した。免疫原性試験を、９回の研究受診の各々において取得した血液サンプルに対して実施した。局所的および全身的反応源性を、各ワクチン接種の後に収集した。非重篤な有害事象（ＡＥ）報告が、用量３の後１カ月間にわたって行われた。重篤な有害事象（ＳＡＥ）報告は、用量３の後６カ月間にわたって行われた。８５５人の健康な免疫適格性対象を研究に登録し、２つの投薬レジメン：１、８および３０日目（日レジメン）または０、１および６カ月目（月レジメン）、のうち１つで３用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン（１００μｇまたは２００μｇの総トキソイド）またはプラセボ（食塩水）を受けるように３：３：１の比で並行して無作為に割り当てた。免疫原性試験を、９回の研究受診：日レジメンについて１、８、１５、３０、３７日目、２、４、７および１３カ月目、ならびに月レジメンについて１、３０、３７、１８７日目、２、６、７、１２および１８カ月目の各々において取得した血液サンプルに対して実施した。毒素Ａおよび毒素Ｂ特異的中和免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）濃度（中和単位／ｍＬ）を、各予定した研究受診において測定した。幾何平均濃度（ＧＭＣ）を計算し、中和閾値を、毒素Ａおよび毒素Ｂについて確立した−（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｄ）。局所的反応および全身的事象を、各ワクチン接種の後１４日間（日レジメンについては用量１の後７日間）にわたって、ｅ−ｄｉａｒｙによって収集した。有害事象報告は、インフォームドコンセントのサイン時から、用量３の後１カ月間にわたって行われた。重篤な有害事象（ＳＡＥ）報告は、用量３の後６カ月間にわたって行われた。安全性、反応源性および免疫原性を、用量（１００μｇおよび２００μｇ）およびプラセボによる各ワクチン接種レジメン内で記述的に分析した。
結果。全体的な免疫原性は、３用量の後に、２００μｇの月レジメンにおいてより高かった。局所的反応源性は、日レジメンにおいて用量＃２の後に増加を実証した。月レジメンにおける有害事象率は、日レジメンと比較して、さらなる５カ月間の追跡に起因して、数値的により高かった。
ワクチン接種に対するピーク抗体免疫応答は、月および日レジメンについて、それぞれ、用量３の７カ月および３７日後に観察された−（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｄ）。
用量３の１２カ月後、月レジメンは、用量群にかかわらず、日レジメンと比較して、予め規定された中和閾値を上回る対象のより高い割合を実証している−（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃおよび図１Ｄ）。
用量３の１２カ月後に、月レジメンについての幾何平均濃度（ＧＭＣ）は、日レジメンのＧＭＣと比較して、毒素Ｂ（４倍高い）および毒素Ａ（２倍高い）についてより高い−（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｄ）。
用量３の１２カ月後に、毒素Ａ ＧＭＣは、２００μｇの月レジメンにおいて、中和閾値を上回ったままである−（図２Ａおよび図２Ｂ）。
毒素Ｂ ＧＭＣは、用量３のおよそ９カ月後まで、２００μｇの月レジメンにおいて、中和閾値を上回る−（図２Ａおよび図２Ｂ）。
疼痛は、報告される最も一般的な局所的反応である。任意の発赤および腫脹の発生率は、両方のレジメンにおいて各用量の後に＜１０％であった。
グレード４の局所的または全身的反応源性は、研究の間に報告されなかった。
月レジメンでは、用量群とプラセボとの間で、集計された有害事象の間で有意な数的差異は観察されなかった−（図３Ａおよび図３Ｂ）。
任意のレジメンまたは用量群の間で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン接種と関連する重篤な有害事象（ＳＡＥ）は、試験の間に報告されなかった−（図３Ａおよび図３Ｂ）。
結論。月レジメンは、３用量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン接種後に、日レジメンよりも免疫原性である。増加した局所的反応源性は、特に２００μｇの用量レベルで、８日目に与えられた用量２の後に観察された。関連する有害事象、重篤な有害事象、および有害事象に起因する離脱は、活性ワクチン群において数値的により高かったが、安全性の懸念を示唆する識別可能なパターンは存在しなかった。全体的な有害事象の頻度および型は、一般的な集団中のこの年齢コホートに特徴的であった。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン接種は、免疫原性であり、十分に耐容された。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン候補は、高度に免疫原性で十分に耐容され、許容できる安全性プロファイルを実証する。２００μｇの月レジメンは、より高い全体的な免疫原性を実証し、第３相の開発のためにこれを選択した。
２００μｇの用量レベルは、一貫して、１００μｇの用量レベルよりも免疫原性であった。
日レジメンは、毒素Ａについて３７日目／２カ月目に優れた早期免疫応答を駆動するが、毒素Ｂについては駆動しない。例えば、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａおよび図５Ｂを参照のこと。毒素Ａについて、ベースライン血清陽性は、早期免疫応答の大きさ（特に、１００μｇの用量レベルについて）に寄与するが、両方のレジメンにおいて、用量３の後には差異がほとんど存在しない。毒素Ｂベースライン血清陰性対象（全体の約８０％）について、閾値を達成する有意な割合を生じるのは、６カ月目に与えた第３の用量だけである。例えば、図６Ａ、図６Ｂ、図７Ａおよび図７Ｂを参照のこと。全ての全身的事象について、プラセボとクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンとの間、または１００μｇの用量レベルと２００μｇの用量レベルとの間で、有意な差異は観察されなかった。関連する有害事象、重篤な有害事象、および有害事象に起因する離脱は、活性ワクチン群において数値的により高かったが、安全性の懸念を示唆する識別可能なパターンは存在しなかった。０、１および６カ月目に投与された２００μｇの用量レベルを、第３相のために選択した。
用量３の１２カ月後の結果に関して、用量＃３の１２カ月後に、対象のおよそ５０％は、毒素Ａに対する中和について、両方の用量群において予め規定された閾値を上回る。月レジメン、２００μｇ用量群の幾何平均濃度（ＧＭＣ）は、用量＃３の１２カ月後に、毒素Ａに対する中和閾値を上回る。用量＃３の１２カ月後に、対象の４７％は、毒素Ｂに対する中和について、月レジメンの２００μｇ用量群において予め規定された閾値を上回る。血清陽性のＧＭＣ（複数可）は、毒素Ｂに対する中和について、両方のレジメンにおいて中和閾値を上回る。月レジメンに関して、毒素Ｂ ＧＭＣは、用量＃３の６カ月後に中和閾値（２９９３中和単位／ｍＬ）を上回り、用量＃３の１２カ月後に同様のままである（２１７８中和単位／ｍＬ）。例えば、図１Ａ〜Ｄ、図２Ａ〜Ｄ、図８Ａ、図８Ｂならびに図９Ａおよび図９Ｂを参照のこと。
（実施例９）
６５〜８５歳の健康な日本人成人において、投与された２つの３用量レジメンのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの安全性、忍容性および免疫原性を評価するための、第１相、プラセボ対照、無作為化、観察者盲検研究（Ｂ５０９１０１０）
これは、６５〜８５歳の健康な日本人成人において、２つの異なる投薬レジメン（０、１および６カ月目［月レジメン］または１、８および３０日目［日レジメン］）での、水酸化アルミニウム含有ワクチンの２つの抗原用量レベル（即ち、１００μｇおよび２００μｇ）の安全性、忍容性および免疫原性を評価するための、第１相、プラセボ対照、無作為化、観察者盲検研究であった。
合計で１２８人の、６５〜８５歳の健康な日本人成人を登録した。対象を、各投薬レジメンでクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン（１００μｇまたは２００μｇの総トキソイド）またはプラセボ（食塩水）を受けるように、３：３：２の比で無作為に割り当てた。
対象を、最後のワクチン接種を受けた後、６カ月間にわたって追跡した。したがって、月レジメンに割り当てられた対象は、およそ１２カ月間にわたって参加し、日レジメンに割り当てられ、それを完了する対象は、およそ７カ月間にわたって参加した。この研究は、およそ１４カ月間で完了するように計画した。研究の終了は、最後の対象の最後の受診であった。
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンは、日本人対象において以前には評価されていなかった。したがって、本発明のファースト・イン・ジャパニーズ研究Ｂ５０９１０１０は、６５〜８５歳の健康な日本人成人に２つの３用量レジメン（１、８および３０日目または０、１および６カ月目のいずれか）として投与された場合の、水酸化アルミニウム含有クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの２つの抗原用量レベル（１００μｇおよび２００μｇの総トキソイド）の安全性、忍容性および免疫原性を評価するために、研究Ｂ５０９１００９と同様に設計した。
研究Ｂ５０９１０１０が進行中であった期間の間に、第２相研究Ｂ５０９１００９を分析したところ、投与された両方のレジメンおよび両方の用量レベルが一般に、十分に耐容されたことが実証された。局所的反応は、優勢に軽度〜中程度であり、注射部位疼痛が最も頻繁な症状であった。用量２の後、局所的反応源性は、特に２００μｇの用量レベルについて、１カ月目と比較して、８日目にワクチンが投与された場合に、より高かった。全身的事象もまた、優勢に軽度〜中程度であり、個々の事象の発生率は、プラセボ群、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の間で同様であった。各レジメン内で、全体的な有害事象（ＡＥ）発生率もまた、プラセボ、１００μｇおよび２００μｇ用量群の間で同様であった。両方のレジメンについて、重篤な有害事象（ＳＡＥ）は、プラセボ群よりも、１００μｇおよび２００μｇ用量群において数値的により高かった。しかし、これらの事象に関するパターンは存在せず、安全性の懸念は確認されなかった。研究した両方の用量レベルは、実質的な中和抗毒素ＡおよびＢ力価を生じ、０、１および６カ月目に投与した３用量の後の免疫原性プロファイルが好ましかった。さらに、２００μｇの用量レベルは、１００μｇの用量レベルよりも免疫原性であった。これに基づいて、０、１および６カ月目に投与した２００μｇの用量レベルを第３相の開発に進めることを決定した。
各投薬レジメンについて、対象を、表４に列挙した３つの研究群のうち１つに無作為化した。およそ２４人の対象が、１００または２００μｇの総トキソイド用量レベルのいずれかでクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンを受けるように計画し、およそ１６人の対象は、プラセボ（食塩水）を受けるように計画した。
Figure 2019065001
血清サンプルを、免疫原性試験のために取得した。月レジメンについては、１日目（ワクチンの投与前）、１５日目（用量１の１４日後）、３０日目（用量２の直前）、３７日目（用量２の７日後）、２カ月目（用量２の１カ月後）、６カ月目（用量３の直前）、１８７日目（用量３の７日後）、７カ月目（用量３の１カ月後）および１２カ月目（用量３の６カ月後）に。
日レジメンについては、１日目（ワクチンの投与前）、８日目（用量２の直前）、１５日目（用量２の７日後）、３０日目（用量３の直前）、３７日目（用量３の７日後）、２カ月目（用量３の１カ月後）、４カ月目（用量３の３カ月後）および７カ月目（用量３の６カ月後）に。
毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方を測定した。
毒素Ａ特異的中和抗体幾何平均濃度および毒素Ｂ特異的中和抗体幾何平均濃度−月レジメンについて、７カ月目（用量３の１カ月後）は、第３の用量のワクチン後の免疫応答を反映したので、これを一次時点として特定した。全体として、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、用量２の後に増加したが、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方について、用量３の後（７カ月目）に最も高かった。毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、７カ月目に、１００μｇ用量群と比較して、２００μｇ用量群においてより高かった。毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、両方の用量レベルについて、７カ月目から１２カ月目まで減少した。１２カ月目に、ＧＭＣは、２００μｇ用量群については毒素Ａ特異的中和抗体および毒素Ｂ特異的中和抗体の両方について、ならびにまた、１００μｇ用量群については毒素Ａ特異的中和抗体について、閾値を上回ったままであった。２００μｇ用量群における毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、用量２の後（３７日目）に３４７．１７中和単位／ｍＬまで増加し、３７日目に１００μｇ用量群において１２５．４６中和単位／ｍＬまで増加した。１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方における毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、６カ月目（用量３の前）までに、それぞれ、８８．８９中和単位／ｍＬおよび１４８．４４中和単位／ｍＬまで減少した。用量３の後、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは再び、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方について増加し、７カ月目に、１００μｇ用量群（１１３７．５０中和単位／ｍＬ）と比較した場合、２００μｇ用量群において数値的により高かった（１６９２．３８中和単位／ｍＬ）。次いで、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、１２カ月目（用量３の６カ月後）まで減少したが、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群は共に、６カ月目のＧＭＣと比較して、一般に高いままであった（それぞれ、２４８．９７中和単位／ｍＬおよび５８７．４６中和単位／ｍＬ）。１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方における毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、用量２の後（３７日目）に、それぞれ、３３７．５４中和単位／ｍＬおよび９０１．１６中和単位／ｍＬまで増加した。毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、６カ月目（用量３の前）までに、それぞれ、２７４．１３中和単位／ｍＬおよび６８９．７４中和単位／ｍＬまで減少した。用量３の後（１８７日目）、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは再び、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方について増加し、７カ月目に、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、１００μｇ用量群（７９０３．６８中和単位／ｍＬ）と比較した場合、２００μｇ用量群において数値的により高かった（１３７５６．５４中和単位／ｍＬ）。１２カ月目に、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは減少したが、６カ月目のＧＭＣと比較して、２００μｇ用量群については一般に高いままであったが（６２９８．１８中和単位／ｍＬ）、１００μｇ用量群についてはそうならなかった（１８８７．２４中和単位／ｍＬ）。毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、プラセボ群では、ベースラインから１２カ月目まで未変化のままであった。月レジメンについて、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、評価可能免疫原性集団において、６５〜６９歳および７０〜７４歳の対象の間で基本的に同様であった。
月レジメンでは、ベースラインからの毒素Ａ特異的中和抗体幾何平均上昇倍率（ＧＭＦＲ）および毒素Ｂ特異的中和抗体幾何平均上昇倍率（ＧＭＦＲ）を、各利用可能なベースライン後時点において計算した：１５日目（用量１の１４日後）、３０日目（用量２の直前）、３７日目（用量２の７日後）、２カ月目（用量２の１カ月後）、６カ月目（用量３の直前）、１８７日目（用量３の７日後）、７カ月目（用量３の１カ月後、一次時点）および１２カ月目（用量３の６カ月後）。
毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲの増加は、２００μｇ用量群において用量２の後（３７日目；４．２６）に観察されたが、６カ月目までに１．８２まで減少した。用量３の後、１８７日目（それぞれ、７．４２および１６．０７）に１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方について毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおけるさらなる増加が存在し、７カ月目にさらなる増加が存在した（それぞれ、１２．５８および２０．７７）。１２カ月目までに、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群において、それぞれ、２．７０および７．２０まで減少した。２００μｇ用量群における毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、各血液サンプリング時点において、１００μｇ用量群のものよりも一貫してより高かった。毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、プラセボ群では、研究を通じて未変化のままであった。
毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける増加が、用量１の後（１５日目；それぞれ、２．８１および５．２１）および用量２の後（３７日目；それぞれ、２．５３および５．３５）に１００μｇ用量群および２００μｇ用量群について観察され、６カ月目までに僅かな減少が観察された（それぞれ、２．０６および４．１０）。毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおけるさらなる増加が、用量３の後、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方について１８７日目に観察され（それぞれ、３２．００および５４．８１）、さらなる増加が７カ月目に観察された（それぞれ、５９．２８および８１．７１）。１２カ月目までに、毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群について、それぞれ、１４．０１および３６．９０まで減少した。２００μｇ用量群における毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、各血液サンプリング時点において、１００μｇ用量群のものよりも一貫してより高かった。毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、プラセボ群では、研究を通じて未変化のままであった。
特定された閾値値（２１９中和単位／ｍＬ［毒素Ａ］および２５８６中和単位／ｍＬ［毒素Ｂ］）を上回る毒素Ａ特異的中和抗体レベル、毒素Ｂ特異的中和抗体レベル、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方を達成した月レジメン中の対象の割合を、評価可能免疫原性集団について評価した。
全体として、閾値を上回る毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルを達成した対象の割合は、全ての血液サンプリング時点にわたって、１００μｇ用量群と比較した場合、２００μｇ用量群においてより高かった。両方の用量群について、閾値を上回る毒素Ａ特異的中和抗体レベル、毒素Ｂ特異的中和抗体レベル、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方を有する対象の割合は、用量２の後に増加し、用量３の後（７カ月目）に最も高かった。
毒素Ａ特異的中和抗体について、用量３の後（１８７日目）、１００μｇ用量群中の対象の７８．３％（１８／２３、９５％ＣＩ：５６．３、９２．５）および２００μｇ用量群中の対象の９５．７％（２２／２３、９５％ＣＩ：７８．１、９９．９）が、プラセボ群中の対象なしと比較して、閾値を上回る毒素Ａ特異的中和抗体レベルを達成した。７カ月目に、１００μｇ用量群中の対象の９１．３％（２１／２３、９５％ＣＩ：７２．０、９８．９）および２００μｇ用量群中の対象の１００．０％（２３／２３、９５％ＣＩ：８５．２、１００．０）が、プラセボ群中の対象なしと比較して、閾値を上回る毒素Ａ特異的中和抗体レベルを達成した。毒素Ａ特異的中和抗体レベルについて閾値を上回る対象の割合は、２００μｇ用量群について１２カ月目に高いままであったが（対象の９５．５％［２１／２２］、９５％ＣＩ：７７．２、９９．９）、１００μｇ用量群においては減退した（対象の５５．０％［９／２０］、９５％ＣＩ：３１．５、７６．９）。プラセボ群中には、１２カ月目に閾値を上回る毒素Ａ特異的中和抗体レベルを有した対象は存在しなかった。
毒素Ｂ特異的中和抗体について、用量３の後（１８７日目）、１００μｇ用量群中の対象の５２．２％（１２／２３、９５％ＣＩ：３０．６、７３．２）および２００μｇ用量群中の９１．３％（２１／２３、９５％ＣＩ：７２．０、９８．９）の対象が、プラセボ群中の対象なしと比較して、閾値を上回る毒素Ｂ特異的中和抗体レベルを達成した。７カ月目に、１００μｇ用量群中の対象の９１．３％（２１／２３、９５％ＣＩ：７２．０、９８．９）および２００μｇ用量群中の対象の１００．０％（２３／２３、９５％ＣＩ：８５．２、１００．０）が、プラセボ群中の対象なしと比較して、閾値を上回る毒素Ｂ特異的中和抗体レベルを達成した。毒素Ｂ特異的中和抗体レベルについて閾値を上回る対象の割合は、２００μｇ用量群について１２カ月目に高いままであったが（対象の８１．８％［１８／２２］、９５％ＣＩ：５９．７、９４．８）、１００用量群においては減退した（対象の４５．０％［１１／２０］、９５％ＣＩ：２３．１、６８．５）。プラセボ群中には、１２カ月目に閾値を上回る毒素Ｂ特異的中和抗体レベルを有した対象は存在しなかった。
月レジメンについて、毒素Ａ特異的中和抗体レベル、毒素Ｂ特異的中和抗体レベル、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方においてベースラインからの規定された上昇倍率（≧４倍、≧８倍、≧１６倍および≧３２倍）を達成する対象の割合を、評価可能免疫原性集団について評価した。全体として、ベースライン毒素Ａ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する対象のより高い割合が、１００μｇ用量群と比較して、２００μｇ用量群において観察された。１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方においてベースラインからの≧３２倍の上昇を達成する対象の割合における増加が、用量３の後（１８７日目）に観察された。７カ月目までに、１００μｇ用量群中の対象の６９．６％（１６／２３）および２００μｇ用量群中の対象の９１．３％（２１／２３）が、ベースラインからの≧８倍の上昇を達成した。さらに７カ月目に、２００μｇ用量群中の対象の６９．６％（１６／２３）は、ベースラインからの≧１６倍の上昇もまた達成した。プラセボ群におけるベースラインからの毒素Ａ特異的中和抗体上昇倍率は、各時点において未変化のままであった。ベースライン毒素Ａ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する対象の割合は、７カ月目と比較して１２カ月目において減退し、１００μｇ用量群中の対象の５．０％（１／２０）および２００μｇ用量群中の対象の１３．６％（３／２２）が、ベースラインからの≧１６倍の上昇を達成した。
全体として、ベースライン毒素Ｂ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する対象のより高い割合が、１００μｇ用量群と比較して、２００μｇ用量群において観察された。１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方において、ベースラインからの≧３２倍の上昇を達成する対象の割合における増加が、用量３の後（１８７日目）に観察された。７カ月目までに、１００μｇ用量群中の対象の７３．９％（１７／２３）および２００μｇ用量群中の対象の８２．６％（１９／２３）が、ベースラインからの≧３２倍の上昇を達成した。プラセボ群におけるベースラインからの毒素Ｂ特異的中和抗体上昇倍率は、各時点において未変化のままであった。ベースライン毒素Ｂ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する対象の割合は、７カ月目と比較して１２カ月目において減退し、１００μｇ用量群中の対象の２５．０％（５／２０）および２００μｇ用量群中の対象の４５．５％（１０／２２）が、ベースラインからの≧３２倍の上昇を達成した。
１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方における毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方についてベースラインからの≧８倍の上昇を達成する対象の割合における増加が、用量３の後（１８７日目）に観察された。７カ月目までに、１００μｇ用量群中の対象の６９．６％（１６／２３）および２００μｇ用量群中の対象の８７．０％（２０／２３）が、ベースラインからの≧８倍の上昇を達成した。さらに７カ月目に、２００μｇ用量群中の対象の６５．２％（１５／２３）が、ベースラインからの≧１６倍の上昇を達成した。プラセボ群におけるベースラインからの毒素Ａ特異的中和抗体上昇倍率およびＢ特異的中和抗体上昇倍率は共に、各時点において未変化のままであった。
月レジメンについて毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベル≦ＬＬＯＱを有する対象の割合を評価した。全体として、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方中の対象の低い割合が、７カ月目および１２カ月目に、毒素Ａ特異的中和抗体レベルまたは毒素Ｂ特異的中和抗体レベルのいずれか＜ＬＬＯＱを有した。プラセボ群中の対象の大部分は、全ての時点において、毒素Ａ特異的中和抗体レベル、毒素Ｂ特異的中和抗体レベル、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベル＜ＬＬＯＱを有した。
日レジメンについて、３７日目（用量３の７日後）は、第３の用量のワクチン後の免疫応答を反映したので、これを一次時点として特定した。しかし、停止規則に従って引き続く投薬を中断するという決定から生じる、登録された対象の限定的な数に起因して、３０日目およびそれを越える時点では、推測を行うことはできなかった。１００μｇ用量群および２００μｇ用量群についての毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、用量１および用量２の後に増加したが、１００μｇ用量群（１５日目に７９．００中和単位／ｍＬおよび３０日目に１１６．２１中和単位／ｍＬ）と比較した場合、１５日目（５１５．６７中和単位／ｍＬ）および３０日目（６７３．００中和単位／ｍＬ）に、２００μｇ用量群においてより高い程度まで増加した。毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣは、プラセボ群では、研究を通じて未変化のままであった。毒素Ａと同様に、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群についての毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、用量１および用量２の後に増加したが、１００μｇ用量群（６９２．９８中和単位／ｍＬおよび６８２．０９中和単位／ｍＬ）と比較した場合、１５日目（３５３１．６９中和単位／ｍＬ）および３０日目（４６６６．５１中和単位／ｍＬ）に、２００μｇ用量群においてより高い程度まで増加した。毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは、プラセボ群では、研究を通じて未変化のままであった。
日レジメンでは、ベースラインからの毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲを、各利用可能なベースライン後時点において計算した：８日目（用量２の直前）、１５日目（用量２の７日後）、３０日目（用量３の直前）、３７日目（用量３の７日後、一次時点）、２カ月目（用量３の１カ月後）、４カ月目（用量３の３カ月後）および７カ月目（用量３の６カ月後）。停止規則に従って引き続く投薬を中断するという決定によって引き起こされる、対象の限定的な数に起因して、３０日目およびそれを越える時点では、推測を行うことはできなかった。毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲの増加が、用量２の後、１５日目に２００μｇ用量群において観察され（６．１１）、３０日目にさらなる増加が観察された（７．７９）。毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける増加が、用量２の後、１００μｇ用量群において３０日目に観察されたが（１．４７）、これは全体的に、全ての時点において、２００μｇ用量群において観察されたＧＭＦＲよりも低かった。毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、プラセボ群では、全ての時点において未変化のままであった。
毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲにおける増加が、用量１の後に１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方において観察され（８日目：それぞれ、１．４１および１．７８）、さらなる増加が、１５日目（それぞれ、４．３７および９．０１）および３０日目（それぞれ、４．５９および１０．６３）に、両方の用量群において観察された。毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、１００μｇ用量群におけるものと比較した場合、２００μｇ用量群において一貫してより高かった。毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、プラセボ群では、全ての時点において未変化のままであった。
日レジメンでは、特定された閾値値（２１９中和単位／ｍＬ［毒素Ａ］および２５８６中和単位／ｍＬ［毒素Ｂ］）を上回る毒素Ａ特異的中和抗体レベル、毒素Ｂ特異的中和抗体レベル、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方を達成したｍＩＴＴ集団中の対象の割合を評価した。３０日目までに、日レジメンでは、１００μｇ用量群（対象の２０．０％［１／５］、９５％ＣＩ：０．５、７１．６）と比較して、２００μｇ用量群中の対象のより高い百分率（対象の６２．５％［５／８］、９５％ＣＩ：２４．５、９１．５）が、閾値を上回る毒素Ａ特異的中和抗体レベルを達成した。
同様に、毒素Ｂ特異的中和抗体について、３０日目に、１００μｇ用量群（対象の２０．０％［１／５］、９５％ＣＩ：０．５、７１．６）と比較して、２００μｇ用量群中の対象のより高い百分率（対象の６２．５％［５／８］、９５％ＣＩ：２４．５、９１．５）が、閾値を上回る毒素Ｂ特異的中和抗体レベルを達成した。
毒素Ａ特異的中和抗体および毒素Ｂ特異的中和抗体の両方について、２００μｇ用量群中の対象の半分が、３０日目までに閾値を上回るレベルを達成したが（対象の５０．０％［４／８］、９５％ＣＩ：１５．７、８４．３）、１００μｇ用量群中の対象はいずれも、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方について閾値を上回るレベルを達成しなかった（対象の０．０％［０／５］）。
日レジメンでは、毒素Ａ特異的中和抗体レベル、毒素Ｂ特異的中和抗体レベル、ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方においてベースラインからの規定された上昇倍率（≧４倍、≧８倍、≧１６倍および≧３２倍）を達成する対象の割合を評価した。全体として、ベースライン毒素Ａ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する日レジメン中の対象のより高い割合が、１００μｇ用量群と比較して、２００μｇ用量群において観察された。３０日目まで、毒素Ａ特異的中和抗体レベルにおける≧４倍以上の上昇を達成した１００μｇ用量群中の対象は存在しなかった。用量２の後（１５日目）にベースラインからの≧３２倍の上昇を達成する２００μｇ用量群中の対象の割合における増加が存在し、これは、３０日目まで継続した（２００μｇ用量群中の対象の２５．０％［２／８］が、ベースラインからの≧３２倍の上昇を達成した）。プラセボ群におけるベースラインからの毒素Ａ特異的中和抗体上昇倍率は、各時点において未変化のままであった。
毒素Ａ特異的中和抗体と同様に、ベースライン毒素Ｂ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する日レジメン中の対象のより高い割合が、１００μｇ用量群と比較して２００μｇ用量群において観察された。用量２の後（１５日目）に、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方中のベースラインからの≧３２倍の上昇を達成する対象の割合における増加が存在し、これは３０日目まで継続した。３０日目に、１００μｇ用量群中の５人の対象のうち１人だけが、規定された上昇倍率のいずれかを達成した。逆に、２００μｇ用量群中の対象の６２．５％［５／８］が、３０日目に≧１６倍の上昇を達成した。プラセボ群におけるベースラインからの毒素Ｂ特異的中和抗体上昇倍率は、各時点において未変化のままであった。
最大で３０日目および３０日目を含んで、毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方における≧４倍以上の上昇を達成した１００μｇ用量群中の対象は存在しなかった。用量２の後（１５日目）に、２００μｇ用量群中の毒素ＡおよびＢの両方についてベースラインからの≧３２倍の上昇を達成する対象の割合における増加が存在し、これは３０日目まで継続した（２００μｇ用量群中の対象の１２．５％［１／８］が、ベースラインからの≧３２倍の上昇を達成した）。プラセボ群におけるベースラインからの毒素Ａ特異的中和抗体上昇倍率および毒素Ｂ特異的中和抗体上昇倍率は、各時点において未変化のままであった。
日レジメンについて毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベル＜ＬＬＯＱを有する対象の割合を評価した。１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方中の対象が、用量２の後１５日目に毒素Ａ特異的中和抗体レベル＜ＬＬＯＱを有し（それぞれ、対象の１００．０％［１１／１１］および対象の５４．５％［６／１１］）、３０日目に低減された（それぞれ、対象の６０．０％［３／５］および対象の２５．０％［２／８］）。３０日目までに、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方中の対象は、毒素Ｂ特異的中和抗体レベル＜ＬＬＯＱ（それぞれ、対象の４０．０％［２／５］および対象の３７．５％［３／８］）ならびに毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方＜ＬＬＯＱ（それぞれ、対象の２０．０％［１／５］および対象の１２．５％［１／８］）を有した。
結論。免疫原性エンドポイントを、この研究における二次エンドポイントとみなした。免疫原性エンドポイントは、ベースラインからの毒素Ａ特異的中和抗体および毒素Ｂ特異的中和抗体のＧＭＣおよびＧＭＦＲ、ならびに閾値を上回る毒素Ａ特異的中和抗体レベル、毒素Ｂ特異的中和抗体レベル、または毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルの両方を有する対象の割合、ならびにベースラインからの≧４倍、≧８倍、≧１６倍および≧３２倍の上昇を有する割合を含んだ。日レジメンを停止させた結果として、限定的な量の免疫原性データのみが、このコホートについて３０日後に入手可能であった。したがって、月レジメンから得たデータから以下の結論を下した。全体として、毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルについてのＧＭＣは、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方において、用量１の後に増加し、７カ月目に最大であり、１２カ月目まで減退した。７カ月目に、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは共に、１００μｇ用量群（それぞれ、１１３７．５０および７９０３．６８中和単位／ｍＬ）と比較した場合、２００μｇ用量群において数値的により高かった（それぞれ、１６９２．３８および１３７５６．５４中和単位／ｍＬ）。１２カ月目までに、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＣおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＣは減退したが、６カ月目のＧＭＣと比較して、２００μｇ用量群では高いままであった（それぞれ、５８７．４６および６２９８．１８中和単位／ｍＬ）。２００μｇ用量群における毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、各血液サンプリング時点において、１００μｇ用量群のものよりも一貫してより高かった。用量３の後、ベースラインからのＧＭＦＲにおける増加が、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方において観察された。毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、７カ月目に最も高く、１００μｇ用量群（それぞれ、１２．５８および５９．２８）と比較した場合、２００μｇ用量群において数値的により高かった（それぞれ、２０．７７および８１．７１）。次いで、毒素Ａ特異的中和抗体ＧＭＦＲおよび毒素Ｂ特異的中和抗体ＧＭＦＲは、両方のワクチン群において１２カ月目までに減退した。閾値を上回る毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルを達成した対象の割合は一般に、全ての血液サンプリング時点にわたって、１００μｇ用量群と比較した場合、２００μｇ用量群においてより高かった。７カ月目までに、２００μｇ用量群中の対象の１００．０％が、閾値を上回る毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルを達成したが、１００μｇ用量群中の対象の９０％よりも多くが、閾値を上回るレベルを達成した。毒素Ａ特異的中和抗体レベルおよび毒素Ｂ特異的中和抗体レベルについて閾値を上回る対象の割合は、１２カ月目に２００μｇ用量群について高いままであったが（それぞれ、９５．５％および８１．８％）、１００用量群では減退した（それぞれ、５５．０％および４５．０％）。プラセボ群中には、１２カ月目に閾値を上回る毒素Ａ特異的中和抗体レベルまたは毒素Ｂ特異的中和抗体レベルを有した対象は存在しなかった。毒素Ａ特異的中和抗体について、１００μｇ用量群中の対象の６９．６％（１６／２３）および２００μｇ用量群中の対象の９１．３％（２１／２３）は、７カ月目までにベースラインからの≧８倍の上昇を達成し、２００μｇ用量群中の対象の大部分（６９．６％；１６／２３）もまた、７カ月目までにベースラインからの≧１６倍の上昇を達成した。ベースライン毒素Ａ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する対象の割合は、７カ月目と比較して１２カ月目に減退し、１００μｇ用量群中の対象の５．０％（１／２０）および２００μｇ用量群中の対象の１３．６％（３／２２）が、ベースラインからの≧１６倍の上昇を達成した。毒素Ｂ特異的中和抗体について、１００μｇ用量群および２００μｇ用量群の両方中の対象の大部分が、７カ月目までに、ベースラインからの≧３２倍の上昇を達成した（それぞれ、対象の７３．９％［１７／２３］および対象の８２．６％［１９／２３］）。ベースライン毒素Ｂ特異的中和抗体レベルからの規定された上昇倍率を達成する対象の割合は、７カ月目と比較して１２カ月目に減退し、１００μｇ用量群中の対象の２５．０％（５／２０）および２００μｇ用量群中の対象の４５．５％（１０／２２）が、ベースラインからの≧３２倍の上昇を達成した。１００μｇ、２００μｇおよびプラセボ用量にわたる、ベースラインにおける月および日レジメン中のベースラインにおける非常に少数の血清陽性対象に起因して、ＧＭＣに対するベースライン血清状態の影響は検討できなかった。月レジメンのＲＣＤＣで明らかなように、２００μｇ用量群は、７カ月目に、一般には全ての時点にわたって、１００μｇ用量群と比較した場合、より高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度および毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を有した。併せて考えると、これらの結果は、月レジメンにおいて、ピーク免疫原性が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの用量３のおよそ１カ月後（７カ月目）に生じることを実証している。さらに、２００μｇ用量は、毒素Ａ特異的中和抗体および毒素Ｂ特異的中和抗体のＧＭＣおよびＧＭＦＲによって評価した場合、１００μｇ用量と比較して、より高くより持続性の抗体応答を誘導する。
（実施例１０）
免疫原性組成物によって誘導される抗体は、種々のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株由来の毒素を中和することが可能である
種々の株から分泌された毒素を含む培養物上清を、免疫原性組成物で免疫化した非ヒト霊長類由来の血清を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイで試験して、免疫原性組成物のカバー範囲を決定し、循環臨床株由来の多様な毒素に対して保護する免疫原性組成物の能力を決定した。
ＩＭＲ−９０細胞を使用して、種々のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株から発現された毒素の中和を試験した。試験サンプルの中和力価は、参照標準に基づいて計算される。アッセイＬＬＯＱ：Ｔｘｄ Ａ＝１５８．０Ｕ／ｍｌ；Ｔｘｄ Ｂ＝２４９．５Ｕ／ｍｌ。表５中の結果は、免疫化された非ヒト霊長類由来の血清が、中和アッセイにおいて、それぞれの培養物上清の各々由来のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を中和できたことを示している。
Figure 2019065001
Figure 2019065001
（実施例１１）
第３相クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン有効性研究を支持する診断アッセイ
Ｃｌｏｖｅｒ（Ｂ５０９１００７）は、ＣＤＩの危険性が増加した５０歳以上の対象におけるトキソイドベースのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（Ｃ）ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの有効性、安全性および忍容性を評価する多国籍の重要な第３相研究である。この研究は、２３カ国のおよそ４００の調査場所が関与して、ほぼ１６，０００人の対象を登録することを目的にしている。この第３相研究の主要目的は、臨床および実験室の両方の診断基準に基づいて、ＣＤＩの最初の一次エピソードの発生率を低減させることにおけるワクチンの有効性を実証することである。ワクチンの有効性の評価は、対象が下痢を経験したときに追跡し、その時に便サンプルを収集し、温度制御された条件下の中央実験室にそれらのサンプルを発送し、疾患を引き起こすクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）および毒素（複数可）の存在についてそれらを試験することを必要とする。ＣＤＩの正確な実験室診断を確実にするために、２−ステップアルゴリズムを、便サンプルを試験するために使用する。このアルゴリズムは、ＰＣＲによる毒素Ｂ遺伝子を保有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株／芽胞の検出と、その後の独占所有権のある毒素検出試験（ＣＣＮＡ）を使用する遊離毒素（ＡおよびＢ）の検出とに基づく。このアプローチを疫学的研究として選択し、これは、遊離毒素の検出が、ＰＣＲ単独よりもＣＤＩ疾患のより良い予測因子であったことを明確に実証した。さらに、２−ステップ試験アルゴリズムは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓによって欧州において、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ ＡｍｅｒｉｃａおよびＳｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａによって米国において、既に推奨されている。この研究ならびにＰＣＲ資格認定およびＣＣＮＡ検証／臨床的検証を実施することの操作上／実行上の課題の主要部は、記載されている。両方のアッセイは、全ての予め特定された許容基準を満たし、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの有効性および疫学研究において診断としてのそれらの意図された使用に適切である。
ＣＥＰＨＥＩＤ ＸＰＥＲＴ（登録商標）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の資格認定／Ｅｐｉ ＰＣＲ試験検証およびＣＣＮＡの臨床的検証
ＸＰＥＲＴ（登録商標）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）／Ｅｐｉ ＰＣＲ試験およびＣＣＮＡは、高感度でロバストで再現性がある。アッセイ資格認定ならびに精度、直線性、正確性および／または特異性の検証は、ＸＰＥＲＴ（登録商標）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）／Ｅｐｉ ＰＣＲ試験およびＣＣＮＡが、それらの意図された目的に適切であることを確認した。各アッセイを、真のＣＤＩ陽性および陰性便サンプルに対して試験し、臨床的正確性について評価した。ＸＰＥＲＴ（登録商標）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）／Ｅｐｉ ＰＣＲ試験およびＣＣＮＡは共に、陽性および陰性サンプルを適切に分類することにより、臨床的に正確であった。
特異性：５０個の非毒素産生性および非クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株を、ＸＰＥＲＴ（登録商標）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）／Ｅｐｉ ＰＣＲを用いて評価した。交差反応は観察されず、これは、１００％の分析特異性に対応する。
感度：便中で急増した１０個のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株の検出限界（ＬＯＤ）を決定した。１０個の株についてのＬＯＤは、３４４〜２１７５コロニー形成単位（ＣＦＵ）の範囲であった。
精度：９つのインプットサンプルを、１０日間の試験日にわたって、３ロットの試験試薬を使用して、２人の分析者が試験した。サンプルの変動性は、これらの条件下で、＜２％相対標準偏差であった。
正確性：濃度が１０倍増加したときの、測定された値と参照値との間の一致は、傾き＝−３．３Ｃｔによって示される。
ＣＥＰＨＥＩＤ ＸＰＥＲＴ（登録商標）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）／Ｅｐｉ ＰＣＲ試験は、臨床的検証において９３全てのＣＤＩ症例サンプルを正確に同定した。優れたＣＣＮＡ精度が、アッセイ検証の間に観察された。ＣＣＮＡは、参照方法と比較した場合、１００％の臨床的特異性を実証した。ＣＣＮＡは、別の参照方法と比較した場合、９５．７％の臨床的感度を実証した。
結論：クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）生物の検出とその後の毒素の検出とに基づく２−ステップアルゴリズムは、ＣＤＩの実験室確認のために使用される。ＣＬＯＶＥＲにおいて使用する前に、ＸＰＥＲＴ（登録商標）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）／Ｅｐｉ ＰＣＲ試験およびＣＣＮＡの両方を資格認定および／または検証したところ、これらは共に、優れた分析特異性、感度および精度を実証した。臨床的検証の間に、両方の診断アッセイは、推定ＣＤＩ症例の検出において、臨床的に特異的かつ高感度であった。信頼性のある臨床サンプル検体収集戦略と併せて使用される各アッセイは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの第３相臨床試験において現在使用されている。
以下の条項は、本発明のさらなる実施形態を記載する：
Ｃ１．ヒトにおいてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に対する免疫応答を惹起するための方法であって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを含む組成物の有効用量をヒトに投与するステップを含み、組成物が少なくとも２回投与される、方法。
Ｃ２．２回目の投与が、１回目の投与の少なくとも７日後であり、３回目の投与が、１回目の投与の約３０日後である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３．３回目の投与が、１回目の投与の約１８０日後である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ４．組成物が少なくとも３回投与される、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ５．２回目の投与が、１回目の投与の約３０日後であり、３回目の投与が、１回目または２回目の投与の約１８０日後である、条項Ｃ２に記載の方法。
Ｃ６．３回目の投与が、１回目の投与の少なくとも１８０日後である、条項Ｃ２に記載の方法。
Ｃ７．惹起される免疫応答が、抗毒素Ａ中和モノクローナル抗体を含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ８．惹起される免疫応答が、抗毒素Ｂ中和モノクローナル抗体を含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ９．惹起される免疫応答が、抗毒素Ａ中和モノクローナル抗体および抗毒素Ｂ中和モノクローナル抗体を含み、中和モノクローナル抗体の濃度が、少なくとも１０μｇ／ｍＬである、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１０．組成物が、少なくとも９０％以上の純度を各々が有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１１．組成物が、約３：１〜約１：１の比でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１２．組成物が、１：１の比でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１３．組成物がアジュバントを含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１４．組成物がアルミニウムアジュバントを含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１５．クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答が、少なくとも約６０日間持続する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１６．クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答が、少なくとも約１８０日間持続する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１７．クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答が、少なくとも約３６５日間持続する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１８．クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答が、少なくとも約５４０日間持続する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１９．２回目の投与が、１回目の投与の少なくとも７日後であり、３回目の投与が、１回目の投与の少なくとも３０日後である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ２０．３回目の投与が、１回目の投与の少なくとも３０日後である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ２１．２回目の投与が、１回目の投与の少なくとも７日後であり、３回目の投与が、１回目または２回目の投与の少なくとも１８０日後である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ２２．３回目の投与が、１回目の投与の少なくとも１８０日後である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ２３．組成物が、少なくとも９０％以上の純度を各々が有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ２４．組成物が、約３：１〜約１：１の比でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ２５．組成物が、１：１の比でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ２６．組成物がアジュバントを含む、請求項１に記載の方法。
Ｃ２７．組成物がアルミニウムアジュバントを含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ２８．クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答が、少なくとも約６０日間持続する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ２９．クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答が、少なくとも約１８０日間持続する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３０．クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答が、少なくとも約３６５日間持続する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３１．クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡが、アルミニウムアジュバントに結合される、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３２．クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢが、アルミニウムアジュバントに結合される、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３３．クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢが、凍結乾燥される、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３４．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３５．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも４倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３６．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも８倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３７．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも１６倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３８．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３９．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ４０．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも４倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ４１．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも８倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ４２．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも１６倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ４３．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ４４．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ４５．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも４倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ４６．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも８倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ４７．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも１６倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ４８．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ４９．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ５０．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも４倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ５１．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも８倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ５２．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも１６倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ５３．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ５４．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ５５．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも４倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ５６．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも８倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ５７．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも１６倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ５８．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ５９．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ６０．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも４倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ６１．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも８倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ６２．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも１６倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ６３．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ６４．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後に測定した場合、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ６５．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後に測定した場合、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ６６．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後に測定した場合、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ６７．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後に測定した場合、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ６８．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後に測定した場合、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ６９．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後のいずれか１つで測定した場合、第３の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ７０．組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第３の用量の約７、３０、６０、９０、１２０、３６５または５４０日後のいずれか１つで測定した場合、第３の用量を受けた後のヒトにおいて毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ７１．ヒトが、毒素Ｂについて血清陰性である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ７２．ヒトが、毒素Ａについて血清陰性である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ７３．ヒトが、毒素Ａおよび毒素Ｂについて血清陰性である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ７４．ヒトが、毒素Ｂについて血清陽性である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ７５．ヒトが、毒素Ａについて血清陽性である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ７６．ヒトが、毒素Ａおよび毒素Ｂについて血清陽性である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ７７．トキソイドが、メチオニンが存在しない配列番号４を含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ７８．トキソイドが、メチオニンが存在しない配列番号６を含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ７９．トキソイドが、メチオニンが存在しない、配列番号１〜８、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８〜３５、８２〜７６１のいずれか１つを含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ８０．トキソイドが、ホルムアルデヒド接触したクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａを含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ８１．トキソイドが、ホルムアルデヒド接触したクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂを含む、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ８２．トキソイドが、ホルムアルデヒドと接触されない、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ８３．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ００２由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ８４．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ００３由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ８５．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ００４由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ８６．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０１２由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ８７．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０１５由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ８８．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０１７由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ８９．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０２０由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ９０．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０２３由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ９１．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０２７由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ９２．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０２９由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ９３．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０４６由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ９４．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０５３由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ９５．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０５９由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ９６．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０７０由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ９７．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０７５由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ９８．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０７８由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ９９．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０８１由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１００．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ０８７由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１０１．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ１０６由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１０２．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ１１７由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１０３．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ１２６由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１０４．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ１３１由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１０５．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）リボタイプ１５４由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１０６．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型０由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１０７．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型Ｉ由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１０８．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型ＶＩＩＩ由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１０９．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型ＩＶ由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１１０．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型ＩＩＩ由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１１１．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型ＸＩＩＩ由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
Ｃ１１２．感染症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素型Ｖ由来である、条項Ｃ１に記載の方法。
配列番号１は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０毒素Ａ（ＴｃｄＡ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、配列番号１と比較して２８５および２８７位に変異を有する変異体ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、配列番号１と比較して２８５、２８７および７００位に変異を有する変異体ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、配列番号２と比較して２８６および２８８位に変異を有する変異体ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、配列番号２と比較して２８６、２８８および６９８位に変異を有する変異体ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、配列番号１と比較して２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２および７００位に変異を有する変異体ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、配列番号２と比較して２７０、２７３、２８６、２８８、４６１、４６３および６９８位に変異を有する変異体ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０毒素Ａ（ＴｃｄＡ）をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号１０は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号１１は、配列番号３をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号１２は、配列番号４をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号１３は、配列番号５をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号１４は、配列番号６をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号１５は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｒ２０２９１ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、配列番号１５をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号１７は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＣＤ１９６ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、配列番号１７をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１０４６３ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、配列番号１９をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号２１は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｒ２０２９１ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、配列番号２１をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号２３は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＣＤ１９６ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、配列番号２３をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号２５は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１０４６３ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、配列番号２５をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号２７は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１０４６３の病原性遺伝子座のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２８は、配列番号１の残基１０１〜２９３のアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、配列番号１の残基１〜５４２のアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、配列番号２の残基１０１〜２９３のアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、配列番号２の残基１〜５４３のアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、配列番号１の残基５４３〜８０９のアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、配列番号２の残基５４４〜７６７のアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、残基１０１、２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、５４１、５４２、５４３、５８９、６５５および７００が任意のアミノ酸であり得る変異体ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、残基１０２、２７０、２７３、２８６、２８８、３８４、４６１、４６３、５２０、５４３、５４４、５８７、６００、６５３、６９８および７５１が任意のアミノ酸であり得る変異体ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号４０は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号４１は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号４２は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号４３は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号４４は、配列番号３をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号４５は、配列番号４をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号４６は、配列番号５をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号４７は、配列番号６をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号４８は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドＯＤＮ ＣｐＧ ２４５５５のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４９は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号５０は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号５１は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号５２は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号５３は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号５４は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖の定常領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号５５は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号５６は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号５７は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号５８は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号５９は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号６０は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号６１は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号６２は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号６３は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号６４は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号６５は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖の定常領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号６６は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号６７は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号６８は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号６９は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号７０は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号７１は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号７２は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号７３は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号７４は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号７５は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号７６は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖の定常領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号７７は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号７８は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号７９は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号８０は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号８１は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号８２は、１０２、２７０、２７３、２８６、２８８、３８４、４６１、４６３、５２０、５４３、５４４、５８７、６００、６５３、６９８および７５１位の残基が任意のアミノ酸であり得る変異体ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号８３は、１位のメチオニンが存在しない、配列番号１と比較して２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２および７００位に変異を有する変異体ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号８４は、１位のメチオニンが存在しない、配列番号１と比較して２８５、２８７および７００位に変異を有する変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号８５は、１位のメチオニンが存在しない、配列番号２と比較して２７０、２７３、２８６、２８８、４６１、４６３および６９８位に変異を有する変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号８６は、１位のメチオニンが存在しない、配列番号２と比較して２８６、２８８および６９８位に変異を有する変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号８７は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４０１３ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号８８は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４１１１ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号８９は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４１１８ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９０は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４２０５ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９１は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４２０６ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９２は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５０２２ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９３は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５０８８ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９４は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５２８３ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９５は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５３２５ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９６は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５３５９ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９７は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００６０１７ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９８は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７０７０ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９９は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７２１７ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１００は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７３０２ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０１は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８１６ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０２は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８３８ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０３は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８５８ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０４は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８８６ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０５は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００８２２２ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０６は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９０７８ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０７は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９０８７ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０８は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９１４１ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０９は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９２９２ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１０は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４０１３ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１１は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４１１１ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１２は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４１１８ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１３は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４２０５ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１４は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４２０６ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１５は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５０２２ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１６は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５０８８ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１７は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５２８３ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１８は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５３２５ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１９は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５３５９ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２０は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００６０１７ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２１は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００６３７６ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２２は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７０７０ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２３は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７２１７ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２４は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７３０２ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２５は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８１６ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２６は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８３８ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２７は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８５８ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２８は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８８６ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２９は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００８２２２ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３０は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９０７８ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３１は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９０８７ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３２は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９１４１ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３３は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９２９２ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３４は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０１４ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３５は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０１５ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３６は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２０ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３７は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２３ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３８は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２７ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３９は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２９ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４０は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０４６ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４１は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０１４ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４２は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０１５ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４３は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２０ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４４は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２３ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４５は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２７ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４６は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２９ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４７は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０４６ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４８は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００１ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４９は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００２ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５０は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００３ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５１は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００４ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５２は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７０ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５３は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７５ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５４は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７７ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５５は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０８１ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５６は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１１７ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５７は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１３１ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５８は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００１ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５９は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００２ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６０は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００３ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６１は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００４ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６２は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７０ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６３は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７５ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６４は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７７ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６５は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０８１ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６６は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１１７ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６７は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１３１ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６８は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０５３ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６９は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７８ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７０は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０８７ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７１は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０９５ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７２は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１２６ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７３は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０５３ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７４は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７８ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７５は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０８７ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７６は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０９５ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７７は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１２６ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７８は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０５９ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７９は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０５９ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８０は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１０６ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８１は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１０６ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８２は、野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０１７ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８３は、配列番号１と比較して２８５、２８７、７００、９７２および９７８位に変異を有する変異体ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８４は、配列番号２と比較して２８６、２８８、６９８、９７０および９７６位に変異を有する変異体ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８５〜配列番号１９５は各々、例示的な変異体毒素のアミノ酸配列を示す。
配列番号１９６〜配列番号２１２は各々、例示的な変異体毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１３〜配列番号２２２は各々、例示的な変異体毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２３〜配列番号２３６は各々、例示的な変異体毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３７〜配列番号２４３は各々、例示的な変異体毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４４〜配列番号２４５は各々、例示的な変異体毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４６〜配列番号２４９は各々、例示的な変異体毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５０〜配列番号２５３は各々、例示的な変異体毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５４は、例示的な変異体毒素のアミノ酸配列を示す。
配列番号２５５〜配列番号２６３は各々、例示的な変異体毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６４〜配列番号２６９は各々、例示的な変異体毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７０〜配列番号２７５は各々、例示的な変異体毒素のアミノ酸配列を示す。
配列番号２７６〜配列番号３２３は各々、例示的な変異体毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２４〜配列番号３７３は各々、例示的な変異体毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号３７４〜配列番号４２１は各々、例示的な変異体毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号４２２〜配列番号４７１は各々、例示的な変異体毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号４７２〜配列番号５１９は各々、例示的な変異体毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号５６８〜配列番号６１５は各々、例示的な変異体毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号５２０〜配列番号５６７は各々、例示的な変異体毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号６１６〜配列番号６６３は各々、例示的な変異体毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号６６４〜配列番号７１１は各々、例示的な変異体毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号７１２〜配列番号７６１は各々、例示的な変異体毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。

Claims (29)

  1. ヒトにおいてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に対する免疫応答を惹起するための方法であって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを含む組成物の有効用量をヒトに投与するステップを含み、組成物が少なくとも２回投与され、２回目の投与が、１回目の投与の約３０日後であり、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答が、少なくとも約６０日間持続する、方法。
  2. 組成物が少なくとも３回投与される、請求項１に記載の方法。
  3. ３回目の投与が、１回目の投与の約１８０日後である、請求項１に記載の方法。
  4. 惹起される免疫応答が、抗毒素Ａ中和モノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 惹起される免疫応答が、抗毒素Ｂ中和モノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 惹起される免疫応答が、抗毒素Ａ中和モノクローナル抗体および抗毒素Ｂ中和モノクローナル抗体を含み、中和モノクローナル抗体の濃度が、少なくとも１０μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
  7. 組成物が、少なくとも９０％以上の純度を各々が有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 組成物が、約３：１〜約１：１の比でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む、請求項１に記載の方法。
  9. 組成物が、１：１の比でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 組成物がアジュバントを含む、請求項１に記載の方法。
  11. 組成物がアルミニウムアジュバントを含む、請求項１に記載の方法。
  12. クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答が、少なくとも約１８０日間持続する、請求項１に記載の方法。
  13. クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答が、少なくとも約３６５日間持続する、請求項１に記載の方法。
  14. クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する免疫応答が、少なくとも約５４０日間持続する、請求項１に記載の方法。
  15. クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢが凍結乾燥される、請求項１に記載の方法。
  16. 組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、請求項１に記載の方法。
  17. 組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、請求項１に記載の方法。
  18. 組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、請求項１に記載の方法。
  19. 組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第１の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、請求項１に記載の方法。
  20. 組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、請求項１に記載の方法。
  21. 組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ａ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ａ特異的中和抗体濃度を誘導する、請求項１に記載の方法。
  22. 組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、請求項１に記載の方法。
  23. 組成物が、細胞毒性アッセイにおいて同一の条件下で測定した場合に、第１の用量を受ける前のヒトにおける毒素Ｂ特異的中和抗体濃度よりも、第２の用量を受けた後のヒトにおいて少なくとも３２倍高い毒素Ｂ特異的中和抗体濃度を誘導する、請求項１に記載の方法。
  24. ヒトが、毒素Ｂについて血清陰性である、請求項１に記載の方法。
  25. ヒトが、毒素Ａについて血清陰性である、請求項１に記載の方法。
  26. ヒトが、毒素Ａおよび毒素Ｂについて血清陰性である、請求項１に記載の方法。
  27. ヒトが、毒素Ｂについて血清陽性である、請求項１に記載の方法。
  28. ヒトが、毒素Ａについて血清陽性である、請求項１に記載の方法。
  29. ヒトが、毒素Ａおよび毒素Ｂについて血清陽性である、請求項１に記載の方法。
JP2018179963A 2017-09-28 2018-09-26 クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答を惹起するための組成物および方法 Active JP7355490B2 (ja)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762565096P 2017-09-28 2017-09-28
US62/565,096 2017-09-28
US201762576603P 2017-10-24 2017-10-24
US62/576,603 2017-10-24
US201762577661P 2017-10-26 2017-10-26
US62/577,661 2017-10-26
US201862720617P 2018-08-21 2018-08-21
US62/720,617 2018-08-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2019065001A true JP2019065001A (ja) 2019-04-25
JP7355490B2 JP7355490B2 (ja) 2023-10-03

Family

ID=63713968

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018179963A Active JP7355490B2 (ja) 2017-09-28 2018-09-26 クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答を惹起するための組成物および方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20200254081A1 (ja)
EP (1) EP3687570A1 (ja)
JP (1) JP7355490B2 (ja)
KR (1) KR102625114B1 (ja)
CN (1) CN111629750A (ja)
AU (1) AU2018343217A1 (ja)
BR (1) BR112020005631A2 (ja)
CA (1) CA3076961A1 (ja)
IL (1) IL273336A (ja)
MX (1) MX2020003756A (ja)
WO (1) WO2019064115A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2754446C2 (ru) 2011-04-22 2021-09-02 ВАЙЕТ ЭлЭлСи Композиции, относящиеся к мутантному токсину CLOSTRIDIUM DIFFICILE, и способы их применения
BR122016023101B1 (pt) 2012-10-21 2022-03-22 Pfizer Inc Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile
EP4168032A2 (en) * 2020-06-19 2023-04-26 Pfizer Inc. Immunogenic compositions against clostridioides (clostridium) difficile and methods thereof
WO2023242817A2 (en) 2022-06-18 2023-12-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014083054A (ja) * 2012-10-21 2014-05-12 Pfizer Inc 突然変異クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に関する組成物および方法
JP2014514318A (ja) * 2011-04-22 2014-06-19 ワイス・エルエルシー 変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素に関する組成物およびその方法
JP2016521754A (ja) * 2013-06-14 2016-07-25 サノフィ パストゥール インコーポレイテッド クロストリジウム・ディフィシル（ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対して免疫する組成物及び方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
ES2333069T3 (es) 1997-03-10 2010-02-16 Ottawa Hospital Research Institute Uso de acidos nucleicos que contienen dinucleotido cpg no metilado en combinacion con alumbre como adyuvante.
EP1568378B1 (en) * 1997-10-20 2016-03-16 Sanofi Pasteur Biologics, LLC Immunization against Clostridium difficile disease
WO1999020304A1 (en) * 1997-10-20 1999-04-29 Oravax, Inc. Passive immunization against clostridium difficile disease
IL145982A0 (en) 1999-04-19 2002-07-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
PT2376107E (pt) 2008-12-09 2014-07-25 Coley Pharm Group Inc Oligonucleotídeos imunoestimulantes

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014514318A (ja) * 2011-04-22 2014-06-19 ワイス・エルエルシー 変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素に関する組成物およびその方法
JP2014083054A (ja) * 2012-10-21 2014-05-12 Pfizer Inc 突然変異クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に関する組成物および方法
JP2016521754A (ja) * 2013-06-14 2016-07-25 サノフィ パストゥール インコーポレイテッド クロストリジウム・ディフィシル（ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対して免疫する組成物及び方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VACCINE (2016) VOL.34, ISSUE 18, P.2082-2091, JPN6022031411, ISSN: 0005023932 *
VACCINE (2016) VOL.34, ISSUE 19, P.2170-2178, JPN6022031412, ISSN: 0005023933 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3076961A1 (en) 2019-04-04
WO2019064115A1 (en) 2019-04-04
KR102625114B1 (ko) 2024-01-12
RU2020112504A3 (ja) 2021-10-28
MX2020003756A (es) 2020-07-29
KR20200057757A (ko) 2020-05-26
BR112020005631A2 (pt) 2020-12-29
CN111629750A (zh) 2020-09-04
EP3687570A1 (en) 2020-08-05
JP7355490B2 (ja) 2023-10-03
IL273336A (en) 2020-05-31
AU2018343217A1 (en) 2020-04-02
US20200254081A1 (en) 2020-08-13
RU2020112504A (ru) 2021-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11484582B2 (en) Methods and compositions for immune protection against extra-intestinal pathogenic E. coli
JP7119245B2 (ja) 髄膜炎菌組成物およびその方法
JP7355490B2 (ja) クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答を惹起するための組成物および方法
US11419930B2 (en) Compositions and methods for immunizing against C. difficile
KR101905278B1 (ko) 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
JP2020128372A (ja) 髄膜炎菌組成物およびその方法
US20220160859A1 (en) Compositions and methods for eliciting an immune response against clostridium difficile
US20230218735A1 (en) Immunogenic compositions against clostridioides (clostridium) difficile and methods thereof
Frey et al. Alternative vaccination against equine botulism (BoNT/C)

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210910

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20220727

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220803

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20221024

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230116

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230329

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230608

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230629

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230906

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230921

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7355490

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150