CN101839898B - 糖类的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可对甘露糖-6-磷酸进行分析的柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法。一种分离分析方法，它是还原糖的采用柱色谱法的分离分析方法，包括下述步骤：将试样装载于阴离子交换树脂柱中，藉由使足量的由含水溶性无机盐的硼酸水溶液形成的第一流动相通过所述柱来对柱进行清洗，供给将所述盐的浓度提高了的第二流动相来将还原糖洗脱，向洗脱液中添加碱性氨基酸，加热，连续地测定并记录照射激发光而发射的荧光的强度。

Description

糖类的分析方法
技术领域
本发明涉及糖类的分析方法，特别是涉及采用柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法的还原糖和甘露糖-6-磷酸的分析方法。。
背景技术
作为还原糖的分析方法，已知下述方法：向将水用作流动相使试样经液相色谱而得的洗脱液中加入含精氨酸等碱性氨基酸的硼酸水溶液，进行加热反应后冷却，对该反应液照射激发光并测定荧光强度或吸光度(专利文献1)。该方法中所用的装置是下述装置：将液相色谱的流出管路延长，在该流路上连接含碱性氨基酸的硼酸水溶液的供给路径，其后安装有加热装置、冷却装置、激发光的照射装置和荧光强度等的测定装置。该方法中需要设置用于向经液相色谱而得的洗脱液加入含碱性氨基酸的硼酸水溶液而使其反应的供给路径。
此外，作为上述方法的改良型，已知下述方法：使试样经采用含作为反应试剂的精氨酸等碱性氨基酸和硼酸的流动相的液相色谱进行洗脱，加热所得的洗脱液而使反应试剂与糖类进行反应(加热反应)后冷却，对该反应液照射激发光并测定荧光强度或吸光度(专利文献2)。该方法中，因为采用含碱性氨基酸的硼酸水溶液作为液相色谱的流动相，所以不需要设置用于加入含碱性氨基酸的硼酸水溶液而使其反应的供给路径。上述的还原糖分析法被称为柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法。
上述的还原糖分析法都在检测中利用了还原糖通过在硼酸的存在下与精氨酸等碱性氨基酸的加热反应生成强荧光衍生物的特性(非专利文献1)。该荧光衍生物是通过还原糖与作为胺化合物的碱性氨基酸的加热反应、即美拉德反应而生成的呈褐色的类黑精，该衍生物如果受到作为激发光的波长320nm的光的照射，则发射波长430nm的光。此外，这些还原糖分析法利用了还原糖具有容易与硼酸结合而生成阴离子性配位离子的性质且该阴离子性配位离子被保持于阴离子交换色谱的特性。
柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法中，作为流动相，采用含0.01～5％的浓度的碱性氨基酸和0.05～0.5M的浓度的硼酸的水溶液(pH7～10)。这时所用的碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸等。另外，最近还已知作为液相色谱的流动相使用由0.1M硼缓冲液和0.4M硼酸缓冲液形成的梯度来进行糖的分离(专利文献3、4)。
柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法中，液相色谱中的试样洗脱在室温～70℃的温度下进行，而加热反应、即美拉德反应在140～180℃进行(专利文献2)。因为在这样的高温下以高硼酸浓度进行洗脱和反应，所以有时流动相中所含的硼酸会析出而堵塞管道。管道堵塞时就无法进行分析，因此必须经过管道的更换和清洗等费时费力的操作来重新开始分析。这是柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法中未解决的重要问题之一。
此外，可通过柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法分析的还原糖有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、鼠李糖等单糖，麦芽糖、麦芽三糖等寡糖，葡糖胺、半乳糖胺等氨基糖，葡糖醛酸等糖醛酸。
作为该方法的分析对象，可以例举糖蛋白的糖链。构成糖蛋白的糖链的还原糖有甘露糖、半乳糖、岩藻糖等中性糖和半乳糖胺等氨基糖等。糖链有时还包含甘露糖被1分子的磷酸修饰而得的甘露糖-6-磷酸(M6P)。
糖蛋白的糖链中所含的M6P具有在蛋白质被摄入细胞内时与细胞膜上的甘露糖-6-磷酸受体结合而促进该摄入的重要功能。作为糖链中含M6P的糖蛋白，已知局部存在于溶酶体中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)等溶酶体酶(非专利文献2)。溶酶体酶中有使用重组技术制成的酶，被用作该酶的遗传性缺失的患者的治疗药，例如α-半乳糖苷酶A和葡糖脑苷脂酶。溶酶体酶由于在细胞内发挥功能，因此为了使通过静脉注射等方法给予患者的溶酶体酶发挥药效，溶酶体酶必须被摄入患者的细胞内，因而需要在溶酶体酶的糖链中包含M6P。因此，进行构成这样的酶的糖链的糖类时，对M6P的分析是特别重要的。柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法可以用作各种糖类的分析技术，但尚未确立采用该方法的M6P的分析技术。
专利文献1：日本专利特开昭58-216953号公报
专利文献2：日本专利特开昭61-25059号公报
专利文献3：日本专利特开2006-184131号公报
专利文献4：日本专利特开2008-245550号公报
非专利文献1：Mikami H.等，《分析化学》(1983)32，E207
非专利文献2：Bielicki J.等，Biochem J.(1993)289，241-246
专利文献：
发明内容
在上述背景下，本发明的一项目的在于调整柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法中所用的阴离子性配位离子对于阴离子交换树脂的保持力，在实现M6P的分析的同时，提高该方法对甘露糖、岩藻糖、葡萄糖等中性还原糖的分析能力。
此外，本发明的另一项目的在于，实质上消除该方法的管道因流动相中所含的硼酸的析出而堵塞的问题。针对上述目的的研究中，本发明人尝试了在柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法中，使用硼酸和水溶性的如氯化钠等中性无机盐的水溶液作为流动相。结果发现，对于这样的流动相，可以通过水溶性的中性无机盐的浓度来调节阴离子性配位离子对于阴离子交换树脂的保持力，而且令人吃惊的是，能够对无法通过现有方法分析的M6P进行分析。此外，也发现与现有方法相比，可以显著地改善对甘露糖、岩藻糖、葡萄糖等中性还原糖的分析能力。另外，还发现通过添加氯化钠，可以降低流动相中所含的硼酸的浓度，能够实质上消除柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法的管道因硼酸的析出而堵塞的问题。
本发明是基于这些发现而完成的发明。
即，本发明提供以下的技术方案。
1.一种分离分析方法，它是试样中所含的还原糖的采用柱色谱法的分离分析方法，其中，包括下述步骤：
将试样装载于阴离子交换树脂柱中，藉由使足量的由含规定浓度的水溶性无机盐的规定浓度的硼酸水溶液形成的第一流动相通过所述柱来对柱进行清洗；
以规定的流速连续地向所述柱供给将所述盐的浓度提高至高于所述第一流动相的第二流动相，藉由所述第二流动相将还原糖洗脱；
将来自所述柱的洗脱液连续地导入流路中；
通过在所述流路的规定位置以规定速度连续地向所述洗脱液中添加至少1种碱性氨基酸，从而形成在所述流路中连续地流动的混合溶液；
通过使所述混合溶液用规定时间通过所述流路的规定温度的加热区域，从而对所述混合溶液进行加热；
在所述流路的规定位置对加热后的在所述流路中流动的所述混合溶液连续地照射激发光的同时，连续地测定并记录从所述混合溶液发射的荧光的强度。
2.如上述1所述的分离分析方法，其中，所述第一流动相的硼酸浓度为50～150mM，所述水溶性无机盐的浓度为10～30mM。
3.如上述2所述的分离分析方法，其中，所述第一流动相及第二流动相的硼酸浓度为75～125mM。
4.如上述1～3中的任一项所述的分离分析方法，其中，所述第一流动相及第二流动相的pH为7.5～9.5。
5.如上述1～4中的任一项所述的分离分析方法，其中，所述水溶性无机盐是氯化钠。
6.如上述1～5中的任一项所述的分离分析方法，其中，在将所述柱加热至70℃以下的温度的状态下进行还原糖的分离。
7.如上述1～6中的任一项所述的分离分析方法，其中，所述碱性氨基酸以在所述混合溶液中达到0.1～2w/v％的浓度的条件添加。
8.如上述1～7中的任一项所述的分离分析方法，其中，所述碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
9.如上述1～8中的任一项所述的分离分析方法，其中，所述规定温度的加热区域的温度为140～180℃。
10.如上述1～9中的任一项所述的分离分析方法，其中，所述第二流动相的所述盐的浓度至少被提高至200mM。
11.如上述1～10中的任一项所述的分离分析方法，其中，还原糖包含中性糖。
12.如上述1～11中的任一项所述的分离分析方法，其中，还原糖包含甘露糖、葡萄糖或岩藻糖。
13.如上述1～12中的任一项所述的分离分析方法，其中，还原糖包含甘露糖-6-磷酸。
14.一种水溶液，该水溶液用于在上述1～13中的任一项所述的分离分析方法中用作所述第一流动相，含50～150mM硼酸和10～30mM氯化钠。
15.一种水溶液，该水溶液用于在上述1～13中的任一项所述的分离分析方法中与所述第一流动相混合来制备所述第二流动相，含50～150mM硼酸和200～250mM氯化钠。
16.一种固体组合物，该组合物用于溶解于水来制备上述14所述的水溶液，以1∶0.1～1∶0.5的摩尔比含有硼酸和氯化钠。
17.一种固体组合物，该组合物用于溶解于水来制备上述15所述的水溶液，以1∶1.5～1∶2.5的摩尔比含有硼酸和氯化钠。
本发明对于柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法，可实现M6P的分析，且提高还原糖的分析能力。此外，由于硼酸的使用浓度低于以往的柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法，因此也可以实质上消除该方法的管道堵塞的问题。
附图说明
图1是模式化表示装置的配置和流路的图。
图2-1是表示采用新方法的中性还原糖混合物标准溶液的分析结果的色谱图。
图2-2是表示采用现有方法的中性还原糖混合物标准溶液的分析结果的色谱图。
图3-1是表示采用新方法的M6P标准溶液的分析结果的色谱图。
图3-2是表示采用现有方法的M6P标准溶液的分析结果的色谱图。
图4-1是表示采用新方法的中性糖混合物标准溶液和M6P标准溶液的混合液的分析结果的色谱图。
图4-2是表示采用现有方法的中性糖混合物标准溶液和M6P标准溶液的混合液的分析结果的色谱图。
符号说明
1：自动进样器，2：柱加热器，3：柱，4：加热单元，5：荧光检测器，A：溶液A(A’)，B：溶液(B’)，C：反应试样液。
具体实施方式
本发明中，“硼酸水溶液”一词也包括为了适当调整pH而添加有如氢氧化钠或硼酸钠等少量的作为pH调整剂的碱的硼酸水溶液。
本发明中，对于硼酸水溶液，提到“硼酸浓度”时，是指将该水溶液中的硼换算为硼酸(H3BO3)时的浓度。因此，也包括以如硼酸钠等盐的形式添加的硼酸。
本发明中，为了提高第二流动相中所含的盐的浓度，例如将提高了盐浓度的其他硼酸水溶液在提高其配比的同时加入至第一流动相中即可。这时，该配比可以连续地提高，也可以间断地提高，较好是连续地提高，特别好是线性地提高，即以恒定的速度连续地提高。第二流动相中的盐浓度的上升进行至作为分析对象的还原糖洗脱即可。通常使盐浓度上升至200mM附近即可，但也可以使其进一步提高，例如可以进行至盐浓度达到250mM。
本发明中，流动相中所含的盐只要是水溶性的除硼酸盐以外的无机盐即可，没有特别限定，较好是溶于水时呈中性的中性盐，特别好是氯化钠、氯化钾。
本发明中，只要可以进行糖类的分析、特别是根据目的进行的中性还原糖或M6P的分析，流动相的硼酸浓度没有限定，较好是在50～150mM的范围内，更好是75～125mM，特别好是约100mM。
本发明中，流动相的pH较好是在7.5～9.5的范围内，特别好是约9。
作为本发明中的用于阴离子交换柱色谱的阴离子交换树脂，可以使用弱阴离子交换树脂和强阴离子交换树脂中的任一种，较好是使用强阴离子交换树脂。此外，基于阴离子交换柱色谱法的洗脱可以在室温下进行，较好是加热柱来进行。但是，这时的加热温度在约70℃以下，较好是约65℃。
作为本发明中使用的碱性氨基酸，没有特别限定，较好是精氨酸、赖氨酸、组氨酸，特别好是精氨酸。此外，碱性氨基酸可以单独使用任一种，也可以将多种氨基酸制成混合物来使用。此外，这时的碱性氨基酸的添加通过将含有该碱性氨基酸的水溶液注入至在流路中流动的来自柱的洗脱液来进行。碱性氨基酸的注入速度只要在一次分析期间保持恒定即可，可以是任意的。通常，以在流路内与来自柱的洗脱液混合后的浓度(最终浓度)达到0.1～2w/v％的条件注入，较好是以达到0.5～1.8w/v％的条件注入，更好是以达到1.0～1.5w/v％的条件注入。碱性氨基酸的添加较好是通过例如以含有该碱性氨基酸的硼酸水溶液的形式注入流路的方法来进行。该情况下，硼酸浓度可以与流动相的硼酸浓度一致，但也可以存在一定程度的差异。
本发明中，将洗脱液与碱性氨基酸一起加热而使其进行反应(加热反应)时的反应温度可以设为140～180℃，较好是约150℃。此外，这时的反应是糖分子中的还原性基团与碱性氨基酸反应而生成褐色物质、即类黑精的美拉德反应。
本发明中，对加热反应后的反应液照射作为激发光的波长约320nm的紫外线，荧光强度的测定针对由此发射的波长约430nm的荧光进行。这时，为了防止噪声的产生，较好是在测定荧光强度之前预先通过冷却装置等将反应液冷却至室温左右。
可通过本发明进行分析的糖类是与碱性氨基酸发生美拉德反应的还原糖。作为例子，可以例举葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、鼠李糖等单糖，麦芽糖、麦芽三糖等寡糖，葡糖胺、半乳糖胺等氨基糖，葡糖醛酸等糖醛酸以及磷酸化糖等；特别是甘露糖、葡萄糖、岩藻糖等中性糖和甘露糖-6-磷酸等磷酸化糖。
此外，本发明的方法中所使用的流动相作为试剂预先准备在提高分析操作的便捷性方面是有利的。试剂的形态可以是水溶液，也可以是通过用纯水溶解而形成流动相的固体组合物(粉末、颗粒等)。水溶液的情况下，用作第一流动相的试剂是含优选为50～150mM、更优选为75～125mM、例如约100mM的硼酸和10～30mM的氯化钠的pH7.5～9.5的水溶液。pH的调整例如可以通过添加氢氧化钠来实现，也可以通过将硼酸的一部分置换为硼酸钠(例如硼砂)来实现，由其中的任一种方法获得的水溶液为同一组成。
此外，用于添加、混合于第一流动相来制备第二流动相的水溶液形式的试剂例如是含优选为50～150mM、更优选为75～125mM、例如约100mM的硼酸和优选200～250mM、例如约200mM的氯化钠的pH7.5～9.5的水溶液。
作为用于单纯地溶解来制备第一流动相的试剂的固体组合物的情况下，试剂是以溶于水后可使硼酸浓度为50～150mM、较好是75～125mM、例如约100mM且氯化钠浓度为10～30mM的比例掺合了硼酸和氯化钠的固体组合物。因此，采用例如以1∶0.1～1∶0.5的摩尔比含有硼酸和氯化钠的固体组合物即可。这时，通过掺入适量的硼酸钠来代替一部分硼酸，可以预先调整制成水溶液时的pH。
该情况下，为了以溶于规定量的水时可获得那样的pH的条件配制，例如预先制备少量目标水溶液，测定使其达到该范围内的pH所需的硼酸量和硼酸钠(硼砂等)量，再基于这些量根据要制备的液量配制适当量的硼酸和硼酸钠(硼砂等)即可。此外，通过添加氢氧化钠来调整水溶液的pH的情况下，与和所需的氢氧化钠的Na离子的摩尔数相同的摩尔数的Na离子对应的硼酸钠量是以硼酸钠代替氢氧化钠来进行pH调整时的硼酸钠的需要量。此外，硼酸的使用量减少与来源于所添加的硼酸钠的硼的摩尔数对应的量。
为了添加、混合于第一流动相来制备第二流动相而制备含高浓度的氯化钠的水溶液，作为用于溶于水来制备所述水溶液的试剂的固体组合物是以制成水溶液时的硼酸的浓度优选为50～150mM、更优选为75～125mM、例如约100mM的硼酸且氯化钠的浓度为200～250mM的pH达到7.5～9.5的条件配制的组合物。因此，采用例如以1∶1.5～1∶2.5的摩尔比含有硼酸和氯化钠的固体组合物即可。
实施例
以下，参照实施例来对本发明进行更详细的说明，但并不表示本发明受到实施例的限定。
〔标准溶液的制备〕
将30mg的D(+)-甘露糖、10mg的L(-)-岩藻糖、30mg的D(+)-半乳糖溶解于纯水，定容为100mL。将在18mL该水溶液中加入纯水而定容为50mL的溶液作为中性还原糖混合物标准溶液。此外，将20mg的甘露糖-6-磷酸钠盐溶于纯水而定容为100mL的溶液作为M6P标准原液。M6P标准原液以1mL为单位分装灌注并于-20℃保存，使用时溶解，将用纯水稀释2倍而得的溶液作为M6P标准溶液。
〔流动相用的溶液的制备(新方法用)〕
将6.2g硼酸加入纯水中溶解，使用2N氢氧化钠调整至pH9.0后，加入纯水将总量定容为1000mL，使用0.22μm的膜滤器抽滤。将所得的溶液记作溶液A(100mM硼酸溶液(pH9.0))。此外，将6.2g硼酸和11.7g氯化钠加入纯水中溶解，使用2N氢氧化钠调整至pH9.0后，加入纯水将总量定容为1000mL，使用0.22μm的膜滤器抽滤。将所得的溶液记作溶液B(100mM硼酸-200mM氯化钠溶液(pH9.0))。
〔流动相用的溶液的制备(现有方法用)〕
将6.2g硼酸加入纯水中溶解，使用2N氢氧化钠调整至pH8.0后，加入纯水将总量定容为1000mL，使用0.22μm的膜滤器抽滤。将所得的溶液记作溶液A’(100mM硼酸溶液(pH8.0))。将24.8g硼酸加入纯水中溶解，使用2N氢氧化钠调整至pH9.0后，加入纯水将总量定容为1000mL，使用0.22μm的膜滤器抽滤。将所得的溶液记作溶液B’(400mM硼酸水溶液(pH9.0))。
〔反应试样液的制备〕
将10g L-精氨酸和30g硼酸加入纯水中溶解，将总量定容为1000mL，使用0.22μm以下的膜滤器抽滤，将所得的溶液作为反应试样液。
〔采用柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法的糖分析(1)〕
(1)装置
在岛津HPLC系统LC-10Avp(还原糖分析系统)中设置作为阴离子交换柱的Shim-pack ISA-07/S2504(4.0mmI.D.×250mm)(基材：聚苯乙烯凝胶，固定相；季铵基)，再设置作为用于加热该柱的柱加热器的Shim-pack保护柱ISA(4.0mmI.D.×50mm)。此外，在柱的流出口的下游设置加热反应用的加热单元(ALB-221，旭科技玻璃株式会社(旭テクノグラス)制)。通过柱加热器将柱加热至65℃的同时，将加热单元设置为150℃。此外，在加热单元的下游设置荧光检测器，设置为照射作为激发光的波长320nm的紫外线并检测波长430nm的荧光。装置的配置和流路模式化示于图1。
(2)操作步骤
将溶液A和溶液B加样于还原糖分析系统的自动进样器，再设置为从柱的流出口的下游(加热单元的上游)供给反应试样液的状态。用色谱分析开始时的流动相(溶液A)平衡柱后，将中性还原糖混合物标准溶液和M6P标准溶液或者它们的混合溶液装载于柱。
新方法中，将糖类的标准溶液装载于柱后，使将溶液A和溶液B以90∶10的体积比混合而制成的第一流动相(因此硼酸100mM，氯化钠20mM)以0.3mL/分钟的流速通入柱35分钟后，以同一流速用25分钟将溶液A和溶液B的体积比线性地提高至25∶75(因此硼酸100mM，氯化钠提高至150mM)，再使溶液B的添加比例达到100％(因此硼酸100mM，氯化钠200mM)并以同一流速通入10分钟，然后与第一流动相的情况同样地使溶液A和溶液B以90∶10的体积比(因此硼酸100mM，氯化钠20mM)以同一流速通入。此外，反应试样液在柱的流出口的下游以0.2mL/分钟的速度供给至流路。因此，反应混合液中的精氨酸浓度为3×0.2/(0.3+0.2)＝1.2w/v％。
现有方法中，将糖类的标准溶液装载于柱后，用50分钟将溶液A’和溶液B’的体积比连续地从100∶0提高至0∶100(因此，硼酸从100mM提高至400mM)的同时，以0.6mL/分钟的流速通入柱后，仅使溶液B’(400mM硼酸)以同一流速通入20分钟，然后仅使溶液A’(100mM)以同一流速通入。此外，反应试样液在柱的流出口的下游以0.5mL/分钟的速度供给至流路。因此，反应混合液中的精氨酸浓度为3×0.5/(0.6+0.5)＝1.36w/v％。
新方法和现有方法中的各溶液的组成和色谱分析的条件示于表1，溶液B、B’的比例分别示于表2。
表1.各溶液的组成和色谱分析的条件
  新方法   现有方法
  检测方法(荧光)   激发光320nm，荧光430nm   激发光320nm，荧光430nm
  溶液A，A’   100mM硼酸(pH9.0)   100mM硼酸(pH8.0)
  溶液B，B’   100mM硼酸，200mM NaCl(pH9.0)   400mM硼酸(pH9.0)
  流动相流速   0.3mL/分钟   0.6mL/分钟
  柱温   65℃   65℃
  反应试样液   1w/v％硼酸，3w/v％dl-精氨酸   1w/v％硼酸，3w/v％dl-精氨酸
  反应试样液注入速度   0.2mL/分钟   0.5mL/分钟
  反应槽温度   150℃   150℃
表2.溶液B，B’的比例
Figure GSA00000061562300101
(注)时间以试样的装载时为基准(0分钟)。
〔中性糖混合物标准溶液的分析〕
通过新方法对中性糖混合物标准溶液进行分析后，获得表示来源于甘露糖、岩藻糖和半乳糖的荧光的强度的完全分离的各峰(图2-1)。另一方面，通过现有方法对中性糖混合物标准溶液进行分析后，来源于甘露糖、岩藻糖和半乳糖的各峰未完全分离，特别是获得来源于岩藻糖和半乳糖的重叠的峰(图2-2)。由这些结果可知，新方法作为中性糖的分析方法，特别是作为定量的分析方法比现有方法更佳。
〔M6P标准溶液的分析〕
通过新方法对M6P标准溶液进行分析后，获得来源于M6P的峰(图3-1)。另一方面，通过现有方法对M6P标准溶液进行分析后，未获得来源于M6P的峰(图3-2)。这被认为是将氯化钠向流动相的掺入使其他还原糖的同时分析成为可能，而且对于对阴离子交换树脂的保持力产生调整性的作用，使得对于现有方法中牢固地结合于阴离子交换树脂而无法容易地洗脱的M6P的保持力下降。还有，新方法的上述实施例中，M6P在将流动相中的氯化钠浓度暂时提高至200mM的10分钟中未与中性糖一起洗脱，然后使氯化钠浓度降低至20mM后发现洗脱，由实施例整体的结果可知，氯化钠浓度越高，则M6P越容易洗脱，所以可知即使不使流动相的氯化钠的浓度从200mM降下而直接流入维持柱，也可以实现M6P的分离。
〔中性糖混合物标准溶液和M6P标准溶液的混合液〕
通过新方法对中性糖混合物标准溶液和M6P标准溶液的混合液进行分析后，获得来源于甘露糖、岩藻糖、半乳糖和M6P的完全分离的峰(图4-1)。另一方面，通过现有方法对中性糖混合物标准溶液和M6P标准溶液的混合液进行分析后，来源于甘露糖、岩藻糖和半乳糖的各峰未完全分离，也未能获得来源于M6P的峰(图4-2)。这些结果显示，新方法作为甘露糖、岩藻糖、半乳糖等中性糖的分析技术以及M6P的分析技术，特别是作为它们的定量分析方法，远远优于现有方法。此外，确认如果采用新方法，则可以同时对M6P和甘露糖进行分析，因此通过对M6P分解而产生的甘露糖进行定量，可以对糖链、构成糖蛋白的M6P的稳定性进行评价。
产业上利用的可能性
本发明可以用作还原糖的新分析法，该方法对于柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法，可实现M6P的分析，且提高中性糖间的分离能力，还解决了该方法的管道堵塞的问题。

Claims (14)

1.一种分离分析方法，它是试样中所含的还原糖的采用柱色谱法的分离分析方法，其特征在于，包括下述步骤：
将试样装载于阴离子交换树脂柱中，藉由使足量的由含有选自氯化钠或者氯化钾的浓度为10－30mM的水溶性无机盐的浓度为50－150mM的硼酸水溶液形成的第一流动相通过所述柱来对柱进行清洗；
以规定的流速连续地向所述柱供给将所述盐的浓度提高至高于所述第一流动相的第二流动相，藉由所述第二流动相将还原糖洗脱；
将来自所述柱的洗脱液连续地导入流路中；
通过在所述流路的规定位置以规定速度连续地向所述洗脱液中添加至少1种碱性氨基酸，从而形成在所述流路中连续地流动的混合溶液；
通过使所述混合溶液用规定时间通过所述流路的规定温度的加热区域，从而对所述混合溶液进行加热；
在所述流路的规定位置对加热后的在所述流路中流动的所述混合溶液连续地照射激发光的同时，连续地测定并记录从所述混合溶液发射的荧光的强度。
2.如权利要求1所述的分离分析方法，其特征在于，所述第一流动相及第二流动相的硼酸浓度为75～125mM。
3.如权利要求1或2所述的分离分析方法，其特征在于，所述第一流动相及第二流动相的pH为7.5～9.5。
4.如权利要求1或2所述的分离分析方法，其特征在于，所述水溶性无机盐是氯化钠。
5.如权利要求1或2所述的分离分析方法，其特征在于，在将所述柱加热至70℃以下的温度的状态下进行还原糖的分离。
6.如权利要求1或2所述的分离分析方法，其特征在于，所述碱性氨基酸以在所述混合溶液中达到0.1～2w/v％的浓度的条件添加。
7.如权利要求1或2所述的分离分析方法，其特征在于，所述碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
8.如权利要求1或2所述的分离分析方法，其特征在于，所述规定温度的加热区域的温度为140～180℃。
9.如权利要求1或2所述的分离分析方法，其特征在于，所述第二流动相的所述盐的浓度至少被提高至200mM。
10.如权利要求1或2所述的分离分析方法，其特征在于，还原糖包括中性糖。
11.如权利要求1或2所述的分离分析方法，其特征在于，还原糖包含甘露糖、葡萄糖或岩藻糖。
12.如权利要求1或2所述的分离分析方法，其特征在于，还原糖包含甘露糖-6-磷酸。
13.一种水溶液，其特征在于，用于在权利要求1或2所述的分离分析方法中用作所述第一流动相，含50～150mM硼酸和10～30mM氯化钠。
14.一种固体组合物，其特征在于，用于溶解于水来制备权利要求13所述的水溶液，以1:0.1～1:0.5的摩尔比含有硼酸和氯化钠。
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