CN108218963B

CN108218963B - 一种环肽及其制备方法和用途

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Publication number: CN108218963B
Application number: CN201810052284.7A
Authority: CN
Inventors: 刘慧荣; 王雯; 董玉; 张苏丽
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2020-10-13
Anticipated expiration: 2038-01-19
Also published as: CN108218963A

Abstract

本发明提供了一种环肽及其制备方法和用途。所述环肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述环肽是通过其氨基酸序列首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的，该环肽命名为RD808。本发明利用多种数据库，分析β₁‑AR‑EC_II的更短优势抗原决定簇，利用固相肽合成法，成功合成了小分子量的环肽RD808，并且在细胞和在体水平验证了此肽对心肌的保护效果；本发明的环肽RD808治疗心衰具有经济负担小、无创、方便的优点；与其他大分子肽类相比，此环肽的机体免疫反应较小，能够实现安全用药。

Description

一种环肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，涉及一种环肽及其制备方法和用途。

背景技术

针对β₁-肾上腺素受体细胞外第二环(β₁-AR-EC_II)的自身抗体(Autoantibodiesagainstβ₁-adrenergic receptor,β₁-AA)参与心力衰竭的发生发展，因此临床上对β₁-AA阳性心衰患者的针对性治疗方式主要有两种方法：体外免疫吸附法和中和抗体法。

体外免疫吸附，即IA(Immunoadsorption)。这种方法是将患者血液单采后，利用特异性或非特异性的IgG凝胶柱去除人体免疫球蛋白IgG，以达到去除自身抗体的目的。

然而，IA虽然能有效的去除患者血清中的自身抗体，但这种方法仍然存在很大的问题：患者必须在特定的单采中心停留数天之久；血液单采治疗费用昂贵；操作程序复杂；此方法需要置换血液，为有创治疗。由于以上几点不足，IA的临床应用受到很大的限制。相较于IA，抗体中和法通用性强，能够有效中和循环血中的自身抗体，达到逆转心脏功能的目的；同时侵入性低、创伤小，治疗费用相对较少，不必反复住院进行手术。这些优点预示着今后肽类药物将可能会成为此类疾病治疗的热门手段之一。

肽类中和法是近年研究的重点，为自身抗体相关疾病的治疗提供了良好的基础。根据β₁-AR-EC_II的氨基酸残基结构，合成针对性结合β₁-AA的肽，中和β₁-AA的损伤效应是治疗β₁-AA阳性心血管疾病的新方法和新出路。已有文献和临床数据证实此类肽对心血管疾病的治疗效果，其中包括环肽和线肽，如COR-1(根据β₁-AR-EC_II的结构合成的环肽)、JNJ-54452840以及RI肽等，其中RI肽(d-DCCKPDNYCR)是目前报道的最小分子量肽，它包含10个氨基酸残基，将β₁-AR-EC_II被动免疫的新西兰白兔给予RI肽治疗，可以有效缓解β₁-AA诱导产生的心房有效不应期缩短，治疗心律失常。

尽管以上提到的几种肽已初见成效，但根据机体免疫应答系统的特点，抗原的分子量越小，其免疫原性越小，进入机体后其安全性就越高。值得指出的是，环肽的生物活性高、半衰期长、受体选择性高、分子内不存在游离的氨基端和羧基端，使得对氨基肽酶和羧基肽酶的敏感性大大降低，其结构具有一定的构象约束作用，环肽的这些特性使其较线型肽有更好的稳定性，其抗酶解能力比线型肽更强，这些特点使环肽具有更高的应用价值。

发明内容

基于上述现有技术的缺陷，为了寻求安全性更高、更稳定、更经济的环肽类药物，本发明的目的在于提供一种环肽及其制备方法和用途，通过分析β₁-AR-EC_II的更短优势抗原表位，合成了分子量更小、更经济的环肽。

本发明的目的主要通过以下技术方案得以实现：

一方面，本发明提供一种环肽，所述环肽的氨基酸序列为RRCYND(如SEQ ID NO：1所示)，所述环肽是通过其氨基酸序列首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的。本发明中将所述环肽命名为RD808。

上述的环肽RD808，优选地，所述环肽RD808的结构式如式(I)所示：

上述的环肽RD808中，优选地，所述环肽RD808的氨基酸序列是通过数据库分析β₁-AR-EC_II更短优势抗原决定簇而获得的。

上述的环肽RD808中，优选地，所述β₁-AR-EC_II的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述的环肽RD808中，优选地，所述数据库包括Chou&Fasman Beta-TurnPrediction、Emini Surface Accessibility Prediction、Karplus&Schulz FlexibilityPrediction、Kolaskar&Tongaonkar Antigenicity、Parker Hydrophilicity Prediction和Bepipred Linear Epitope Prediction中的一种或多种的组合。

另一方面，本发明还提供上述环肽RD808的制备方法，包括以下步骤：

将所述环肽RD808的氨基酸的肽链残基R-R-C-Y-N-D的羧基端连接至CTC树脂上，获得全保护线性肽；然后对全保护线性肽进行环肽的合成，最后洗脱干燥后制成白色粉末，即为环肽RD808。

上述的制备方法，优选地，合成全保护线性肽的具体步骤为：

步骤一，称取2-CTC树脂和Fmoc-Asp(OtBu)-OH于固相合成反应器中，加入保护剂，在氮气保护下进行搅拌，然后加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)进行反应，并用甲醇(MeOH)进行封端，然后用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤并真空干燥，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC resin；

步骤二，向步骤一中得到的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC resin中加入20％哌啶/DMF溶液进行脱保护，然后用二甲基甲酰胺洗涤并真空干燥，得到Asp(OtBu)-CTC resin；

步骤三，称取Fmoc-Asn(Trt)-OH和缩合剂，加入二甲基甲酰胺溶解，冰浴下加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)进行预活化，将预活化后的混合液倒入步骤一中的固相合成反应器中，在氮气保护下进行搅拌与Asp(OtBu)-CTC resin反应，利用茚三酮监测反应，检测结果为阴性时停止反应，然后用二甲基甲酰胺洗涤并真空干燥得到Asn(Trt)-Asp(OtBu)-CTC resin；

步骤四，重复步骤二和步骤三，依次连接氨基酸：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OH得到H-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-CTC resin；然后用二甲基甲酰胺和甲醇分别进行洗涤并真空干燥得到目标线性肽树脂；

步骤五，向目标线性肽树脂中加入TFA/DCM溶液进行裂解，抽滤收集滤液，调节滤液pH值为碱性，洗涤干燥并纯化后，得到全保护线性肽。

上述的制备方法中，优选地，全保护线性肽合成环肽RD808的具体步骤为：

将全保护线性肽溶解于保护剂中，加入缩合剂室温下进行反应，利用高效液相色谱和质谱联用检测反应是否完成，反应完成后，洗涤干燥并后，得到全保护环化肽；

向全保护环化肽中加入TFA/TIS/H₂O裂解液进行脱保护，反应后加入甲基叔丁基醚进行沉淀，离心洗涤并真空干燥纯化后，获得目标环肽，即为环肽RD808。

上述的制备方法中，20％哌啶/DMF溶液、TFA/DCM溶液和TFA/TIS/H₂O裂解液等溶液为本领域常规配方的溶液，可自制也可市售获得。

上述的制备方法中，优选地，所述保护剂包括三氟乙酸(TFA)和/或二氯甲烷(DCM)；

上述的制备方法中，优选地，所述缩合剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、1-羟基苯并三唑(HoBt)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)中的一种或多种。

再一方面，本发明还提供上述环肽RD808在制备用于治疗心力衰竭的药物中的用途。

另一方面，本发明还提供了一种药物，其中包含治疗有效量的本发明的上述环肽RD808。

本发明利用多种数据库，分析β₁-AR-EC_II的更短优势抗原决定簇，利用固相肽合成法，成功合成了小分子量的环肽RD808，并且在细胞和在体水平验证了此肽对心肌的保护效果。本发明的环肽RD808治疗心衰具有经济负担小、无创、方便的优点；与其他大分子肽类相比，此环肽的机体免疫反应较小，能够实现安全用药。

附图说明

图1为本发明实施例1中β₁-AR-EC_II的优势抗原决定簇的筛选数据图；

图2为本发明实施例2中环肽RD808改善β₁-AA引起的细胞损伤的实验数据图；

图3为本发明实施例2中环肽RD808对心功能的影响实验数据图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。本发明实施例中所采用的化学试剂及原料未作说明的均为市售购买；实施例中的原料用量根据具体操作进行合理适当调整获得。

实施例1

一方面，本实施提供环肽RD808，该环肽RD808的氨基酸序列为RRCYND(如SEQ IDNO：1所示)，所述环肽RD808通过其氨基酸序列首尾氨基酸的氨基和羧基形成酰胺键成环得到的，该环肽RD808的结构式如式(I)所示：

本实施的环肽RD808的氨基酸序列是通过数据库分析β₁-AR-EC_II更短优势抗原决定簇而获得的。具体为：采用β₁-AR-EC_II的全长氨基酸序列HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC(如SEQ ID NO：2所示)。利用六种数据库Chou&Fasman Beta-Turn Prediction、EminiSurface Accessibility Prediction、Karplus&Schulz Flexibility Prediction、Kolaskar&Tongaonkar Antigenicity、Parker Hydrophilicity Prediction和BepipredLinear Epitope Prediction以及免疫信息学原理综合分析β₁-AR-EC_II的更短抗原决定簇，得分越高，说明其作为抗原决定簇的可能性越大。分析结果如图1和表1所示。

表1

序列	开始位置	得分
			RRCYNDPKCCDFVTNR(SEQ ID NO：2序列的第11-26位)	11	0.94
HWWRAESDEARRCYND(SEQ ID NO：2序列的第1-11位)	1	0.9

由表1和图1的分析结果可知，氨基酸序列RRCYND(如SEQ ID NO：1所示)为作为抗原决定簇可能性大的最佳序列。

另一方面，本实施例还提供上述环肽RD808的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，称取2-CTC树脂和Fmoc-Asp(OtBu)-OH于固相合成反应器中，加入适量的无水二氯甲烷，在氮气保护下进行搅拌，然后加入N,N-二异丙基乙胺进行反应2.5h，并用甲醇进行封端，然后用二甲基甲酰胺洗涤3次并真空干燥；

步骤二，向步骤一中加入20％哌啶/DMF溶液进行脱保护，然后用二甲基甲酰胺洗涤5次并真空干燥，得到Asp(OtBu)-CTC resin；

步骤三，称取Fmoc-Asn(Trt)-OH和1-羟基苯并三唑到合适的三口瓶中，加入适量二甲基甲酰胺溶解，冰浴下加入N,N-二异丙基碳二亚胺进行预活化10min，将预活化后的混合液倒入步骤一中的固相合成反应器中，在氮气保护下进行搅拌与Asp(OtBu)-CTC resin反应，利用茚三酮监测反应，检测结果为阴性时停止反应，然后用二甲基甲酰胺洗涤5次并真空干燥得到Asn(Trt)-Asp(OtBu)-CTC resin；

步骤四，重复步骤二和步骤三，依次连接氨基酸：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OH得到H-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-CTC resin；然后用二甲基甲酰胺和甲醇分别进行洗涤3次并真空干燥得到目标线性肽树脂；

步骤五，将干燥的目标线性肽树脂加入到固相合成反应器中，向目标线性肽树脂中加入低浓度的TFA/DCM溶液进行裂解，抽滤收集滤液，并用二氯甲烷洗涤树脂，抽滤收集滤液，合并滤液，利用N,N-二异丙基乙胺调节滤液pH值为碱性，用水洗，酸洗，饱和食盐水洗涤后干燥并纯化后，得到全保护线性肽。

步骤六，将全保护线性肽溶解于适量的无水二氯甲烷中，加入缩合剂1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N,N-二异丙基乙胺，室温下进行反应，利用高效液相色谱和质谱联用检测反应是否完成，反应完成后，用水洗，酸洗，饱和食盐水洗涤后干燥后，得到全保护环化肽；

步骤七，向全保护环化肽中加入TFA/TIS/H₂O裂解液进行脱保护3h，反应后加入冷的甲基叔丁基醚进行沉淀，离心洗涤3次并真空干燥纯化后，获得目标环肽，经反应色谱纯化冻干后得到环肽RD808。反应过程如下式：

本实施制备的环肽RD808为白色粉末，分子量为808。利用HPLC高效液相色谱检测其纯度≥98％。

实施例2

本实施例提供上述实施例1制备的环肽RD808在制备心力衰竭药物中的用途。

(1)环肽RD808改善β₁-AA引起的细胞损伤的实验

为了明确环肽RD808是否能保护心肌细胞免受β₁-AA过度刺激引起的损伤，我们采用细胞存活率来反映细胞损伤与否，美托洛尔(Met)为β₁肾上腺素受体阻断剂，结果如图2所示。

由图2实验数据可知，β₁-AA组OD值降低(^**P<0.01)，细胞存活率下降，RD808处理后其存活率较β₁-AA有改善(^##P<0.01)；说明环肽RD808可以改善由β₁-AA引起的细胞损伤。

(2)环肽RD808对心功能的影响实验

为了在体实验上探究RD808对心功能的影响，我们建立了β₁-AA诱导的心功能下降模型。模型建立时间为两个月，β₁-AA与RD808均经鼠尾静脉注入小鼠体内。心功能结果如图3所示：与生理盐水溶剂对照组相比，β₁-AA被动免疫小鼠8周时，β₁-AA组的左室射血分数(EF)明显下降(*P<0.05)，β₁-AA+RD808组较单独给予β₁-AA有明显升高(#P<0.05)。由实验结果可知：β₁-AA的长期存在可导致心功能下降，环肽RD808有较好的治疗效果，可改善β₁-AA诱导的左心室射血分数下降。

综上所述，本发明的环肽RD808治疗心衰具有经济负担小、无创、方便的优点；与其他大分子肽类相比，此环肽的机体免疫反应较小，能够实现安全用药。

序列表

<110> 首都医科大学

<120> 一种环肽及其制备方法和用途

<130> GAI17CN1257

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 环肽RD808

<400> 1

Arg Arg Cys Tyr Asn Asp

5

<210> 2

<211> 27

<212> PRT

<213> β1-AR-ECII

<400> 2

His Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp

5 10 15

Pro Lys Cys Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg Cys

20 25

Claims

1.一种环肽，其特征在于：所述环肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述环肽是通过其氨基酸序列首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的；

所述环肽的结构式如式(I)所示：

所述环肽的氨基酸序列是通过数据库分析β₁-AR-EC_II更短优势抗原决定簇而获得的；所述β₁-AR-EC_II的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述数据库包括Chou&Fasman Beta-Turn Prediction、Emini SurfaceAccessibility Prediction、Karplus&Schulz Flexibility Prediction、Kolaskar&Tongaonkar Antigenicity、Parker Hydrophilicity Prediction和Bepipred LinearEpitope Prediction。

2.权利要求1所述环肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述环肽的氨基酸的肽链残基R-R-C-Y-N-D的羧基端连接至CTC树脂上，获得全保护线性肽；然后对全保护线性肽进行环肽的合成，最后洗脱干燥后制成白色粉末，即为所述环肽。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，合成全保护线性肽的具体步骤为：

步骤一，称取2-CTC树脂和Fmoc-Asp(OtBu)-OH于固相合成反应器中，加入保护剂，在氮气保护下进行搅拌，然后加入N,N-二异丙基乙胺进行反应，并用甲醇进行封端，最后用二甲基甲酰胺洗涤并真空干燥，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC resin；

步骤三，称取Fmoc-Asn(Trt)-OH和缩合剂，加入二甲基甲酰胺溶解，冰浴下加入N,N-二异丙基碳二亚胺进行预活化，将预活化后的混合液倒入步骤一中的固相合成反应器中，在氮气保护下进行搅拌与Asp(OtBu)-CTC resin反应，利用茚三酮监测反应，检测结果为阴性时停止反应，然后用二甲基甲酰胺洗涤并真空干燥得到Asn(Trt)-Asp(OtBu)-CTC resin；

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，全保护线性肽合成环肽的具体步骤为：

向全保护环化肽中加入TFA/TIS/H₂O裂解液进行脱保护，反应后加入甲基叔丁基醚进行沉淀，离心洗涤并真空干燥纯化后，获得目标环肽，即为所述环肽。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述保护剂包括三氟乙酸和/或二氯甲烷。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述缩合剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。

7.权利要求1所述环肽在制备用于治疗心力衰竭的药物中的用途。

8.一种药物，其中包含治疗有效量的权利要求1所述环肽。