CN101835793B - 抑制β1-肾上腺素受体抗体的突变双环化受体肽 - Google Patents

抑制β1-肾上腺素受体抗体的突变双环化受体肽 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新的β-肾上腺素受体同源性环肽-突变体，其包含能形成分子内键的仅两个半胱氨酸残基，涉及能形成这些环肽-突变体的线性肽以及涉及编码这些环肽-突变体和线性肽的核酸分子。而且，提供了包含上述的核酸分子的载体和重组体宿主细胞和产生公开的环肽-突变体的方法。还提供了包含本发明的肽、核酸分子、载体或宿主细胞的组合物。本发明也涉及利用本发明肽的治疗和诊断的手段、方法和用途以及涉及用于检测类似抗-β1-肾上腺素受体抗体的抗-β-肾上腺素受体抗体的手段、方法和用途。

Description

抑制β1-肾上腺素受体抗体的突变双环化受体肽
本发明涉及包含能形成分子内键的仅两个半胱氨酸残基的新的β-AR同源环肽-突变体，涉及能形成这些环肽-突变体的线性肽，以及涉及编码这些环肽-突变体和线性肽的核酸分子。而且，提供了包含所述核酸分子的载体和重组宿主细胞和产生公开的环肽-突变体的方法。进一步提供了包含本发明的肽、核酸分子、载体或宿主细胞的组合物。本发明还涉及利用本发明的肽的治疗和诊断的手段、方法和用途以及用于检测如抗-β1-肾上腺素能受体抗体的抗-β-肾上腺素能受体抗体的手段、方法和用途。 
未知病因学的渐进性心脏扩大和泵衰竭被称为“特发性”扩张性心肌病(DCM)(Richardson 1996 Circulation，93，841-842)。DCM是严重性心力衰竭的主要原因之一，年发病率为每一百万人中有高达100例的患者，流行程度为每一百万人中有300-400例患者(AHA报道2007)。编码肌细胞结构蛋白的基因突变(Morita 2005)和包括酒精、蒽环类抗生素和最近治疗上使用的单克隆抗体(例如曲妥单抗)的若干心脏毒素约占扩张性心肌病(DCM)病因的三分之一(Chien 2000，Fabrizio andRegan 1994)。然而对剩下三分之二的病因学了解甚少。 
目前绝大部分的DCM被认为是源于导致急性心肌炎的初始(主要为病毒性的)感染，急性心肌炎在免疫系统活化时可进展为(慢性)自身免疫性心肌炎而导致心脏扩大和严重的充血性心力衰竭；后述的进展特别出现在伴随如下(a)或(b)时：(a)针对心脏功能所必需的独特的肌细胞肌纤维膜蛋白或膜蛋白的自身抗体形成(Freedman 2004，Jahns2006)，(b)心肌慢性炎症和病毒持续存在(Kühl 2005)。这些最近的研究结果被DCM患者经常伴有细胞免疫和体液免疫两者的改变这一事实(Jahns 2006，Limas 1997，Luppi 1998，Mahrholdt 2006)进一步巩固。在这种情况下，初始的急性炎症反应可进展为一种轻度的炎症 (MacLellan 2003)，其促进异常的或误导的对初次感染触发剂的免疫应答(Freedman 2004，Kühl 2005，MacLellan and Lusis 2003，Maekawa 2007，Smulski 2006)。 
在体液反应的环境下，已发现大多数DCM患者产生了针对包括下述的多种心脏抗原的交叉反应抗体和/或自身抗体：线粒体蛋白(例如腺嘌呤核苷酸转运体，硫辛酰胺和丙酮酸脱氢酶(Pohlner 1997，Schultheiss 1985，Schultheiss 1988，Schulze 1999))、肌纤维膜蛋白(例如肌动蛋白、层粘连蛋白、肌球蛋白、肌钙蛋白(Caforio 2002， 2006，Li 2006，Neumann 1990，Okazaki 2003))和膜蛋白(例如细胞表面肾上腺素能或蕈毒能受体(Christ.2006，Fu 1993，Jahns 1999b，Magnusson1994)。然而看起来这些中只有几个选择的抗体自身能够导致心肌组织损伤和诱导严重的充血性心力衰竭。另外，个体基因遗传倾向(包括各自的人白细胞抗原(HLA)-和主要组织相容性复合物(MHC)-表型(Limas 1996))也可能明显地促进针对自体的免疫反应的易感性和疾病的表型表达(Limas 2004，MacLellan 2003)。 
诸如膜受体的肌细胞表面分子与病毒或细菌蛋白间的同源性被提议作为通过抗原模拟产生内源性心脏自身抗体的机制(Hoebeke 1996，Mobini 2004)。查加斯氏心脏病(Chagas’heart disease)，一种慢性进展的炎性心肌病，是这一机制最显著的实例之一(Elies 1996，Smulski2006)。这一疾病起源于原生动物克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)感染；在大约30％查加斯氏患者中，克氏锥虫的核糖体P2β蛋白与β1-肾上腺素受体(β1-AR)的第二细胞外环的N-末端半段间的分子模拟导致交叉反应抗体的产生(Ferrari 1995)。因为来自DCM患者的受体-自身抗体优先地识别同一环的C-末端半段(Wallukat 1995)，故推测这些抗体可能来源于β1-AR和迄今未鉴定出的病毒病原体(Magnusson 1996)间的分子模拟。另一种导致内源性心脏自身抗体产生的可能更相关的机制为初次心脏损伤后伴随“关键量”的抗原性决定子从肌细胞膜或细胞质中的(快速的或慢性的)释放，这些抗原决定子原先不暴露于免疫系统。这种损伤最可能是发生在导致肌细胞凋亡或坏死的急性感染(心肌 炎)、中毒或缺血性心脏疾病(心肌缺血)中(Caforio 2002，Rose 2001)。然后心肌自身抗原向免疫系统的呈递诱发自身免疫反应，其在最坏的情况下导致免疫介导的永久性肌细胞损伤，这涉及细胞(例如T细胞)或体液(例如B细胞)免疫反应，或先天性和适应性免疫系统的共活化(Eriksson 2003，Rose 2001)。 
从病理生理学角度来看，将心脏特异性自身抗体的可能的有害性(例如诱导心肌病)与相应靶标的可及性和功能的关联性联系起来是合理的。对自身抗体而言，肌细胞表面受体是可容易地接近的(Okazaki2005)。两种最有希望的候选物为心脏的β1-AR(代表心脏中占优势的肾上腺素受体亚型)和M2-毒蕈碱性乙酰胆碱受体，针对这两种受体的自身抗体已在DCM患者中检测到(Fu.1993，Jahns 1999b，Matsui1995)。然而抗毒蕈碱的抗体(表现出对心脏M2乙酰胆碱受体的类激动剂作用)主要与窦房水平的负性变时性效应有关(例如窦房结功能障碍，心房纤颤(Baba 2004，Wang.1996))，激动性抗β1-AR抗体与心室水平的严重心律失常的发生(Christ 2001，Iwata 2001a)以及与最终转变为左心室增大和渐进性心力衰竭的(适应不良的)左心室肥大的发展(Iwata 2001b，Jahns 1999b，Khoynezhad 2007)这两者有关。这两种自身抗体呈现出针对各自受体的第二细胞外环。为产生自身免疫应答，肌细胞膜蛋白(例如受体)必须降解成能与宿主的MHC或HLA II类分子形成复合物的小的寡肽(Hoebeke 1996)。就人类β1-AR而言，基于计算机的对潜在免疫原性氨基酸片段的分析显示，该受体分子包含B-和T-细胞表位并可被自身抗体接近的唯一部分实际上是预测的第二细胞外受体环(β1-ECII)(Hoebeke 1996)。这可以解释第二环肽在不同的动物模型中用于产生β1-特异性受体抗体的成功应用(Iwata 2001b，Jahns.2000，Jahns 1996)。而且，在最近十年中，几个研究组在不同的免疫测定(全细胞酶联免疫吸附测定，免疫沉淀反应，免疫荧光)中已独立地证实了抗体第二环优先地识别完整天然的β1-AR，这表明它们是“构象的”(Hoebeke 1996，Jahns 2006)。功能测定揭示相同的抗体也影响受体功能，诸如细胞内cAMP-产生和/或cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)活性，提示它们可以作为β1-AR活性的变构调节剂(Jahns 2000，Jahns 2006)。 也可通过Warne(2008Nature.DOI：10.1038)分析β1-AR的结构。 
按照Witebsky’s要求(Witebsky 1957)，疾病的自身免疫病因学的间接证据需要鉴定触发剂(例如作为病因的自身抗原)，以及诱导实验性动物中针对自身抗原的免疫应答，其随后必须发展为类似的疾病。然而，直接的证据需要自一动物向同一物种中另一动物转移同源性致病抗体或自身反应T细胞来再现疾病(Rose 1993)。 
为分析抗β1-AR抗体的致病潜力，Jahns等选择了体内实验方法，其满足Witebsky对自身免疫性疾病直接证据的标准。通过针对β1-ECII(人类与大鼠间100％序列同源性；间接证据)免疫近交系大鼠诱导DCM；然后通过大鼠抗“β1-AR自身抗体”的等基因转移在健康动物中再现疾病(直接证据)(Jahns 2004)。动物发生渐进性左心室(LV)扩张和功能失调，LV壁增厚度的相对下降和β1-AR的选择性下调，这一特征也可见于人类DCM(Lohse 2003)。 
这些结果，结合体内抗体激动剂样的短期效应(Jahns 2004)，提示诱导的和转移的心肌病表型这两者主要归因于通过刺激型抗β1-AR抗体获得的适度但持久的受体活化。基因或药理学处理后所观察到过量的和/或长期的β1-AR活化的心脏毒性效应而获得的大量数据支持了这一假说(Engelhardt 1999，Woodiwiss 2001)。因此，现在可认为抗β1-AR诱导的扩张性免疫性心肌病(DiCM)自身结合其他的已确定的诸如重症肌无力或Graves’疾病的针对受体的自身免疫性疾病(Freedman 2004Hershko 2005，Jahns 2004，Jahns 2006)是一个致病性疾病团体(pathogenetic disease entity)。 
心脏自身抗体的临床重要性难以评估，因为上述抗体作为天然免疫系统全部的一部分，在健康人群中也可以检测到这种抗体的低滴定量(Rose 2001)。然而，关于功能性活化的抗β1-AR抗体，先前来自Jahns等的数据显示，如果使用基于以天然构象呈递靶标(例如β1-AR)的细胞系统的筛选方法，抗β1-AR抗体在健康个体中的流行程度是几乎可以忽略的(＜1％)(Jahns 1999b)。通过利用后者的筛选方法，也可以在慢性 瓣膜或高血压性心脏病的患者中排除抗β1-AR自身抗体的出现(Jahns1999a)。相比之下，刺激性抗β1-AR的流行程度在缺血性心肌病(ICM)中为约10％、在扩张性心肌病(DCM)中为约30％(Jahns 1999b)，这显著高于健康对照组，但是处于以前报道的关于DCM集合(33％到95％流行程度)较低的范围(Limas 1992，Magnusson 1994，Wallukat 1995)。似乎可以想象得到的是用于检测功能性活化的抗β1-AR自身抗体的筛选方法的差异很可能造成了过去报道的流行程度的宽泛范围(Limas1992)。实际上，只有很少部分的ELISA-确定的人抗β1-AR自身抗体能结合到位于细胞表面的天然β1-AR，只有这一部分识别(如免疫荧光所确定的)和活化(如细胞的cAMP和/或PKA活性所确定的)表达在完整的真核细胞膜的人β1-AR(Jahns 2000，Jahns 1999b)。因此，以靶标天然构象呈递靶标的细胞系统代表了在用于功能性相关抗β1-AR自身抗体的筛选中的基本工具(Nikolaev 2007)。 
临床上，DCM中抗β1-AR自身抗体的存在显示与更严重地降低的心脏功能(Jahns 1999b)、更严重的室性心律失常的发生(Chiale 2001)和心源性猝死的高发病率(Iwata 2001a)有关。对比随访时间超过10年的抗体阳性和抗体阴性DCM患者所获得的最新数据不但确定了在活化抗β1-AR存在情况下室性心律失常的高患病率，而且揭示了抗体阳性预示几乎增加了3倍的心血管死亡率-风险( 
Figure GPA00001106782700051
2006)。总之，可获得的临床数据强调了DCM中功能性活化的抗β1-AR自身抗体的病理生理学的关联性。 
目前普遍所接受的一种药理学的策略为使用β-阻断剂以减弱或甚至消除自身抗体介导的刺激性效应，至少如果β-阻断剂确实能预防抗体诱导的β1-AR的活化(Freedman 2004，Jahns 2000，Matsui 2001，Jahns2006)。实际上新的治疗方法包括通过非选择性的或选择性的免疫吸附去除刺激性抗β1-AR(Hershko 2005，Wallukat 2002)或抗β1-ECII抗体和/或自身产生抗β1-ECII的B细胞(即免疫耐受的诱导)的直接靶向作用(Anderton 2001)。然而，因为免疫球蛋白耗竭后感染的风险性增加， 出于安全考虑，非选择性免疫吸附需要人IgG的取代物(Felix 2000)，其有本领域中已知的取代的人蛋白的所有可能的副作用，包括严重过敏反应和死亡。 
WO 01/21660公开了某些与β1-AR的第一和第二环的表位同源的肽并建议将这些肽用于扩张性心肌病(DCM)的医疗干预。即便WO01/21660概略地提及可将肽进行修饰以保护它们免遭血清蛋白酶降解，例如通过环化作用，但没有给出相应的实例和实施方案，也没有所建议的肽对DCM进程或对受体-抗体滴定过程的任何体外或体内的影响。此外，WO 01/21660中意图采用上文提及的非选择性的免疫吸附方法，其具有相应提及的风险。 
此外，相比之下，刺激性抗β1-ECII抗体的活性诱导后6周，使用新开发的β1-ECII同源性环肽(例如β1-ECII-CPs)。β1-ECII-CPs为包含3个半胱氨酸残基的环肽并因此能形成分子内键，从而有个别地形成两个分子内键的潜在性选择(另外N末端和C末端间的环化作用)。β1-ECII-CP显著性减少了循环的抗β1-ECII抗体的数量，有效地预防了心脏扩张和功能失调的发展(Boivin 2005)。WO 2006/103101中也公开了上文提及的β1-ECII-CPs。 
结合现有技术，本发明潜在的技术问题是提供改进的和易于获得的手段和方法，用于与抗β-AR抗体尤其是抗β1-ECII抗体相关的疾病的医疗干预。 
所述技术问题是通过权利要求中表征的实施方案的提供得以解决的。 
因此，在第一方面，本发明涉及β-AR同源性环肽-突变体(本文中也称为环状肽或环肽等)，具体涉及β1-AR同源性环肽-突变体，即β1-ECII同源性环肽-突变体。这些环肽-突变体/环状肽的结构的特征在 于能够形成只有一个单独的分子内二硫键。 
具体地，在第一方面，本发明涉及式I的环状肽： 
cyclo(x-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-x)(I)， 
其中 
a)X为除Cys以外的氨基酸； 
b)h为1至15的任一整数； 
c)i为0至14的任一整数； 
d)xa，xb和xc的一个为Pro； 
e)y为除Cys以外的氨基酸；和 
f)环状肽由至少16个且最多25个氨基酸组成。 
如下文所讨论的，特别优选的具体实施方案为式VII、IX、IX′、VI或VIII描述的具体环状肽。 
本发明解决了上文确定的技术问题，因为如下文和所附的实施例所记载的，令人惊讶地发现含有仅两个半胱氨酸的突变环状肽也能够抑制抗β-AR抗体，因此能够用于抑制刺激性抗β1-AR抗体，所述两个半胱氨酸能形成一个确定的、单独的分子内二硫键。 
此外，在本发明上下文中还令人惊讶地发现，在构象抗β-AR抗体的识别或清除以及抗体中和(即药学)潜力两个方面，本文描述和提供的具有环状结构的肽突变体(例如环状肽)都优于它们的线状对应物。分别通过示例性地应用ELISA竞争性测定和功能性(cAMP)FRET-测定获得这些研究结果。 
另外，能够容易地获得/制备、生物化学上表征以及纯化包含仅两个半胱氨酸的本发明的环状肽，所述两个半胱氨酸能形成单个确定的、单独的分子内二硫键。这在需要同一环肽异构体的纯化部分时特别正确。在本发明的环境下，避免了包含具有不同分子内二硫键的环肽异 构体的环肽异构体(即立体异构体)的混合物。如下文所记载的，因为这种避免，能够获得特异的纯净的医学产品(符合GMP标准)，其包含均具有同一分子内二硫键的异构体。 
在本发明的上下文中以及如所附的实施例所描述的，还有一个令人惊讶的发现：半胱氨酸残基的一个与丝氨酸残基交换的精确性显著地决定了衍生于β1-ECII的环状肽的抗体中和效价强度。 
具体地，如分别地在本文示例地和优选地公开的25-meric环肽(式VII/IX)的18位、在本文示例地和优选地公开的22-meric环肽(式IX)的17位或在本文示例地和优选地公开的18-meric环肽(式VI/VIII)的14位的Cys→Ser交换的Cys→Ser交换产生了具有极好的体外抗体中和以及药理学效应(图.4-11和27)的环肽，而令人惊讶地，分别在本文示例性公开的25-meric、22-meric或18-meric环状肽的17、16或13位的Cys→Ser交换几乎没有抑制效应。既不能在它们作为抗体-清道夫的性能方面检测到这种抑制效应，也不能在它们抑制功能性抗体效应的能力方面检测到这种抑制效应，例如，如体外受体-刺激的中和作用所显示的(例如图.4-10)。 
在本发明中还有一个发现：能够通过包含22个氨基酸的第二环-同源环化肽获得ECII-β1-AR结构域的近乎完美的空间模拟，所述22个氨基酸例如人β1-AR公开的原始一级序列的21个氨基酸，即氨基酸200(R)到221(T)(根据Frielle et al.1987，PNAS 84，pages 7920-7924编号)加上一个额外的氨基酸残基(例如甘氨酸(G))在222位上闭合合成环以形成22AA环肽。 
不受理论约束，环状肽的心脏保护和免疫调节活性很大程度上取决于它们的构象。另外，在本发明中发现在(预测)的环闭合位点上(或其相应的位置上)导入最小的天然存在的氨基酸-甘氨酸使对抗β1-AR自身抗体的结合增强，即明显进一步增加了22AA肽与ECII-β1-AR结构域的相似性。具体地，所附的实施例等显示了cyc22AA环肽与其它 较大的ECII-模拟环肽(例如cyc25AA肽)或较小的ECII-模拟环肽(例如cyc18AA肽)相比，具有显著提高的体内抗体阻断功效。对上述22AA环肽的计算机辅助模型研究证实了预测的第二细胞外环结构的极好的模拟，当与预测的天然第二细胞外环反向螺旋(也见于附图24)相对比时，计算的差异在环肽基部(而不是预测的抗体结合位点)仅4.5埃(4.5 
Figure GPA00001106782700091
)大小。而且，本文和附加的实施例中显示，特别是所述22AA环肽非常高效地降低了抗β1-AR自身抗体的滴定度。 
因为存在于环状22AA肽的三个半胱氨酸中的一个的取代允许剩余的两个半胱氨酸间引入增强的二硫键(作为第二”内部”环，经双环化作用产生)，产生的环状22AA环肽也代表了生物化学上明确定义的产物(也见于图25和26)。 
还令人惊讶地发现在25位(25-meric环肽-突变体)或18(18-meric环肽-突变体)上的 
Figure GPA00001106782700092
交换没有显著地影响环肽的阻断能力，与它们的长度无关；例如如图6，7和9所显示的25与18个氨基酸。 
下文的实施例也证明了本文所公开的环状肽显示了改进的特征，例如与包含3个半胱氨酸残基的肽相比(例如WO 2006/103101中所公开的Cys/Cys环状肽)。本发明环状肽的改进特征的实例有极佳的阻断抗β1-AR抗体的能力及根据GMP标准提高的可生产性。 
在本发明中，体外发现通常经体内试验证实(图12-16和28/29)。令人感兴趣的是，Cys18，17或14→Ser18，17或14突变的环肽与其相应的线性肽相比的阻断能力的差异甚至在体内更为显著(图5，7和14-16)。 
已建立的抗β1-肾上腺素的抗体诱导的自身免疫-心肌病大鼠模型(Jahns，2004)用于评价体内产生的β1-ECII同源的环肽突变体的功效。体内数据表明，公开的突变环肽(例如18AA Cys/Ser环肽)的功效可能同等地取决于给药的剂量(图14-16)。 
另外，体内实验显示突变环肽的抗体阻断能力似乎没有被氨基酸 自25-meric到18-meric环肽的氨基酸数量的减少所影响；体外和体内数据显示这两个含有2个半胱氨酸的单个二硫键的25AA Cys/Ser或18AA Cys/Ser环肽突变体有极好的可比性。然而应该注意的是，1.0mg/kg 25AA-meric Cys/Ser及高剂量(即4.0mg/kg Bw)18AA Cys/Ser突变体都导致了抗体-滴定度最初瞬间的增加从而使受体抗体滴定度对三分之一或四分之一环肽应用的显著性减少延迟(治疗的第三或第四个月)。1.0或2.0mg/kg Bw剂量的18AA Cys/Ser环肽突变体均未发生这一现象(图16B，C)。 
特别地，如本文所公开的18meric或25meric环状肽给药的动物未表现出异常的体征，只检测到给药的肽的期待的效应，即抗β1-AR抗体阻断作用。相应地，本文所提供的肽在应用的剂量方案未显示出不良的副作用或毒性。这在本文中通过下述现象的显示被进一步证实：本发明的环状肽对肾脏无毒性(未检测到肾小球膜的机械性阻塞；图23)。另外，指示肾脏功能的常规实验室参数在环状肽应用12个月下仍然正常，与未治疗的对照的动物相比没有差异(图22A，B)。 
本发明的突变的环肽的抗体阻断能力不受肽长度的影响，只要肽不短于18个氨基酸，并不超过25个氨基酸。这一点通过肽的氨基酸数目自25到18的减少被示例性地证实。在18到25格氨基酸范围内，本发明具有22个氨基酸的环状肽是最有效的，因此具有22个氨基酸的环状肽为特别优选的实施方案。这种特别优选的22mer环状肽的实例显示于式IX中。 
本发明的环肽突变体的优势之一为-通过将一个特定的半胱氨酸(优选对应于β1-AR氨基酸序列的Cys216的Cys)突变为丝氨酸残基并通过经由另一S-S的特异性环化方法加强独特的可能的分子内S-S键形成-它们的构象限制(conformational restraint)是增加的。与本领域已知的肽相比，本发明的肽增加的抑制产生的分子较好地模拟在细胞表面上的第二β1-ECII环的天然构象中呈现的表位。 
诸如比索洛尔的β阻断剂显著降低了心率和血压，所述β阻断剂用于治疗扩张性心肌病和其他由刺激性抗β1-AR抗体导致的疾病的领域。与此相比之下，本发明突变环肽的体内应用对肺脏功能、心率或血压没有负面影响(图20和21)。另外，大量评价肝脏和肾脏功能的重要的实验室参数没有受到重复的环肽注射的影响(图22a/b和23)。因此，本发明的环状肽尤其适用于不然不能应用β阻断剂治疗的特殊患者组，例如已患有心动过缓的病人，或对那些因为禁忌症而不可能使β阻断剂的患者(比如那些患有阻塞性肺疾病或低血压的患者)。 
特别地，如所提及的，相比于利用衍生自仍含有3个半胱氨酸的β1-ECII的(环状)肽(例如如在WO 2006/103101中所公开的)的手段和方法，本发明的手段和方法的另外优势是能够避免环肽异构体混合物的形成。 
在包含3个或更多Cys残基的肽的环化期间形成的不同环肽异构体混合物的生化表征是费力的。因此，当利用包含3个或更多个Cys残基的肽时，生产仅包含一种类型环肽异构体的纯环状肽部分耗费巨大的时间和财力。当在GMP标准下生产环状肽时尤其这样。 
与此相比之下，本发明的环状肽作为同一异构体的纯化部分可被容易地表征和生产。这带来了高度的再现性。本发明的肽的特别优势是避免了必须被分离且通过复杂的测试进行表征的异构体混合物，这样最终省略了至少另外一步的生产步骤(分离和/或生化表征)(也见于Sewald 2002)。 
本发明尤其基于所附的实施例描述的实验。 
在这些实施例中，β1-ECII 25AA-环肽的17位或18位的半胱氨酸的一个被丝氨酸残基取代(Cys17或18→Ser17或18突变)，从而可形成只有一个单独的、单一分子内二硫键(S-S)(图1)。像这样的措施提供了减少副作用和保持或提高本发明的构建体的生物功效的潜能。与现有技术中形成异构体混合物的肽相比，可通过简单、稳健和可高度重复的生 产过程获取本发明的环状肽。这些能够按比例的有效增加。而且这些过程避免了异构体混合物的分离，并适合GMP标准。 
附加的实施例提供了相应的生产/制备方法。在所附的实施例中，尤其通过引入“DGlu”突变(例如在环状肽的(环)闭合位点引入；如图2所示的 
Figure GPA00001106782700121
突变)来实现本发明的肽的环化。 
而且，在本发明的另外的环肽突变体系列中，氨基酸数量自25AA减少到22AA，并进一步减少到18AA。这一措施提供了使构建体潜在的免疫副作用降低到最小的潜力。18AA环肽-突变体包含14位或13位上的半胱氨酸→丝氨酸交换(分别包含Cys13-Ser14或Ser13-Cys14突变环肽的18AA)，所述半胱氨酸→丝氨酸交换与例如在环状肽的环闭合位点的(另外的)谷氨酰胺-交换/D-谷氨酸( 突变)组合或不与其组合(图2)。22AA环肽-突变体包含位置17上cysteine→serine交换(包含Cys16-Ser17的22AA)，选择性地结合位置22上引入的甘氨酸残基(环状肽的可能的环闭合位点；图24)。 
总之，本文提供的实验性体外数据以及体内数据清楚地表明，所公开的突变环状肽的抗体阻断能力不受环肽氨基酸数量自25-meric到18-meric减少的影响，当使用的剂量为0.25至5.0mg/kg Bw，尤其为1.0至2.0mg/kg Bw时。体内外数据显示了剂量在1.0mg/kg Bw的包含2个半胱氨酸的单个二硫键的25AA Cys/Ser(式VII/IX)或18AACys/Ser(公式VI/VIII)的两个环肽突变体有极好的可比性；图16到21。然而，依照本发明，19到24AA的“中间”环状肽显示了增加的活性。具体地，依照本发明，22AA环状肽显示了增加的活性。上述“中间”环状肽的优选实例为包含或由如式IX中所显示的氨基酸残基组成。 
而且，半胱氨酸残基的一个与丝氨酸残基交换(即Cys/Ser或Ser/Cys-突变体)的精确的性质显著地决定了所公开的环状肽的体外及体内的效价强度(图6-10和14-16)。 
β-肾上腺素受体(β-AR)，特别是β1-肾上腺素受体(β1-AR)为本技术 领域所熟知。例如，人β1-AR(也称为肾上腺素β-1-受体(ADRB1))的核酸和氨基酸序列(SEQ ID NO.40)能够从数据库条目NM_000684或NP_000675获取。已知β-ARs形成两个在本文中称为ECI和ECII或β(1)-ECI和β(1)-ECII的细胞外结构域。如上所述，本发明的环状肽与β1-ECII共享序列相似性，特别是与人β1-AR的氨基酸片段DEARRCYNDPKCCDFV(SEQ ID NO.33)或RAESDEARRCYNDPKCCDFVTNR(SEQ ID NO.34)(分别为204-219位或200-222位的氨基酸)共享序列相似性，或者，特别是与人β1-AR的氨基酸片段DEARRCYNDPK(SEQ ID NO.45)或ESDEARRCYNDPK(SEQ ID NO.46)共享序列相似性。本文所使用的β-AR优选地指β1-肾上腺素受体(β1-AR)，更优选地是如上文所描述的人β1-AR。 
本文所提供的环状肽具备至少一个选自以下的特征： 
a)能够结合抗β1-肾上腺素受体(β1-AR)ECII环的(自身)抗体； 
b)能够抑制β1-AR与抗β1-AR的ECII环的(自身)抗体间的相互作用； 
c)模拟在β1-AR的ECII环的天然构象中呈现的至少一个表位； 
d)能够降低抗体介导的β1-AR的活化。 
Warne(2008Nature.DOI：10.1038)尤其分析了β1-AR的结构。 
如上文所提及的，本发明的环状肽是由通式环(x-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-x)(式I)所确定的。在该式中，“y”可以是除Cys外的任一氨基酸残基，优选地，“y”可以为除Pro和Cys外的任一氨基酸残基。一般地，“y”可为任一氨基酸，只要这一氨基酸不会与文中所提供的环状肽的另一氨基酸(例如与文中所提供的环状肽的另一Cys)形成分子内键(例如二硫键)。优选地，“y”可为类似于Cys的任一氨基酸(即具有类似的化学结构和/或三维肽结构内类似的性能)，除外的情况是它不会与文中所提供的环状肽的另一氨基酸(例如与文中所提供的环状肽的另一Cys)形成分子内键(例如二硫键)。更优选地，“y”可以是除Cys外的任一极性氨基酸，如苏氨酸Thr和丝 氨酸Ser。最优选地，本文所提供的环状肽中，“y”为Ser或Ser类似物。本文中“Ser类似物”表示具备与Ser具有相似的结构特征的残基，特别是氨基酸残基。例如“Ser类似物”指的是具备与Ser的化学结构相似的和/或与Ser在三维肽结构中性能相似的(氨基酸)残基。进一步的实例中，“y”也可为硒代半胱氨酸或其类似物。 
总之，像“除Cys外的任一氨基酸(残基)”或“不同于Cys的氨基酸(残基)”等的术语的意义都为本领域技术人员所熟知。具体地，如本发明自始至终所使用的，上述术语指的是任一氨基酸，只要这一氨基酸不与文中所提供的环状肽的另一氨基酸(例如与文中所提供的环状肽的另一Cys)形成分子内键(例如二硫键)。 
如所提及的，本发明环状肽的一个主要特征为它们包含能形成分子内键的仅两个半胱氨酸。例如，上述环状肽能够通过用一个不同的氨基酸取代β1-ECII的同源肽的第三个Cys来获得。因此，待被取代的Cys为对应于β1-ECII的第二个或优选第三个Cys，其彼此直接邻近(人β1-AR的215位和216位氨基酸(也见于NP_000675和SEQ ID NO.40)。本文中这两个Cys残基指的是如”Cys-Cys”，“Cys/Cys”，“Cys215-Cys216”或“Cys215/Cys216”等)。 
因此将产生的如文中所公开的合成突变肽或突变体称为“Cys-Ser”，“Cys/Ser”，“Cys13，16或17-Ser14，17或18”或“Cys13，16或17/Ser14，17或18”突变肽或突变体或者“Ser-Cys”，“Ser/Cys”，“Ser13或17-Cys14或18”或“Ser13或17/Cys14或18”突变肽或突变体，这取决于哪个半胱氨酸Cys被取代以及突变肽包含多少个氨基酸。 
可选地，通过特定位置上具体氨基酸的交换的参照来确定如本文所公开的突变肽。然后，例如突变肽/突变体被称为“Cys14，17或18→Ser14，17或18”突变肽/突变体或“Cys13或17→Ser13或17”突变肽/突变体，分别取决于对应于β1-AR的Cys216的Cys或对应于β1-AR 的Cys215的Cys是否被不同的氨基酸取代。指数“14，17或18”或“13或17”涉及本发明的示例性环状肽中的位置。其中位置1对应于如式I，即环(x-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-x)中所确定的第一个“x”。 
因此，使用的如“Cys13-Ser14”或“Cys13/Ser14”突变肽/突变体的术语与“Cys14→Ser14”突变肽/突变体具有同样的意义，而且在具体实施例中，指的是本文所公开的18mer肽。使用的如“Cys16-Ser17”或“Cys16/Ser17”突变肽/突变体的术语与“Cys17→Ser17”突变肽/突变体具有同样的意义，而且在一具体实例中，指的是本文所公开22mer肽。使用的如“Cys17-Ser18”或“Cys17/Ser18”突变肽/突变体的术语与“Cys18→Ser18”突变肽/突变体具有同样的意义，而且在一具体实例中，指的是本文所公开的25mer肽。 
类似地，使用的如“Ser13-Cys14”或“Ser13/Cys14”突变肽/突变体的术语与“Cys13→Ser13”突变肽/突变体具有同样的意义，而且在一具体实例中，指的是本文所公开的18mer肽，并且使用的如“Ser17-Cys18”或“Ser17/Cys18”的术语与“Cys17→Ser17”突变肽/突变体在具有同样的意义，而且在一具体实例中，指的是本文所公开的25mer肽。 
上文所给出的示例性指数指的是分别在本文所公开的具体的18mer、22mer或25mer肽中所示的氨基酸的位置。在本发明中，给出的关于本文公开的环状肽所示氨基酸位置的起始点为环状肽线性主链的N-末端氨基酸(像式I中的第一个“x”，见于上文)。给出的关于本文公开的线性肽所示氨基酸位置的起始点为其N-末端氨基酸。 
如本文所提供的发现和附加的实施例展现了没有任何半胱氨酸Cys突变的25AA，22AA和18AA环肽与环状25AA，22AA或18AACys18，17或14→Ser18，17或14(Cys-Ser)突变体、而不是与环状25AA或18AACys17或13→Ser17或13(Ser-Cys)突变体的可比性。 
还如上文所提及的，本发明的环状肽的式中，h能够是1至15的 任一整数，优选为5至9的任一整数，和/或i能够为0至14的任一整数，优选1至14，更优选0至6且甚至更优选1至6的任一整数。因此，h能够为1，2，3，4，5，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15和/或i能够为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14。优选地，h为5，8或9和/或i为3，4或6。更优选地，h为8和/或i为4。在本发明特别优选的实施方案中，xh代表特定氨基酸片段DEARR(SEQ ID NO.35)，AESDEARR(SEQ ID NO.47)或RAESDEARR(SEQ ID NO.36)和/或xi代表特定氨基酸片段DFV(SEQ ID NO.37)，DFVT(SEQ ID NO.48)或DFVTNR(SEQ ID NO.38)。在本发明更优选的实施方案中，xh代表特定氨基酸片段AESDEARR(SEQ ID NO.47)和/或xi代表特定氨基酸片段DFVT(SEQ ID NO.48)。 
本发明的环状肽(或其环状部分)可以由至少18个氨基酸、且最多25个氨基酸组成。因此，本发明的环状肽可以由18，19，20，21，22，23，24或25个氨基酸组成，其中特别地，优选18或25个氨基酸，且特别地，最优选22个氨基酸。在次优选的实施方案中，还考虑较小的肽，即包含16个或17个氨基酸的肽。 
在本发明中，特别优选的环状肽为如下的肽：长度为(21+1＝)22个氨基酸，具有确定的取决于各自氨基酸组成的环状分子的最大和最小尺寸，由来自人β1-肾上腺素受体的原始一级序列的21个氨基酸以及作为在假定环闭合位点(位置222)的22nd氨基酸的一个附加甘氨酸组成。 
不受理论约束时，结合抗β1-AR抗体的环状肽的一级结构(即氨基酸主链)的氨基酸数量进而长度对它们的生物学效应和/或成功/有效的生产是很关键的。 
长度为或超过26个氨基酸(一级结构)的肽可直接刺激(即不用载体蛋白)免疫活性T细胞并由此可以引发通过T细胞介导的B细胞刺激产生的抗β1-受体抗体的不希望的异常增加。 
在将合成的产物溶解于水溶液中的生产过程和问题期间，例如用于静脉或皮下注射，长度小于16个氨基酸(一级结构)的肽导致不希望的结晶。 
在本发明的次优选的实施方案中，也提供了属于上文给出的式I的a)到f)定义的环状肽，其只由16个氨基酸或甚至不太优选的只有17个氨基酸组成的环状肽。上述次优选的非限定性实例为肽：环(Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Tyr-Gln/DGlu)(如可由SEQ ID NO.39中所示的氨基酸主链所形成的)。 
本文特别优选的是，所公开的环状肽包含单个Pro。因此，特别优选的是，既不是本文所描述的式中的y也不是x，除了恰好xa，xb和xc的一个外，不是Pro。式I(或其他的式)中所描述的氨基酸片段xa，xb和xc中，优选xc为Pro。 
本文特别考虑的是，酸性氨基酸，如Asp或Glu，在本发明环状肽中所包含的Pro之前。因此，优选的是，式I(或其他的式)中所示的xb为酸性氨基酸，如Asp或Glu。具体地，当xc为Pro时，xb可为酸性氨基酸，当xb为Pro时，xa可为酸性氨基酸和当xa为Pro时，式I(或其他的式)的位于xa与第一个Cys间的x可为酸性氨基酸。 
更具体地，本发明的环状肽可由式I′或I″所确定： 
环(xI-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-x)(I′)； 
环(xIII-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-x)(I″)。。 
甚至更具体地，本发明的环状肽可由公式I′″或I″″所确定： 
环(xI-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-xII)(I′″)； 
环(xIII-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-xIV)(I″″)。 
总之，如所提及的，式I′和I′″中(和本文所示的其他式中)所示的xI和xII可为除了半胱氨酸以外的任一氨基酸。然而，特别地，当本发 明的环状肽的环闭合发生在xI和xII间时，特别考虑的是，xI和xII是在“头到尾(head to tail)”环化作用条件下能与彼此形成肽键的氨基酸。“头到尾”环化作用为本领域技术人员所知(例如Kates and Albericio：Solid phase synthesis，CRC-Press，2000；Williams，Chemical Approachesto the Synthesis of Peptides，CRC-Press 1997；Benoiton：Chemistry ofPeptide Synthesis.CRC-Press，2005)并在实验性部分给出其实施例。氨基酸可能的实例可为xI是甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸和优选丙氨酸。氨基酸可能的实例可为xII是谷氨酸和优选谷氨酰胺。次优选地，xII也可以是Asp或Asn。最优选地，xI是ALa和xII是Gln或Glu(优选DGlu)。 
因此，本发明的环状肽中，如式I′和I′″所提及的xII可以为Gln或Glu，其中Glu也可为DGlu(D-Glu；D-谷氨酸)。然而，天然氨基酸在本文是优选的。因此，更优选地，xII为谷氨酰胺。 
基于本文所提供的教导和本领域的知识(例如Williams，ChemicalApproaches to the Synthesis of Peptides，CRC-Press 1997；Benoiton：Chemistry of Peptide Synthesis.CRC-Press，2005)，本领域技术人员能够挑选出适合作为本发明的式I′和I′″的xI和/或xII的氨基酸残基。 
如所提及的，式I″和I″″中(和本文描述的其他式中)所描述的xIII和xIV可以是除了Cys以外的任一氨基酸。然而，具体当本发明的环状肽的环闭合发生在xIII和xIV间时，特别考虑的是，xIII和xIV是在”头到尾”环化作用条件下能与彼此形成肽键等的氨基酸。可为xIII的氨基酸可能的实例是精氨酸。可为xIV的可能的且最优选的氨基酸实例是甘氨酸或甘氨酸类似物。本文中的“Gly类似物”表示具有与甘氨酸类似的结构特征的残基，特别为氨基酸残基。具体地，例如“Gly类似物”指的是与Gly残基大小一样的(或甚至更小的)(氨基酸)残基。在本发明中令人惊讶地发现，具体地像位于“XIV”位置的Gly的小的(氨基酸)残基导致本发明相应的环状肽对β1-AR的ECII模拟的改进。根据本文所提供的教导和本领域的知识(例如Williams，ChemicalApproaches to the Synthesis of Peptides，CRC-Press 1997；Benoiton： Chemistry of Peptide Synthesis.CRC-Press，2005)，本领域技术人员能够挑选出适合作为式I″和I″″的xIII和/或xIV的氨基酸残基。 
本文进一步特别优选的是，本发明的环状肽缺乏Trp和/或His。因此，在本发明中特别考虑的是，式I到I″″中任一个所描述的x或y都不是Trp或His。 
而且，优选所提供的环状肽没有对水解作用或切割蛋白酶，例如像血清蛋白酶敏感的位点。术语“水解作用”和“(血清)蛋白酶”的含义都是本领域中所熟知的。 
本文所提供的肽也可描述为由与SEQ ID NO.33(代表包含β1-ECII表位的野生型氨基酸片段)同源的氨基酸序列组成或包含与SEQ IDNO.33同源的氨基酸序列的肽，其中(a)对应于SEQ ID NO.33的位置13(或次优选的，对应于位置12)的氨基酸不是半胱氨酸，并且对应于SEQ ID NO.33的位置6和12(或次优选的，对应于位置6和13)的氨基酸为半胱氨酸，(b)其中所述氨基酸序列不包含能在肽(即在与SEQ ID NO.33同源的肽部分)中形成分子内键的另外的半胱氨酸，以及其中所述肽能够发挥本发明的环状肽的功能，例如能阻断抗β1-AR抗体，或者其中所述肽能形成这种环状肽。任选地，本文所给出的关于公开的线性和/或环状肽的结构的更多规定应用于本文，并作出必要的修改。这样确定的肽由与SEQ ID NO.33同源的16个氨基酸片段组成，一个或多个氨基酸位于N-末端和C-末端侧翼，优选天然存在的氨基酸，如位于本文所给出的式I′到I″″的位置1的“xI”/“xIII”和最后位置的“xII”/“xIV”。 
在本发明中，尤其在(野生型)SEQ ID NO.33中，术语“同源的”表示氨基酸水平上的一致性至少为18.75％，至少为37.5％，至少为50％，至少为56.25％，至少为62.5％，至少为68.75％，至少为75％，至少为81.25％，至少87.5％或93.75％，其中优选较高的数值。 
总之，术语“氨基酸”或“氨基酸残基”的含义为本领域中已知 的并相应地用于本文中。因此，需要注意的是当“氨基酸”为肽或蛋白的组分时，本文中所使用的术语“氨基酸”的意义与“氨基酸残基”是一样的。 
具体地，本文中提及的“氨基酸”或“氨基酸残基”优选考虑为天然存在的氨基酸，更优选天然存在的L-氨基酸(除外上文提及的DGlu)。然而，尽管次优选地，本发明中的“氨基酸”或“氨基酸残基”也可以为非天然存在(例如合成的)氨基酸，例如，像正亮氨酸或β-丙氨酸，或具体地就本文所描述的式的“y”而言，“y”为硒代半胱氨酸或其类似物。 
术语“酸性氨基酸”、“碱性氨基酸”、“脂肪氨基酸”和“极性氨基酸”的含义也是本领域已知的(例如Stryer，Biochemie，Spectrum Akad.Verlag，1991，Item I.2.)。相应地这些术语的使用贯穿本发明始终。因此，本文给出的关于本发明的环状肽的具体规定也适用本文。 
具体地，本文所使用的术语“酸性氨基酸”意指选自Asp，Asn，Glu，和Gln的氨基酸，优选Asp和Glu；本文所使用的术语“碱性氨基酸”意指选自Arg，Lys和His的氨基酸，优选Arg和Lys；本文所使用的术语“脂肪氨基酸”意指选自Gly，Ala，Ser，Thr，Val，Leu，Ile，Asp，Asn，Glu，Gln，Arg，Lys，Cys和Met的任一氨基酸；本文所使用的术语“极性氨基酸”意指选自Cys，Met，Ser，Tyr，Gln，Asn以及次优选的Trp的任一氨基酸。 
在本发明第一方面的更一般的实施方案中，本文所提供的环状肽可以为式II，III或III′的环状肽： 
环(xI-x1-x1-x-x2-x2-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-xII)(II)； 
环(xI-x2-x-x1-x-x1-x1-x-x2-x2-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-xII)(III)； 
环(xIII，2-x-x1-x-x1-x1-x-x2-x2-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-xIV)(III′)， 
其中 
a)x1单独地和独立地选自酸性氨基酸；和/或 
b)x2单独地和独立地选自碱性氨基酸。 
在本发明第一方面的更具体的实施方案中，本文所提供的环状肽可为式IV，V或V′的环状肽： 
环(xI-x1-x1-x4-x2-x2-Cys-x3-xa 5-xb-xc-x2-Cys-y-x1-x3-x3-xII)(IV)； 
环(xI-x2-x4-x1-x4-x1-x1-x4-x2-x2-Cys-x3-xa 5-xb-xc-x2-Cys-y-x1-x3-x3-x4-x5-x2-xII)(V)； 
环(xIII，2-x4-x1-x4-x1-x1-x4-x2-x2-Cys-x3-xa 5-xb-xc-x2-Cys-y-x1-x3-x3-x4-xIV)(V′)， 
其中： 
a)x1单独地和独立地选自酸性氨基酸； 
b)x2单独地和独立地选自碱性氨基酸； 
c)x3单独地和独立地选自Leu，Ile，Val，Met，Trp，Tyr和Phe； 
d)x4单独地和独立地选自Ser，Thr，Ala和Gly；和/或 
e)x5单独地和独立地选自Gln和Asn。 
在本发明第一方面另外的实施方案中，环状肽包含由式II或IV的第2-12或2-14位氨基酸所确定的氨基酸片段、由式III或V的第4-16或4-18位氨基酸所确定的氨基酸片段或由式III′或V′的第3-15或3-17位氨基酸所确定的氨基酸片段；在本发明第一方面的更一般的实施方案中，本文所提供的环状肽可以为式II，III或III′的环状肽。 
在本发明第一方面另外特定的实施方案中，本文所提供的环状肽可以包含如下氨基酸片段： 
aci-Glu-Ala-bas-bas-Cys-Tyr-neu-aci-neu-bas； 
aci-neu-aci-Glu-Ala-bas-bas-Cys-Tyr-neu-aci-neu-bas； 
aci-Glu-Ala-bas-bas-Cys-Tyr-neu-aci-neu-bas-Cys-Ser；或 
aci-neu-aci-Glu-Ala-bas-bas-Cys-Tyr-neu-aci-neu-bas-Cys-Ser， 
其中“aci”代表酸性氨基酸，“neu”代表中性氨基酸且“bas”代表碱性氨基酸。上文两个氨基酸片段的每一个氨基酸残基也可以独立地确定为如本文所提供的式I，II，III，III′，IV，V和V的任一个的相应氨基酸 残基。 
在本发明第一方面的另外具体的实施方案中，本文所提供的环状肽可以包含如下氨基酸片段(amino acid stretch)： 
Asp-Xxx1-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys(SEQ ID NO.45)或 
Glu-Ser-Asp-Xxx1-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys(SEQ ID NO.46)。 
其中如上文所示的式所提及的，Xxx1被确定为“x”或“x1”，Xxx3被确定为“x”或“x3”和/或Xxx4被确定为“x”或“x4”。例如上述氨基酸片段可以为 
Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys(SEQ ID NO.45)或 
Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys(SEQ ID NO.46)。 
本文特别考虑的是，本发明环状肽包含一个或多个由β1-ECII携带的表位，例如像任一上文所提及的氨基酸片段(或所公开的包含这些氨基酸片段的环状肽的部分)所携带的表位。在本文中，术语“表位”具体指与(自身)抗β1-AR抗体结合的氨基酸片段。具体地，本发明中的表位由至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或至少14个氨基酸组成。本领域技术人员处在推论β1-ECII的哪个特定氨基酸残基促成(自身)抗β1-AR抗体结合的表位的位置。因此，他能推出至少哪个特定氨基酸残基必须包含在本发明的环状肽中以确保这些肽结合(自身)抗β1-AR抗体。为此，可利用若干本领域中已知的手段和方法(例如，用于表位定位的手段和方法(像PepSpotsTM、Biacore、氨基酸扫描(像丙氨酸扫描))。 
根据本发明，非限定性环状肽实例为选自以下的环状肽： 
a)由如SEQ ID NO.41，43，1-4和17-20的任一个所示的氨基酸序列形成或可形成的环状肽； 
b)由如SEQ ID NO.42，44，9-12，25-28，49，50，53和54的任一个 所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列形成或可形成的环状肽；和 
c)由核苷酸序列编码的氨基酸序列形成或可形成的环状肽，由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO.42，44，9-12，25-28，49，50，53和54的任一个所示的核苷酸序列。 
根据本发明的环状肽中，特别优选那些为Cys-Ser突变肽的环状肽，即对应于β1-ECII的第三个Cys(位于β1-AR位置216的Cys)的Cys被Ser交换的环状肽。上文给出的实例指的是这种特别优选的环状肽。如所附加的实施所显示的，这种环状肽在抑制或诊断抗β1-AR抗体中特别有用。 
下文的式VI到IX′的任一个给出了上述示例性特别优选的环状肽的特定结构： 
环(Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Gly)(IX′)； 
环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)(VI)； 
环(Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln)(VII)； 
环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-DGlu)(VIII)；和 
环(Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu)(IX)。 
根据本发明，非限定性的次优选的环状肽实例为选自以下的环状肽： 
a)由如SEQ ID NO.5-8和21-24的任一个所示的氨基酸序列可形成或形成的环状肽； 
b)由如SEQ ID NO.13-16和29-32的任一个所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列可形成或形成的环状肽；和 
c)由核苷酸序列编码的氨基酸序列可形成或形成的环状肽，所述核苷酸序列由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID NO.29-32任一个所示的核苷酸序列。 
下文的式X到XIII的任一个给出了上文示例性次优选的环状肽的特定结构： 
环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Gln)(X)； 
环(Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln)(XI)； 
环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-DGlu)(XII)； 
环(Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu)(XIII)。 
上述肽是本发明次优选的实施方案，因为如“Cys-Ser”突变肽(“Cys-Ser”环状肽)的肽尤其是在体内的作用强于本文所确定的次优选的“Ser-Cys”突变肽(“Ser-Cys”环状肽)。 
在本文中值得注意的是，本发明的环状肽的最优选的实例特别为那些药理学和/或诊断功能已在所附的实施例中被证实的环状肽(例如式VI到IX′的任一个所表征的那些)。 
可以理解的是，对于本发明的各种不同的肽，只要能保证相应肽的至少由一些确定的氨基酸残基和它们的空间排列所确定的总体二级和三级结构，例如氨基酸序列主链的一级序列中的特定的柔韧性和变异性是可能的(例如见式I，上述)。 
基于本文所提供的教导，一方面，本领域技术人员容易发现本发明的肽的相应的变体。另一方面，本领域技术人员能测试本发明的肽的特定变异体是否仍具有期望的功能，例如特异性结合β-AR抗体的能力，因此而拥有相应的像本文所提供和描述的治疗和诊断应用的医 学干预的潜能。本文示例性提供和描述了上述测试，即相应的测定的实验指南，，特别是在附加的实施例中。 
因此，本文也提供本文所公开和描述的肽的变体，只要是，首先这些变体仍有符合本发明的功能性活性，即作为抗β-AR抗体、特别作为抗β1-ECII的抗β1-AR抗体的结合配体的功能活性，更具体地作为β1-AR的阻断剂的功能活性和甚至更优选在抑制β1-AR与针对β1-ECII的抗β1-AR(更优选针对β1-ECII的自身-抗β1-AR抗体)间的相互作用中的活性；和其次，当根据本发明的生产方法环化时，这些变体不会以异构体混合物的形式出现且不会形成异构体混合物。这些变体被考虑为含有仅两个特定的半胱氨酸残基，所述两个残基形成或能够形成仅一个单独的分子内键(例如二硫键)。 
在本发明的肽的变体中，例如考虑将所述肽的一个或多个氨基酸用另外的一个或多个天然存在或合成的氨基酸取代。在本文中，优选这一/这些氨基酸交换为保守的氨基酸交换，即取代氨基酸与被取代的氨基酸属于同一类的氨基酸。例如，一个酸性氨基酸可被另一个酸性氨基酸所取代、一个碱性氨基酸可被另一个碱性氨基酸所取代，脂肪氨基酸可被另一个脂肪氨基酸所取代和/或一个极性氨基酸可被另一个极性氨基酸所取代。 
因此，本发明特别优选和提供的(环)肽的变体为如下变体：其中至少一个酸性氨基酸被选自酸性氨基酸的不同的氨基酸所取代，至少有一个碱性氨基酸被选自碱性氨基酸的不同的氨基酸所取代，至少有一个极性氨基酸被选自极性氨基酸的不同的氨基酸所取代和/或至少有一个脂肪族氨基酸被选自脂肪族氨基酸的不同的氨基酸所取代(只要是满足上文所提及的要求)。 
特别考虑的是，导致形成所公开的(环)肽的变体的氨基酸交换使得产生的变体的三级结构中的极性和电荷的形式实质上仍模拟相应的β1-AR的ECII表位的三维结构。 
在本发明的(环)肽的变体方面，本文所确定的半胱氨酸也可被另外的氨基酸取代，只要这一取代仍可导致形成环肽中像二硫键那样的单独的分子内键，即环化期间异构体混合物形成的避免和/或β1-AR的ECII的正确模拟。上述氨基酸尤其可能为非天然形成的氨基酸，像含有能形成二硫键的-SH基团的非天然形成的氨基酸。然而，本文优选的是，上文式I中所给出的Cys确实为天然形成的氨基酸，优选半胱氨酸自身。 
本领域中的技术人员也公认的是形成本发明的(环)肽的一个或几个氨基酸可被修饰。与此相对应的是，本文所使用的任一氨基酸都可代表其修饰形式。例如，本文所使用的丙氨酸残基可包含一个修饰的丙氨酸残基。上述的修饰尤其可为甲基化或酰基化等，从而这种修饰或修饰的氨基酸优选包含在本发明中，只要这样修饰的氨基酸，更具体地是包含所述这样修饰的氨基酸的肽仍有本文所确定的功能性活性，比如作为抗β1-AR抗体的抑制剂的功能性活性，优选在抑制β1-AR与抗体间相互作用方面的活性，更优选作为直接针对β1-AR的自身抗体。确定所述肽，即包含一个或几个修饰的氨基酸的肽是否满足这一要求的相应测定法为本领域中技术人员所知晓，其中包括那些本文、特别是在本文实施例部分描述的那些。 
本发明也提供了所公开的(环)肽的衍生物，诸如像盐酸、硫酸、磷酸、苹果酸、反丁烯二酸、枸橼酸、tatratic酸、乙酸的生理学的有机酸和无机酸的盐。 
如本文所使用的，自N末端到C末端显示公开的肽序列，由此N末端在所描述的相应氨基酸序列的左侧而C末端在所描述的相应氨基酸序列的右侧。当提及环状肽时，自对应于式I的左侧到对应于公式I的右侧显示对应的序列。 
根据本发明，“环状肽”或“环肽”等为在其氨基酸主链/一级氨 基酸序列中通过具有共价特征的至少一个、优选至少两个、更优选恰好两个分子内键在分子内形成分子环状结构的肽。在本发明中，这一分子环状结构的形成过程也称为“环化”。 
在一具体优选的实施方案中，本发明的环状肽有两个具有共价特征的分子内键，其中这些键中的一个为肽的N和C末端间的分子内键，所述肽为公开的环状肽的氨基酸主链/一级氨基酸序列，另一个是位于该肽的两个非末端的氨基酸间的分子内键合。如所提及的，这两个非末端氨基酸可以是两个Cys。 
通常，本发明的“环化”可以通过至少一个选自S-S键、肽键、诸如C-C或C＝C的碳键、酯键、乙醚键、偶氮键、C-S-C键、C-N-C键和C＝N-C键的共价结合的键发生。 
具体地，能通过肽的N末端氨基酸的NH2基团和肽的C末端氨基酸的COOH基团形成如本发明自始至终所提及的的肽键，所述肽形成所公开的环状肽的氨基酸主链/一级氨基酸序列。 
优选地，形成所公开的环状肽的氨基酸主链/一级氨基酸序列的肽的N和C末端间的分子内键是肽键，并且位于该肽的两个非末端氨基酸间的分子内键为S-S键(例如二硫键)。 
在本发明中，在提供的环状肽的氨基酸主链/一级氨基酸序列中的两个Cys残基间能形成在所述环状肽中的分子内S-S键。 
在本发明的环状肽内，不但可以形成上文提及的两个特定的分子内共价键，而且在下述条件下还可以形成另外的分子内键：保持本文所描述的环状肽的功能和仍能容易地对环状肽进行生化表征，这例如意味着在相应的氨基酸主链/一级氨基酸序列的环化期间不会形成异构体混合物。 
例如，上述另外的分子内键为由组成氨基酸(constituent aminoacids)的NH2基团和COOH基团的侧链形成的附加键。 
如本发明自始至终所使用的“氨基酸主链”或“一级氨基酸序列”的术语一方面指的是环状肽的结构组分或部分，其由它对应的氨基酸序列可形成或形成，。另一方面，这些术语指的是能通过环化作用形成本发明的环状肽的线性的肽。 
在本发明第一方面的一个具体实施方案中，所提供的环状肽为可通过如本文所提供的环状肽的生产方法获得的。上文所给出的定义也适用于这一具体提供的本发明的环状肽。 
在本发明第一方面的一个具体实施方案中，也提供了这样的肽，所公开的环状肽通过这样的肽可形成或形成。具体地，这些肽是形成或能够形成本文公开的环状肽的线性肽，即其氨基酸主链/一级氨基酸序列。 
总之，这种线性肽可为任一肽，其N和C末端的共价键产生如本发明中所公开的环状肽。例如，这种线性肽可以是生产本发明的环状肽的过程中的某种中间化合物，所述过程如本文所公开的生产环状肽的方法。 
总之，在本发明中，本文所提供的线性肽的N和C末端可以是位于所公开的环状肽的氨基酸主链中的直接相互邻近处的任一氨基酸对。换句话说，本发明的环状肽的环化(环闭合)通常发生在任一所述氨基酸对之间。技术人员容易发现这种特定的氨基酸对，其能够有效地/适合作为本文所公开的线性肽的N和C末端，即其能够有效地/适合作为参与本发明中所确定的环闭合/环化的氨基酸对。 
在一优选的但非限定性的实例中，本发明的线性肽的环化(环闭合)可以发生在Ala与Gln或Glu间，即这一线性肽的N末端氨基酸可为Ala，并且C末端氨基酸可为Gln或Glu。能形成本发明的环状肽的这种线性肽的实例为SEQ ID NO.1-4和次优选的SEQ ID NO.5-8。 
在另一优选的但非限定性的实例中，本发明的线性肽的环化(环闭合)可以发生在Lys与Pro间，即这一线性肽的N末端氨基酸可为Lys且C末端氨基酸可为Pro。能形成本发明的环状肽的这种线性肽的实例为SEQ ID NO.17-20和次优选的SEQ ID NO.21-24。 
在另一更优选的但非限定性的实例中，特别当所提供的为22mer环状肽时，本发明的线性肽的环化(环闭合)可以发生在Arg与Gly间，即这一线性肽的N末端氨基酸可为Arg且C末端氨基酸可为Gly。能形成本发明的环状肽的这种线性肽的实例为SEQ ID NO.41。 
在另一更优选的但非限定性的实例中，特别当所提供的为22mer环状肽时，本发明的线性肽的环化(环闭合)可以发生在Lys与Pro间，即这一线性肽的N末端氨基酸可为Lys且C末端氨基酸可为Pro。能形成本发明的环状肽的这种线性肽的实例为SEQ ID NO.43。 
除了它们的氨基酸主链之外，本发明的环状肽还可以包含(例如共价结合的)(a)另外的取代基，像标记物、锚定基(像蛋白性膜锚定基)、标签(像组氨酸标签)等。合适的取代基和将它们添加到本发明的环状肽的方法都为本领域中的技术人员所熟知。 
本文中的标记物的实例尤其包括荧光染料(像荧光素、若丹明、德克萨斯红(Texas Red)等)、酶(像辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(像32P、33P，35S、121I或123I、135I、124I、11C、15O)、生物素、地高辛、胶体金属、化学或生物发光化合物(像二氧烷酮基、鲁米诺或吖啶酯)。可以与本发明的肽结合的特别考虑的一种标记物为属于荧光染料的FRET对的荧光染料，例如GFP变体(例如GFP、eGFP、EYFP或ECFP)。 
可以利用各种用于标记生物分子的技术，这些技术为本领域中技术人员所熟知并被认为在本发明的范围内并且尤其包含酶或生物素基团的共价偶联，磷酸化作用，生物素(酰)化，随机引物法，切口平移法，拖尾(利用末端转移酶)法。这些技术例如在Tijssen，“Practice andtheory of enzyme immunoassays”，Burden and von Knippenburg(Eds)，Volume 15(1985)；“Basic methods in molecular biology”，Davis LG， Dibmer MD，Battey Elsevier(1990)；Mayer，(Eds)“Immunochemicalmethods in cell and molecular biology”Academic Press，London(1987)；或在“Methods in Enzymology”，Academic Press，Inc.系列中有所描述。检测方法包括，但不限于，放射自显影法、荧光显微法、直接和间接酶促反应等。 
取代基可直接或通过连接子与本发明的环状肽结合(例如共价地)。技术人员容易地找到应用于本文中的合适的连接子。 
另一方面，本发明涉及包含编码本发明中所公开的环状肽的氨基酸主链/一级氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子。本发明也涉及包含编码本文所提供和描述的线性肽的核苷酸序列的核酸分子。例如，这种核酸分子可以包含如SEQ ID NO.42，44，9-12，25-28，49，50，53和54中的任一个或如次优选的SEQ ID NO.13-16和29-32中的任一个所描述的核苷酸序列或由于遗传密码子的简并性而与其有所不同的核苷酸序列。 
术语“核酸分子”、“核酸序列”和“核苷酸序列”等术语的意义为本领域所熟知并且相应地应用于本发明中。 
例如，当在本发明自始至终使用时，这些术语指所有天然存在形式的或重组产生的类型的核苷酸序列和/或核酸序列/分子以及指化学合成的核苷酸序列和/或核酸序列/分子。这些术语也包含核酸类似物和核酸衍生物，诸如，例如锁DNA、PNA、寡聚核苷酸硫代磷酸酯和取代的寡聚核糖核苷酸。此外，这些术语还指包含核苷酸或核苷酸类似物的任一分子。 
优选地，“核酸分子”、“核酸序列”和“核苷酸序列”等术语指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。“核酸分子”、“核酸序列”和“核苷酸序列”可通过本领域技术人员已知的合成化学方法学、或通过利用重组技术来制备，或者从天然来源中分离或通过其组合来制备。DNA和RNA可以任选地包含非天然的核苷酸并且可以为单链或双链。“核酸分子”、“核酸序列”和“核苷酸序列”还指正义和反义DNA 和RNA，即与DNA和/或RNA中的特定核苷酸序列互补的核苷酸序列。 
此外，“核酸分子”、“核酸序列”和“核苷酸序列”等术语可以指DNA或RNA或其杂交体或其在现有技术中已知的任一修饰物(例如参见US 5525711，US 4711955，US 5792608或EP 302175的修饰物的实例)。本发明的这些分子可为单链或双链的、线性的或环状的、天然或合成的，并且没有任何大小的限制。例如，“核酸分子”、“核酸序列”和“核苷酸序列”可以为基因组的DNA、cDNA、mRNA、反义RNA、核酶或编码上述RNA的DNA或嵌合体(Cole-Strauss Science 1996273(5280)1386-9)。它们可为质粒形式或病毒DNA或RNA的形式。“核酸分子”、“核酸序列”和“核苷酸序列”等还指寡聚核苷酸，其中包括现有技术中的任一修饰物，诸如硫代磷酸酯或肽核酸(PNA)。 
本文所提供的核酸分子特别用于生产本发明的环状肽，例如通过本文所公开的相应的方法。 
另一方面，本发明还涉及包含如本文所公开和上文描述的核酸分子的载体。 
所述载体可为克隆性载体或表达性载体，例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以具有复制能力或为复制缺陷型。在后一种情况下，病毒增殖通常只发生在互补的宿主/细胞中。本文所提供的核酸分子可以连接到包含用于在宿主中增殖的选择性标记物的特定载体。通常，在诸如磷酸钙沉淀物或氯化铷沉淀物的沉淀物中，或在带电荷的脂质的复合物中，或诸如富勒烯的碳基簇中引入质粒载体。如果载体为病毒，可以在应用于宿主细胞前利用合适的包装细胞株将其在体外包装。 
优选地，本发明的核酸分子可操作地连接到允许在原核或真核细胞或其分离的部分中表达的表达调控序列(例如在本文所公开的载体中)。所述多聚核苷酸的表达包括核酸分子的转录，优选将核酸分子转 录为可翻译的mRNA。确保在真核细胞中、优选在哺乳动物细胞中表达的调节元件为本领域技术人员所熟知。它们通常包含确保转录起始的调节序列和确保转录终止和转录物稳定的任选的多聚A信号。额外的调节元件可包括转录及翻译增强子。允许真核宿主细胞内表达的可能的调节元件包含例如大肠杆菌中的lac、trp或tac启动子，并且允许真核宿主细胞内表达的调节元件的实例有酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其它动物细胞中的CMV-，SV40-，RSV-启动子(鲁斯氏肉瘤)、CMV-增强子、SV40-增强子或珠蛋白内含子。除了负责转录起始的元件外，上述的调节元件还可以包括转录终止信号，诸如SV40-多聚-A位点或tk-多聚-A位点，多聚核苷酸的下游区。在本文中，合适的表达载体诸如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)，pSPORT1(GIBCO BRL)是本领域已知的。优选地，所述载体为表达载体和/或基因转移载体。衍生于诸如下述的病毒的表达载体可以用于将本发明的多聚核苷酸或载体递运到靶向的细胞群：逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒。为本领域技术人员所熟知的方法可用于构建符合本发明的载体；例如参见Sambrook，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1989)N.Y.和Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology，Green Publishing Associates和Wiley Interscience，N.Y.(1994)中所描述的技术。可选地，可将本发明的多聚核苷酸和载体重建到脂质体中以用于递送到靶细胞。 
术语“其分离的部分”指能够从本发明的载体转录或者转录和翻译RNA的真核或原核细胞或组织的部分。所述部分包含RNA转录所需的蛋白或者RNA转录以及所述RNA翻译为多肽所需的蛋白。例如，所述分离的部分可为真核细胞诸如网织红细胞的核和胞浆部分。包含上述细胞或组织的分离的部分、用于转录和翻译RNA的试剂盒可以商购，例如TNT网织红细胞裂解物(TNT reticulolysate，Promega)。 
此外，像本发明的核酸分子，本文所提供和描述的载体也特别用 于生产本发明的环状肽，例如通过本文所公开的相应的方法。 
在另一方面，本发明涉及包含如本文所公开的核酸分子和/或载体的重组宿主细胞。在这一方面，本文所公开的核酸分子和/或载体尤其能用于基因工程宿主细胞，例如以表达和分离本文所公开的环状肽的氨基酸主链/一级氨基酸序列，并由此表达和分离本发明的线性肽。 
上述宿主细胞可为原核或真核细胞；参见上文。出现在宿主细胞中的核酸分子或载体可被整合到宿主细胞的基因组或其仍保持在染色体外。 
宿主细胞可为任一原核或真核细胞，诸如细菌的、昆虫的、真菌的、植物的、动物的、哺乳动物的或优选人类细胞。例如优选的真菌细胞为酵母属那些、尤其是酿酒酵母种的那些，或者属于菌丝真菌组的那些、例如若干青霉株或曲霉株。术语“原核的”意味着包括所有能被核酸分子转化或转染以用于表达本文所公开的环状肽的氨基酸主链/一级氨基酸序列，从而表达本发明的线性肽的细菌。原核宿主可以包括革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌诸如，例如大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。利用本领域中技术人员所普遍知晓的任一技术，能够将用于编码本文所公开的环状肽的氨基酸主链/一级氨基酸序列，从而编码本发明的线性肽的核酸分子用于转化或转染宿主。制备融合的、可操作地连接的基因并在细菌或动物细胞中表达它们的方法为本领域中所熟知(Sambrook，见上文)。本文所描述的基因构建体和方法可用于在例如原核宿主中表达上文提及的氨基酸主链/一级氨基酸序列和线性肽。 
总之，促进插入的多聚核苷酸有效转录的包含启动子序列的表达载体被用于与宿主的连接。表达载体代表性地包含复制起始点、启动子和终止子及能够提供转化的细胞的表型选择的特定基因。转化的原核宿主能够在发酵罐中生长，并能够根据本领域中已知的技术培养转化的原核宿主以实现最佳的细胞生长。然后能够从生长培养基、细胞 溶解物或细胞膜部分中分离表达的肽。微生物表达或以另外方式表达的肽的分离和纯化可借助任一常规方法诸如，例如制备型色谱分离法和诸如涉及单克隆或多克隆抗体使用的那些的免疫学分离法(Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.(1994))。 
此外，像本文所描述和提供的核酸分子和载体，相应的宿主细胞也特别用于生产本发明的环状肽，例如，通过文本所公开的相应的方法。 
然而在另一方面，本发明涉及生产本发明的环状肽的方法，包括以下步骤： 
a)(i)在使本文公开的环状肽的氨基酸主链(或本发明的线性肽)表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞，并且回收上述的氨基酸主链(或上述的本发明的线性肽)；或 
(ii)化学合成本文所公开的环状肽的氨基酸主链(或本发明的线性肽)；以及 
b)使上述氨基酸主链(或上述线性肽)环化以形成本文所公开的环状肽。 
上文所给出的关于术语“环化”的定义适用于此处，并可作必要的变化。在上文方法的具体背景下，术语“环化”的含义包括分子内键(二硫键)的形成和通过共价连接环状肽主链的N末端和C末端产生的环闭合。 
本文给出的有关本发明的环状肽、其氨基酸主链或相应的线性肽及有关本文所提供的宿主细胞方面的定义适用于此处，并可作必要的变化。 
如上文已提及的有关所提供的环状肽和线性肽方面，在本发明的另一方面的优选实施方案中，待环化以产生本发明的环状肽的氨基酸 主链/线性肽的N末端氨基酸为Ala、Arg或Lys，并且相应的C末端氨基酸为Gln、Gly或Glu(DGlu也是可能的)或Pro。然而，如上文所提及的，也考虑其它的N和C末端的氨基酸，即在所公开的方法中也可以使用其它的环化(环闭合)位点。 
基于公知常识和如WO 2006/103101的现有技术(其公开了如何合成肽特别是环状肽的通用方法)，本领域技术人员能够容易地将本文所公开的生产环状肽的方法付诸实施。另外，例如在附加的实验部分(实施例1)中的本发明的教导提供了能够实现的技术指导。 
在本发明的非限定性实施例1中，将环肽首先合成为其线性肽/氨基酸主链的形式(例如通过应用化学合成方法，比如芴甲氧羰基/叔丁基策略(Fmoc/tert butyl strategy)(如WO 2006/103101中所记载的；Chen W.C.and White P.D.：Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis，OxfordUniversity Press 2003))，然后通过C末端的羧基基团与N末端氨基酸的氨基的缩合将其在主链中共价环化(“头到尾”环化；Kates S.andAlbericio F.：Solid phase synthesis，CRC-Press，2000)。 
随后，通过本领域已知的化学相互作用(e.g.Benoiton N.L.：Chemistry of Petide Synthesis.CRC-Press，2005)在能形成二硫键的线性肽的那两个半胱氨酸残基间形成二硫键(例如18mer肽的Cys7和Cys13间，22mer肽的Cys10和Cys16间，或者25mer肽的Cys11和Cys17间)。 
总之，在上文描述的方法的“环化”步骤中，待生产的环状肽的线性主链的环闭合可在S-S键形成之前或之后完成。换句话说，肽氨基酸链的两个半胱氨酸残基间的S-S键可为所描述的生产过程的“环化”步骤的第一步而环闭合为第二步，或反之亦然。技术人员能发现这些具体方法的哪一种是适合给出的生产先决条件的方案。 
如上文所提及的，待生产的线性肽/环状肽的氨基酸主链也可通过重组工程技术来生产。上述的技术在本领域中是熟知的(例如Sambrook， 见上文)。特别地，也如上文所提及的，所述线性肽/氨基酸主链的这种生产方式可以利用本文公开和描述的核酸分子、载体和/或宿主细胞。相应地上文给出的定义也适用于此处，并可作必要的修改。 
肽合成的若干方法，特别是环状肽的合成方法为本领域中是已知的(例如Williams，Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides，CRC-Press 1997；Benoiton：Chemistry of Peptide Synthesis.CRC-Press，2005)。技术人员基于本文提供的教导，能够容易地将现有技术知识适用于所公开的生产环状肽的方法的特定要求。 
如上文已提及的，本发明还涉及通过上文所描述的方法可获得的或获得的环状肽，而且也涉及通过上文所描述的方法可获得的或获得的作为某种中间产物(具体地，通过上文描述的方法的步骤a)可获得的或获得的产物)的相应的线性肽(相应的环状肽的氨基酸主链/一级序列)。 
总之，本发明的环状肽尤其可用于医疗干预方法中。这种方法包括作为诊断试剂或在诊断试剂中的使用和用于生产治疗疾病的药物，或者在组合物中或作为组合物，优选药物组合物、诊断组合物或诊断试剂盒的使用，优选用于抗β-AR抗体的检测，更优选用于抗β1-AR抗体的检测。 
如所提及的，本文所确定或描述的抗体优选自身抗体。 
化合物，特别是本发明的环状肽的非限定性用途和应用描述于本文中，例如在下文中。 
本发明还涉及包含本发明中所公开和提供的环状或线性肽、核酸分子、载体或重组宿主细胞和任选的载体的组合物。 
在这一方面的一具体实施方案中，上述的组合物为药物组合物，并且上述的载体为药物可接受的载体。 
如本文所描述和确定的，本发明的组合物，特别是本发明的药物组合物应用于治疗、改善或预防时特别有用。因此，本发明的药物组合物可以用于β-AR的活性增强的疾病的治疗、改善和预防或用于治疗带有抗β-AR抗体的患者。而且，本发明的药物组合物可以用于诱导患者的免疫耐受，特别是诱导患者对于内源性β1-AR的免疫原片段的免疫耐受。 
除了包含至少一个本发明的环状肽以外，所提供的(药物)组合物可以包含两个或多个(比如至少3个或至少5个)本发明的环状肽。 
同样地，根据本发明，不但一个，而且两个或多个(比如至少3个或至少5个)上述的环状肽可以给予需要医疗干预的患者。因此上述一个以上的环状肽的给药可以是同时地或相继地。 
而且，在一具体实施方案中，本发明涉及本文所公开的药物组合物、医疗干预的方法或用途或者环状肽或药物组合物，其中上述环状肽与至少一个另外的药物活性剂一起给药或上述药物组合物包含至少一个另外的药物活性剂。 
上述至少一个另外的药物活性剂可以是β受体阻断剂，优选选择性β-AR阻断剂，例如，比如选自阿替洛尔、美托洛尔、奈比洛尔、比索洛尔等的β1-AR阻断剂。 
不受理论约束，因为β1-AR同时通过像比索洛尔或美托洛尔的β阻断剂上调，这种特定的组合通过本文所提供的环状肽提供防御抗体诱导的选择性β1-AR下调的保护并且最终产生环状肽和附加的β阻断剂的协同效应。 
任选地包含在本发明的(药物)组合物中或与本发明的(药物)组合物或环状肽一起给药的载体可具体为药物可接受的载体、赋形剂或稀释剂。 
上述载体为本领域中所熟知。技术人员容易地找出特别适合应用 于本发明的载体。 
下文中，描述了若干非限定性给药方案和相应合适的药物可接受的载体的使用。 
对于经由皮下或静脉内注射给予本发明的药物组合物和/或环状肽，本发明的化合物可在水溶液中配制，优选在生理性相容的缓冲液中，诸如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理盐水缓冲液。对于经粘膜或经肺给药，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。上述渗透剂为本领域中所通常知晓的。 
使用药物可接受的载体将本发明的化合物配制成适于全身给药，即静脉内/动脉内或皮下给药的剂型或药物组合物，这在本发明的范围内。通过选择正确的载体和合适的生产实践，本发明的组合物，尤其是配制成溶液的那些，可以经胃肠外给药，诸如经静脉内注射。利用本领域中所熟知的药物可接受的载体，可以容易地将化合物配制成适合于皮下或口腔给药的剂型。上述载体使本发明的化合物能配制成为片剂、药丸、胶囊、锭剂、液体、凝胶、糖浆、水浆、悬浮液等用于治疗对象的口服。 
可以利用本领域中技术人员所熟知的技术，给予预期体内/细胞内给药的本发明的化合物或包含化合物的药物。例如，上述试剂可以包裹在脂质体内，然后如上文所描述的给药。脂质体为内部含水的球状脂质双分子层。脂质体形成时存在于水溶液中的所有分子都被合并到水性内部。脂质体内容物既被保护免于与外部的(细胞)微环境接触，而且因为脂质体与细胞膜融合，又能有效地被递送到细胞表面附近。Janoff等拥有的U.S.Patent No.4,880,635中公开了涉及脂质体的递送系统。出版物和专利提供了脂质体药物递送技术的有用的描述。 
用于胃肠外和/或皮下给药的包含本发明化合物的药物组合物包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的悬浮液可制 备成合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括诸如芝麻油或蓖麻油的脂肪油，或诸如油酸乙酯或甘油三酯的合成性脂肪酸酯，或脂质体。水性注射悬浮液可以包含增加悬浮液粘性的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、右旋糖酐等。任选地，悬浮液也可包含合适的稳定剂或增加化合物的可溶性的试剂以允许制备高度浓缩溶液并使物质在有机体内持续缓慢释放。 
本领域技术人员清楚的是，根据本发明，公开的药物组合物或环状肽可以以药物/治疗有效剂量给药，这意味着达到给予的化合物的药物/治疗有效量。优选地，药物/治疗有效剂量指给予的化合物(活性成分)引起个体症状改善或存活延长的量，这可由本领域技术人员借助常规试验来确定。 
需要注意的是，本发明待给药的化合物的剂量方案将由主治医生和临床因素所决定。如医学领域中所熟知的，对任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体积、体表面积、年龄、待给药的特定化合物、性别、给药时间和途径、一般健康状况、和同时给予的其他药物。本领域技术人员可意识到并能检测根据本发明应用于医学的化合物被给药的相关剂量。 
如本文所显示的，本文所提供的环状肽的作用，即抗β1-AR抗体的阻断，可通过剂量依赖性方式来获得。 
从而如本文所公开的Cys→Ser突变环肽的功效取决于阈值浓度(图14.15和16B，C)。 
因此，特别地，公开的药物组合物或环状肽可以其存在如下浓度，即达到阈值浓度的方式给药：每kg体重至少0.05mg，优选每kg体重至少0.1mg，更优选为每kg体重0.1mg(100μg/kg)至每kg体重100mg，更优选为每kg体重1mg至每kg体重100mg和最优选为每kg体重1mg至每kg体重10mg。 
特别地，公开的药物组合物或环状肽的有效剂量可以为大约每kg 体重1mg。通过相应的给药应用方案，通常也考虑达到公开的药物组合物或环状肽的更高浓度。例如，如此的更高浓度可以为每kg体重至少2、3、4或5mg。优选每kg体重至少1mg或每kg体重至少2mg的浓度。 
本发明中应用的一个特别优选的非限定性给药方案为每2周或4周皮下或静脉注射。 
在本文中，需要注意的是，本文应用的大鼠模型中，1到4mg/kg的剂量每隔一个月静脉注射可足以得到本发明的化合物的治疗水平，而人类相应的剂量方案优选为约0.3-10mg/kg静脉或皮下注射，更优选约1-10mg/kg静脉或皮下注射，甚至更优选约1-5mg/kg静脉或皮下注射。 
如本文所显示的，公开的环状肽的给药最初可触发短暂的相反的免疫反应，尤其当使用较高剂量时。长远来看这种短暂的免疫反应可被使用的环状肽的抗体灭活活性所抵消。这可能导致使用的环状肽的作用降低，即抗β1-AR抗体的清除减慢并由此导致(异常的)β1-AR活性的降低缓慢。 
本发明还涉及用于下述的方法： 
a)治疗、改善或预防β-AR活性增强、优选β1-AR活性增强的疾病； 
b)治疗以下患者：具有抗β-AR、优选抗β1-AR的抗体，或者患有或有发展为本文所公开的疾病的风险；或 
c)诱导免疫耐受， 
所述方法包括以下步骤：给予需要这种医疗干预的患者药物活性量的本文所公开的环状肽和/或药物组合物，以及任选地药物可接受的载体。 
本发明也涉及如本文所公开的环状肽和药物组合物，以及任选地药物可接受的载体，用于 
a)治疗、改善或预防β-AR活性增强、优选β1-AR活性增强的疾 病； 
b)治疗以下患者：具有抗β-AR、优选抗β1-AR的抗体，或者患有或有发展为本文所公开的疾病的风险；或 
c)诱导免疫耐受。 
根据本发明待医疗干预(治疗、改善、预防或诊断)的疾病或如本文确定和描述的患者所患的疾病优选是那些其中β1-AR以非生理方式活化的疾病，更优选其中β1-AR通过抗体、更优选通过抗β1-AR的自身抗体活化的疾病。 
示例性地且优选地，根据本发明待医疗干预的疾病或如本文确定和描述的患者所患的疾病包括，但不只限于心脏病类型。 
特别地，根据本发明待医疗干预的心脏疾病或如本文所确定和描述的患者所患的心脏疾病可以包含但不限于感染性和非感染性心脏疾病、缺血性和非缺血性心脏疾病、炎症性心脏疾病和心肌炎、心脏扩张、特发性心肌病、(特发的)扩张性心肌病(DCM)、免疫性心肌病、心力衰竭和包括室性和/或室上性过早夺获搏动及包括心房纤颤和/或心房扑动在内的任何房性心律失常的任何心律失常。 
换句话说，对于本发明的方法或环状肽或药物性组合物，本文给出的描述和定义中所提及的心脏疾病可以是选自下述的心脏疾病：感染性和非感染性心脏疾病、缺血性和非缺血性心脏疾病、炎症性心脏疾病和心肌炎、心脏扩张、特发性心肌病(特发的)扩张性心肌病(DCM)、免疫性心肌病、心力衰竭和包括室性和/或室上性过早夺获搏动及包括心房纤颤和/或心房扑动在内的任何房性心律失常的任何心律失常。 
需要注意的是，根据本发明待医疗干预(治疗、改善、预防或诊断)的最优选的疾病或如本文所确定和描述的患者所患的最优选的疾病为扩张性心肌病(DCM)，优选自发性扩张性心肌病。 
出于本发明的目的，“患者”的特定亚群为患有任一本文所描述的疾病的那些患者，更具体地为患有本文所描述的心脏疾病和同时具有抗β-ARs抗体、更优选抗β1-AR抗体的患者，其中抗体优选为自身抗体。 
根据本发明待医疗干预(治疗、改善、预防或诊断)的疾病或如本文所确定和描述的患者所患的疾病预期通过抗β-AR抗体、优选抗β1-AR抗体被诱发。这些抗体优选为自身抗体。 
本文所提供的手段和方法在用于本文所确定的疾病的预防/防止时尤其有用。这意味着患者可应用本发明的环状肽和/或药物性组合物在本文所确定的疾病(症状)发作前进行治疗。例如，这一预防性治疗在前述的诊断应用后，例如，所述诊断应用利用本文所提供的诊断手段和方法。因此，当诊断为具有发展为如本文所确定的疾病风险时，例如当检测到抗β-AR(自身)抗体时，优选应用利用本发明的治疗性手段和方法的预防性治疗。 
在本文中，优选的“患者”为处于发展为如本文所确定的疾病风险中的患者。具体地，这一患者具有抗β-AR(自身)抗体、优选抗β1-AR(自身)抗体，但还未患有如本文所确定的疾病或其症状。 
本发明中免疫耐受的诱导可以考虑具体通过抑制抗β-AR分子的免疫原片段的抗体的产生来获得，不受理论约束，这可归因于对产生抗体的早期(成熟的)B细胞和记忆B细胞的抗原识别位点的阻断。 
在本发明中，所提供的药物性组合物或环状肽特别用于治疗、预防和/或改善在本文所确定的任一疾病和患者群或患者，包括在这些患者中利用上述的化合物检测抗β-AR抗体。 
出于本发明的目的，“患者”，即待给药本发明的化合物或患有本文所确定和描述的疾病或者预期依照本发明被诊断的那些，包括人类 和其他的动物和有机体。从而本发明的化合物和方法可应用于或与包括诊断剂、诊断步骤和方法及分期步骤和方法在内的人类治疗和兽医应用有关。在一优选实施方案中，患者为哺乳动物，并且在最优选的实施方案中，患者为人类。 
本发明的突变环状肽也可以用于制备治疗、预防和/或改善如本文所确定的任一疾病和患者群/患者的药物。本文就药物组合物所述的内容也适用于本发明肽可以用于其生产的药物。 
仍在另一方面，本发明涉及诊断试剂，其包含或是本发明的环状肽或组合物，以及任选地至少一个另外的生物活性化合物。 
本文所公开的诊断剂优选包含或由本发明的突变肽组成，其中突变肽包含标记物。这种标记物可以选自包含放射性标记物和荧光标记物的组。相应的标记物是本领域技术人员已知的。如上文所给出的标记物的定义和描述应用于此，并可以作必要的修改。代表性地，肽为赋予诊断剂特异结合特征的诊断剂的部分，优选结合抗β1-AR抗体，而标记物赋予诊断剂信号特征。 
除了标记的或未标记的本发明的突变肽以外，本发明的诊断剂可以包含另外的生物活性化合物。这种另外的生物活性化合物可以是赋予诊断剂信号特征的一种手段，尤其在本发明的突变肽未标记的情况下。例如，另外的生物活性化合物可以是抗体，优选单克隆抗体，更优选特异性结合本发明的突变肽的标记的抗体或结合由本发明的突变肽和抗β-AR抗体、优选抗β1-AR抗体组成的复合物的标记的抗体。 
在另一方面，本发明涉及诊断本文所确定和描述的疾病的方法，其包含以下步骤： 
a)利用本发明的环状肽或组合物或诊断剂检测抗β-AR的抗体(例如在样品中)；和 
b)当上述抗体的滴定度增加时，诊断为上述疾病。 
在另一方面，本发明涉及利用本发明的突变肽、药物组合物和药物诊断能够被治疗的患者的方法。在该特定方法中也可使用利用本发明的化合物检测针对β-AR的抗体(例如在样品中)的步骤和/或考虑上述检测步骤的结果是否提示本文所确定的疾病的步骤。如所提及的，当上述的抗β-AR抗体的滴定度增加时，即指示本文所确定的疾病或发展为本文所确定的疾病的风险。 
在另一方面，本发明涉及用于诊断如本文所确定的疾病(例如在样品中)的如本文所提供和描述的环状肽、组合物或诊断剂。同样，通过抗β-AR抗体增加的滴定度指示本文所确定的疾病或发展为本文所确定的疾病的风险。 
在本发明中，术语“抗β-AR抗体增加的滴定度”意指抗β-AR抗体(例如在来自本发明待诊断的患者的样品中)的滴定度高于健康对照患者的滴定度，所述健康对照患者也就是没有患本文所确定的疾病的患者和/或没有抗β-AR抗体的患者。 
如所提及的，健康患者中，抗β-AR抗体通常是几乎或完全不存在的或不可检测的。因此，本发明的“抗β-AR抗体增加的滴定度”优选指抗β-AR抗体的任何出现，即可检测量的抗β-AR抗体的任何出现。 
根据本发明，合适的“样品”包括，但并不限于，(a)生物或医学样品，例如像包含细胞或组织的样品。例如这种样品可以包含活检组织的生物物质。“活检组织”的含义为本领域中所知。例如，活检组织包括主治医生取自本文所描述的患者/个体的细胞或组织。示例性而非限定性的本发明中待分析的生物或医学样品为或衍生于血液、血浆、血白细胞、尿液、精液、痰液、脑脊液、淋巴或淋巴组织或细胞、肌细胞、心脏细胞、静脉或动脉来源的细胞、神经细胞、脊髓来源的细胞、脑细胞、肝细胞、肾脏细胞、肠道来源的细胞、睾丸来源的细胞、泌尿生殖道来源的细胞、结肠细胞、皮肤、骨、骨髓、胎盘、羊水、 毛发、毛发和/或毛囊、干细胞(胚胎的、神经元的和/或其它的)或原代或永生性细胞系(淋巴细胞、巨噬细胞或细胞系)。根据本发明，优选的“样品”为衍生于血液或血浆的那些。本文所确定的生物或医学样品也可以是或衍生于活检组织，例如衍生于心脏组织、静脉或动脉的活检组织。 
在另一方面，本发明涉及诊断试剂盒，例如用于检测针对β-AR的抗体的诊断试剂盒，包含本发明的环状肽、组合物或诊断剂。 
根据本发明的试剂盒包含本发明所公开的至少一个化合物，例如像本发明的环状或线性肽，本发明的核酸分子、载体或宿主细胞或本发明的组合物或诊断剂。在一具体实施方案中，试剂盒还包含说明书和/或用于试剂盒应用的缓冲液、和/或执行试剂盒用于或待用于的检测反应的至少一个反应容器。在另一实施方案中，至少一个、一些或所有的用于与上述试剂盒应用相关的试剂作为用于执行反应额部分存在，所述反应为试剂盒用于或待用于的反应。 
本发明的环状肽、诊断试剂或试剂盒也可以应用于β1-AR的检测。因此，本发明的环状肽、诊断剂或试剂盒具体用于鉴定/检测细胞或组织表面的结合的抗β1-AR抗体。例如，本发明的环状肽、诊断剂或试剂盒可用于成像目的，像单光子发射断层摄影术(SPECT)、MiBi、PET、磁共振断层摄影术(MRI)或其他应用于医学的诊断成像技术。由于131I-标记的CP-体内分布模式(图30)，例如本发明的环状肽、诊断剂可具体用作器官特异性示踪剂。 
将本发明的化合物分别用作诊断剂和用于诊断方法中的一个特定方法是三步筛选法。例如这一方法包括使用本发明的环状肽进行酶联免疫吸附测定(ELISA)，以及确定表达天然人类β-AR的细胞中的免疫荧光和cAMP反应。公认的是，利用本发明的环状肽，能够同样地进行前述的每一步骤用于上述抗体的检测。由此基于功能活跃的抗β1-AR抗体，筛选出大量患者，例如心力衰竭患者。结合这种(而且与 本文所公开的其他的)诊断方法，功能活跃的抗β1-AR抗体的定义优选基于它们对受体介导的信号转导的作用，即它们对细胞cAMP水平和对cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的活性的作用。环AMP为包括β-AR家族在内的许多G蛋白偶联受体的通用二级信使。它通过PKA、cAMP门控离子通道、磷酸二酯酶和cAMP直接活化的交换蛋白(称为Epac 1和2)发挥作用。现有技术描述了若干用于测定完整细胞中cAMP的荧光方法，其都可用于本发明的诊断方法中。与PKA的调节和催化亚基融合的绿色荧光蛋白(GFP)变体间的荧光共振能量偏移(FRET)已被描述用于研究神经元(Hempel CM，Vincent P，Adams SR，Tsien RY，Selverston AI.Nature.1996；384：113-114)或心肌细胞(Zaccolo M，PozzanT.，Science.2002；295：1711-1715)中的cAMP的时空动力学。 
更近地，本领域中描述了单链荧光指示剂，其特征在于具有与Epac蛋白的cAMP结合结构域直接融合的增强的蓝绿色(CFP)或黄色(YFP)荧光蛋白，这可允许获得敏感性更高和瞬时分辨率更好的cAMP测定。在WO2005/052186等中描述了这一系统。利用本发明的环状肽或其他相应的化合物，这一系统能够与本发明的任一诊断方法联用。这一系统也能够用于分析功能活跃的抗β1-AR抗体的流行性，然而并不仅限于此。优选地，这一诊断方法应用于先前抗体验明的DCM患者组群或任何待被评估的个体或疑似患有任一本文所描述疾病或有患任一本文所描述疾病风险的个体。诊断方法和筛选方法的另外步骤中，可分别评估和确定β阻断剂抑制抗β1-AR抗体诱导的受体活化作用的能力。 
前述测定方法是有利的，因为它较简单、耗时更少且同时披露或鉴定所有先前被认为抗β1-ECII抗体阳性的DCM患者，所述测定方法为利用本发明的肽的如WO 2005/052186中所描述的基于FRET的方法。利用本发明的一种或几种肽的基于FRET的诊断方法的该实施方案基于检测抗体诱导的cAMP增加。 
总之，Epac-FRET筛选看起来代表了非常敏感的单步骤方法，其 允许检测直接针对人β1-AR的活化的抗体。因此，本发明也涉及本发明的一种或几种肽在Epac-FRET测定中的应用。更优选地，这种Epac-FRET测定用于诊断，甚至更优选地用于患有或疑似患有本文所描述的任一疾病的患者的诊断。 
鉴于上述，依照本发明，特别优选地使用或应用FRET技术，特别是基于FRET的检测系统。 
在另一方面，本发明涉及用于检测针对β-AR(例如在如本文所确定的样品中)的抗体的方法，其包含上述待被检测的抗体与本发明的环状肽相接触的步骤。 
在另一方面，本发明涉及用于检测(例如在如本文所确定的样品中)抗β-AR的抗体的如本文所公开的环状肽、组合物或诊断剂。 
上述检测抗体或环状肽、组合物或诊断剂的方法特别用于应用在在本发明所提供和描述的诊断应用中。 
本申请自始至终中，下列的缩写词的含义如下：Ab或ab：抗体，Abs或或abs：多个抗体，AR：肾上腺素受体，EC：β-AR的细胞外结构域，ECII：β-AR的细胞外结构域II以及AA：氨基酸。 
参考下文的非限定性的附图和实施例进一步描述了本发明。 
附图说明
图1为显示β1-ECII-25氨基酸(AA)环肽和突变的β1-ECII-25AA环肽(具有原始的Cys残基(白球)或丝氨酸突变的半胱氨酸(黑球；分别为Cys/Ser或Ser/Cys)的黑环)的结构设计，以及显示分别在210nm或220nm波长下检测的高液压液相色谱洗脱图谱的图。 
对含有3个Cys的β1-ECII-25AA Cys/Cys环肽，在Waters分离模块(Waters Separation Modul)2690连同Waters双λ(Waters Dual Lambda)吸光度检测器中进行高压液相色谱；220nm处读取吸光度。肽合成和环化后，将样品溶解于水/5％乙睛(ACN)中，然后加载于流速为1ml/min Nuclosil 100-5/C18柱(Macherey-Nagel Inc.，Germany；柱长250 nm，管腔4mm)；然后在0.2％TFA存在下跑5％-60％ACN的分离梯度。残余微弱量的线状β1-ECII-25AA肽出现小峰，通常在14到16分钟间，而含有β1-ECII-25AA Cys/Cys环肽的部分在18分钟到20分钟出现。 
突变25AA环肽的高压液相色谱的操作利用流速为1ml/min的继而在分离梯度为0.1％TFA中含5％到60％ACN的硅氧碳18柱(15μm，120A，长250mm，管径4mm)走柱。含有环状β1-ECII-25AA突变体的部分通过紫外线吸收法(210nm)监测，并且显示了在～10.5分钟(25AA Cys/Ser-突变体，左侧)或～16.5分钟(25AA Ser/Cys，右侧)出现的锐利的单洗脱峰。 
图2为显示突变的β1-ECII-25AA或18AA环肽(具有原始的半胱氨酸残基(白球)或丝氨酸突变的半胱氨酸(黑球；分别为半胱氨酸/丝氨酸或丝氨酸/半胱氨酸)，连同参与头到尾闭合后一级环结构形成的氨基酸(闭合位点，Ala-DGlu，或Pro-Lys)的结构设计的图。 
对于固相上合成环状β1-ECII-18AA(或β1-ECII-25AA)肽，将具有侧链保护基团的Fmoc-Glu-ODmab或其他Fmoc氨基酸合并到线性肽的C末端，所述保护基团可被选择性以正交方式裂解掉。环状肽从合成树脂裂解下来产生肽酰胺(在D-Glu→Gln的情况下)且通过三氟乙酸/三乙丙基硅烷/乙烷二硫醇/水处理树脂几个小时来移除侧链的保护性基团。 
图3显示了展现本发明的两个线性肽(左侧，分别为18AA半胱氨酸/丝氨酸和25AA半胱氨酸/半胱氨酸)和4个突变的环肽的高压液相色谱洗脱图谱的6个图面，所有突变的环肽为具有Pro-Lys闭合位点的含有Gln的环肽。突变的25AA-或18AA-环肽的HPLC在Waters分离模块以及紫外线吸收检测仪中进行操作。读取210nm处的吸光度。肽合成和环化后，将样品溶解于水/5％乙睛(ACN)且加载于流速为1ml/min的C18硅柱上(15μm，120A，柱长250mm，管腔4mm)；然后在0.1％TFA存在下跑5％-60％ACN的分离梯度。如它们的线性对应物所显示的，包含环状β1-ECII-18AA突变体的部分(上面一行，中间的 图面)(半胱氨酸/丝氨酸，～14分钟)，右侧图面(丝氨酸/半胱氨酸，～16.5分钟)；或β1-ECII-25AA突变体(下面一行，中间的图面(半胱氨酸/丝氨酸，～10.6分钟)，右侧图面(丝氨酸/半胱氨酸，～16.5分钟)的部分在所示的时间点出现锐利的单洗脱峰。 
图4为显示具有DGlu环闭合的β1-ECII-18AA环肽突变体(半胱氨酸/丝氨酸突变，白色柱；丝氨酸/半胱氨酸突变，右斜阴影线柱)阻断能力的图，显示了利用含有3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原的ELISA竞争性测定中，上述突变体与含有3个半胱氨酸的18AA环肽(黑色柱)相比的阻断能力的在。描述了利用自12只不同的免疫的抗体阳性大鼠血清分离出的IgG部分获得的代表性结果。y轴代表使用的不同肽的阻断功效，表示为血清与所示环肽预孵育后(12小时过夜，4℃旋转培养箱)，阻断的相对非阻断的血清ELISA-反应的百分比。 
图5为显示了具有DGlu环闭合的β1-ECII-18AA环肽突变体(半胱氨酸/丝氨酸突变，白色菱形；丝氨酸/半胱氨酸突变，黑色菱形)阻断能力的图，显示了利用含有3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原的ELISA竞争性测定中，所述突变体与含有3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽(黑色方块)相比的阻断能力。利用取自抗体阳性的心肌病大鼠的单一代表性血清(图4，4号大鼠)。Y轴代表通过ELISA所确定的特异性抗β1-ECIIIgG抗体的浓度，x轴对应于用于预孵育IgG部分(12h，4℃，旋转培养箱)的线性或环状肽的摩尔超出量，假定1∶1化学计量(假定一个环状(2.1KDa分子量(MM)或线性肽(3.0KDa MM)阻断一个IgG抗体(150KDa MM))。 
图6为显示了利用荧光共振能量转移(FRET)的方法，具有DGlu环闭合的β1-ECII-18AA环肽突变体对β1受体介导的信号转导(功能性cAMP测定)的的阻断能力的图。将代表性大鼠(血清)(图4，4号大鼠)的抗β1-ECIIIgG抗体与β1-ECII-18AA环肽突变体(半胱氨酸/丝氨酸突 变，深蓝(3)；丝氨酸/半胱氨酸杂合，浅蓝(4))的预孵育(12h，4℃，旋转培养箱)的效应与含有3个半胱氨酸的25AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽(红色(2))的效应或在无阻断性肽存在情况下抗β1-ECIIIgG抗体所获得的结果对比(黑色(1))。Y轴代表记录的FRET发射信号的标准化的YFP/CFP比，x轴对应于以秒计的记录时间。 
图7为在利用线性的含有3个半胱氨酸的25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原的ELISA竞争性测定中，与从源自免疫的抗体阳性大鼠的78血清分离出的IgG预孵育后，继续描述具有DGlu环闭合的环肽突变体的阻断效应的图。柱代表突变的β1-ECII18AA环肽(半胱氨酸/丝氨酸突变，黑色柱；丝氨酸/半胱氨酸突变，白色柱)与含有3个半胱氨酸的18AA环肽(垂直阴影柱)、含有3个半胱氨酸的25AA环肽(水平阴影柱)或含有3个半胱氨酸的线性25AA肽(右斜线阴影柱)相比所获得的结果。误差棒显示平均值的标准误(±SEM)。y轴代表所用的不同肽的阻断功效，表示为阻断的相对未阻断的血清ELISA-反应性的百分比。 
图8为在利用n＝82的经免疫抗体阳性大鼠的血清进行的ELISA竞争性测定中，继续描述β1-ECII18AA环肽突变体(具有DGlu环闭合)的阻断效应的图。约95％的血清能被单独的β1-ECII18AA Cys/Ser突变环肽(左侧白色柱的上部示意的)有效阻断，而约5％的血清被18AACys/Ser-和18AA Ser/Cys突变体(右侧黑色柱的上部示意的后者)的两者所阻断。 
图9为由两个主要的(上面的和下面的)图面组成的图，显示了在利用含有3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原的竞争性ELISA测定中，与自69只不同的经免疫抗体阳性的大鼠分离的血清预孵育(12h，4℃，旋转培养箱)后，具有Gln闭合位点的25AA和18AA环肽突变体及具有DGlu闭合位点的18AA环肽突变体的重新获得的阻断效应。上部图面描述了优先与半胱氨酸/丝氨酸突变环肽反 应(类型1反应，n＝64)的大鼠血清，分别在cyc25AA(Gln)肽(左侧)和cyc18AA(Gln和DGlu)肽(右侧)中。下部图面描述了与半胱氨酸/丝氨酸和丝氨酸/半胱氨酸突变的环状肽反应(类型2反应，n＝5)的大鼠血清，同样分别在用cyc25AA(Gln)肽(左侧)和cyc18AA(Gln和DGlu)肽(右侧)所获得的结果中。 
两个图面中左侧的前三个柱代表用(非突变的)含有3个半胱氨酸的25AA(Gln)环肽(黑色柱)和突变的β1-ECII-25AA(Gln)环肽(半胱氨酸/丝氨酸突变，白色柱；丝氨酸/半胱氨酸突变，水平阴影柱)所获得的结果。 
两个图面中右侧的五个柱代表用含有3个半胱氨酸的18AA(Gln)环肽(黑色柱)与另外的含有2个半胱氨酸的突变18AA环肽(具有Gln闭合位点的18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体，白色柱；具有DGlu闭合位点的18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体，左斜线阴影柱(digonally lefthatched column)；具有Gln闭合位点的18AA丝氨酸/半胱氨酸突变体，右斜线阴影柱(diagonally right hatched column)；具有DGlu闭合位点的18AA丝氨酸/半胱氨酸突变体，垂直阴影柱)相比所获得的结果。 
误差棒代表平均值的标准误(±SEM)。y轴代表所用的不同肽的阻断功效，表示为阻断的相对非阻断的血清ELISA-反应的百分比。 
图10为在用源自n＝69经免疫抗体阳性大鼠的血清的竞争性ELISA测定中，继续描述β1-ECII-18AA(Gln)环肽突变体的阻断能力的图。约93％(n＝64)的血清可被单独的β1-ECII-18AA半胱氨酸/丝氨酸突变的肽有效阻断(左侧白色柱的上部所示意的)，而约7％(n＝5)的血清被18AA半胱氨酸/丝氨酸和18AA丝氨酸/半胱氨酸突变体(后者如右侧黑色柱的上部所示意的)两者所阻断。 
图11为在采用源自n＝6随机选取的经免疫抗体阳性大鼠的血清的竞争性ELISA测定中，继续描述不同线性和环状β1-ECII肽的剂量依赖性(x轴，横坐标：特定肽的摩尔超出量的-倍数)阻断能力的图，表示为未阻断的抗体滴定度的百分比(y轴，纵坐标)，所述肽包括25AA 半胱氨酸/半胱氨酸线性肽(黑色方块)、25AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体(白色方块)、18AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽(黑色菱形)、18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体(白色菱形)和18AA半胱氨酸/丝氨酸线性肽突变体(垂直阴影菱形)。所有的血清被β1-ECII-18AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽最有效地阻断，其次是非突变的18AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽和25AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽。所有的环肽(具有或不具有突变)在抗体阻断能力方面大大优于它们的线性对应物(P＜0.005)。 
图12为继续描述不同线性和环状β1-ECII肽在第一次免疫(和两个随后的β1-ECII/GST抗原加强，对应于预防方案)后3月开始，总共5次(预防性)应用的体内阻断能力的图。B1受体抗体的血清滴定度在每一肽注射前和注射后18-20小时(横坐标，时间以月为单位)确定，并表示为免疫的未处理的大鼠的相应抗体滴定的百分比(y轴，纵坐标)。注射的肽为：25AA半胱氨酸/半胱氨酸线性肽(黑色方块)、25AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽(白色方块)、18AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽(黑色菱形)、18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体(白色菱形)以及18AA半胱氨酸/丝氨酸线性肽突变体(垂直阴影线菱形)。环状肽在体内的功效也大大优于它们的线性对应物。抗体中和作用的最大效能的取得在1.0mg/kg体重(Bw)的非突变25AA半胱氨酸/半胱氨酸或18AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽(在5次环肽注射后87.7±2％或89.9±3％降低，与未处理的免疫动物相比，皆P＜0.005)，其次是18AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽(在5次环肽注射后54.5±2％降低；P＜0.05)，而同一浓度的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽或线性18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体无显著的阻断效应(在5次环肽注射后25.8±3％或4.5±11％降低，分别为P＝0.16或P＝0.8)。黑圈显示作为参照的未定期处理的(每4周)免疫的动物的抗体滴定度，设定为100％。 
图13显示了用从免疫的抗β1阳性心肌病的未处理的动物(β1未处理的，黑色柱)的骨髓(左侧柱)或脾脏(右侧柱)制备的B细胞进行的ELISPOT测定的结果，与从预防性地用25AA ECII半胱氨酸/半胱氨酸 环肽(25cyc.Cys/Cys，垂直阴影柱)，18AA ECII半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体(18cyc.Cys/Ser，右斜线阴影柱)，或线性18AA ECII半胱氨酸/丝氨酸肽突变体(18lin.Cys/Ser，水平阴影柱)处理的免疫的抗β1抗体阳性的心肌病的动物中分离出来的那些相比较。对于这一测定，利用0.05mol/l Tris缓冲液pH 9.4.中的特异性抗原(GST/β1-ECII-FP)包被ELIspot板并过夜，然后洗板三次并在37℃应用BSA阻断3小时。继而在37℃将板用来源于脾脏或骨髓的B细胞(培养于添加了10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640/X-VIVO-15培养基中)孵育过夜保持每孔1×106到1×103细胞。12小时后去除B细胞并将结合有B细胞分泌性IgG的板洗涤若干次(PBS/0.5％Tween)，然后添加碱性磷酸酶偶联的抗大鼠IgG二抗(0.3μg/ml)以检测结合的大鼠IgG。然后将板在37℃再孵育3小时，用PBS/0.5％Tween洗涤若干次，利用LMP/BICP 5∶1(1ml每孔；”LMP”意为低熔点琼脂糖，”BICP”意为5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸对甲苯胺盐，蓝色的染料)显色允许对所获得的蓝色斑点定量，每一个斑点代表脾脏或骨髓细胞分泌的一个抗原特异性IgG。 
图14为继续描述带有Gln闭合位点的25AA和18AA环肽突变体在第一次静脉注射(i.v.)1.0mg/kg体重(Bw)到免疫的抗体阳性的大鼠中后所所测定的的体内阻断效应的图。在静脉注射1.0或0.25mg/kgBw的所示的肽后18-20小时提取血清并利用含有3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原通过ELISA测定反应性。 
图面中的第一组代表了用突变的含有2个半胱氨酸的25AA半胱氨酸/丝氨酸(谷氨酰胺)-环肽(第一组的上方所示意的，阴影化圆圈)处理的大鼠组(n＝5)，第二和第三组代表了用两种不同浓度的突变的18AA半胱氨酸/丝氨酸(谷氨酰胺)环肽(n＝40，1mg/kg Bw；n＝9，0.25mg/kg Bw，第二组上部描述的环状肽图，白色圆圈)处理的大鼠组，第四组代表了用突变的18AA丝氨酸/半胱氨酸(谷氨酰胺)环肽(1mg/kgBw，第四组的上部描述的环状肽图，黑色菱形)处理的n＝4动物，第五组代表了静脉注射含有两个半胱氨酸的线性18AA半胱氨酸/丝氨酸(谷氨酰胺-)肽(第五组的上方描述的线性肽图，黑色圆圈)所获得的结 果。 
每一组的长条和序号(框内(in boxes))代表静脉注射肽前或注射肽后18-20小时(y轴)相应标示肽的阻断能力的平均值，表示为血清ELISA免疫反应的百分比 
图15为继续描述带有Gln闭合位点的25AA和18AA环状肽突变体在第一次静脉注射1mg/kg Bw或0.25mg/kg Bw到免疫的抗体阳性的大鼠后所确定的体内阻断效应的图。在静脉注射各种肽后18-20小时后提取血清并利用含有3个半胱氨酸线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸作为抗原通过ELISA测定反应性。 
图表描述了注射不同肽后取自抗体阳性免疫大鼠血清中特异性抗β1受体抗体滴定度的相对降低(或增加)以及显示了静脉注射肽前或注射肽后18-20小时相应标明肽的阻断能力的平均值(y轴)，表示为血清的ELISA免疫反应的百分比。图面右侧的符号代表：白色方块，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(1mg/kg Bw)；白色菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(0.25mg/kg Bw)；黑色菱形，18AA丝氨酸/半胱氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(1mg/kg Bw)；水平阴影方块，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变线性(谷氨酰胺)肽(1mg/kg Bw)；黑色方块，25AA半胱氨酸/丝氨酸突变的(谷氨酰胺)环肽(1mg/kg Bw)。为了清楚，误差棒没有在图中显示。 
图16A为继续描述带有Gln闭合位点的25AA和18AA环肽突变体体内阻断效应的图，这在将1.0mg/kg Bw的所示肽总计9次静脉注射到免疫的抗体阳性大鼠后所确定。每4周静脉注射不同肽前和注射后18-20小时(横坐标：以月为时间的处理)提取血清并利用含有3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原通过ELISA测定反应性。 
图表描述了注射不同肽后，来自抗体阳性的免疫大鼠血清中的特异性抗β1受体抗体滴定度的相对降低(或增加)，并显示了以开始处理前初始ELISA免疫反应性的百分比表示的肽阻断能力的相应的平均值 (y轴，纵坐标)。 
符号表示： 
黑色圆圈，未定期(每4周)处理的免疫的动物(n＝9)；白色菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(1.0mg/kg Bw，n＝20)；黑色正方形，25AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(1.0mg/kg Bw，n＝5)。 
图16B为继续描述不同浓度的带有Gln闭合位点的18AA环肽突变体，在总共9次静脉注射0.25，1.0，2.0和4.0mg/kg Bw到免疫抗体阳性大鼠后所确定的体内阻断效应的图，不考虑个别动物的环肽“应答器状态(responder-state)”。每4周静脉注射不同种肽前和注射后18-20小时(横坐标：以月为时间单位)提取血清并利用含有3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原通过ELISA测定反应性。 
图表描述了注射所示的肽后，来自抗体阳性的免疫的大鼠血清中的特异性抗β1受体抗体滴定度的相对降低(或增加)，并显示了以开始处理前初始ELISA免疫反应性的百分比表示的肽阻断能力的相应的平均值(y轴，纵坐标)。 
符号表示： 
黑色圆圈，未定期(每4周)处理的免疫的动物(n＝9)；白色圆圈，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(0.25mg/kg Bw，n＝4)；白色菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(1.0mg/kg Bw，n＝20)；垂直阴影化菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(2.0mg/kg Bw，n＝5)；黑色菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(4.0mg/kg Bw，n＝9)。 
图16C为继续描述不同浓度的带有Gln闭合位点的18AA环肽突变体，在总共9次静脉注射0.25、1.0、2.0和4.0mg/kg体重(Bw)到免疫的抗体阳性大鼠后所确定的体内阻断效应的图，只考虑环肽敏感性“应答器”，这由如下确定：在注射7次环肽后，动物具有的最大残余受体抗体水平等于或低于治疗开始时的相应滴定度的80％(对比图16c 和图16b的曲线，后者代表未选择的动物的天然存在的多相应答)。如上文所描述的，提取血清并利用含有3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原通过ELISA测定反应性。 
图表显示，注射所示的肽后，来自抗体阳性的免疫的大鼠血清中的特异性抗β1受体抗体滴定度的相对降低，将阻断能力表示为初始ELISA免疫反应性的百分比(y轴，纵坐标)。 
符号表示(粗体表示的应答器数)： 
黑色圆圈，未定期(每4周)处理的免疫的动物(n＝9)；白色圆圈，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(0.25mg/kg Bw，n＝3/4)；白色菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(1.0mg/kg Bw，n＝16/20)；垂直阴影化菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(2.0mg/kg Bw，n＝2/5)；黑色菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(4.0mg/kg Bw，n＝6/9)。 
图17A为显示了以下内容的图：GST/β1-ECII-免疫的未治疗的(黑色圆圈)与用标明的不同环肽(见图例)治疗的GST/β1-ECII-免疫的动物通过超声心动描记术(超声心动图系统：可视声学，Vevo770(版本V2.2.3)，装备有15-17.5MHz换能器)所确定的内部的收缩末期的和舒张末期的左心室直径的时程(0到20月)，从而LVES/LVED为左心室收缩末期直径和左心室舒张末期直径。 
符号表示： 
白色圆圈，未治疗的0.9％NaCl注射的未免疫的对照动物(n＝10)；黑色圆圈，未定期(每4周)治疗的免疫动物(n＝9)；白色菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(1.0mg/kg Bw，n＝20)；黑色方块，25AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(1.0mg/kg Bw，n＝5)；白色方块，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变线性(谷氨酰胺)肽(1.0mg/kg Bw，n＝5)。 
图17B为类似的表现GST/β1-ECII-免疫的未治疗的(黑色圆圈)与用不同浓度的18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体(见图例)治疗的β1-ECII-免疫的动物的内部收缩末期的和舒张末期的左心室直径(LVES， LVED)的时程(0到20月)的图。 
符号表示： 
白色圆圈，未治疗的0.9％NaCl注射的未免疫的对照动物(n＝10)；黑色圆圈，未定期(每4周)治疗的免疫的动物(n＝9)；白色正方形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(0.25mg/kg Bw，n＝4)；白色菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(1.0mg/kg Bw，n＝20)；垂直阴影化菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(2.0mg/kgBw，n＝5)；黑色菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(4.0mg/kg Bw，n＝9)。 
图18为显示在GST/β1-ECII-免疫的大鼠与0.9％NaCl注射的大鼠中的特异性抗β1-ECII抗体的滴定度过程(0到9月)的图，其中“β1”表示免疫的动物(根据本发明在用肽开始治疗之前)，“NaCl对照”表示相应的NaCl注射的对照动物。 
图19A为描述通过超声波心动描记术(超声心动图系统，见图17a的图例)所确定的以ml/min/g(体重)表示的“心指数(cardiac index)”(CI)的时程(0到20月)图。 
符号表示： 
白色圆圈，未治疗的0.9％NaCl注射的未免疫的对照动物(n＝10)；黑色圆圈，未定期(每4周)治疗的免疫的动物(n＝9)；白色菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(1.0mg/kg Bw，n＝20)；黑色正方形，25AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(1.0mg/kg Bw，n＝5)；白色正方形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变线性(谷氨酰胺)肽(1.0mg/kgBw，n＝5)。 
图19B为类似的显示通过超声波心动描记术(超声心动图系统见图17a的图例)所确定的以ml/min/g(体重)表示的“心指数”(CI)的时程(0到20月)图。 
符号表示： 
白色圆圈，未治疗的0.9％NaCl注射的未免疫的对照动物(n＝10)；黑色圆圈，未定期(每4周)治疗的免疫的动物(n＝9)；白色正方形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(0.25mg/kg Bw，n＝4)；白色菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(1.0mg/kg Bw，n＝20)；垂直阴影化菱形，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽(2.0mg/kgBw，n＝5)。 
图20显示在10个月的治疗后治疗性研究中所获得的血液动力学参数的三组图面(a，b，c)，具体地，第一组在第一组(a)的每一图面的左侧显示了以每分钟跳动(＝bpm)为单位的心率(HF)，右侧显示了以mmHg为单位的LV收缩期血压(LV压)；第二组(b)的每一图面的左侧显示了以mmHg/s为单位的收缩性(+dP/dt)以及右侧显示了以-mmHg/s为单位的舒张(-dP/dt)；第三组(c)表现了通过心导管检查术所确定的以mmHg为单位的左心室舒张末期压(LVEDP)。 
每一组中的左和右图面分开用(左图面，不同的肽均为1.0mg/kgBw)环状18AA半胱氨酸/丝氨酸(右斜线线阴影柱，n＝20动物)、线性半胱氨酸/丝氨酸突变体(水平阴影柱，n＝5动物)和环25AA Cys/Ser突变体(竖直阴影柱，n＝5动物)获得的数据。右侧图面中的柱代表不同浓度的环状18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体所获得的数据：白色填充的黑色圆点柱对应于0.25mg/kg Bw(n＝4动物)，右斜线阴影柱对应于1.0mg/kg Bw(n＝10动物)，左斜线阴影柱对应于2.0mg/kg Bw(n＝5动物)以及黑色结构柱对应于4.0mg/kg Bw(n＝9动物)。每一图面中的黑色和白色柱作为参照并对应于未定期(每4周)处理的免疫的动物(阳性对照，黑色，n＝9)或0.9％NaCl注射的未免疫的对照动物(阴性对照，白色，n＝10)。 
图例中“β1-未处理的”表示免疫的抗β1抗体阳性心肌病未处理的动物(n＝9，黑色柱)，“对照”表示0.9％NaCl注射的对照组(n＝10，白色柱)，“18cyc半胱氨酸/丝氨酸”表示在免疫9个月后利用标示的线性18lin半胱氨酸/丝氨酸(n＝5[1.0mg/kg Bw]或环状18cyc半胱氨酸/丝氨酸突变体(n＝10[1.0mg/kg Bw]或环状25AA半胱氨酸/丝氨酸突变 体(n＝4[1.0mg/kg Bw)治疗性处理的免疫的抗β1抗体阳性心肌病动物。右侧图面描述了不同剂量的经静脉内注射的β1-ECII18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体(分别为n＝4[0.25mg/kg Bw]；n＝20[1.0mg/kg Bw]，n＝5[2.0mg/kg Bw]，和n＝9[4.0mg/kg Bw])的效应。通过单因素方差分析(one way ANOVA)评估组间差异；n.s＝无显著性，*P＜0.05，**P＜0.005。 
图21显示了两个图面(a和b)，表现了来自如柱中的治疗研究的动物的宏观解剖学参数。 
上图面(a)表现了以g/kg体重为单位的所示器官(自左到右为心脏，脾脏，右侧肾脏，左侧肾脏，肺脏和肝脏)的相对湿重，从而“β1-未处理的”表示免疫的抗β1抗体阳性心肌病未处理的动物(n＝9，黑色柱)，”对照”表示0.9％NaCl注射的对照组(n＝10，白色柱)，“18cyc半胱氨酸/丝氨酸”表示在免疫9个月后利用标示的线性18lin半胱氨酸/丝氨酸(n＝5[1.0mg/kg Bw]，水平阴影柱)或环状18cyc半胱氨酸/丝氨酸突变体(n＝20[1.0mg/kg Bw]，斜线阴影柱)或环状25AA半胱氨酸/丝氨酸肽突变体(n＝4[1.0mg/kg Bw]，垂直阴影柱)治疗性处理的免疫的抗β1抗体阳性心肌病动物。 
下图面(b)表现了免疫的抗β1阳性心肌病动物以g/kg体重表示的所示器官(自左到右为心脏，脾脏，右侧肾脏，左侧肾脏，肺脏和肝脏)的相对净重，所述免疫的抗β1阳性心肌病动物在免疫9个月后利用所示剂量的β1-ECII18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体(n＝4[0.25mg/kgBw]，白色填充黑色圆点柱；n＝20[1.0mg/kg Bw]，右斜线阴影柱，n＝5[2.0mg/kg Bw]，左斜线阴影柱；n＝9[4.0mg/kg Bw]，黑色结构柱)治疗性处理，从而“β1-未处理的”表示免疫的抗β1抗体阳性心肌病未治疗的动物(n＝9，黑色柱)，“对照”表示0.9％NaCl注射的对照组(n＝10，白色柱)。 
肾脏R表示右侧肾脏，肾脏L表示左侧肾脏。通过单因素方差分析评估组间差异；n.s＝无显著性，*P＜0.05，**P＜0.005。 
图22表现了10个月治疗后在动物血清中测定的不同实验室参数的两个图面(a和b)。两个图面中的“β1-未处理的”和“对照”分别地表示免疫抗β1抗体阳性心肌病未处理的动物(n＝5，黑色柱，阳性对照)和0.9％NaCl注射的对照组(n＝6，白色柱，阴性对照)。 
上图面(a)表现了免疫9个月后利用标明的线性18lin半胱氨酸/丝氨酸(n＝5[1.0mg/kg Bw]，水平阴影柱)或环状18cyc半胱氨酸/丝氨酸突变体(n＝20[1.0mg/kg Bw]，右斜线阴影柱)或环状25AA半胱氨酸/丝氨酸肽突变体(n＝4[1.0mg/kg Bw]，垂直阴影柱)治疗性处理免疫的抗β1抗体阳性心肌病动物的参数。 
下图面(b)表现了免疫9个月后利用所示剂量的β1-ECII18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体(n＝4[0.25mg/kg Bw]，白色填充黑色圆点柱；n＝20[1.0mg/kg Bw]，右斜线阴影柱，n＝5[2.0mg/kg Bw]，左斜线阴影柱；n＝9[4.0mg/kg Bw]，黑色结构柱)治疗性处理免疫的抗β1阳性心肌病动物的参数；Crea表示肌酸酐；GOT表示谷氨酸草酰乙酸转氨酶；GPT表示谷氨酸丙酮酸转氨酶；LDH表示乳酸脱氢酶。 
图23表现了在静脉注射1.0mg/kg体重(Bw)的标记的环肽到未免疫的0.9％NaCl处理的对照动物(左panel)或免疫的抗体阳性的心肌病路易斯鼠(550g Bw)后德克萨斯红(texas red)(荧光染料)标记的18AAECII半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体(“CP-1”)的分布模式。照片描述了德克萨斯红标记的18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体在肾脏(肾脏皮质区域的2μm切片)中的亚细胞分布。这一图像表明未观察到本发明的环状肽作用于肾脏的毒性和肾小球膜的机械性阻塞。 
图24为描述突变的包含半胱氨酸的β1-ECII同源性环肽(白色小球代表氨基酸AA，并在每一个球中写有相应的AA字母编码)的示意图。半胱氨酸分子和它们的取代物显示为黑色小球。黑色粗体线代表二硫键的假定位置。 
左侧：描述人β1肾上腺素受体的ECII环的原始序列的示意图；中间：带有位于假定的环闭合位点(位置222)上的Gly突变的环状22AA ECII同源肽。 
右图面描述了包含仅两个半胱氨酸(即位置209和215)的环状22A肽突变体的实例。显示了位于第216位的半胱氨酸的半胱氨酸/丝氨酸突变体(环状22Aβ1-ECII肽Cys216→Ser216)。 
给定的号码指示了根据Frielle et al.1987，PNAS 84，pages7920-7924氨基酸原始一级序列的编号。 
图25显示的两个图面表现了两个环状((22+1)＝22AA肽的高压液相色谱(HPLC)洗脱图谱；第一个图面对应本发明含有3个半胱氨酸的构建体cyc22AA半胱氨酸/半胱氨酸(25A)，且第二个图面对应本发明含有2个半胱氨酸的突变cyc22AA半胱氨酸/丝氨酸(25B)，它们所有环肽都有一个Gly闭合位点。在装备有双波长UV吸收检测器的Hewlett Packard系列1050分析HPLC系统(Agilent TechnologiesGermany GmbH， 
Figure GPA00001106782700611
)中操作HPLC，在216nm处读取吸光度。肽合成和环化后，样品溶解于H2O/0.1％三氟酸(TFA)并加样于流速为2ml/min的分析HPLC柱(Waters GmbH，Eschborn)XBridge BEH130，C18，3,5μm(柱长50mm，管腔4.6mm)；然后在0.1％TFA存在下自0％到75％乙睛(ACN)的分离梯度跑柱5分钟。 
包含具有三个可自由地接近的半胱氨酸分子的环状β1-ECII-22AA半胱氨酸/半胱氨酸肽的部分展现出典型的山峰状的洗脱形式，提示了半胱氨酸消旋物的存在(25A，在2.6与3.8分钟间洗脱)。相比之下，包含仅两个半胱氨酸(通过另一强化的二硫键连接)的突变的环状22AA肽在2.63出现锐利的单洗脱峰(cyc22AA半胱氨酸/丝氨酸，25B)。 
图26显示了通过质谱(MALDI)描述22AA-ECII环状肽特征的两个代表性图面。第一个图面对应包含3个半胱氨酸的构建体cyc22AA半胱氨酸/半胱氨酸(26A)，且第二个图面对应本发明含有2个半胱氨酸的突变cyc22AA半胱氨酸/丝氨酸(26B)，它们所有环肽都有一个Gly闭合位点。图面显示了所示的环状β1-ECII-22AA肽的代表性MALDI- 示踪。 
每一图的纵坐标表示测量的信号强度(“a.u.”表示任意单位)，横坐标指示分子量(表示为m/z)。26A对应cyc22AA半胱氨酸/半胱氨酸肽(2518.28m/z)和26B对应cyc22AA半胱氨酸/丝氨酸突变体((2502.31m/z)。MALDI分析通过利用装备有Scout-26样品载体的反射II质谱仪(Bruker Daltonic GmbH，Bremen)进行操作。在所有情况下在2200m/z分析简单质子化的分子。 
图27A和B描述了人β1肾上腺素受体的第二细胞外环(ECII)的不同的含有半胱氨酸的环肽变异体的体外阻断能力(＝中和作用)，这是通过ELISA测试在与标示的环肽一起过夜孵育后(12-14h，4℃)免疫的β1-ECII抗体阳性大鼠的n＝6个体血清(27A)所确定的。27A中的柱代表所示的环肽的受体抗体阻断功效，表示为未阻断的抗体阳性大鼠血清所获得的抗体-(ELISA-)信号的百分比。27B中的柱代表每一环肽的平均阻断功效，误差棒表示±SEM。 
白色柱：cyc18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体(当通过双侧t检验测试其与未阻断血清间的显著性时，阻断功效60.0±8.3％，P＝0.0014)；垂直阴影柱：cyc18AA半胱氨酸/半胱氨酸(阻断功效66.1±7.0％，P＝0.00025)；黑色柱：cyc22AA半胱氨酸/半胱氨酸(阻断功效82.0±5.0％，P＝0.000046)；(右)斜线阴影柱：cyc22AA半胱氨酸/丝氨酸突变体(阻断功效74.9±5.0％，P＝0.00026)；水平阴影柱：cyc25AA半胱氨酸/半胱氨酸(阻断功效73.4±5.0％，P＝0.00011)。 
图28A和B描述了在将不同构建体治疗性地注射到自8个月定期免疫的大鼠(第一次＝基础免疫，其后是每4周一次的7次抗原加强免疫)时，人β1肾上腺素受体的第二细胞外环(ECII)的含有两个半胱氨酸的18AA或22AA环肽突变体的体内阻断能力(＝中和作用)。显示了4到5次后续的每4周一次的环肽注射的效应。图28A描述了免疫的β1-ECII抗体阳性心肌病大鼠(每组动物数在图例中给出)的每一处理组的平均值±SEM。 
图28A显示4次后续的环肽注射的平均效应，这由所示的构建体应用后20-22小时所确定。(柱)描述了每组注射后残余的受体抗体滴定度，表示为初始治疗时(第8个月)抗体滴定度的百分比。误差棒表示±SEM。柱中的号码表示(后续的)每月注射的数。 
黑色柱：未处理的抗体阳性的动物(总共8+4(＝12)抗原加强免疫后的参考滴定度(对比治疗开始时的滴定度)110.7±5.6％；n＝5，阳性对照)。 
白色柱：cyc18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体，n＝5动物(4次注射后残余的抗体滴定度，以治疗开始时的滴定度的百分比表示：当通过双侧t检验测试其与未处理的抗体阳性动物的抗体滴定度显著性时，76.0±23.0％，P＝0.44)。 
(右)斜线阴影柱：cyc22AA半胱氨酸/丝氨酸突变体，n＝8动物(以治疗开始时的滴定度的百分比表示的4次注射后残余抗体滴定度：9.0±2.2％，P＝3.0×10-7)。 
图28B显示了4次后续环肽注射后抗体滴定度的时程，这由应用所示的构建体之前和之后20-22小时所确定。值表示为与开始治疗(第8个月)时确定的抗体滴定度相比，每次环肽注射后相应抗体滴定度的增加或减少的百分比。 
黑色圆圈：未处理的抗体阳性动物(n＝5，阳性对照)；白色正方形：cyc18AA半胱氨酸/丝氨酸突变突变体，4次注射，n＝5动物；黑色菱形：cyc22AA半胱氨酸/丝氨酸突变突变体，4次注射，n＝8动物。 
图29A为显示了以下内容的图：GST/β1-ECII-免疫的未处理的动物(黑色圆圈)与用所示的不同环肽(见图例)处理的GST/β1-ECII-免疫的动物通过2D和M模式的超声心动描记术(超声心动图系统：可视声学，Vevo770(版本V2.2.3)，装备有15-17.5MHz换能器)所确定的内部收缩末期的和舒张末期的左心室直径(LVES，LVED)的时程(0到12月)，从而LVES/LVED为左心室收缩末期直径和左心室舒张末期直径。 
白色圆圈，未治疗的0.9％NaCl注射的未免疫的对照动物(n＝5)；黑色 圆圈，未定期(每4周)治疗的免疫的抗体阳性动物(n＝6)；白色正方形，cyc18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体(1.0mg/kg Bw，n＝5)；黑色菱形，cyc22AA半胱氨酸/丝氨酸突变(Gly)肽(1.0mg/kg Bw，n＝8)。 
图29B为描述通过2D和多普勒超声波心动描记术(超声心动图系统见上文)所确定的表示为ml/min/g(体重)的心指数(CI)的时程(0到12月)的图。 
白色圆圈，未治疗的0.9％NaCl注射的未免疫的对照动物(n＝5)； 
黑色圆圈，未定期(每4周)治疗的免疫的抗体阳性动物(n＝6)白色正方形，cyc18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体(1.0mg/kg Bw，n＝5)；黑色菱形，cyc22AA半胱氨酸/丝氨酸突变(Gly)肽(1.0mg/kg Bw，n＝8)。 
图30表现了将0.5-1.0MBq的jodine131标记的18AA ECII半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体静脉注射到未免疫的0.9％NaCl处理的对照动物(左图面)和免疫的抗体阳性的Lewis大鼠(350-400g Bw)后20分钟，所示器官中累积的放射活性的模式。数值以每g器官湿重的初始注射的放射活性(ID)的百分比活性给出。 
下文的非限定性实施例对本发明进行了说明。 
实施例1：突变环肽的合成 
本文所公开的只能形成单个独立的二硫键的环肽的三个具体实例分别由18、22或25氨基酸(AA)：ECII-18AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽、ECII-22AA半胱氨酸/丝氨酸突变(甘氨酸)环肽和ECII-25AA半胱氨酸/丝氨酸突变(谷氨酰胺)环肽组成。其一级序列与人β1-AR序列部分同源(分别为第204-219、200-220和200-222位氨基酸)。借助通过线性肽的头到尾环化及随后另一(单个)二硫键稳定环化的步骤来限制构象柔性，18AA、22或25AA环肽突变体采取的构象更接近模拟存在于天然β1-ECII蛋白环表面的表位的构象。而且，经常将环化作为一种延长肽作用持续时间的工具，因为环状肽通常比它们 的线性对应物对蛋白水解作用更稳定。 
详细地，环(K-18-P)环状S-S，Cys/Ser突变体的肽序列为： 
环-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln；环化可发生在Cys7和Cys13间(二硫键)及Ala1和Gln18间(环闭合)。 
详细地，环(K-22-P)环状S-S，Cys/Ser突变体的肽序列为： 
环-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Gly；环化可发生在Cys10和Cys16间(二硫键)及Arg1和Gly22间(环闭合)。 
详细地，环(K-25-P)环状S-S，Cys/Ser突变体的肽序列为： 
环-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln；环化可发生在Cys11和Cys17间(二硫键)及Ala1和Gln25间(环闭合)。 
本发明的环肽突变体首先合成为线性肽，然后在氨基酸主链上借助C末端羧基与N末端的氨基缩合共价地环化。随后，在半胱氨酸残基7和13(18mer环肽)、半胱氨酸残基10和16(22mer环肽)和半胱氨酸残基11和17(25mer环肽)间形成二硫键。 
采用芴甲氧羰基叔丁基策略(Fmoc/tert butyl strategy)通过逐步的固相肽合成进行线性肽的组装。氯代三苯甲基作为启始树脂使用。第一个氨基酸(Fmoc-Pro-OH)在DMF中与DIEA偶联，第二个在DMF中与PYBOP/HOBT/DIEA偶联然后接下来的氨基酸在DMF中与二异丙基碳酰亚胺(diisopropylcarboimide)、HOBT偶联。通过UV检测器在线监测肽的质量。以下描述了脱保护/偶联(超过两倍)操作方法： 
表1：脱保护/偶联(超过两倍)操作方法 
  步骤   溶剂     环
  1  2   偶联/DMF  DMF   (*)min  3×1min   偶联  洗涤
  3  4   25％哌啶/DMF  25％哌啶/DMF   1min  2×15min   脱保护  脱保护
  5   DMF   7×1min   洗涤
*偶联时间由Kaiser测试确定 
对于组装，使用以下的氨基酸(提供18mer环状半胱氨酸/丝氨酸肽突变体作为示例)： 
表2：用于18mer环状Cys/Ser肽突变体的F-moc合成的氨基酸 
  氨基酸    
  Fmoc-ASP(OtBu)-OH   Fmoc-Asn(Trt)-OH   Fmoc-Tyr(tBu)-OH
  Fmoc-Cyc(Trt)-OH   Fmoc-Arg(Pbf)-OH   Fmoc-Ala-OH
  Fmoc-Glu(OtBu)-OH   Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH   Fmoc-Val-OH
  Fmoc-Phe-OH   Fmoc-Ser(tBu)-OH   Fmoc-Lys(Boc)-OH
带有反应性N末端氨基和C末端羧基基团的完全保护的肽通过六氟异丙醇/二氯甲烷的处理从树脂中裂解下来。 
其后根据以下操作步骤在溶液中进行环化： 
被保护的肽的“头到尾”环化作用在高DMF稀释液(10mmol线性肽/1L DMF)中用PyBOP/NaHCO3进行。在3天后完成环化。DMF蒸馏后，用5％NaHCO3、水和纯水洗涤肽。冷却反应混合物，将肽除了半胱氨酸基团之外脱保护。然后，部分被保护的肽通过甲基叔丁基乙醚的沉淀作用而分离出来。 
粗制肽通过液态层析法进行预纯化： 
固定相：硅胶C18，15μm，120A 
洗脱剂：水乙腈和0.1％TFA 
检测：UV(210nm) 
在二甲基sulfoxyde(3％)存在的情况下，在水中(2mg/ML)进行二硫化物的环化。环化反应在3天后完成。利用上文所描述的条件通过HPLC纯化肽。纯度高于95％的部分合并在一起。肽在离子交换树脂(Dowex 1X2)上进行交换且将最终的溶液冻干。肽内容物通过氨基酸分析来确定(Edman测序)。 
图1、3、25和26中的HPLC洗脱图清楚地显示了锐利且轮廓分 明的洗脱峰，其是由所有包含相同单个二硫键的突变环肽所获得的，与包含3个半胱氨酸的18AA Cys13-Cys14、22AA Cys16-Cys17和25AACys17-Cys18环肽所获得的较大的(山峰样)洗脱图形成对比。 
下文所有的体外和体内研究都利用这些环肽突变体进行。 
实施例2：体外ELISA竞争性测定 
利用包含3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原的ELISA竞争性测定中，不同数目的来源于免疫的抗体阳性大鼠的血清孵育(12h，4℃，旋转孵育过夜)后，比较β1-ECII-18AA环肽突变体(具有额外D-Glu→Gln交换(例如环闭合位点上)的Cys13-Ser14或Ser13-Cys14突变)与包含3个半胱氨酸的25AA或18AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽的阻断能力。图4，5和7-10显示了利用本发明不同的环肽对n＝12直到n＝82免疫的抗体阳性大鼠血清实施测定的结果。 
令人惊奇地，自12只不同免疫的抗体阳性大鼠血清分离出的IgG部分所获得的结果显示只有半胱氨酸/丝氨酸而不是丝氨酸/半胱氨酸环肽突变体能显著性阻断抗体结合β1-ECII抗原。18AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽的阻断效应与包含3个半胱氨酸的β1-ECII-18AA环肽的阻断能力相比是相当的(在超过半数的被分析的血清n＝8/12)甚或更有效(图4)。这一发现通过剂量滴定法研究得以证实，剂量滴定法研究显示了清楚的β1-ECII-18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体的剂量依赖性阻断效应，其在两倍到八倍摩尔超出量(假定两个环状(2.1KDa分子量(MM))和线性肽(3.0kDaMM)的化学计量为1∶1，考虑IgG分子的分子量为150kDa)在阻断受体抗体方面持续明显地优于其丝氨酸/半胱氨酸突变对应物或包含3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽(图5)。 
图7继续描述在利用线性的包含3个半胱氨酸的25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原的ELISA竞争性测定中，不同环肽突变体在与自n＝78免疫的抗体阳性大鼠分离出的IgG预孵育后的阻断效应。相比于 完全无效的环状25AA或18AA丝氨酸/半胱氨酸突变体(分别为6±2％或1±2％；P＜5×10-30或P＜3.7×10-33)，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体的阻断能力最高(69±2％)，其次为25AA半胱氨酸/半胱氨酸(67±2％)、18AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽(60±4％)和包含3个半胱氨酸的线性25AA肽(55±4％)。只有少于5％的测试的大鼠血清还部分地被环状ECII-18AA丝氨酸/半胱氨酸突变体阻断，然而绝大多数(＞95％；n＝78)能被ECII-18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体有效阻断(图8)。 
利用ELISA竞争性测定(利用包含3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原)分析具有谷氨酰胺-丙氨酸闭合位点或D-谷氨酸-丙氨酸闭合位点的环肽突变体在与从69只不同的免疫的抗体阳性的大鼠中分离出的血清预孵育后的体外阻断效应。结果显示在图9中。 
同样，测试的大鼠血清存在两种反应模式(类1/类型2)。血清的大部分(93％，图9，上部图面，类型1和图10)可被25AA或18AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽(分别为69±2％或68±3％(Gln-闭合)/69±2％(D-Glu-闭合)非常有效地阻断，这甚至优于相应的包含3个半胱氨酸的25AA或18AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽(分别为65±2％或59±2％)，然而25AA或18AA丝氨酸/半胱氨酸突变体几乎无抑制效应，与位于闭合位点的氨基酸无关(6±2％，25AA丝氨酸/半胱氨酸，P＜5×10-30；1±2％，具有谷氨酰胺闭合的18AA丝氨酸/半胱氨酸(P＜3.7×10-33)或1±2％，具有D-Glu闭合的18AA丝氨酸/半胱氨酸(P＜6×10-55)。 
血清的较小部分(7％，图9，下部图面，类型2和图10)能被半胱氨酸/丝氨酸或丝氨酸/半胱氨酸突变肽类似地阻断-尽管阻断能力较小；另外，对于25AA和18AA环肽，突变体效应小于它们包含3个半胱氨酸的25AA或18AA半胱氨酸/半胱氨酸对应物。25AA或18AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽的阻断能力分别为48±6％或50±8％(谷氨酰胺闭合)/47±5％(D-Glu闭合)，这都低于相应的包含3个半胱氨酸的25AA或18AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽(分别为72±5％或67±6％)的阻断能力；然而，在这些动物中，25AA或18AA丝氨酸/半胱氨酸突变 体显示的阻断能力几乎与半胱氨酸/丝氨酸突变体的阻断能力相当(分别为37±7％25AA丝氨酸/半胱氨酸，P＝0.22n.s.；47±3％具有谷氨酰胺的18AA Ser/Cys或33±5％，带有D-Glu闭合的18AA Ser/Cys P＝0.7n.s.或P＝0.08n.s.)。 
随后，利用相同的竞争性ELISA测定分析不同线性和环状β1-ECII肽的体外剂量依赖性阻断能力(图11)： 
包括线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽、环状25AA半胱氨酸/丝氨酸肽突变体、环状18AA半胱氨酸/半胱氨酸肽、环状18AA半胱氨酸/丝氨酸肽突变体和线性18AA半胱氨酸/丝氨酸肽突变体的试验显示，所有来自n＝6随机选取的免疫的抗体阳性大鼠的血清被β1-ECII-18AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽以剂量依赖方式最好地阻断，其次是非突变的18AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽和25AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体。所有环肽的抗体中和能力大大优于它们的线性对应物(有或无突变)(P＜0.005；图11)，18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体使循环中游离的抗β1-ECII-抗体剂量依赖性降低：8倍超出量的18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体使循环中游离的抗β1-ECII-抗体降低53％，20倍超出量降低66％，80倍超出量降低大约85％。环状18AA半胱氨酸/半胱氨酸或环状25AA半胱氨酸/丝氨酸肽的相应结果为：46/30％[8倍超出量]，56/49％[20倍超出量]和在80倍超出量时的71/83％。线性肽的功效明显地较小，线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸和线性18AA半胱氨酸/丝氨酸肽使受体抗体滴定度的剂量依赖性降低仅24％[8倍超出量]、35％[20倍超出量]和在80倍超出量时的大约50％。 
此外，人β1-肾上腺素受体的第二细胞外环(ECII)的不同环肽变异体的体外阻断(＝中和作用)能力利用在4℃孵育12-14小时后的免疫的β1-ECII抗体阳性大鼠的血清进行测试。22AA环肽cyc22AA Cys/Cys(相对于未阻断的血清的阻断功效为82.0±5.0％，P＝0.000046)和22AA环肽突变体cyc22AACys/Ser(阻断功效为74.9±5.0％，P＝0.00026)的体外阻断功效甚至高于前面描述的包含3个半胱氨酸的环肽，即 cyc25AA半胱氨酸/半胱氨酸(阻断功效73.4±5.0％，P＝0.00011)或cyc18AA半胱氨酸/半胱氨酸(相对于未阻断的血清的阻断功效为66.1±7.0％，P＝0.00025；见图27A/B)的阻断能力。 
实施例3：体外功能性FRET测定 
利用通过荧光共振能量转移的方法测定β1-ECII 25AA或18AA环肽突变体(在环闭合位点上有或无D-Glu/Gln)对β1受体介导的信号转导(功能性cAMP测定)的阻断能力进(图6)。 
将与β1-ECII18AA环肽突变体(分别为半胱氨酸/丝氨酸或丝氨酸/半胱氨酸)预孵育(12小时，4℃，旋转孵育器)的代表性大鼠的抗β1-ECIIIgG抗体的效应与包含3个半胱氨酸的25AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽的抑制效应相比或与未与阻断性肽一起孵育的抗β1-ECII IgG抗体的效应相比较。记录的FRET发射信号的标准化YFP/CFP比用于量化本发明的环肽突变体在阻断抗体诱导的细胞的cAMP产生(以百分比)方面的效应，所述细胞的cAMP为瞬时Epac1转染的稳定表达β1-AR的人胚肾细胞(HEK293-β1细胞)产生的。图6中的x轴对应于以秒(s)为单位的记录时间。 
利用通过荧光共振能量转移(FRET)的方法分析β1-ECII 18AA环肽突变体对抗体诱导的β1肾上腺素的跨膜信号转导刺激的抑制效应。同样，在抑制可测量的功能性抗体效应(阻断细胞内的CAMP增加)方面，环状β1-ECII18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体也大大优于其丝氨酸/半胱氨酸对应物，甚至轻度比包含3个半胱氨酸的25AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽更有效(图6)。 
总之，本文所进行的测试的结果表明，突变的环肽的抗体阻断能力没有受到自25-meric到18-meric肽的氨基酸数目减少的影响。这些结果也显示出25AA半胱氨酸/半胱氨酸和18AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽与环状25AA或18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体，而不是与环状25AA或18AA丝氨酸/半胱氨酸突变体-的极好的可比性。令人吃惊地，单个 半胱氨酸残基与丝氨酸残基的交换的精确性显著地确定了突变的肽的中和效能：分别在位置18上(25AA环肽)或位置14上(18AA环肽)的Cys→Ser交换产生了具有极好的体外抗体中和和药理学作用(图6-10)，然而Cys17→Ser17或Cys13→Ser13突变体(分别为25AA或18AA肽)几乎没有阻断效应，无论是在其为抗体清道夫的性能方面，还是在其抑制功能性抗体效应的能力方面(体外受体刺激的中和作用；图6-10和实施例3)。第25(25AA环肽突变体)或18(18AA环肽突变体)位上的D-Glu/谷氨酰胺交换没有显著地影响环肽的阻断能力，不管它们的长度如何(即25和18氨基酸相比；图7-10)。 
实施例4：动物模型，受体抗体的”体内”阻断 
如果没有相反的说明，用于这一实施例和本文所描述的其他任何实施例的动物模型为模拟人类的大鼠模型。分别在评价和测试之前，利用本发明的不同化合物，更特别地式VI，VII，VIII和IX的化合物以及对照如下文所描述的处理模拟人类的大鼠模型，所述对照为线性ECII-18AA半胱氨酸/丝氨酸突变的(Gln18-)肽(氨基酸序列如下：Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)和线性非突变的包含3个半胱氨酸的ECII-25AA半胱氨酸/半胱氨酸(Gln25)肽(氨基酸序列如下：Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln)。 
在将1.0mg/kg Bw的每一构建体静脉注射到最近免疫的抗体阳性的大鼠(即，环肽用于一种”预防性”研究中)后，分析25AA和18AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽(带有谷氨酰胺闭合位点)、18AA丝氨酸/半胱氨酸突变环肽和突变的线性18AA半胱氨酸/丝氨酸肽的体内阻断效应，在最初免疫(以及在第2和3月的两次加强)后3个月第一次应用环肽。加起来，在4周一次的间隔内给予不同构建体5次预防性应用，总是在每月一次持续的抗原加强后两周。血清提取自静脉注射后18-20小时并利用含有3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为 抗原的ELISA测定反应性(图12)。 
第一次(预防性)体内环肽应用表明，1.0mg/kg体重(Bw)的非突变25AA半胱氨酸/半胱氨酸或18AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽获得了抗体中和作用的最高功效(与未治疗的免疫的动物相比，5次环肽注射后降低87.7±2％或89.9±3％；都是P＜0.005)，其次是18AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽(5次环肽注射后54.5±2％的降低；P＜0.05)，然而同一浓度的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽或线性18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体没有显著的阻断效应(5次注射后抗体滴定度降低25.8±3％或4.5±11％，P＝0.16或P＝0.8；图12)。 
所选择的环肽处理的与未处理的免疫的大鼠(n＝3)的骨髓和脾脏细胞制备物的ELIspot分析证实了这一发现。图13显示，特异性抗β1-ECII抗体分泌细胞(ASC)的数目在脾脏和骨髓中(较低程度)的显著减少只出现在用25AA半胱氨酸/半胱氨酸环肽或18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体处理的大鼠中(分别地n＝3或4)，然而线性18AA半胱氨酸/丝氨酸肽突变体(n＝3)(无论是在脾脏还是骨髓)都对ASC没有作用。 
而且，在将每一构建体的首次静脉剂量(即，1.0mg/kg体重(Bw))注射到长期免疫的抗β1-ECII抗体阳性、呈现出心肌病的表型的大鼠中(β1-ECII/GST抗原的每月1次免疫9个月后；图14-16和17)，评价治疗性使用的25AA和18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体、18AA丝氨酸/半胱氨酸(谷氨酰胺)环肽和突变的线性18AA半胱氨酸/丝氨酸肽的体内阻断效应。首次静脉注射各种构建体后18-20小时提取血清并利用包含3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原的ELISA测定反应性。各种环肽在心肌病抗体阳性大鼠中的“治疗性”应用显示，18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体(1mg/kg/Bw)相比于同一浓度的25AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体或功效明显较低的18AA丝氨酸/半胱氨酸环肽突变体具有较高的体内阻断能力(图14和15)。此外，18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体的体内功效大大优于线性18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体的体内功效。然而当将环状18AA 半胱氨酸/丝氨酸突变体的应用剂量降低到0.25mg/kg体重(Bw)时，没有获得相应的受体抗体的降低，这提示环肽突变体的剂量和效应关系。 
突变的单个S-S环肽每4周注射到长期免疫的患有抗体诱导的免疫心肌病的大鼠中的反复的治疗性注射证实了单个S-S环肽突变体的一种“临界最小剂量”和效应关系：18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽的0.25mg/kg Bw剂量-虽然在一定程度上能够清除受体抗体-在以下两方面的功效明显较小：(1)达到的循环的受体抗体降低(甚至当只考虑环肽敏感性“应答器”，这由如下确定：7次环肽注射后动物具有的最大残余抗体水平等于或低于治疗开始时的滴定度的80％(图16b和c)，和(2)与1.0或2.0mg/kg Bw剂量的18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽相比较的所获得的心脏保护效应(图17b，19b，20和21b)。后两者剂量在中和循环的受体抗体(图16b和c)和逆转抗体诱导的心肌病特征(图17b，19b，20和21b)两方面的效力几乎是等同的。然而将应用的剂量进一步增加到4.0mg/kg Bw并没有产生更高的功效，无论是抗体清除能力(图16b和c)还是心肌保护性效应方面(图17b，19b，20和21b)。 
肽注射时，未观察到严重的局部或全身不良反应。此外，在各种突变环肽注射后，动物的心率和血压都没有受到影响(图20a)。此外，没有发生明显的与环肽突变体应用相关的常规实验室参数的改变(图22a和b)。 
为了产生抗β1受体抗体，利用包含细菌谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白和人β1肾上腺素受体的第二细胞外环(GST/β1-ECII)免疫动物。在利用本发明的突变环肽处理动物前，在每4周常规免疫6到8个月后观察到渐进性扩张免疫心肌病(图17)。所有免疫的动物产生了高滴定度的刺激性抗β1-ECII抗体。特异性抗β1-ECII滴定度在每4周连续加强免疫动物的6到8个月间达到最大值，然而，NaCl注射的对照动物未产生特异性受体抗体(图18)。 
上述的免疫的动物用于本发明的突变环肽应用中。在首次静脉注射(i.v.)1.0mg/kg Bw(对18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽也为0.25mg/kg/Bw)到免疫的抗体阳性大鼠中后，确定25AA和18AA半胱氨酸 /丝氨酸突变环肽(带有谷氨酰胺闭合位点)的体内阻断效应。血清提取自首次静脉注射各种构建体后18-20小时并利用包含3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原的ELISA测定反应性。 
如所提及的，在首次静脉注射(i.v.)1.0mg/kg Bw的每一构建体到免疫的抗体阳性大鼠中后，分析25AA和18AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽(带有谷氨酰胺闭合位点)、18AA Ser/Cys突变(Gln-)环肽和突变的线性18AA半胱氨酸/丝氨酸肽的体内阻断效应。静脉注射后18-20小时提取血清并利用包含3个半胱氨酸的线性25AA半胱氨酸/半胱氨酸肽作为抗原的ELISA测定反应性。 
体内数据证实了18AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽(1mg/kg/BW)相比于同一浓度的25AA半胱氨酸/丝氨酸突变体或效力明显较小的18AA丝氨酸/半胱氨酸突变环肽具有较高的阻断能力(图14和15)。18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽的体内功效也大大优于线性18AA半胱氨酸/丝氨酸肽的体内功效。 
在肽注射时，未观察到严重的局部或全身不良反应。而且，在各种突变环肽注射后，动物的心率和血压都没有受到影响。 
然而体内数据也提示，18AA Cys/Ser突变的(Gln-)环肽的功效看起来也取决于应用的剂量；0.25mg/kg/Bw注射在抗体中和作用方面的功效低于同一构建体在1mg/kg/Bw浓度时所达到的功效(图14和15)。 
实施例2和3所描述的体外发现普遍在体内得到证实(例如图14-16)。有趣的是，半胱氨酸/丝氨酸突变环肽相比于线性肽的阻断功效在体内的差异更明显(图5，7和14-16)。 
然而，体内数据也提示，18AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽的功效可能同样取决于应用的剂量(图14-16)。所获得的结果与单个S-S环肽突变体的(最小)剂量和效应关系是符合的：相比于1.0或2.0mg/kg Bw剂量，0.25mg/kg剂量的18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体在达到的循环受体抗体的降低和达到的的心脏保护效应两方面的功效大幅降低(图14-16)。这些剂量在循环受体抗体的中和及抗体诱导的心肌病特征 的逆转两方面的功效是相等的(图16-20)。然而应用剂量进一步增加到4mg/kg Bw并没有引起更高的功效-无论是关于抗体清除能力(图16)还是关于体内心肌保护效应方面(图17-21)。 
cyc18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体的高剂量(＝4mg/kg Bw)没有提高功效；反而，它导致抗体滴定度的短暂增加，只有在第三或第四次环肽注射后才使受体抗体滴定度显著降低。最值得注意的是，在利用1.0或2.0mg/kg Bw 18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体所获得的最佳心脏保护作用的研究期间的逆转抗体诱导的心肌病特征方面也证实了不同注射浓度的cyc18AA半胱氨酸/丝氨酸突变环肽的抗体中和能力的效应(图17B，19B，20，21B)。 
如所提及的，1.0mg/kg Bw的25AA-meric半胱氨酸/丝氨酸及高剂量(＝4.0mg/kg Bw)的18AA-meric半胱氨酸/丝氨酸突变体导致抗体滴定度的短暂增加，与初始免疫反应符合，只有在第三或第四次环肽注射(治疗第3或4个月；见图16a和b)后才使受体抗体滴定度显著降低。这一现象在1.0或2.0mg/kg剂量的18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体没有出现，导致治疗9个月后抗体滴定度与治疗开始时相应抗体滴定度的仅-37±13％(1.0mg/kg 25AA半胱氨酸/丝氨酸环肽；P＝0.36与免疫的未治疗的动物相比)或39±14％(4.0mg/kg 18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽；P＝0.24与免疫的未治疗的动物相比)相比的更高的绝对降低(分别为1.0mg/kg：-59±14％或2.0mg/kg：-59±12％，P＜0.0005与免疫的未治疗的动物相比)。因此剂量为1.0或2.0mg/kg Bw的cyc18AA半胱氨酸/丝氨酸肽在中和循环受体抗体方面(图16b和c)和抗体诱导的心肌病特征逆转方面的研究期间的功效几乎是相等的(图17b、19b、20和21b)。 
另外，体内实验表明，突变环肽的抗体阻断能力看起来没有受到氨基酸数目自25-meric到18-meric环肽减少的影响；体外和体内数据都表明了这两种包含2个半胱氨酸的单个二硫键的25AA半胱氨酸/丝氨酸或18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体极好的相似性(图17a)。然而应该注意的是1.0mg/kg 25AA meric半胱氨酸/丝氨酸以及高剂量(即 4.0mg/kg Bw)的18AA meric半胱氨酸/丝氨酸突变体引起抗体滴定度初始短暂的升高(图16a和b)，从而将受体抗体滴定度的显著降低推迟到第三或第四次环肽应用时(治疗的第三或第四个月)。应用1.0或2.0mg/kg Bw剂量的18AA半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体时未出现这一现象。 
人β1肾上腺素受体的第二细胞外环(ECII)的cyc 22AA半胱氨酸/丝氨酸突变体的体内阻断(＝中和)能力也通过“治疗性”注射大鼠来测试并与所描述的cyc18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体的效应相比较，所述大鼠已被定期免疫8个月(基础免疫和随后每4周的7次抗原加强，见图28A/B)。 
在4到5次环肽每4周定期注射后，未治疗的抗体阳性的动物中的滴定度增加到治疗开始时数值的110.7±5.6％(n＝5，阳性对照；与第8月的抗体滴定度相比，总共8+4(＝12)次抗原应用后的参考滴定度)。相比之下，cyc22AA半胱氨酸/丝氨酸突变体(n＝8动物)的4次注射使抗体滴定度降低到治疗开始时抗体滴定度的9.0±2.2％(P＝3.0×10-7，当通过双侧t检验测试与未治疗的抗体阳性动物的抗体滴定度的显著性时)。因此，cyc22AA突变体的体内功效与所描述的具有18个氨基酸长度的半胱氨酸/丝氨酸环肽突变体(cyc18AA半胱氨酸/丝氨酸；n＝5动物)相比进一步地增强，其在4次注射后使抗体滴定度降低到治疗开始时滴定度的76.0±23.0％(与未治疗的抗体阳性动物相比P＝0.44，n.s.；见图28A)。 
另外，治疗4个月后的超声心动图的追踪数据也显示了cyc22AA突变体相比于cyc18AA半胱氨酸/丝氨酸突变体在关于体内心脏保护效应方面的优越性，这可由通过体内心脏保护效应通过利用可视声学超声心动图系统(Vevo 770，version V2.2.3版本)；装备有17.5MHz换能器)的二维和多普勒超声心动描记术所确定的左心室舒张末期(LVED)和左心室收缩末期(LVES)直径的减小(图29A)和“心指数”(CI，以ml/min/g体重表示，见图29B)的增加来评价。 
总之，因为ECII同源的环状肽的心脏保护和免疫调节活性看起来在很大程度上取决于它们的构象，位于分子内的二硫键对于稳定和维持构建体的三维结构是必要的。环状21+1(＝22)AA肽中，保留的半胱氨酸(即在209位和215位的半胱氨酸，如果216位已被突变为丝氨酸)维持确定的分子内间距，这通过在(预测的)环闭合位点引入最小的天然存在的氨基酸-Gly进一步加强，以允许确定结构的分子内二硫键的形成。 
本发明涉及下文的核苷酸和氨基酸序列： 
SEQ ID No.1： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys14→Ser14)；环化可发生在Ala1和Gln18间 
Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln 
SEQ ID No.2： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys18→Ser18)；环化可发生在Ala1和Gln25间 
Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln 
SEQ ID No.3： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys14→Ser14；Gln18→DGlu18)；环化可发生在Ala1和DGlu18间 
Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-DGlu 
SEQ ID No.4： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys18→Ser18；Gln25→DGlu25)；环化可发生在Ala1和DGlu25间 
Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe- Val-Thr-Asn-Arg-DGlu 
SEQ ID No.5： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys13→Ser13)；环化可发生在Ala1和Gln18间 
Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Gln 
SEQ ID No.6： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys17→Ser17)；环化可发生在Ala1和Gln25间 
Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln 
SEQ ID No.7： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys13→Ser13；Gln18→DGlu18)；环化可发生在Ala1和DGlu18间 
Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-DGlu 
SEQ ID No.8： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys17→Ser17；Gln25→DGlu25)；环化可发生在Ala1和DGlu25间 
Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu 
SEQ ID No.9： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys14→SeT14)的核苷酸序列 
gacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaag 
Figure GPA00001106782700782
gacttcgtc 
Figure GPA00001106782700783
SEQ ID No.10： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys18→Ser18)的核苷酸序列 
Figure GPA00001106782700791
cgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaag 
Figure GPA00001106782700792
gacttcgtcaccaaccgg 
SEQ ID No.11： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys14→Ser14；Gln18→DGlu18)的核苷酸序列 
Figure GPA00001106782700794
gacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagtgc 
Figure GPA00001106782700795
gacttcgtc 
Figure GPA00001106782700796
SEQ ID No.12： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys18→Ser18；Gln25→DGlu25)的核苷酸序列 
Figure GPA00001106782700797
cgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaag 
Figure GPA00001106782700798
gacttcgtcaccaaccgg 
SEQ ID No.13： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys13→Ser13)的核苷酸序列 
Figure GPA000011067827007910
gacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaag 
Figure GPA000011067827007911
gacttcgtc 
Figure GPA000011067827007912
SEQ ID No.14： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys17→Ser17)的核苷酸序列 
Figure GPA000011067827007913
cgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaag 
Figure GPA000011067827007914
gacttcgtcaccaaccgg 
SEQ ID No.15： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys13→Ser13；Gln18→DGlu18)的核苷酸序列 
gacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaag 
Figure GPA00001106782700802
gacttcgtc 
Figure GPA00001106782700803
SEQ ID No.16： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys17→Ser17；Gln25→DGlu25)的核苷酸序列 
cgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaag 
Figure GPA00001106782700805
gacttcgtcaccaaccgg 
SEQ ID No.17： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys3→Ser3)；环化可发生在Lys1和Pro18间 
Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro 
SEQ ID No.18： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys3→Ser3)；环化可发生在Lys1和Pro25间 
Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro 
SEQ ID No.19： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys3→Ser3；Gln7→DGlu7)；环化可发生在Lys1和Pro18间 
Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-DGlu-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro 
SEQ ID No.20： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys3→Ser3；Gln10→DGlu10)；环化可发生在Lys1和Pro25间 
Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro 
SEQ ID No.21： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys2→Ser2)；环化可发生在Lys1和Pro18间 
Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Gln-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro 
SEQ ID No.22： 
与人β1-AR的ECII表位(25AA；Cys2→Ser2)同源的氨基酸序列；环化可发生在Lys1和Pro25间 
Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro 
SEQ ID No.23： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys2→Ser2；Gln7→DGlu7)；环化可发生在Lys1和Pro18间 
Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-DGlu-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro 
SEQ ID No.24： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys2→Ser2；Gln10→DGlu10)；环化可发生在Lys1和Pro25间 
Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro 
SEQ ID No.25： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys3→Ser3)的核苷酸序列 
aag 
Figure GPA00001106782700811
gacttcgtc 
Figure GPA00001106782700812
gacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
SEQ ID No.26： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys3→Ser3)的 核苷酸序列 
aag 
Figure GPA00001106782700821
gacttcgtcaccaaccgg cgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
SEQ ID No.27： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys3→Ser3；Gln7→DGlu7)的核苷酸序列 
aag 
Figure GPA00001106782700823
gacttcgtc gacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
SEQ ID No.28： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys3→Ser3；Gln10→DGlu10)的核苷酸序列 
aag gacttcgtcaccaaccgg 
Figure GPA00001106782700826
cgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
SEQ ID No.29： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(18AA；Cys2→Ser2)的核苷酸序列 
aag 
Figure GPA00001106782700827
gacttcgtc 
Figure GPA00001106782700828
gacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
SEQ ID No.30： 
编码与人β1-AR的ECII表位(25AA；Cys2→Ser2)同源的氨基酸序列的核苷酸序列 
aag gacttcgtcaccaaccgg 
Figure GPA000011067827008210
cgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
SEQ ID No.31： 
编码与人β1-AR的ECII表位(18AA；Cys2→Ser2；Gln7→DGlu7)同源的氨基酸序列的核苷酸序列 
aag 
Figure GPA000011067827008211
gacttcgtc 
Figure GPA000011067827008212
gacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
SEQ ID No.32： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(25AA；Cys2→Ser2；Gln10→DGlu10)的核苷酸序列 
aag 
Figure GPA00001106782700831
gacttcgtcaccaaccgg 
Figure GPA00001106782700832
cgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
SEQ ID No.33： 
人β1-AR的ECII表位携带部分的氨基酸序列(16AA；204到219位AA) 
DEARRCYNDPKCCDFV 
SEQ ID No.34： 
人β1-AR的ECII表位携带部分的氨基酸序列(23AA；200到222位AA) 
RAESDEARRCYNDPKCCDFVTNR 
SEQ ID No.35： 
人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列 
DEARR 
SEQ ID No.36： 
人β1-AR的ECII表位(携带部分)的氨基酸序列 
RAESDEARR 
SEQ ID No.37： 
人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列 
DFV 
SEQ ID No.38： 
人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列 
DFVTNR 
SEQ ID No.39： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(16AA；Cys11→Ser11；N末端AA：Gln16或DGlu16)；环化可发生在Ala1和Gln16/DGlu16间 
Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Tyr-Gln/DGlu 
SEQ ID No.40： 
人β1-AR的氨基酸序列 
  1 mgagvlvlga sepgnlssaa plpdgaataa rllvpasppa sllppasesp eplsqqwtag 
 61 mgllmalivl livagnvlvi vaiaktprlq tltnlfimsl asadlvmgll vvpfgativv 
121 wgrweygsff celwtsvdvl cvtasietlc vialdrylai tspfryqsll trararglvc 
181 tvwaisalvs flpilmhwwr aesdearrcy ndpkccdfvt nrayaiassv vsfyvplcim 
241 afvylrvfre aqkqvkkids cerrflggpa rppspspspv papapppgpp rpaaaaatap 
301 langragkrr psrlvalreq kalktlgiim gvftlcwlpf flanvvkafh relvpdrlfv 
361 ffnwlgyans afnpiiycrs pdfrkafqgl lccarraarr rhathgdrpr asgclarpgp 
421 ppspgaasdd ddddvvgatp parllepwag cnggaaadsd ssldepcrpg faseskv 
SEQ ID No.41： 
与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(22AA；Cys17→Ser17)；环化可发生在Arg1和Gly22间 
Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Gly 
SEQ ID No.42： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(22AA；Cys17→Ser17)的核苷酸序列 
Figure GPA00001106782700841
gcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaag gacttcgtcacc 
Figure GPA00001106782700843
SEQ ID No.43： 
与人β1-AR的ECII表位(22AA；Cys3→Ser3)同源的氨基酸序列；环化可 发生在Lys1和Pro22间 
Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Gly-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro 
SEQ ID No.44： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(22AA；Cys3→Ser3)的核苷酸序列 
aag 
Figure GPA00001106782700851
gacttcgtcacc 
Figure GPA00001106782700852
gcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
SEQ ID No.45： 
人β1-AR的ECII表位(携带部分)的氨基酸序列 
DEARRCYNDPK 
SEQ ID No.46： 
人β1-AR的ECII表位(携带部分)的氨基酸序列 
ESDEARRCYNDPK 
SEQ ID No.47： 
人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列 
AESDEARR 
SEQ ID No.48： 
人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列 
DFVT 
SEQ ID No.49： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(19AA；Cys15→Ser15(18AA；Cys14→Ser14))的核苷酸序列 
Figure GPA00001106782700853
agcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaag 
Figure GPA00001106782700854
gacttcgtc 
Figure GPA00001106782700855
SEQ ID No.50： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(19AA；Cys15→Ser15(18AA；Cys14→Ser14)；Gln18→DGlu18)的核苷酸序列 
agcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaag 
Figure GPA00001106782700862
gacttcgtc 
Figure GPA00001106782700863
SEQ ID No.51： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(19AA；Cys14→Ser14(18AA；Cys13→Ser13))的核苷酸序列 
agcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaag 
Figure GPA00001106782700865
gacttcgtc 
Figure GPA00001106782700866
SEQ ID No.52： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(19AA；Cys14→Ser14(18AA；Cys13→Ser13)；Gln18→DGlu18)的核苷酸序列 
agcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaag 
Figure GPA00001106782700868
gacttcgtc 
SEQ ID No.53： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(19AA；Cys3→Ser3(18AA；Cys3→Ser3))的核苷酸序列 
aag 
Figure GPA000011067827008610
gacttcgtc 
Figure GPA000011067827008611
agcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
SEQ ID No.54： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(19AA；Cys3→Ser3(18AA；Cys3→Ser3)；Gln7→DGlu7)的核苷酸序列 
aag 
Figure GPA000011067827008612
gacttcgtc 
Figure GPA000011067827008613
agcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
SEQ ID No.55： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(19AA；Cys2→Ser2(18AA；Cys2→Ser2))的核苷酸序列 
aag 
Figure GPA000011067827008614
gacttcgtc 
Figure GPA000011067827008615
agcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
SEQ ID No.56： 
编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列(19AA；Cys2→Ser2(18AA；Cys2→Ser2)；Gln7→DGlu7)的核苷酸序列 
aag 
Figure GPA00001106782700871
gacttcgtc agcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 
在核苷酸序列中，“SER”代表编码Ser(丝氨酸)的任一核苷酸三联体，即tcn或agy；“GLY”代表编码Gly(甘氨酸)的任一核苷酸三联体，即ggn。 
n代表任一核苷酸，特别地a、c、g或t，y代表t或c以及r代表a或g。 
如本文所使用的，各种肽的序列的显示自N末端到C末端，从而N末端在相应描述的氨基酸序列的左侧且C末端在相应描述的氨基酸序列的右侧。 
下面为本文使用的其它的缩写词： 
氨基酸：          3-字母代码 1-字母代码
丙氨酸            Ala        A 
精氨酸            Arg        R 
天冬酰胺          Asn        N 
天冬氨酸          Asp        D 
半胱氨酸          Cys        C 
谷氨酸            Glu        E 
谷氨酰胺          Gln        Q 
甘氨酸            Gly        G 
组氨酸            His        H 
异亮氨酸          Ile        I 
亮氨酸            Leu        L 
赖氨酸            Lys        K 
甲硫氨酸          Met        M 
苯丙氨酸          Phe        F 
脯氨酸                    Pro    P 
丝氨酸                    Ser    S 
苏氨酸                    Thr    T 
色氨酸                    Trp    W 
酪氨酸                    Tyr    Y 
缬氨酸                    Val    V 
天冬酰胺或天冬氨酸        Asx    B 
谷氨酰胺或谷氨酸          Glx    Z 
亮氨酸或异亮氨酸          Xle    J 
未指明的或未知的氨基酸    Xaa    X 
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<120>抑制β1肾上腺素受体抗体的突变双环化受体肽
<130>M3119 PCT S3
<160>56
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<400>1
Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Ser Asp Phe
1               5                   10                  15
Val Gln
<210>2
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<400>2
Ala Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys
1               5                   10                  15
Cys Ser Asp Phe Val Thr Asn Arg Gln
            20                  25
<210>3
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(18)..(18)
<223>/取代＝″DGlu″
<400>3
Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Ser Asp Phe
1               5                   10                  15
Val Glu
<210>4
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(25)..(25)
<223>/取代＝″DGlu″
<400>4
Ala Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys
1               5                   10                  15
Cys Ser Asp Phe Val Thr Asn Arg Glu
            20                  25
<210>5
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<400>5
Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys  Ser Cys Asp Phe
1               5                   10                   15
Val Gln
<210>6
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<400>6
Ala Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys
1               5                   10                  15
Ser Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg Gln
            20                  25
<210>7
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(18)..(18)
<223>/取代＝″DGlu″
<400>7
Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys  Ser Cys Asp Phe
1               5                   10                   15
Val Glu
<210>8
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(25)..(25)
<223>/取代＝″DGlu″
<400>8
Ala Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys
1               5                   10                  15
Ser Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg Glu
            20                  25
<210>9
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g，t或u
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(42)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(54)..(54)
<223>r ia a或g
<400>9
gcngacgagg cgcgccgctg ctacaacgac cccaagtgct ctgacttcgt ccar          54
<210>10
<211>75
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g，t或u
<220>
<221>misc_feature
<222>(52)..(54)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(75)..(75)
<223>r是a或g
<400>10
gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc tgctacaacg accccaagtg ctctgacttc    60
gtcaccaacc ggcar                                                     75
<210>11
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g，t或u
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(42)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(54)..(54)
<223>r是a或g
<400>11
gcngacgagg cgcgccgctg ctacaacgac cccaagtgct ctgacttcgt cgar         54
<210>12
<211>75
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g，t或u
<220>
<221>misc_feature
<222>(52)..(54)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(75)..(75)
<223>r是a或g
<400>12
gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc tgctacaacg accccaagtg ctctgacttc    60
gtcaccaacc gggar                                                     75
<210>13
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g，t或u
<220>
<221>misc_feature
<222>(37)..(39)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(54)..(54)
<223>r是a或g
<400>13
gcngacgagg cgcgccgctg ctacaacgac cccaagtctt gcgacttcgt ccar          54
<210>14
<211>75
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g，t或u
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(51)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(75)..(75)
<223>r是a或g
<400>14
gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc tgctacaacg accccaagtc ttgcgacttc    60
gtcaccaacc ggcar                                                     75
<210>15
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g，t或u
<220>
<221>misc_feature
<222>(37)..(39)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(54)..(54)
<223>r是a或g
<400>15
gcngacgagg cgcgccgctg ctacaacgac cccaagtctt gcgacttcgt cgar          54
<210>16
<211>75
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>SEQ ID No.16：
     编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g，t或u
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(51)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(75)..(75)
<223>r是a或g
<400>16
gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc tgctacaacg accccaagtc ttgcgacttc    60
gtcaccaacc gggar                                                     75
<210>17
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<400>17
Lys Cys Ser Asp Phe Val Gln Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn
1               5                   10                  15
Asp Pro
<210>18
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<400>18
Lys Cys Ser Asp Phe Val Thr Asn Arg Gln Ala Arg Ala Glu Ser Asp
1               5                   10                  15
Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro
            20                  25
<210>19
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(7)..(7)
<223>/取代＝″DGlu″
<400>19
Lys Cys Ser Asp Phe Val Glu Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn
1               5                   10                  15
Asp Pro
<210>20
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(10)..(10)
<223>/取代＝″DGlu″
<400>20
Lys Cys Ser Asp Phe Val Thr Asn Arg Glu Ala Arg Ala Glu Ser Asp
1               5                   10                  15
Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro
            20                  25
<210>21
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<400>21
Lys Ser Cys Asp Phe Val Gln Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn
1               5                   10                  15
Asp Pro
<210>22
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<400>22
Lys Ser Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg Gln Ala Arg Ala Glu Ser Asp
1               5                   10                  15
Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro
            20                  25
<210>23
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(7)..(7)
<223>/取代＝″DGlu″
<400>23
Lys Ser Cys Asp Phe Val Glu Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn
1               5                   10                  15
Asp Pro
<210>24
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(10)..(10)
<223>/取代＝″DGlu″
<400>24
Lys Ser Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg Glu Ala Arg Ala Glu Ser Asp
1               5                   10                  15
Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro
            20                  25
<210>25
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>r是a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>25
aagtgctctg acttcgtcca rgcngacgag gcgcgccgct gctacaacga cccc         54
<210>26
<211>75
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(30)
<223>r是a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(33)..(33)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>26
aagtgctctg acttcgtcac caaccggcar gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc    60
tgctacaacg acccc                                                     75
<210>27
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>r是a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>27
aagtgctctg acttcgtcga rgcngacgag gcgcgccgct gctacaacga cccc         54
<210>28
<211>75
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(30)
<223>r是a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(33)..(33)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>28
aagtgctctg acttcgtcac caaccgggar gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc    60
tgctacaacg acccc                                                     75
<210>29
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(6)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>r是a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>29
aagtcttgcg acttcgtcca rgcngacgag gcgcgccgct gctacaacga cccc          54
<210>30
<211>75
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(6)
<223>/取代＝″tcc ″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg ″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(30)
<223>r是a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(33)..(33)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>30
aagtcttgcg acttcgtcac caaccggcar gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc    60
tgctacaacg acccc                                                     75
<210>31
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(6)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>r是a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>31
aagtcttgcg acttcgtcga rgcngacgag gcgcgccgct gctacaacga cccc          54
<210>32
<211>75
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(6)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(30)
<223>r是a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(33)..(33)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>32
aagtcttgcg acttcgtcac caaccgggar gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc    60
tgctacaacg acccc                                                   75
<210>33
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列
<400>33
Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Cys Asp Phe Val
1               5                   10                  15
<210>34
<211>23
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列
<400>34
Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys
1               5                   10                  15
Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg
            20
<210>35
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列
<400>35
Asp Glu Ala Arg Arg
1               5
<210>36
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列
<400>36
Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg
1               5
<210>37
<211>3
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列
<400>37
Asp Phe Val
1
<210>38
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列
<400>38
Asp Phe Val Thr Asn Arg
1               5
<210>39
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(16)..(16)
<223>/取代＝″DGlu″
/取代＝″Glu″
<400>39
Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Ser Asp Phe Val Tyr Glx
1               5                   10                  15
<210>40
<211>477
<212>PRT
<213>人
<400>40
Met Gly Ala Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Ser Glu Pro Gly Asn Leu
1               5                   10                  15
Ser Ser Ala Ala Pro Leu Pro Asp Gly Ala Ala Thr Ala Ala Arg Leu
            20                  25                  30
Leu Val Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Leu Leu Pro Pro Ala Ser Glu
        35                  40                  45
Ser Pro Glu Pro Leu Ser Gln Gln Trp Thr Ala Gly Met Gly Leu Leu
    50                  55                  60
Met Ala Leu Ile Val Leu Leu Ile Val Ala Gly Asn Val Leu Val Ile
65                  70                  75                  80
Val Ala Ile Ala Lys Thr Pro Arg Leu Gln Thr Leu Thr Asn Leu Phe
                85                  90                  95
Ile Met Ser Leu Ala Ser Ala Asp Leu Val Met Gly Leu Leu Val Val
            100                 105                 110
Pro Phe Gly Ala Thr Ile Val Val Trp Gly Arg Trp Glu Tyr Gly Ser
        115                 120                 125
Phe Phe Cys Glu Leu Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala
    130                 135                 140
Ser Ile Glu Thr Leu Cys Val Ile Ala Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile
145                 150                 155                 160
Thr Ser Pro Phe Arg Tyr Gln Ser Leu Leu Thr Arg Ala Arg Ala Arg
                165                 170                 175
Gly Leu Val Cys Thr Val Trp Ala Ile Ser Ala Leu Val Ser Phe Leu
            180                 185                 190
Pro Ile Leu Met His Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg
        195                 200                 205
Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg Ala Tyr
    210                 215                 220
Ala Ile Ala Ser Ser Val Val Ser Phe Tyr Val Pro Leu Cys Ile Met
225                 230                 235                 240
Ala Phe Val Tyr Leu Arg Val Phe Arg Glu Ala Gln Lys Gln Val Lys
                245                 250                 255
Lys Ile Asp Ser Cys Glu Arg Arg Phe Leu Gly Gly Pro Ala Arg Pro
            260                 265                 270
Pro Ser Pro Ser Pro Ser Pro Val Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Gly
        275                 280                 285
Pro Pro Arg Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Pro Leu Ala Asn Gly
    290                 295                 300
Arg Ala Gly Lys Arg Arg Pro Ser Arg Leu Val Ala Leu Arg Glu Gln
305                 310                 315                 320
Lys Ala Leu Lys Thr Leu Gly Ile Ile Met Gly Val Phe Thr Leu Cys
                325                 330                 335
Trp Leu Pro Phe Phe Leu Ala Asn Val Val Lys Ala Phe His Arg Glu
            340                 345                 350
Leu Val Pro Asp Arg Leu Phe Val Phe Phe Asn Trp Leu Gly Tyr Ala
        355                 360                 365
Asn Ser Ala Phe Asn Pro Ile Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg
    370                 375                 380
Lys Ala Phe Gln Gly Leu Leu Cys Cys Ala Arg Arg Ala Ala Arg Arg
385                 390                 395                 400
Arg His Ala Thr His Gly Asp Arg Pro Arg Ala Ser Gly Cys Leu Ala
                405                 410                 415
Arg Pro Gly Pro Pro Pro Ser Pro Gly Ala Ala Ser Asp Asp Asp Asp
            420                 425                 430
Asp Asp Val Val Gly Ala Thr pro Pro Ala Arg Leu Leu Glu Pro Trp
        435                 440                 445
Ala Gly Cys Asn Gly Gly Ala Ala Ala Asp Ser Asp Ser Ser Leu Asp
    450                 455                 460
Glu Pro Cys Arg Pro Gly Phe Ala Ser Glu Ser Lys Val
465                 470                 475
<210>41
<211>22
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<400>41
Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys
1               5                   10                  15
Ser Asp Phe Val Thr Gly
            20
<210>42
<211>66
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(51)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(66)..(66)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>42
cgggcggaga gcgacgaggc gcgccgctgc tacaacgacc ccaagtgctc tgacttcgtc    60
accggn                                                               66
<210>43
<211>22
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列
<400>43
Lys Cys Ser Asp Phe Val Thr Gly Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg
1               5                   10                  15
Arg Cys Tyr Asn Asp Pro
            20
<210>44
<211>66
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>44
aagtgctctg acttcgtcac cggncgggcg gagagcgacg aggcgcgccg ctgctacaac    60
gacccc                                                               66
<210>45
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人β1-AR的ECII表位(携带部分)的氨基酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>45
Asp Xaa Xaa Arg Arg Cys Xaa Asn Asp Pro Lys
1               5                   10
<210>46
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人β1-AR的ECII表位(携带部分)的氨基酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>46
Glu Ser Asp Xaa Xaa Arg Arg Cys Xaa Asn Asp Pro Lys
1               5                   10
<210>47
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列
<400>47
Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg
1               5
<210>48
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人β1-AR的ECII表位的氨基酸序列
<400>48
Asp Phe Val Thr
1
<210>49
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g，t或u
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)..(45)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(57)
<223>r是a或g
<400>49
gcnagcgacg aggcgcgccg ctgctacaac gaccccaagt gctctgactt cgtccar       57
<210>50
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g，t或u
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)..(45)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(57)
<223>r是a或g
<400>50
gcnagcgacg aggcgcgccg ctgctacaac gaccccaagt gctctgactt cgtcgar       57
<210>51
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g，t或u
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(42)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(57)
<223>r是a或g
<400>51
gcnagcgacg aggcgcgccg ctgctacaac gaccccaagt cttgcgactt cgtccar       57
<210>52
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g，t或u
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(42)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(57)
<223>r是a或g
<400>52
gcnagcgacg aggcgcgccg ctgctacaac gaccccaagt cttgcgactt cgtcgar       57
<210>53
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>r是a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>53
aagtgctctg acttcgtcca rgcnagcgac gaggcgcgcc gctgctacaa cgacccc       57
<210>54
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>r是a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>54
aagtgctctg acttcgtcga rgcnagcgac gaggcgcgcc gctgctacaa cgacccc       57
<210>55
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(6)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>r是a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>55
aagtcttgcg acttcgtcca rgcnagcgac gaggcgcgcc gctgctacaa cgacccc       57
<210>56
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码与人β1-AR的ECII表位同源的氨基酸序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(6)
<223>/取代＝″tcc″
     /取代＝″agc″
     /取代＝″tca″
     /取代＝″tcg″
     /取代＝″agt″
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>r是a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>n是a，c，g，t或u
<400>56
aagtcttgcg acttcgtcga rgcnagcgac gaggcgcgcc gctgctacaa cgacccc       57

Claims (48)

1.环状肽，其为选自如下的环状肽： 
a)由如SEQ ID NO.41，43，1-4和17-20中任一个所示的氨基酸序列形成的环状肽； 
b)由如SEQ ID NO.42，44，9-12和25-28中任一个所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列形成的环状肽； 
c)由核苷酸序列所编码的氨基酸序列形成的环状肽，所述核苷酸序列由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO.42，44，9-12和25-28中任一个所示的核苷酸序列；以及 
d)式VI到IX′中任一个的环状肽： 
环(Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Gly)(IX′)； 
环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)(VI)； 
环(Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln)(VII)； 
环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-DGlu)(VIII)； 
环(Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu)(IX)， 
其中所述环化通过至少两个为S-S键和肽键的键发生，所述S-S键通过所述肽的两个半胱氨酸残基形成；所述肽键通过N末端氨基酸的NH2基团和C末端氨基酸的COOH基团形成。 
2.如权利要求1所述的环状肽，其中所述环状肽 
i)能够降低抗体介导的β1-肾上腺素受体的活化； 
ii)能够结合抗β1-肾上腺素受体的ECII环的抗体； 
iii)能够抑制β1-AR与抗β1-AR的ECII环的抗体之间的相互作用；和/或 
iv)模拟在β1-AR的ECII环的天然构象中呈现的一个或多个表位。 
3.如权利要求2所述的环状肽，其中所述抗体为自身抗体。 
4.如权利要求1所述的环状肽，其中附加的键通过组成氨基酸的NH2基团和COOH基团的侧链形成。 
5.编码如权利要求1至4中任一权利要求所述的环状肽的氨基酸主链的核酸分子。 
6.如权利要求5所述的核酸分子，其选自在SEQ ID NO.9-12，25-28，42和44任一个中所示的核苷酸序列或由于遗传密码的简并性而与之不同的核苷酸序列。 
7.载体，包含权利要求5或6所述的核酸分子。 
8.重组宿主细胞，包含权利要求5或6所述的核酸分子或权利要求7所述的载体。 
9.生产权利要求1至4中任一权利要求所述的环状肽的方法，包括以下步骤： 
a)(i)在使权利要求1至4中任一项所述的多肽的氨基酸主链表达的条件下，培养权利要求8所述的重组宿主细胞，并回收所述氨基酸主链；或 
(ii)化学合成权利要求1至4中任一项所述的多肽的氨基酸主链；以及 
b)使所述氨基酸主链环化以形成权利要求1至4中任一项所述 的环状肽。 
10.如权利要求9所述的方法，其中所述环化是如权利要求1至4中任一权利要求所定义的。 
11.如权利要求10所述的方法，其中分别地所述N末端氨基酸为Ala或Arg，且所述C末端氨基酸为Gln或Glu或Gly，或者所述N末端氨基酸为Lys，且所述C末端氨基酸为Pro。 
12.如权利要求11所述的方法，其中Glu为DGlu。 
13.通过权利要求9至12中任一权利要求所述的方法可获得的环状肽。 
14.组合物，其包含权利要求1-4和13中任一权利要求的环状肽、权利要求5或6的核酸分子、权利要求7的载体或权利要求8的重组宿主细胞，以及任选的载体。 
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物为药物组合物，且所述载体为药物可接受的载体。 
16.如权利要求15的组合物，其中所述药物组合物包含至少一种另外的药物活性剂。 
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述至少一种另外的药物活性剂为β-肾上腺素受体阻断剂。 
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述β-肾上腺素受体阻断剂为选择性β-肾上腺素受体阻断剂。 
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述选择性β-肾上腺素受体阻断剂为阿替洛尔、美托洛尔、奈比洛尔或比索洛尔。 
20.如权利要求15至19中任一权利要求所述的组合物，其用于治疗患者β-肾上腺素受体活性增强的疾病。 
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述疾病为心脏疾病。 
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述心脏疾病选自感染性和非感染性心脏疾病、缺血性和非缺血性心脏疾病、炎症性心脏疾病和心力衰竭。 
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述非感染性心脏疾病选自心脏扩张、特发性心肌病、扩张性心肌病、免疫性心肌病和心律失常。 
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述心律失常包括室性和／或室上性过早夺获搏动及房性心律失常。 
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述房性心律失常包括心房纤颤和／或心房扑动。 
26.如权利要求22所述的组合物，其中所述炎症性心脏疾病选自心肌炎。 
27.如权利要求23所述的组合物，其中所述心脏疾病为特发性扩张性心肌病。 
28.如权利要求15-19中任一权利要求所述的组合物，其用于治疗由抗β-肾上腺素受体的抗体诱发的疾病。 
29.如权利要求15-19中任一权利要求所述的组合物，其中所述药物组合物被制备成以达到每kg体重至少0.05mg所述环状肽给药的药物。 
30.如权利要求20所述的组合物，其中所述β-肾上腺素受体为β1-肾上腺素受体。 
31.如权利要求28所述的组合物，其中所述β-肾上腺素受体为β1-肾上腺素受体。 
32.如权利要求1-4和13中任一权利要求所述的环状肽或权利要求15所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于 
a)治疗、改善或预防β-肾上腺素受体活性增强的疾病； 
b)治疗具有抗β-肾上腺素受体抗体的患者；或 
c)诱导免疫耐受。 
33.如权利要求32所述的用途，其中所述环状肽被制备成与至少一种另外的药物活性剂一起给药的药物。 
34.如权利要求33所述的用途，其中所述至少一种另外的药物活性剂为β-受体阻断剂。 
35.如权利要求34所述的用途，其中所述β-受体阻断剂为选择性β-肾上腺素受体阻断剂。 
36.如权利要求35所述的用途，其中所述选择性β-肾上腺素受体阻断剂为阿替洛尔、美托洛尔、奈比洛尔或比索洛尔。 
37.如权利要求32至36中任一权利要求所述用途，其中所述β-肾上腺素受体活性增强的疾病为心脏疾病，或者其中所述患者患有心脏疾病。 
38.如权利要求37所述的用途，其中所述心脏疾病选自感染性和非感染性心脏疾病、缺血性和非缺血性心脏疾病、炎症性心脏疾病和心力衰竭。 
39.如权利要求38所述的用途，其中所述非感染性心脏疾病选自心脏扩张、特发性心肌病、扩张性心肌病、免疫性心肌病和心律失常。 
40.如权利要求39所述的用途，其中所述心律失常选自室性、室上性过早夺获搏动及房性心律失常。 
41.如权利要求40所述的用途，其中所述房性心律失常包括心房纤颤和／或心房扑动。 
42.如权利要求38所述的用途，其中所述炎症性心脏疾病为心肌炎。 
43.如权利要求37所述的用途，其中所述心脏疾病为特发性扩张性心肌病。 
44.如权利要求32至36中任一权利要求所述的用途，其中所述疾病由抗β-肾上腺素受体的抗体诱发。 
45.如权利要求32至36中任一权利要求所述的用途，其中所述环状肽被制备成以达到每kg体重至少0.05mg所述环状肽给药的药物。 
46.如权利要求32至36中任一权利要求所述的用途，其中所述β-肾上腺素受体为β1-肾上腺素受体。 
47.检测样品中抗β-肾上腺素受体抗体的方法，其包含将权利要求1-4和13中任一权利要求所述的环状肽与待检测的所述抗体接触的步骤。 
48.如权利要求47所述的方法，其中所述β-肾上腺素受体为β1-肾上腺素受体。 
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