CN101838397A - 胶原溶解及再生方法 - Google Patents

Abstract

胶原溶解及再生方法，其目的是为了提供一种简便的胶原溶解方法，同时还提供了将溶解后的胶原再生成膜、纤维、微球或粉状等各种形态的胶原制品的方法。为实现这一目的，本发明采用的技术方案为：胶原溶解方法，是利用离子液体做溶剂溶解胶原，所述离子液体为为烷基咪唑类离子液体：1-甲基-3-丁基卤代咪唑、1-丁基-3-甲基卤代咪唑、1-乙基-3-甲基卤代咪唑、1-烯丙基-3-甲基卤代咪唑或二卤二(3，3′-二甲基)咪唑基亚砜盐。胶原再生方法，是利用所述胶原溶解方法制备胶原/离子液体溶液，然后用凝固剂洗去溶液中的离子液体后得到再生胶原。本发明的胶原溶解及再生方法步骤简单、无毒无害、安全性高，为胶原制品的研究和推广应用奠定了良好的基础。

Description

胶原溶解及再生方法

技术领域

本发明涉及一种溶解胶原(collagen)的方法，以及进一步利用水或其他凝固浴将溶解的胶原再生为多种形态的方法。

背景技术

胶原是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质之一，广泛存在于动物的结缔组织、皮肤、骨骼、肌腱、内脏、细胞间质、韧带、血管、巩膜等部位，占动物体内蛋白质总量的25～30％，是动物体内主要的结构蛋白。作为一种优良的可再生天然高分子资源，胶原具有优异的生物相容性和可降解性，已在生物医学材料、皮革化学与工程、日化工业、食品工业等领域得到广泛的应用或具有广阔的应用前景。近年来，由于石油资源短缺、环境恶化及可持续发展的挑战，具有来源丰富、可再生、可生物降解等优良特性的胶原已成为最为重要的有机天然资源之一。

胶原具有完整的四级结构：胶原的每一条肽链形成左手α-螺旋结构，每三条左手螺旋多肽链相互缠绕，形成一个右手超螺旋结构(原胶原)，多肽链内和链间由数量众多的氢键、离子键、疏水键、范德华力等相互作用以保持螺旋结构稳定。由于三股螺旋的旋转方向与构成它们的多肽链的旋转方向相反，因而不易解旋，使胶原具有极高的强度和结构稳定性。原胶原首尾相接，按规则平行排列成束，首尾错位1/4，通过共价键搭接交联，形成稳定的胶原微纤维(microfibril)，并进一步聚集成束，形成难溶的胶原纤维(fiber)。和其他许多天然高分子材料(纤维素、甲壳素等)一样，胶原不具有热塑性，不能被熔融加工，也很难溶解在普通溶剂中，限制了胶原在许多领域的应用。

中性盐或稀醋酸溶液能够从动物皮肤、肌腱、骨骼等富含胶原纤维的组织中提取出部分未能共价交联或未成熟的胶原，即可溶性胶原。然而动物体内大部分为难溶性胶原，这部分胶原以胶原纤维形式存在，彼此相互交叉形成网状。对于难溶性胶原，可先用胃蛋白酶消化水解，去除末端非螺旋型区域，再用稀醋酸溶液提取；胶原粗制品经反复透析、离心等纯化处理后，经冷冻干燥可得胶原制品。以从猪皮中提取I型胶原为例：首先，从猪皮组织中分离皮肤，去除毛发和表皮，脱脂，用绞肉机绞碎；以2.5g/L的质量浓度悬浮在0.5mol/L醋酸中进行胃蛋白酶水解，连续搅拌消化48h，超速低温离心30min；去除沉淀后，在上清液中加入NaCl至最终浓度为4.4mol/L，充分搅拌后再离心沉淀；将沉淀溶解在醋酸中后，继续加入NaCl至最终浓度为1.7mol/L，离心后收集沉淀；将沉淀溶解在醋酸中，通过0.45μm的滤膜过滤，在4℃对0.001mol/L醋酸溶液透析24h。可以看出，胶原的整个提取过程相当繁琐，且该过程会产生很多废弃物，提取率也非常低。同时，冷冻干燥的方法需要特殊的仪器，耗时长，成本高。寻求胶原天然高分子材料的环保加工技术一直是科学工作者不懈努力的目标。如果能找到一种溶剂，直接将皮胶原溶解在其中，并用简单的方法将胶原再生成膜、纤维、微球状、粉状等各种形态的制品，必将极大地促进胶原产业的发展。

离子液体是近年来兴起的一类极具应用前景的环保型溶剂，它不挥发，对水和空气稳定，对无机、有机化合物以及高分子材料具有良好的溶解性，在电化学、有机合成、化工分离、材料制备等领域有着广泛的应用。离子液体是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成的盐，也称为低温熔融盐。与传统有机溶剂、水、超临界流体等相比，离子液体具有许多优良的性能：对很多化学物质，包括有机物和无机物具有良好的溶解性能；具有较高的离子传导性；热稳定性较高；液态温度范围较宽；极性较高，溶剂化性能较好；几乎不挥发、不氧化、不燃烧；粘度低、热容大；对水和空气均稳定；易回收，可循环使用；设备简单、易于制造。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种简便的胶原溶解方法，同时还提供了将胶原再生成膜、纤维、微球或粉状等各种形态的胶原制品的方法。

基于上述目的，本发明采用了如下技术方案：胶原溶解方法，是利用离子液体做溶剂溶解胶原。

所述离子液体为烷基咪唑类离子液体。

所述离子液体1-甲基-3-丁基卤代咪唑、1-丁基-3-甲基卤代咪唑、1-乙基-3-甲基卤代咪唑、1-烯丙基-3-甲基卤代咪唑或二卤二(3，3′-二甲基)咪唑基亚砜盐。

取干燥的胶原投入到离子液体中，85～140℃下搅拌0.5～6h。

胶原与离子液体的重量比为1～15∶100。

胶原再生的方法，步骤为：将胶原溶解于离子液体中得到胶原/离子液体溶液后，用凝固剂洗去溶液中的离子液体，得到再生胶原。

所述凝固剂选自去离子水、乙醇、甲醇、丙酮中的一种或任意组合。

将所述胶原/离子液体溶液铺膜，然后置于凝固剂中，胶原再生为薄膜形态。

使所述胶原/离子液体溶液自细孔(喷丝孔)喷入凝固剂中，胶原再生为纤维形态。

将所述胶原/离子液体溶液直接滴入凝固剂中，胶原再生为球状或粉末形态。

本发明所提供的胶原溶解及再生方法步骤简单、无毒无害、安全性高，能大幅度简化胶原制品的制备过程。离子液体可以破坏胶原分子间或分子内的作用力，进而将其溶解，溶解条件温和，易于控制，获得胶原/离子液体溶液具有良好的可再生性；再生过程简单，所用的凝固剂价格低廉、易于回收，为胶原制品的研究和推广应用奠定了良好的基础。

附图说明

图1是在皮粉纤维溶解过程中拍摄的显微照片，其中图1a对应的是70℃，图1b对应120℃；

图2是在皮粉纤维的溶解过程中，于70℃、100℃、110℃及120℃拍摄的偏光显微照片；

图3是在II型胶原纤维的溶解过程中，于70℃、110℃、120℃、125℃拍摄的偏光显微照片。

具体实施方式

实施例1

称取0.56g皮粉纤维和5.03g离子液体1-甲基-3-丁基氯代咪唑放入烧杯中，边磁力搅拌边升温至100℃；皮粉纤维在离子液体中逐渐溶解，1.5h后溶液呈均匀分散的浑浊状态，继续搅拌，溶液逐渐变得澄清，直至皮粉纤维完全溶解。

取少量制备的皮粉纤维离子液体溶液，均匀铺在玻片上，将玻片浸入去离子水中静置，皮胶原再生成膜。将膜用去离子水反复浸泡，彻底洗去离子液体，将膜在室温下通风处自然晾干，得到再生皮胶原膜。

实施例2

称取0.25g皮粉纤维和3.00g离子液体1-丁基-3-甲基氯代咪唑，加入0.30g去离子水，于油浴中加热至120℃，并进行磁力搅拌；皮粉纤维在含水离子液体中逐渐溶解，1h后溶液呈均匀分散的浑浊状态，继续搅拌，溶液逐渐变得澄清，直至皮粉纤维完全溶解。

用注射器取少量制备的真皮层纤维离子液体溶液，将溶液注射入丙酮中，皮胶原再生成纤维。将纤维用丙酮反复浸泡，彻底洗去离子液体，将纤维在室温下通风处自然晾干，得到再生皮胶原纤维。

实施例3

将浸酸山羊皮的真皮层刮下，中和，于室温下在真空烘箱中充分干燥，得到真皮层纤维。称取0.6g真皮层纤维和5.03g离子液体1-丁基-3-甲基溴代咪唑，在油浴中加热至85℃，并进行磁力搅拌；纤维在离子液体中逐渐溶解，6h后，溶液呈均匀分散的浑浊状态，继续搅拌，溶液逐渐变得澄清，直至纤维完全溶解。

用注射器取少量制备的真皮层纤维离子液体溶液，将溶液逐滴滴入丙酮中，皮胶原再生成微粉状。抽滤后得到微粉，将微粉在室温下通风处自然晾干，得到再生皮胶原粉。

实施例4

称取0.05g皮粉纤维和5.03g离子液体1-乙基-3-甲基溴代咪唑放入烧杯中，边磁力搅拌边升温至90℃；皮粉纤维在离子液体中逐渐溶解，3h后，溶液呈均匀分散的浑浊状态，继续搅拌，溶液逐渐变得澄清，直至皮粉纤维完全溶解。

用注射器取少量制备的皮粉纤维离子液体溶液，将溶液逐滴滴入甲醇中，皮胶原再生成微粉状。抽滤后得到微粉，用甲醇反复浸泡并抽滤，在室温下通风处自然晾干，得到再生皮胶原粉。

实施例5

将浸酸山羊皮的真皮层刮下，中和，于室温下在真空烘箱中充分干燥，得到真皮层纤维。称取0.75g真皮层纤维和5.00g离子液体1-烯丙基-3-甲基氯代咪唑，加入0.30g去离子水，于油浴中加热至120℃，并进行磁力搅拌；纤维在含水离子液体中逐渐溶解，1h后，溶液呈均匀分散的浑浊状态，继续搅拌，溶液逐渐变得澄清，直至皮粉纤维完全溶解。

取少量制备的真皮层纤维离子液体溶液，均匀铺在玻片上，将玻片浸入丙酮中，用丙酮将离子液体洗去，使皮胶原再生成膜。将膜在室温下通风处自然晾干后揭下，得到再生皮胶原膜。

实施例6

称取0.50g皮粉纤维和5.00g离子液体二氯二(3，3′-二甲基)咪唑基亚砜盐，加入0.30g去离子水，于油浴中加热至140℃，并进行磁力搅拌；皮粉纤维在含水离子液体中逐渐溶解，0.5h后，溶液呈均匀分散的浑浊状态，继续搅拌，溶液逐渐变得澄清，直至皮粉纤维完全溶解。

取少量制备的皮粉纤维离子液体溶液，均匀铺在玻片上，将玻片浸入去离子水中静置，皮胶原再生成膜。将膜用去离子水醇反复浸泡，彻底洗去离子液体。将膜在室温下通风处自然晾干，得到再生皮胶原膜。

溶解实验1

取一根皮粉纤维(生牛皮经水洗、脱脂、浸灰、片皮、脱灰后，进行脱水干燥处理，然后进行研磨，即可得到皮粉纤维)置于载玻片上，将一滴离子液体[Bmim]Cl滴在皮粉纤维上，将其完全覆盖，盖上盖玻片。将载玻片置于LEICAMPS 30热台偏光显微镜的热台上，自室温缓慢升温至140℃，撤去起偏镜能观察到皮粉在温度升至70℃之前(图1a)一直呈现纤维状，但随着温度的升高，皮粉逐渐溶解，升温至120℃时(图1b)皮粉几乎完全溶解，视野中满是小液滴(若不加离子热体，则能观察到皮粉随温度升高逐渐褐变、碳化)。升温过程中，于关键温度点拍摄偏光照片，如图2所示，发现70℃时皮粉纤维在偏光显微镜下呈现大片亮区，表明纤维中有大量结晶区域；升温至100℃时，体系中亮区区域减少，表明部分结晶结构已被破坏；升温至110℃时，体系中的亮区区域进一步减少；升温至120℃，体系中亮区完全消失，此时皮粉纤维溶解在离子液体中。

溶解实验2

取一根不溶性II型胶原纤维(Sigma，C-8886)置于载玻片上，将一滴离子液体[Bmim]Cl滴在胶原纤维上，将纤维完全覆盖，盖上盖玻片。将载玻片置于LEICA MPS 30热台偏光显微镜的热台上，从室温缓慢升温至140℃，撤去起偏镜能观察到皮粉在70℃以下一直呈现纤维状，但随着温度的升高，皮粉逐渐溶解，升温至125℃时皮粉几乎完全溶解，视野中满是小液滴。在关键温度点拍摄偏光照片，如图3所示。从图中可以看出，在70℃时II型胶原纤维在偏光显微镜下呈现大片亮区，表明纤维中有大量结晶区域；升温至110℃时，体系中亮区缩减，表明其中部分结晶结构已被破坏；升温至120℃时，体系中的亮区区域进一步减少；在125℃下停留5min，体系中亮区完全消失，此时胶原纤维完全溶解在离子液体中。

Claims (10)

1.胶原溶解方法，其特征是，利用离子液体做溶剂溶解胶原。

2.如权利要求1所述的胶原溶解方法，其特征是，所述离子液体为烷基咪唑类离子液体。

3.如权利要求2所述的胶原溶解方法，其特征是，所述离子液体为1-甲基-3-丁基卤代咪唑、1-丁基-3-甲基卤代咪唑、1-乙基-3-甲基卤代咪唑、1-烯丙基-3-甲基卤代咪唑或二卤二(3，3′-二甲基)咪唑基亚砜盐。

4.如权利要求1-3任一所述的胶原溶解方法，其特征是，取干燥的胶原投入到离子液体中，85～140℃下搅拌0.5～6h。

5.如权利要求4所的胶原溶解方法，其特征是，胶原与离子液体的重量比为1～15∶100。

6.利用权利要求1-5任一所述胶原溶解方法进行胶原再生的方法，其特征是，将胶原溶解于离子液体中得到胶原/离子液体溶液后，用凝固剂洗去溶液中的离子液体，得到再生胶原。

7.如权利要求6所述胶原再生的方法，其特征是，所述凝固剂选自去离子水、乙醇、甲醇、丙酮中的一种或任意组合。

8.如权利要求7所述胶原再生的方法，其特征是，将所述胶原/离子液体溶液铺膜，然后置于凝固剂中，胶原再生为薄膜形态。

9.如权利要求7所述胶原再生的方法，其特征是，使所述胶原/离子液体溶液自细孔喷入凝固剂中，胶原再生为纤维形态。

10.如权利要求7所述胶原再生的方法，其特征是，将所述胶原/离子液体溶液直接滴入凝固剂中，胶原再生为微球或粉末形态。

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