CN101835503A - 用于治疗流感的组合物和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗或预防流感的组合物、试剂盒和方法。

Description

用于治疗流感的组合物和试剂盒
发明背景
本发明的领域是抗病毒组合以及它们用于治疗或预防患者中的流感的应用。
目前有4种由FDA核准的抗病毒药物用于治疗急性、非并发性的(uncomplicated)流感。M2抑制剂盐酸金刚烷胺
Figure G2008800158516D00011
和金刚乙胺
Figure G2008800158516D00012
被核准用于治疗和预防A型流感。金刚烷胺和金刚乙胺二者以100mg片剂和50mg/ml糖浆提供用于口服施用。对于两种药物，通常的成年人剂量是200mg，以每天两次分开的剂量(BID)。在年龄为1-9岁的患者中，金刚烷胺的儿科剂量是4.4-8.8mg/kg/天，不超过150mg/天；对于金刚乙胺，剂量是5mg/kg，每天施用一次(QD)，不超过150mg/天。
神经氨酸酶抑制剂扎那米韦
Figure G2008800158516D00013
和磷酸奥塞米韦
Figure G2008800158516D00014
核准用于治疗和预防A型和B型流感。提供扎那米韦用于口腔吸入，仅与吸入装置一起使用。推荐的用于流感预防和治疗的扎那米韦的剂量分别是10mg/天QD和20mg/天BID。磷酸奥塞米韦磷酸可作为包含75mg奥塞米韦的用于口服应用的胶囊获得，并且作为用于口服混悬液的粉剂获得，其在按指示用水构建时包含12mg/ml奥塞米韦。对于超过13岁的患者，推荐的用于流感预防和治疗的奥塞米韦剂量分别是75mg/天QD和150mg BID。
已经提议了多种抗病毒药物组合用于治疗流感。美国专利号5,866,601公开了将神经氨酸酶抑制剂组合物和抗病毒药(诸如金刚烷胺，金刚乙胺和利巴韦林)组合。已经报道了关于各种药物二重组合抗流感效果的体外和体内动物模型研究(参见，例如，包括利巴韦林与金刚烷胺(Wilson等，Antimicrob Agents Chemother(抗微生物药剂化学治疗)(1980)17：642-648；Hayden等，Antimicrob Agents Chemother(抗微生物药剂化学治疗)(1980)18：536-41；和Burlington等，J.Antimicrob Chemother(抗微生物药化学治疗杂志)(1983)11：7-14)，金刚乙胺(Hayden等，同前所述；Galegov等，Experientia(1977)33：905-906；和Madren等，Antivir ChemChemother(抗病毒化学和化学治疗)(1995)6：109-113)，peramavir(Smee等，Chemotherapy(化学治疗)(2002)48：88-93)，和奥塞米韦(Smee等，Antiviral Chem Chemother(抗病毒化学和化学治疗)(2006)17：185-92)组合；以及奥塞米韦与金刚烷胺(Ilyushina等，Antiviral Res.(抗病毒研究)(2006)70：121-31)和金刚乙胺(Govorkova等，Antimicrob AgentsChemother(抗微生物药剂化学治疗)(2004)48：4855-4863；Galabov等，Antivir Chem Chemother(抗病毒化学和化学治疗)(2006)17：251-8；和Leneva等，Antiviral Res(抗病毒研究)(2000)48：101-15)的组合。这些论文中的一些报道利巴韦林和金刚烷胺的组合，与用单一所述药物治疗相比，具有对抗流感病毒的协同作用的附加作用(参见，例如，Wilson等，同前所述；Hayden等，同前所述；和Burlington等，同前所述)。在这些研究中的一些中，据报道，与单一治疗法治疗相比，组合治疗具有不利的结果。例如，据报道，奥塞米韦和金刚乙胺每种药物以低浓度组合导致针对A型流感病毒的拮抗相互作用(Govorkova等，同前所述)。Smee等(2006)报道用奥塞米韦加利巴韦林的组合治疗A型流感病毒-感染的小鼠不比单独使用利巴韦林更好，且当所述治疗在感染后3-4天起始时，用所述组合治疗的组比仅用利巴韦林治疗的动物具有更少的存活者。
在治疗过程中，针对M2抑制剂金刚乙胺和金刚烷胺的病毒抗性可以快速形成，原因在于在M2蛋白中的某些单点突变可以赋予针对金刚烷胺和金刚乙胺二者的抗性。在2006年1月，CDC检测揭示在美国流通的大部分A型流感病毒耐受金刚烷胺和金刚乙胺，这引起CDC推荐反对这些药物用于流感的治疗和预防的应用(CDC Health Alert(CDC健康警告)，2006年1月14日)。目前，认为奥塞米韦是用于A型流感病毒的一线治疗。然而，已经报道了奥塞米韦-耐受性毒株(de Jong等，N Engl J Med.(新英格兰医学杂志)(2005)353：2667-72；Euro Surveill.(2005)10(10)：E051020.2)，这引起对可传递的、病原抗性毒株可能减少抗病毒应用在流行病控制中的益处的关注(Lipsitch等，PLoS Med(2007)Jan23；4(1)：e15[电子公布先于书面公布])。此外，奥塞米韦治疗已经与严重的精神病治疗事件、尤其是儿科患者相关(参见Prescrire Int.(2006)15：182-3)。
考虑到前述，本发明的一个目的是提供用于流感、特别是流行性流感和/或耐受M2抑制剂和/或神经氨酸酶抑制剂的流感毒株的治疗或预防的提高的疗法。
本发明的另一个目的是提供用于流感的治疗或预防的提高的疗法，其防止在患者或群体内产生耐药性毒株。
本发明的另一个目的是提供用于流感的治疗或预防的改进疗法，其与目前的单一疗法相比具有显著更少或没有不利事件或毒性作用。
发明概述
本发明的一个方面是用于治疗或预防患者中的流感的组合物，所述组合物包括：10-60重量百分比(wt.％)，25-50wt％，或50-75wt％金刚烷胺或金刚乙胺；和30-80wt.％，50-75wt.％，或25-50wt.％利巴韦林或viramidine，其中所述重量百分比是基于所述组合物中活性剂的总重。在具体实施方案中，所述组合物还包括0.5-30wt.％的奥塞米韦。
在一个实施方案中，所述组合物采用适于口服或胃施用的制剂，诸如液体、糖浆、混悬液、片剂、胶囊、胶囊中的珠、或香囊剂中的珠。在具体实施方案中，所述组合物采用用于口服施用的单位剂型，其包括25-125mg金刚烷胺或金刚乙胺和50-200mg利巴韦林或viramidine。在具体实施方案中，所述单位剂型包括至少125mg处于延长释放形式的金刚烷胺，和少于200mg的利巴韦林。在另一个实施方案中，所述单位剂型包括25-125mg金刚烷胺和50-200mg利巴韦林。
在另一个实施方案中，所述组合物采用适于肠胃外施用的形式，诸如冻干的粉剂，其在施用前重构，或在小瓶中的无菌液体。
本发明的另一方面是用于治疗或预防患者中的流感的试剂盒，其包括金刚烷胺或金刚乙胺，和利巴韦林或viramidine，且任选神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦、扎那米韦，或peramivir。
在具体实施方案中，提供用于口服治疗或预防患者中的流感的试剂盒，其包括多个剂型，所述多个组成一个或多个剂量，每个剂量包括治疗或预防有效量的利巴韦林和金刚烷胺的组合。金刚烷胺和利巴韦林可以配制为独立的剂型或共同配制为单一剂型。金刚烷胺可以采用延长释放的形式。在具体实施方案中，金刚烷胺和利巴韦林配制为独立的剂型，每个金刚烷胺剂型包括75-250mg金刚烷胺，且每个利巴韦林剂型包括50-200或100-400mg利巴韦林。在不同实施方案中，试剂盒包括处于选自80mg、180mg、和330mg的剂量强度的金刚烷胺剂型，和处于选自由115mg、330mg和660mg组成的组的剂量强度的利巴韦林剂型。在一个实施方案中，每个剂量还包括奥塞米韦。
在另一个实施方案中，提供用于肠胃外治疗人患者中的流感的试剂盒，其包括处于适于肠胃外施用的形式的金刚烷胺；和处于适于肠胃外施用的形式的利巴韦林。金刚烷胺可以包含在多个第一小瓶中，且利巴韦林包含在多个第二小瓶中。备选地，金刚烷胺和利巴韦林共同配制且包含在多个小瓶中。试剂盒还可以包括处于适于肠胃外施用的形式的奥塞米韦、peramivir、或扎那米韦。
本发明的另一个方面是用于治疗或预防患者中的流感的方法，所述方法包括：向所述患者施用有效量的三种不同抗病毒药剂的组合，所述三种抗病毒药剂具有相应的三种不同的作用机制，选自由流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶抑制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂组成的组中。
在具体实施方案中，所述方法包括向患者施用有效量的第一、第二和第三抗病毒药剂的组合，其包括：a)选自由金刚乙胺和金刚烷胺组成的组的M2抑制剂；b)选自由利巴韦林和viramidine组成的组的RNA聚合酶抑制剂；和c)选自由奥塞米韦、扎那米韦、和peramivir组成的组的神经氨酸酶抑制剂(NAi)。
在优选实施方案中，第一和第二抗病毒药剂以这样的量施用，相对于用作单一治疗时流感病毒对所述第三抗病毒药剂的敏感性，所述量增加流感病毒对所述第三抗病毒药剂的敏感性至少2倍。在一个具体的这样的实施方案中，第一和第二抗病毒药剂是利巴韦林和奥塞米韦，且第三抗病毒药剂是金刚烷胺。
在所述方法的一个实施方案中，通过选自由口服、肠胃外、吸入、以及它们的组合组成的组的方法将抗病毒药剂施用给患者。
在具体实施方案中，以维持血浆浓度在0.1-3.0μg/ml，0.1-1.5μg/ml，或0.3-1.5μg/ml持续至少48小时的量向患者施用金刚烷胺或金刚乙胺。
在另一个实施方案中，所述患者以5-500mg/天，20-250mg/天，100-800mg/天，100-600mg/天，200-700mg/天，或200-500mg/天的量肠胃外或口服施用金刚烷胺或金刚乙胺。当口服施用时，金刚烷胺任选地采用延长释放的形式。
在另一个实施方案中，患者通过静脉内输注以1-50mg/小时，3-40mg/小时，或5-30mg/小时的速率持续至少48小时施用金刚烷胺。
在一个实施方案中，患者以维持血浆浓度在0.1-10.0μg/ml，0.5-8μg/ml，0.5-5.0μg/ml，1-6μg/ml，1-4μg/ml，2-6μg/ml，2-4μg/ml，0.01-2μg/ml，或0.2-2μg/ml持续至少48小时的量施用利巴韦林或viramidine。患者以50-2000mg/天，50-1600mg/天，100-1200mg/天，400-800mg/天，50-600mg/天，75-500mg/天，或75-200mg/天的量肠胃外或口服施用利巴韦林。
在具体实施方案中，患者通过静脉内输注以5-200mg/小时，10-150mg/小时，15-100，或20-80mg/小时的速率持续至少48小时施用利巴韦林。
在具体实施方案中，其中向施用患者处于上述具体量中的一种的金刚烷胺或金刚乙胺以及处于上述具体量中的一种的利巴韦林或viramidine，还向患者施用处于维持神经氨酸酶抑制剂的血浆浓度在0.001-5μg/ml，0.02-5μg/ml，0.1-3μg/ml，0.1-1μg/ml，0.3-3μg/ml，或0.3-1μg/ml持续至少48小时的量施用选自由下列各项组成的组的神经氨酸酶抑制剂：奥塞米韦，奥塞米韦羧酸盐，扎那米韦，和peramivir。
在具体实施方案中，患者通过静脉内输注以0.1-10mg/小时，0.4-7mg/小时，或1-5mg/小时的速率持续至少48小时施用扎那米韦。
在另一个实施方案中，患者通过静脉内输注以0.1-20mg/小时，0.4-7mg/小时，1-7mg/小时，1-5mg/小时，或2-7mg/小时的速率持续至少48小时施用奥塞米韦。
在不同实施方案中，患者可以以10-150mg/天，10-50mg/天，50-100mg/天，75-150mg/天，150-300mg/天，100-500mg/天，或1-50mg/天的量肠胃外或口服施用奥塞米韦。
本发明提供用于同时独立或顺序施用的第一抗病毒药剂、第二抗病毒药剂和第三抗病毒药剂，其中所述三种药剂具有相对应的三种不同的作用机制，选自由下列各项组成的组：流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶抑制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂。
本发明还提供在治疗中组合使用的第一抗病毒药剂、第二抗病毒药剂和第三抗病毒药剂，其中所述三种抗病毒药剂具有相对应的三种不同的作用机制，选自由下列各项组成的组：流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂。
本发明还提供在治疗和/或预防流感传染中组合使用的第一抗病毒药剂、第二抗病毒药剂和第三抗病毒药剂，其中所述三种抗病毒药剂具有相对应的三种不同的作用机制，选自由下列各项组成的组：流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶抑制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂。
本发明还提供第一抗病毒药剂、第二抗病毒药剂和第三抗病毒药剂在制备用于治疗和/或预防流感传染的药物中的应用，其中所述三种抗病毒药剂具有相对应的三种不同的作用机制，选自由下列各项组成的组：流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶抑制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂。如下文所述，所述三种药剂可以彼此独立或两两或三种组合施用。
本发明还提供抗病毒药剂在制备用于治疗和/或预防流感传染的药物中的应用，其中所述抗病毒药剂选自由下列各项组成的组：流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶抑制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂，并且其中制备所述药物用于与两种其他抗病毒药剂组合施用(或被施用)给患者，其中所述三种抗病毒药剂具有不同的作用机制，选自由下列各项组成的组：流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶抑制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂。
本发明还提供第一抗病毒药剂在制备用于治疗和/或预防流感感染的药物中的应用，其中制备所述药物用于与第二抗病毒药剂和第三抗病毒药剂组合施用(或被施用)给患者，其中：a)所述第一抗病毒药剂选自由流感病毒吸附抑制剂和M2抑制剂组成的组；b)所述第二抗病毒药剂选自由IMP脱氢酶抑制剂，和RNA聚合酶抑制剂组成的组；并且c)所述第三抗病毒药剂选自由干扰寡核苷酸和神经氨酸酶抑制剂组成的组。
本发明还提供第二抗病毒药剂在制备用于治疗和/或预防流感感染的药物中的应用，其中制备所述药物用于与第一抗病毒药剂和第三抗病毒药剂组合施用(或被施用)给患者，其中：a)所述第一抗病毒药剂选自由流感病毒吸附抑制剂和M2抑制剂组成的组；b)所述第二抗病毒药剂选自由IMP脱氢酶抑制剂，和RNA聚合酶抑制剂组成的组；并且c)所述第三抗病毒药剂选自由干扰寡核苷酸和神经氨酸酶抑制剂组成的组。
本发明还提供第三抗病毒药剂在制备用于治疗和/或预防流感感染的药物中的应用，其中制备所述药物用于与第一抗病毒药剂和第二抗病毒药剂组合施用(或被施用)给患者，其中：a)所述第一抗病毒药剂选自由流感病毒吸附抑制剂和M2抑制剂组成的组；b)所述第二抗病毒药剂选自由IMP脱氢酶抑制剂，和RNA聚合酶抑制剂组成的组；并且c)所述第三抗病毒药剂选自由干扰寡核苷酸和神经氨酸酶抑制剂组成的组。
本发明还提供第一和第二抗病毒药剂在制备用于治疗和/或预防流感感染的药物中的应用，其中制备所述药物用于与第三抗病毒药剂组合施用(或被施用)给患者，其中：a)所述第一抗病毒药剂选自由流感病毒吸附抑制剂和M2抑制剂组成的组；b)所述第二抗病毒药剂选自由IMP脱氢酶抑制剂，和RNA聚合酶抑制剂组成的组；并且c)所述第三抗病毒药剂选自由干扰寡核苷酸和神经氨酸酶抑制剂组成的组。
本发明还提供一种或多种抗病毒药剂在制备用于治疗和/或预防流感传染的药物中的应用，其中所述抗病毒药剂具有不同的作用机制，选自由下列各项组成的组：流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶抑制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂，并且其中制备所述药物用于与一种或多种其他抗病毒药剂组合施用(或被施用)给患者，以便患者接受具有选自所述组的不同作用机制的三种抗病毒药剂。
本发明还提供抗病毒药剂在制备用于治疗和/或预防患者流感传染的药物中的应用，其中所述抗病毒药剂选自由下列各项组成的组：流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶抑制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂，并且其中患者先前已用至少两种其他抗病毒药剂治疗过，其中所述抗病毒药剂具有不同的作用机制，所述不同的作用机制选自由下列各项组成的组：流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶抑制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂。
本发明还提供第一抗病毒药剂在制备用于治疗和/或预防患者中的流感传染的药物中的应用，其中所述患者先前已用第二抗病毒药剂、任选地第三抗病毒药剂治疗过，其中：a)所述第一抗病毒药剂选自由流感病毒吸附抑制剂和M2抑制剂组成的组；b)所述第二抗病毒药剂选自由IMP脱氢酶抑制剂，和RNA聚合酶抑制剂组成的组；并且c)所述第三抗病毒药剂选自由干扰寡核苷酸和神经氨酸酶抑制剂组成的组。
本发明还提供第二抗病毒药剂在制备用于治疗和/或预防患者中的流感传染的药物中的应用，其中所述患者先前已用第一抗病毒药剂、任选地第三抗病毒药剂治疗过，其中：a)所述第一抗病毒药剂选自由流感病毒吸附抑制剂和M2抑制剂组成的组；b)所述第二抗病毒药剂选自由IMP脱氢酶抑制剂，和RNA聚合酶抑制剂组成的组；并且c)所述第三抗病毒药剂选自由干扰寡核苷酸和神经氨酸酶抑制剂组成的组。
本发明还提供第三抗病毒药剂在制备用于治疗和/或预防患者中的流感传染的药物中的应用，其中所述患者先前已用第一抗病毒药剂和第二抗病毒药剂治疗过，其中：a)所述第一抗病毒药剂选自由流感病毒吸附抑制剂和M2抑制剂组成的组；b)所述第二抗病毒药剂选自由IMP脱氢酶抑制剂，和RNA聚合酶抑制剂组成的组；并且c)所述第三抗病毒药剂选自由干扰寡核苷酸和神经氨酸酶抑制剂组成的组。
在这些应用中，在施用所述药物之前，患者先前的治疗将典型地不多于7天(例如，在先前的7，6，5，4，3，2天，或在先前的24小时)。
本发明还提供用于治疗和/或预防流感传染的抗病毒药剂，其中所述抗病毒药剂选自由下列各项组成的组：流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶抑制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂，且其中所述抗病毒药剂与至少一种其他抗病毒药剂一起施用(或制备用于施用)，其中所述抗病毒药剂具有不同的作用机制，所述不同的作用机制选自由下列各项组成的组：流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶抑制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂。
本发明还提供用于治疗和/或预防流感传染的第一抗病毒药剂，其中所述第一抗病毒药剂与第二抗病毒药剂、任选地第三抗病毒药剂一起施用(或制备用于施用)，其中：a)所述第一抗病毒药剂选自由流感病毒吸附抑制剂和M2抑制剂组成的组；b)所述第二抗病毒药剂选自由IMP脱氢酶抑制剂，和RNA聚合酶抑制剂组成的组；并且c)所述第三抗病毒药剂选自由干扰寡核苷酸和神经氨酸酶抑制剂组成的组。
本发明还提供用于治疗和/或预防流感传染的第二抗病毒药剂，其中所述第二抗病毒药剂与第一抗病毒药剂、任选地第三抗病毒药剂一起施用(或制备用于施用)，其中：a)所述第一抗病毒药剂选自由流感病毒吸附抑制剂和M2抑制剂组成的组；b)所述第二抗病毒药剂选自由IMP脱氢酶抑制剂，和RNA聚合酶抑制剂组成的组；并且c)所述第三抗病毒药剂选自由干扰寡核苷酸和神经氨酸酶抑制剂组成的组。
本发明还提供用于治疗和/或预防流感传染的第三抗病毒药剂，其中所述第三抗病毒药剂与第一抗病毒药剂和第二抗病毒药剂一起施用(或制备用于施用)，其中：a)所述第一抗病毒药剂选自由流感病毒吸附抑制剂和M2抑制剂组成的组；b)所述第二抗病毒药剂选自由IMP脱氢酶抑制剂，和RNA聚合酶抑制剂组成的组；并且c)所述第三抗病毒药剂选自由干扰寡核苷酸和神经氨酸酶抑制剂组成的组。
附图简述
图1A-4是6种包括按照本发明的不同实施方案的剂型的不同各个泡眼包装(blister packs)的平面图。
图5是由实施例1B所述的实验产生的数据的协同体积图。
发明详述
本发明提供用于治疗患有流感病毒传染或怀疑感染了或处于暴露于流感病毒的危险的人患者的方法、应用、组合物、和试剂盒。本发明可以用来防止或减少产生耐药性毒株的可能性，以治疗怀疑感染了或处于暴露于耐药性流感病毒的人患者，且将与单一治疗相关的副作用和毒性最小化。
本发明的一个方面是用于治疗或预防患者中的流感从而减少或预防与流感病毒传染相关的症状的方法。所述患者可以是对流感传染敏感的人或任何其他动物(例如，家畜，如猫和狗；家畜和农场动物，如马、牛、猪、鸡等)。应用医学护理标准来确定患者可能感染了流感病毒或处于暴露于流感病毒的危险中。流感病毒可以是A或B型病毒。在具体实施方案中，病毒是A型流感病毒(例如，H1N1，H1N2，H2N2，H3N2，H5N1，H7N7，H9N2，等.)。
所述方法包括向患者施用三种不同抗病毒药剂的组合(本文称为“三联组合(triple combination)”)，所述三种不同抗病毒药剂具有相对应的三种不同的作用机制，其选自由下列各项组成的组：流感病毒吸附抑制剂，M2抑制剂，IMP脱氢酶抑制剂，RNA聚合酶抑制剂，流感-特异性干扰寡核苷酸，和神经氨酸酶抑制剂。一种或多种另外的抗病毒药剂可以添加到该三联组合中(例如，第四抗病毒药剂，其具有与该三联组合的三种机制不同的或与三联组合机制之一相同的作用机制)。本文引用具体的抗病毒药剂(例如，金刚烷胺，奥塞米韦，等等)意欲包括该抗病毒药剂的药用盐(例如，盐酸金刚烷胺，磷酸奥塞米韦，等等)。
所述抗病毒药剂优选地以这样的相对比例和剂量施用，其表现出关于病毒负荷、症状、疾病持续时间的减少，防止耐药性毒株等的相加或协同作用。协同作用是组合的功效大于该组合中的每一种药物作为单一药剂的累加功效(Prichard和Shipman，Antiviral Res.(抗病毒研究)(1990)14：181-206)。测量抗病毒药剂的药物协同作用的方法描述在下述实施例中，并且通常是本领域中所知的(参见，例如，Schinazi等，Antimicrob AgentsChemother.(抗微生物药剂化学治疗)(1982)22：499-507；和Prichard与Shipman，同前所述；和Prichard等，Antibicrob Agents Chemother(1993)37：540-545；每一篇通过引用结合于此)。图5描述由下述实施例1B所述的实验获得的数据的三维协同图；分析使用记述在Prichard等(1993)，同前所述.中的方法进行。
与在目前的单一治疗中所用的相比，使用协同量的抗病毒药剂提供更高的功效和/或允许更低量的一种或多种所用药物，由此导致对患者更少的副作用，且允许由有限量的大体积药物(bulk drug)产生更多的治疗剂量。在具体实施方案中，与当用作单一治疗时病毒对药物的敏感性相比，所述组合将流感病毒的一种或多种毒株对至少一种抗病毒药剂的敏感性增加至少2-倍，5-倍，10-倍，20-倍，50-倍，或100-倍。例如，当药物在用作单一治疗时通过体外检测确定具有1.0μg/ml针对流感病毒的EC50，且在于两种其他抗病毒药剂组合使用时具有0.01μg/ml或更低的EC50时，据说所述组合将所述流感病毒针对该药物的敏感性增加至少100-倍。优选地，该组合中的两种或所有三种药物的敏感性提高至少2-倍，5-倍，10-倍，20-倍，50-倍，或100-倍。下述实施例1B描述了一种体外测定法，其用于确定使用H3N2流感毒株可以确定药物敏感性增加多少。相同的测定法可以用来测量药物针对其他流感毒株的敏感性。在不存在协同作用时，由于在该组合内的每种药物的附加贡献和该组合的整体功效，无附加的毒性，所以抗病毒药组合可以仍旧是有益的。
与先前的单一治疗相比，使用三联组合显著减少产生耐药毒株的可能性。这在治疗以流行性或局部爆发的流感中特别有利。此外，三联组合可以用来治疗感染或出于暴露于耐药流感病毒的危险的人患者。由于快速的病毒基因分型在实时基础上对于临床医生不总是可行，允许基于抗性模式选择合理的药物，本发明提供甚至在没有这些数据的情形中提供宽泛和有效的抗病毒范围。在具体实施方案中，耐药流感病毒耐受所用的组合中的一种药物。令人惊讶地，与除了排除作为单一治疗时病毒耐受性的药物的相同治疗相比，用该三联组合治疗提供更高的针对该耐药病毒的抗-流感作用。使用标准医学方法来评估患者感染或处于暴露于耐药病毒的可能性(例如，通过CDC健康警告(CDC Health Alerts)等的指导)。
优选地，在该组合中的每种药物在流感病毒生命周期的不同时期有活性。例如，流感病毒吸附抑制剂和M2抑制剂在生命周期的开始有活性；IMP脱氢酶抑制剂和RNA聚合酶抑制剂在生命周期的中期有活性；且干扰寡核苷酸和神经氨酸酶抑制剂在生命周期的末期有活性。
流感病毒吸附抑制剂的实例包括血凝素-特异性单克隆抗体(参见，例如Palladino等，J Virol.(病毒学杂志)(1995)69：2075-81)，polyoxometalates(参见，例如Shigeta等，Antimicrob Agents Chemother.(抗微生物药剂化学治疗)(1997)41：1423-7)，硫酸化的多糖，唾液酸酶融合蛋白(例如Fludase)，和唾液酸的O-糖苷(参见例如Guo等，Glycobiology(糖生物学)(2002)12：183-90)。这些和其他流感吸附抑制剂在本领域中是已知的(参见，例如，Combating the Threat Of Pandemic Infuenza：DrugDiscovery Approaches(同流行性流感的威胁作战：药物发现方法)，Ed.PaulF.Torrence，John Wiley和Sons Ltd(2007)，其通过引用结合于此)。
M2抑制剂的实例包括氨基金刚烷化合物，如金刚烷胺(1-氨基-金刚烷)，金刚乙胺(1-(1-氨基乙基)金刚烷)，螺[环丙烷-1，2′-金刚烷]-2一胺，螺[吡咯烷-2，2′-金刚烷]，螺[哌啶-2，2′-金刚烷]，2-(2-金刚烷基)哌啶，3-(2-金刚烷基)吡咯烷，2-(1-金刚烷基)哌啶，2-(1-金刚烷基)吡咯烷，和2-(1-金刚烷基)-2-甲基-吡咯烷；和M2-特异性单克隆抗体(参见，例如US 20050170334；和Zebedee和Lamb，J Virol.(病毒学杂志)(1988)62：2762-72)。在优选实施方案中，在所述三联组合中的一种抗病毒药剂是金刚烷胺或金刚乙胺。
IMP脱氢酶抑制剂的实例包括利巴韦林，viramidine(利巴韦林的前药)，和美泊地布(merimepodib)(VX-497；参见例如Markland等，Antimicrob Agents Chemother.(抗微生物药剂化学治疗)(2000)44：859-66)。
当用于本文时，术语RNA聚合酶抑制剂是指抑制聚合酶、蛋白酶、和/或病毒RNA聚合酶复合物或其一个亚基(即，PB1，PB2和PA)的内切核酸酶活性的抗病毒药剂。示例性的RNA聚合酶抑制剂包括抗病毒核苷类似物如利巴韦林，viramidine，6-氟-3-羟基-2-吡嗪酰胺(T-705)，2′-脱氧-2′-氟鸟苷，吡唑呋林，3-脱氮杂鸟嘌呤，卡波啶(参见，例如Shannon等，Antimicrob Agents Chemother.(抗微生物药剂化学治疗)(1981)20：769-76)，和环penenyl胞嘧啶(参见，例如Shigeta等，Antimicrob Agents Chemother.(抗微生物药剂化学治疗)(1988)32：906-11)；和内切核酸酶抑制剂flutimide(参见，例如Tomassini等，Antimicrob Agents Chemother.(抗微生物药剂化学治疗)(1996)40：1189-93)。在优选实施方案中，三联组合中的一种抗病毒药剂是利巴韦林或viramidine。
流感-特异性干扰寡核苷酸的实例包括siRNAs(参见，例如Zhou等，Antiviral Res.(抗病毒研究)(2007)76：186-93)，反义寡核苷酸，磷硫酰寡核苷酸，核酶(参见，例如Draper的美国专利号6,258,585)，吗啉代寡聚体和肽核酸(参见，例如Schubert和Kurreck，Handb Exp Pharmacol.(2006)173：261-87)。
神经氨酸酶抑制剂的实例包括奥塞米韦，奥塞米韦羧酸盐(GS4071；参见，例如Eisenberg等，Antimicrob Agents Chemother.(抗微生物药剂化学治疗)(1997)41：1949-52)，扎那米韦，peramivir(RWJ-27021；BXC-1812，BioCryst)，2，3-二脱氢-2-脱氧-N-乙酰基神经氨酸(DANA)，2-脱氧-2，3-脱氢-N-三氟乙酰基神经氨酸(FANA)，A-322278，和A-315675(参见Maring等的美国专利号6,455,571，和Kati等，Antimicrob AgentsChemother.(抗微生物药剂化学治疗)(2002)46：1014-21)。在优选实施方案中，三联组合中的一种抗病毒药剂是奥塞米韦，peramivir，或扎那米韦。
在一个实施方案中，第一抗病毒药剂是M2抑制剂，优选金刚烷胺；第二抗病毒药剂是抗病毒核苷类似物，优选是利巴韦林或viramidine；且第三抗病毒药剂是神经氨酸酶抑制剂，优选是奥塞米韦或扎那米韦。在另一实施方案中，第一抗病毒药剂是金刚烷胺或金刚乙胺；第二抗病毒药剂是利巴韦林或viramidine，且第三抗病毒药剂是奥塞米韦，奥塞米韦羧酸盐，peramivir或扎那米韦。
利用适合特定药剂的一种或多种施用途径(例如，口服，肠胃外，通过吸入，经皮，鼻内，胃施用(例如，通过G-，NG-，J-，等饲管)，等等)施用所述组合的每种抗病毒药剂。在不同实施方案中，制备所述抗病毒药剂用于口服施用和/或胃施用(例如，通过饲管)，作为液体、糖浆、混悬液、片剂、胶囊、胶囊中的珠、或香囊剂中的珠。在一些实施方案中，至少一种抗病毒药剂通过一种施用途径(例如，肠胃外)施用，且至少一种抗病毒药剂通过备选的施用途径(例如，口服或通过吸入)进行施用。
在口服给药实施方案中，一种或多种抗病毒药剂可以以立即释放(IR)或延长释放(ER)形式提供。ER剂型(在本领域中还称为″控释″，″缓释″，和″改进释放″剂型)的制备是公知的。适当的M2抑制剂ER剂型记述在USSN 11/285,905和USSN 11/399,879中，二者皆授予Went等，其内容通过引用结合于此。抗病毒药剂可以作为独立的制剂、同时、或顺序地施用。备选地，两种或多种抗病毒药剂可以提供为单一剂型的组合组合物。
当治疗表现出呕吐和/或腹泻症状的患者中的确定的流感病毒感染时，特别优选肠胃外施用，因为口服施用在迅速获得需要的抗病毒药剂血浆浓度方面可能不是有效的。优选地，肠胃外施用选自静脉内输注，静脉内注射，或肌内注射。最优选静脉内输注。用于肠胃外施用的优选的试剂盒包括M2抑制剂(金刚烷胺或金刚乙胺)，抗病毒核苷类似物(利巴韦林或viramidine)，和任选地神经氨酸酶抑制剂(奥塞米韦，奥塞米韦羧酸盐，或扎那米韦)，其与处于单一药物组合物中的药用载体一起肠胃外施用。在其他实施方案中，M2抑制剂，抗病毒核苷类似物，和任选的神经氨酸酶抑制剂，作为独立的剂型肠胃外施用。在一些实施方案中，M2抑制剂、抗病毒核苷类似物、和神经氨酸酶抑制剂(如果存在)中的至少一种，最初以冻干组合物形式提供，其在肠胃外施用之前用药用载体重构。在一些实施方案中，M2抑制剂，抗病毒核苷类似物、和神经氨酸酶抑制剂(如果存在)，每一种最初提供在独立的容器中，且此后在肠胃外施用之前与药用载体组合。在一些实施方案中，一种所述抗病毒药剂可以以冻干形式提供，其通过其他抗病毒药剂中的一种的液体制剂重构。
所述三联组合中每种药物的血浆浓度优选维持在需要的Cmin和Cmax之间连续至少24，48，72，96，120，144，或168小时。利用常规临床试验来确定不同给药方案的患者群体的平均Cmin，Cmax，和Cmean血浆浓度。该治疗法的持续时间典型治疗5-10天，或直到病毒已从患者清除。对于预防，抗病毒药剂的日常剂量典型地是治疗所用的50％，且在两或更多周的疗程中施用，典型地多至约6周或更多周，直到感染的危险降低。
本发明还在下文关于下述进行例证：特定抗病毒药剂和抗病毒药剂组合的使用，和它们所用的剂量和浓度。下文未进一步例证的其他抗病毒药剂合适的剂量和浓度可以利用参考文献中可用的信息或通过常规实验，诸如在下述实施例中所述的和在本领域中通常是已知的，进行确定。
在本发明的具体实施方案中，所述三联组合的第一抗病毒药剂是金刚烷胺或金刚乙胺，其以维持金刚烷胺或金刚乙胺的血浆浓度在0.05μg/ml(Cmin)-5.0μg/ml(Cmax)，优选0.1-3.0μg/ml，更优选0.1-1.5μg/ml，且最优选0.3-1.5μg/ml持续至少48小时的量施用给患者。可以通过以5-500mg/天，20-250mg/天，100-800mg/天，100-600mg/天，200-700mg/天，或200-500mg/天的量肠胃外或口服施用金刚烷胺或金刚乙胺而获得需要的血浆浓度。金刚乙胺特别优选的日常口服剂量在约50-400mg/天，75-300mg/天，100-250mg/天，或100-200mg/天的范围内。
在一些实施方案中，示例性的金刚烷胺和金刚乙胺口服剂型包含至少约25，50，75，100，125，150，175或200mg/剂型且多至约75，100，125，150，175，200，225，250，275，300，350，或400mg/剂型。对于预防或治疗，每天可以施用一个、两个、三个或四个所述剂型一或两次。得到的日常剂量可以为至少25，50，75，100，125，150，175或200mg/天且多至约和多至约75，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350，400，450，500，550，600，650，700，750或800mg/天。在一个示例性治疗中，患者每12小时(即BID)自我施用两个125mg的金刚烷胺ER单位剂型(例如，胶囊或片剂)，总共约500mg/天金刚烷胺，典型地如下述与利巴韦林组合摄取。还在该实施例中，预防剂量是一个125mg ER剂型BID。
对于200mg/天或更多的金刚烷胺或金刚乙胺的口服施用，优选ER制剂，因为他们允许更低的Cmax/Cmin比例，由此最优化M2抑制剂浓度保持高于ED50的时间，同时最小化毒性。在优选的ER剂型中，金刚烷胺或金刚乙胺具有1小时内小于约70wt.％，2小时内小于约90wt.％，6小时内大于约40wt.％且12小时内大于约85wt.％的体外溶解模式，如使用USP 2型(搅拌器)溶解系统以50rpm，在温度37±0.5℃用500ml水作为溶解介质测量的。进一步优选的是金刚烷胺或金刚乙胺的ER制剂，其具有如上述测量的1小时内小于20wt％，2小时内小于约50％，6小时内大于约40％，且12小时内大于约90％的体外溶解模式。溶解的这种减少可以有利地减少在活性剂的血浆浓度方面剂量之间的可变性或提高活性剂的耐受性，特别是当施用是BID或QD时。在某些实施方案中，金刚烷胺或金刚乙胺处于口服剂型中，且具有至少4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20小时的Tmax。
在具体实施方案中，患者通过静脉内输注以1-50mg/小时，3-40mg/小时，或5-30mg/小时的速率连续至少48，72，或96小时施用金刚烷胺。
在本发明的一个实施方案中，所述三联组合的第二抗病毒药剂是利巴韦林或viramidine。在优选实施方案中，利巴韦林或viramidine与以上文提及的量的金刚烷胺或金刚乙胺一起施用。利巴韦林或viramidine以这样的量施用给患者，所述量获得0.1μg/ml(Cmin)-10.0μg/ml(Cmax)，0.5-8μg/ml，0.5-5μg/ml，1-6μg/ml，1-4μg/ml，2-6μg/ml，2-4μg/ml，0.01-2μg/ml，或0.2-2.0μg/ml的血浆浓度连续至少48，72，或96小时。需要的血浆浓度可以通过以50-2400mg/天，50-2000mg/天，50-1600mg/天，100-1200mg/天，400-800mg/天，50-600mg/天，75-500mg/天，或75-200mg/天的量肠胃外或口服施用利巴韦林获得。在优选实施方案中，利巴韦林或viramidine以低日常剂量施用，所述剂量在与金刚烷胺或金刚乙胺和神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦、peramivir、或扎那米韦组合施用时具有相加的或协同作用。所述低剂量典型地为约10-800mg/天，25-600mg/天，50-600mg/天，且优选约75-500mg/天。在一个示例性治疗中，患者自我施用一个160mg利巴韦林单位剂型BID，总共320mg/天利巴韦林。
在具体实施方案中，利巴韦林或viramidine以至少约10，25，30，40，50，75，100，125，150，175或200mg/剂型和多至约150，175，200，250，300，350，400，450或500mg/剂型的量口服施用。对于预防或治疗，一个、两个、三个或四个所述剂型可以每天施用一次或两次。得到的日常剂量可以为至少10，25，30，40，50，75，100，125，150，175或200mg/天和多至约100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，1200，1600，或2000mg/天。在一个示例性的治疗中，患者自我施用2×200mg剂型BID，总共约800mg/天。此外，在该实施例中，预防剂量是1×200mg剂型BID。
利巴韦林或viramidine(和任选地所述其他抗病毒药剂中的一种或两种)可以在开始时以负载剂量的量施用，且此后以日常维持剂量的量施用，其中所述负载剂量的量是所述日常维持剂量的量的约1.5-约3倍。所述负载剂量可以通过与随后的维持剂量相同或不同的途径施用。所述负载剂量优选地通过肠胃外或口服施用，且最优选通过肠胃外施用。优选地，所述负载剂量作为静脉内输注、静脉内注射、或肌内注射施用。利用静脉内输注，所述负载剂量可以通过在输注给患者的第一静脉内包中使用更高浓度的抗病毒药剂获得。备选地，初始静脉内输注包可以与随后的静脉内包具有相同浓度的活性剂，但是以增加的输注速率(例如，3-6小时相比于8小时)施用。
在具体实施方案中，患者通过静脉内输注以5-200mg/小时，10-150mg/小时，15-100，或20-80mg/小时的速率连续至少48，72，或96小时施用利巴韦林或viramidine。
在本发明的一个特定的实施方案中，在耐受金刚烷胺或奥塞米韦单一治疗的流感病毒治疗中，利巴韦林或viramidine与金刚烷胺和奥塞米韦一起施用。
在本发明的一个实施方案中，所述三联组合的第三抗病毒药剂是神经氨酸酶抑制剂，其选自由下列各项组成的组：奥塞米韦，奥塞米韦羧酸盐，扎那米韦，和peramivir。奥塞米韦和扎那米韦是特别优选的。所述神经氨酸酶抑制剂，优选奥塞米韦或扎那米韦，以这样的量施用给患者，所述量获得0.001-5μg/ml，0.02μg/ml-5μg/ml 0.1-3μg/ml，0.1-1μg/ml，0.3-3μg/ml，0.3-1μg/ml，0.001-0.1μg/ml，或0.0001-0.01μg/ml的血浆浓度连续至少48，72，或96小时。需要的血浆浓度可以通过以10-150mg/天，10-50mg/天，50-100mg/天，75-150mg/天，150-300mg/天，或100-500mg/天的量肠胃外或口服施用奥塞米韦获得。扎那米韦典型地以25-150mg/天，优选40-100mg/天的量施用。
在优选实施方案中，所述神经氨酸酶抑制剂以低日常剂量施用，所述剂量在与金刚烷胺和利巴韦林或viramidine组合施用时具有相加的或协同作用。在具体实施方案中，当在患者中维持血浆浓度为0.15-1.5μg/ml金刚烷胺，0.0001-0.01μg/ml奥塞米韦，和0.6-6μg/ml利巴韦林持续至少48，72，或96小时时获得协同作用。获得这些血浆浓度的具体剂量利用常规计算确定且通过临床试验验证。奥塞米韦的低剂量典型地为约1-50mg/天，优选约1-25mg/天，且更优选约2.5-10mg/天。在一个示例性的治疗中，患者自我施用单位剂型的25mg奥塞米韦，以QD或BID摄入。在优选实施方案中，在任何上述剂量中的奥塞米韦与任何上述量的金刚烷胺和利巴韦林组合摄入。在具体实施方案中，25mg的奥塞米韦以QD或BID与160mg金刚烷胺和160mg利巴韦林(以独立的单位剂型，或以组合的单位剂型)一起摄入，所述金刚烷胺和利巴韦林也以QD或BID摄入。在另一个具体的实施方案中，75mg奥塞米韦以QD或BID与100mg金刚烷胺QD或BID和600mg利巴韦林QD或BID摄入。
在具体实施方案中，患者通过静脉内输注以0.1-20mg/小时，0.4-7mg/小时，1-7mg/小时，1-5mg/小时，或2-7mg/小时的速率连续至少48，72，或96小时施用奥塞米韦。需要的扎那米韦血浆浓度可以通过以5-250mg/天，10-200mg/天，或25-150mg/天的量肠胃外施用获得。在具体实施方案中，患者通过静脉内输注以0.1-10mg/小时，0.4-7mg/小时，或1-5mg/小时的速率持续至少48，72，或96小时施用扎那米韦。
在具体实施方案中，患者以1-75mg/天，1-50mg/天，1-25mg/天，10-150mg/天，50-100mg/天，75-150mg/天，或150-300mg/天的量口服施用奥塞米韦。在不同的实施方案中，如果存在，按照本发明施用的奥塞米韦的量可以是至少约1，2，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，75，80，90，100，110，120，130，140或150mg/剂型和多至约75，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190或200mg/剂型。对于预防或治疗，一个、两个、三个或四个所述剂型可以每天施用一次或两次。得到的日常剂量可以为至少1，2，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，75，80，90，100，110，120，130，140或150mg/天和多至约75，100，120，140，150，160，180，200，220，240，250，260，280或300mg/天。在一个示例性的治疗中，患者自我施用75mg剂型BID，总共约150mg/天；对于预防，剂量为75mg，每24小时摄入一次(QD)。
除了三联抗病毒治疗，患者可以给予辅助治疗，以加强天然抗病毒反应。示例性的辅助治疗包括用下列各项的治疗：干扰素、聚乙二醇化的干扰素、维生素D(参见，例如，Cannell等，Epidemiol Infect.(2006)134：1129-40)，香叶基香叶基丙酮(参见，例如，Unoshima等，AntimicrobAgents Chemother.(抗微生物药剂化学治疗)(2003)47：2914-21)，聚ICLC(参见，例如，Wong等，Antimicrob Agents Chemother.(抗微生物药剂化学治疗)(1995)39：2574-6)，
Figure G2008800158516D00191
和CpG-寡脱氧核苷酸(参见，例如，Lopez等，Vet Immunol Immunopathol.2006年11月15日；114(1-2)：103-10)。所述辅助治疗可以特别有益于预防流感。然而，对于活性流感传染的治疗，可能需要避免某些辅助治疗(例如，干扰素治疗)。相反，抗病毒药剂可以与抗-免疫/抗-炎性治疗诸如皮质类固醇(例如，甲泼尼龙，氢化可的松，等)或他汀(例如，阿托伐他汀，辛伐他汀，等)联合使用，以减少“细胞因子爆发(cytokine storm)”的可能性。
本发明的另一个方面是一种组合物及其在治疗或预防人患者的流感中的应用。在不同的实施方案中，制备组合物用于口服、肠胃外、或胃施用(例如，通过饲管)，作为液体、糖浆、混悬液、片剂、胶囊、胶囊中的珠、或香囊剂中的珠进行施用。
在具体实施方案中，所述组合物在用于口服、胃、或肠胃外施用的单一剂型中包括金刚烷胺或金刚乙胺，和利巴韦林或viramidine，和任选地奥塞米韦。在具体实施方案中，单一剂型包括与处于任意上述指定量的利巴韦林(即，25，50，75...500mg)和任选地处于任意上述指定量(即，25，30，40...200mg)的奥塞米韦组合的处于任意上述指定量(即，25，50，75...300mg)的金刚烷胺。在一个实施方案中，所述组合物包括利巴韦林和ER金刚烷胺的组合，其优选地具有如上述的体外溶解模式和/或Tmax。
在一个实施方案中，所述组合物包括10-60重量百分数(wt.％)，25-50wt.％，或50-75wt.％的金刚烷胺或金刚乙胺；和30-80wt.％，50-75wt.％，或25-50wt.％的利巴韦林或viramidine，其中所述重量百分数是基于该组合物中活性剂的总重。所述组合物还可以包括0.5-30wt.％奥塞米韦。在优选实施方案中，所述组合物包含这样的量的金刚烷胺和利巴韦林，其在与神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦，peramivir，或扎那米韦用于三联组合中用于流感的治疗或预防时表现出如上述的相加或协同作用。
对于肠胃外施用，所述组合物可以采用包含在小瓶中的冻干粉末或无菌液体形式。所述小瓶可以适配橡胶隔片，以允许注射器进入从而重构或吸出小瓶内容物。
对于口服施用，所述组合物可以处于单位剂型中，诸如胶囊或片剂。用于口服施用的一个示例性的单位剂型在片剂或胶囊中包括任选地采用ER形式的25-125mg或150-300mg金刚烷胺，，和50-200mg利巴韦林。本发明的一种剂型包括160mg ER金刚烷胺HCL和120mg IR利巴韦林。另一种示例性的剂型是包括160mg金刚烷胺和160mg利巴韦林，和75mg奥塞米韦的胶囊。
本发明的另一个方面是一种试剂盒，其包括M2抑制剂(例如，金刚烷胺或金刚乙胺)，抗病毒核苷类似物(例如，利巴韦林或viramidine)和任选地神经氨酸酶抑制剂(例如，peramivir，扎那米韦，或奥塞米韦)。在所述试剂盒中的抗病毒药剂可以以共同包装在一起的独立的剂型提供，因为这可以最大化可以将适当治疗量施用给需要其的受试者的容易性。
在具体实施方案中，试剂盒包括香囊剂，其包含一种或多种活性剂。所述香囊剂可以包含适于口服、肠、或胃施用(例如，通过G-，NG-，或J-管).的单位剂量的量的活性剂的珠。
当提供为用于口服施用的试剂盒时，所述抗病毒药剂可以提供在泡眼包装(blister pack)中。单个泡眼可以包含一种抗病毒药剂，或两种，或所有三种。当提供为泡眼包装时，优选将以每一给药时间间隔提供的抗病毒药剂独立标识，----这可以这样实现：通过将用于每次剂量的所有剂型提供在单一泡眼中，或如果包装在独立的泡眼中，包含用于每次剂量的剂型的泡眼可以分组或标识为一组，例如，通过在泡眼周围印刷。典型地，所述试剂盒包括使用说明。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括一个或多个在第一包装中的M2抑制剂(例如，金刚烷胺)和抗病毒核苷类似物(例如，利巴韦林)的容器，和在第二独立包装中的神经氨酸酶抑制剂。例如，所述试剂盒可以包括共同包装在第一泡眼包装中的金刚烷胺和利巴韦林，和在第二泡眼包装中的75mg奥塞米韦胶囊。所述试剂盒可以通过共同包装
Figure G2008800158516D00211
泡眼包装和包括利巴韦林和金刚烷胺的泡眼包装而制备。在本发明的另一种试剂盒中，大量供应的
Figure G2008800158516D00212
(例如，政府储备)用作奥塞米韦的来源。
Figure G2008800158516D00213
胶囊的内含物被倒空，任选地重新检测保存期稳定性，然后以少于75mg/胶囊(例如，10，25，35，50mg)的量重新封装，且与相加或协同量的利巴韦林和金刚烷胺共同包装。延长奥塞米韦的保存期且减少治疗或预防流感所需要的日常剂量具有极大扩充抗病毒治疗流行性流感的政府储备的益处。
在一个实施方案中，试剂盒包括提供为多个独立口服剂型的金刚烷胺和利巴韦林，其中每一金刚烷胺剂型包括75-250mg金刚烷胺，并且每一利巴韦林剂型包括50-400mg利巴韦林。在具体实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个泡眼包装，其包括包含处于延长释放剂型中的125mg盐酸金刚烷胺的一个或多个剂型，和包含200mg利巴韦林的一个或多个剂型。在所述包装中的泡眼可以排列或市售，以便每种类型的剂型中的一种应该每天施用一次或两次。备选地，在泡眼中的剂型可以这样排列，以指示一个金刚烷胺剂型应该每天施用两次，且一个利巴韦林剂型应该每天施用一次，或在泡眼中的剂型可以这样排列，以指示两个金刚烷胺剂型和一个利巴韦林剂型应该每天施用一次。任选地，泡眼包装可以设置为包括一个或多个相似设置的包括75mg奥塞米韦的剂型，或市售以每天施用一次或两次。附图的图1和2举例说明代表性的构型。备选地，所述试剂盒可以这样安排，以最优化其与商购神经氨酸酶抑制剂(例如，)联合使用的便利性。
在另一个实施方案中，可以提供这样的试剂盒，其包括一个或多个泡眼包装，其中每个泡眼包装包括一组或多组泡眼，且在每组泡眼内，一个泡眼包含包括60-300mg处于延长释放制剂中的金刚烷胺的一个或两个片剂或胶囊剂型，且一个泡眼包含一个或两个包括25-200mg利巴韦林的片剂或胶囊剂型。在泡眼包装内的组数或试剂盒内提供的组数可以在1-约5，7，10，14，15，20，21，28，30，40，42或60之间变化。任选地，所述试剂盒包括关于每天施用一次或两次的使用说明。
用于口服施用金刚烷胺与利巴韦林的另一种示例性的试剂盒包括处于立即释放或延长释放形式的80mg，180mg，或330mg金刚烷胺的单位剂型；和330mg或660mg利巴韦林的单位剂型。在一种示例性的治疗中，给患者施用660-2400mg RBV和360-660mg金刚烷胺作为第一剂量(例如，第一天AM)；此后(例如，第二天AM-第十天)，给患者施用660-1320mg RBV和180-660mg金刚烷胺，每天一次(QD)。
当提供为用于肠胃外治疗的试剂盒时，所述组合中的两种或多种抗病毒药剂以适于肠胃外施用的形式提供。例如，抗病毒药剂可以单独配制或共同配制，且填充到适当的容器如注射器、安瓿、或小瓶中。活性剂可以以冻干组合物的形式提供在容器中，且在肠胃外施用之前用药用载体重构。在其他实施方案中，活性剂可以以液体形式提供在容器中，其可以不必稀释而施用(例如，用于静脉内或肌内推注施用(bolusadministration))，或备选地添加到静脉内输注包中。在一些实施方案中，一种抗病毒药剂可以以冻干形式提供，在施用给患者之前，将其用试剂盒中提供的液体形式的另一种抗病毒药剂重构。在一些实施方案中，M2抑制剂(例如，金刚烷胺或金刚乙胺)，抗病毒核苷类似物(例如，利巴韦林或viramidine)，和神经氨酸酶抑制剂(例如，奥塞米韦，扎那米韦，或peramivir)，如果存在的话，每一种处于独立的容器中，且此后在肠胃外施用之前与药用载体组合所述活性剂。每一容器可以包含单位剂量的活性剂，且每个试剂盒可以具有充足数目的容器，以治疗个体患者至少12，24，48，或72小时。试剂盒可以具有关于一种或多种活性剂的负载剂量的独特标记的容器，具有指示所述独特标记的容器是在开始患者治疗时使用的第一个容器的说明书。或者，负载剂量可以分开包装，且可以具有关于使用的独立说明书。用于口服治疗的示例性试剂盒在下述实施例5-9中进一步详述。用于肠胃外施用的示范性试剂盒在下述实施例11中描述。实施例1A：在烧瓶中培养的A/Albany/1/98(H3N2)感染的MDCK细胞中，单一的和二联和三联组合中的金刚烷胺、奥塞米韦、和利巴韦林的抗病毒活性的剂量响应研究
我们进行这样的实验，其设计为评估金刚烷胺，奥塞米韦，和利巴韦林组合在抑制A/Albany/1/98(H3N2)病毒复制中的剂量响应抗病毒活性。实验的目的是证明与没有药物相比的病毒负荷的减少、和与单一治疗相比的二联和三联组合的协同作用。
在使用每种药物作为单一治疗的剂量范围研究中证明关于每种药物的EC25，EC50，和EC75(此处，例如，EC50，是在72小时减少50％的病毒的药物浓度)。简言之，利用先前所说的方法(Smee等，Chemotherapy(化学治疗)(2002)48：88-93)，将处于不同剂量的化合物添加到在烧瓶中生长的MDCK细胞中。在加入药物后30分钟，向每个孔中加入处于0.001PFU/细胞的感染复数的病毒。在～24-78小时后，去除每个孔的细胞外病毒介质，在3,200g离心5分钟，且滴定病毒。结果提供在表1A中。
表1A
  药物   抑制水平   体外C   靶点血清C
  金刚烷胺   EC25   0.054μg/ml   0.288μm
  金刚烷胺   EC50   0.091μg/ml   0.480μm
  金刚烷胺   EC75   0.153μg/ml   0.815μm
  奥塞米韦   EC25   0.025ng/ml   0.080nM
  奥塞米韦   EC50   0.050ng/ml   0.160nM
  奥塞米韦   EC75   0.075ng/ml   0.240nM
  利巴韦林   EC25   0.310μg/ml   0.760μM
  利巴韦林   EC50   0.420μg/ml   1.030μM
  利巴韦林   EC75   0.615μg/ml   1.500μM
检测单一的和处于所有可能的二联和三联组合对于组织培养物中的病毒复制的相加和/或协同作用关于每种药物的EC25，EC50，和EC75浓度，总共检测了64种条件(即，无药物，9种单一治疗，27种二联组合治疗，和27种三联组合治疗)。简言之，在烧瓶中生长MDCK细胞为单层，向培养物中加入药物，且通过以0.001PFU/细胞的感染复数(MOI)(即，感染病毒颗粒与被感染的细胞数目的比例)引入A/Albany病毒而感染细胞。培养物维持～48小时，或直到在单层中致细胞病变作用变得明显。在离心后，将上清作为3×500μl等分试样保存在-70℃，用于TCID50，PFU，和NA分析，和作为1×200μl用于QPCR。
如果对病毒复制的实际抑制大于利用Prichard等(AntimicrobAgents Chemother(抗微生物药剂化学治疗)(1993)37：540-545)所述的MacSynergy II软件计算的抑制，则确定药物组合是协同作用的。使用金刚烷胺与利巴韦林和金刚烷胺与奥塞米韦的二联组合，在将在人中导致较低不利副作用的足够低的浓度，观察到强协同作用。另外，与处于EC25和EC50的金刚烷胺的三联组合在将最小化或避免副作用的浓度表现出强协同作用。
实施例1B：在A/Sydney/05/97H3N2感染的MDCK细胞中，金刚烷胺，奥塞米韦和利巴韦林组合的抗病毒活性剂量响应研究
本研究的目的是证明与无药物相比，金刚烷胺、奥塞米韦和利巴韦林的三联组合减少病毒负荷，且与单一治疗相比表现出协同作用。除了下述之外，所用的方法与实施例1A中所用的方法相同。
MDCK细胞在96-孔板中生长为单层，且通过引入处于0.01PFU/细胞的MOI的A/Sydney/05/97H3N2病毒进行感染。以216种可能的组合中的每一种以下述浓度加入药物：金刚烷胺，处于0，0.032，0.1，0.32，1.0，和3.2μg/ml；奥塞米韦，处于0，0.001，0.0032，0.01，0.032，和0.1μg/ml；和利巴韦林，处于0，0.032，0.1，0.32，1.0，和3.2μg/ml。
利用Prichard和Shipman(1990)，同前所述，和Prichard等(1993)，同前所述中所示的三维分析方法来显现上述图5中所示的数据。与利巴韦林或奥塞米韦二联组合的金刚烷胺表现出协同作用，而奥塞米韦与利巴韦林的二联组合没有协同作用。在下述浓度范围观察到协同作用：金刚烷胺，处于0.1-1μg/ml；利巴韦林，处于0.032-1.0μg/ml；和奥塞米韦，处于0.001-0.032μg/ml。这些浓度对应于约50-200mg金刚烷胺，200-600mg利巴韦林，和2.5-25mg奥塞米韦的人日常剂量。在高于1μg/ml的金刚烷胺浓度没有表现出协同作用，这是由于检测测定法的局限性(即，存在病毒负荷的完全抑制)。
该实验进一步证明三种药物在组合使用时的协同相互作用。在三联组合中使用时，与作为单一治疗使用的每种药物相比，病毒对每种药物的敏感性提高10-至超过100-倍。例如，使用处于1μg/ml浓度的金刚烷胺的单一治疗导致病毒负荷约60％的减少，而使用处于0.1μg/ml的金刚烷胺与0.01μg/ml奥塞米韦和0.32μg/ml利巴韦林组合获得大约相同的病毒负荷减少，这证明对金刚烷胺的敏感性增加10-倍。使用处于0.1μg/ml浓度的奥塞米韦的单一治疗导致病毒负荷约50％的减少，而处于0.001μg/ml的奥塞米韦与0.32μg/ml金刚烷胺和0.32μg/ml利巴韦林组合导致病毒负荷约65％的减少，这证明对奥塞米韦敏感性增加超过100-倍。使用处于1μg/ml和3.2μg/ml浓度的利巴韦林的单一治疗分别导致病毒负荷约10％和95％的减少，而处于0.032μg/ml的利巴韦林与0.32μg/ml金刚烷胺和0.01μg/ml奥塞米韦组合导致病毒负荷减少约95％，这证明对利巴韦林敏感性增加100-倍。
实施例1C：在体外动力学测定中确定单一和组合治疗的功效的研究
本研究的目的是在A型流感/Victoria/3/75(H3N2)病毒感染的体外动力学模型中评估金刚烷胺，奥塞米韦，和利巴韦林作为单一药剂和组合的抗病毒功效。通过由CCID50和qPCR测量的病毒负荷的减少和由病毒检查确定的对病毒致细胞病变作用(CPE)的抑制而评估功效。第二个目的是确定最佳感染剂量和对于作为单一药剂和组合的每种药物的适当的给药范围。
治疗组在表1C中列出。每组检测两次，且在MDCK和SIAT-1细胞系中进行。
表1C：研究设计
Figure G2008800158516D00251
Figure G2008800158516D00261
a每组检测两次，且在MDCK和SIAT-1细胞系中进行。
将MDCK和SIAT-1细胞以4×105细胞/mL的细胞密度接种在T25烧瓶中的生长培养基中，总共5mL。允许细胞附着在烧瓶上过夜，且次日检查烧瓶以验证细胞为～70％汇合。用具有或不具有药物的5mL感染培养基洗涤细胞一次。
在T＝0时，烧瓶用A/流感/3/75(H3N2)以～101CCID50/ml的感染剂量进行感染。2小时后，去除培养基，且将细胞用具有药物的5mL感染培养基洗涤一次。弃掉洗涤培养基，加入5mL具有药物的新鲜感染培养基。
在24小时，将烧瓶从培养箱中移出，且视觉检查CPE。CPE，为细胞存活力的指示，通过在0-4的等级计分烧瓶而进行定量评估，4为最大CPE。计分是％存活力的估算。100％死亡的烧瓶计分为4。75％死亡的烧瓶计分为3，50％＝2，25％＝1，和0％＝0。然后，从烧瓶中完全去除培养基，取得整分试样，且冷冻随后用于通过CCID50分析进行的病毒负荷定量。细胞单层用具有或不具有药物的5mL感染培养基洗涤两次，且加入5mL具有或不具有药物的新鲜感染培养基。然后将烧瓶放回培养箱。在T＝48，72，96，120，144，和168小时，重复该步骤。进行CPE评估，其在每个时间点为每种方案收集用于病毒负荷定量的样品。
在最后的时间点，将所有病毒负荷样品解冻，且通过CCID50分析确定关于每个时间点的病毒负荷。将MDCK细胞以4×105细胞/ml接种在384-孔板中，每孔体积为50mcL。允许细胞附着过夜。然后向板中加入50μl连续稀释的病毒，且将板放回到培养箱中。在第3和6天，从培养箱中移出板，视觉计分CPE。6天后，将板在-80℃冷冻准备用于桑格测序(Sanger sequencing)。
CCID50，其定义为50％的孔被感染的剂量，利用Karber算法(Karber，1931)进行计算，由下述方程给出：log CCID50＝L-d(S-0.5)，此处：L＝在检测中所用的最低稀释的对数；d＝在对数稀释步骤之间的差异；和S＝“阳性”检测的比例的总和(即，显示CPE的培养物)。
在不存在药物时，安慰剂组在SIAT-1和MDCK细胞系中在感染后48小时产生峰值病毒滴度。对于SIAT-1和MDCK细胞系，峰值病毒滴度相似，SIAT-1细胞在感染后48小时测量时在24小时的期间内产生6.75log10CCID50/0.05mL，MDCK细胞产生6.25log10CCID50/0.05mL。病毒似乎在SIAT中比在MDCK细胞中复制更快；在感染后24小时，对于SIAT，病毒滴度为4log10CCID50/0.05mL，对于MDCK细胞为2.25log10 CCID50/0.05mL。达到峰值后，在两种细胞系中病毒生产下降。可能地，病毒滴度的下降是由于所有的细胞均已被感染且被所述感染杀死。
在病毒负荷和细胞存活力之间存在良好的相关性，所有的细胞均在峰值病毒滴度的同时或之后不久死亡。例如，对于SIAT细胞，安慰剂组的峰值病毒负荷在48小时发生，且完全的细胞死亡(0％细胞存活力)在48小时时发生；对于MDCK细胞，峰值病毒负荷在48小时时发生，且完全的细胞死亡在72小时时发生。
在SIAT和MDCK细胞中，使用作为单一药剂的药物治疗在24小时给出剂量-依赖性的病毒负荷抑制。在24小时的时间点，与安慰剂组相比较，作为单一药剂的每种药物以高剂量在SIAT细胞中减少病毒负荷3-4logs，在MDCK细胞中减少2logs。对于作为单一药剂的所有三种药物，在24小时的时间点观察到的抑制不是持续不变的，可以在以后的时间点检测到高病毒滴度。因此，没有任何一种单一药剂治疗方案成功地完全抑制病毒复制，尽管在所有情形中，与安慰剂相比较，单一药剂治疗将病毒生产的峰值延迟24-48小时。
对于单一药剂方案的细胞存活力数据与病毒负荷数据一致：单一药剂治疗能够延迟，但不抑制细胞死亡率。在SIAT细胞中，所有单一药剂组在72小时具有完全的细胞死亡率，与安慰剂相比较，高剂量的每种药物将细胞死亡延迟24小时。在MDCK细胞中，与安慰剂相比较，单一药剂治疗将细胞死亡延迟最大48-72小时。关于细胞存活力，最好的单一药剂方案是0.5μg/mL剂量的金刚烷胺，其中直到感染后144小时才观察到明显的细胞死亡。
组合方案也表现出对病毒复制的剂量依赖性抑制。在SIAT细胞中，与安慰剂相比较，低剂量组合组将峰值病毒生产延迟24小时，且中剂量组合组将峰值病毒生产延迟48小时。在两组中，对于低和中剂量，病毒生产分别达到相对高的滴度：6.1和4.9log10CCID50/0.05mL，尽管作为时间函数的病毒负荷在测量的所有时间协同性减少超过2-倍。然而，高剂量组合组，将病毒生产完全抑制到不可检测的水平持续到在感染后168小时采集的最后时间点。与病毒生产的完全抑制一致，在高剂量组合组中的细胞还完全被保护免于细胞死亡，持续到在感染后168小时测量的最后时间点。给出这样的事实，即，在该方案下，在整个研究过程中，SIAT和MDCK细胞均为100％存活，可以推论所有三种药物的组合在测试的高剂量不是细胞毒性的，且对病毒生产的抑制是由于组合中药物的协同抗病毒作用，而不是人为的细胞毒性的结果。低和中组合剂量在SIAT细胞中分别将细胞死亡延迟24和96小时，且在MDCK细胞中分别延迟72和96小时。此外，在这些低病毒复制速率下，三联组合完全抑制耐药性的形成。
因此，三联组合可以导致流感病毒生长和耐药性的速率的协同性减少。更具体地，在使用M2抑制剂(例如，金刚烷胺)，神经氨酸酶抑制剂(例如，奥塞米韦，扎那米韦)和复制抑制剂(例如，利巴韦林)时，与金刚烷胺0.15-1.5μg/ml，奥塞米韦0.0001-0.01μg/ml，和利巴韦林0.6-6μg/ml的浓度范围相比，在生长速率中存在大于2-倍的协同性减少。
实施例2：金刚烷胺，奥塞米韦，和利巴韦林的三联组合对空心纤维系统中的野生型H3N2流感的作用
我们设计实验以利用先前所述的方法(Drusano等，AntimicrobAgents Chemother(抗微生物药剂化学治疗)(2002)46：464-470)来检测金刚烷胺，奥塞米韦，和利巴韦林的三联组合对空心纤维模型中的病毒复制的作用。药物，单一的和组合的，通过稳定状态的连续的输注以稳定状态的浓度递送168小时。简言之，108MDCK细胞生长在空心纤维中，且通过引入102感染流感病毒的细胞进行感染，其通过涂布在处于双重储蓄库空心纤维系统(dual reservoir hollow fiber system)中的细胞培养基中进行。检测了野生型A型/Albany(H3N2)毒株。维持培养物168小时。在T＝感染后24，48，72，96，120，144，和168小时，从空心纤维中去除样品，且进行滴定，以确定病毒滴度。在空心纤维的药物一侧，进行12个独立的实验，以检测表2所示的药物组合和浓度。
表2
Figure G2008800158516D00291
在不同时间点，将样品从空心纤维去除，以确定感染的病毒的数目。还通过桑格方法测序来自不同时间点的病毒，以确定NA，HA，和M2基因的序列。与使用单一药物治疗相比较，使用组合治疗时序列变化的减少表明三联组合抑制针对任一种药物的耐药性突变株的产生。
单独的金刚烷胺在低剂量具有可以忽略的作用，在高剂量在48小时滴度具有2-3log减少；单独的奥塞米韦在两种剂量均具有～1log减少；单独的利巴韦林在低剂量具有可以忽略的作用，且在高剂量在48小时具有～3log减少。所有三种药物的组合在低剂量在48小时导致滴度～8log减少，病毒生长4-log协同减少。所有三种药物的组合在高剂量在所有时间点导致协同性和完全的抑制(即，＞8logs)。因此，三联组合在下述浓度表现出协同性：金刚烷胺0.1-1μg/ml，奥塞米韦0.001-0.01μg/ml，和利巴韦林0.5-5μg/ml。这些浓度对应于约50-700mg金刚烷胺，200-2500mg利巴韦林，和2.5-10mg奥塞米韦的人日常剂量。
另外，关于金刚烷胺和奥塞米韦的单一治疗组导致明显的M2和NA耐药性的形成，而三联高剂量组不导致。
实施例3A：金刚烷胺，奥塞米韦，和利巴韦林的三联组合对治疗小鼠中的流感的作用
我们设计该实验来确定金刚烷胺，奥塞米韦，和利巴韦林三联组合在小鼠流感感染模型中的作用。
将雌性小鼠(17-18g)通过腹膜内注射(i.p.)用氯胺酮(100mg/kg)麻醉。在病毒激发前约12小时，通过皮下途径将包含金刚烷胺的Alzet渗透泵通过手术插入到小鼠的背部。在感染的时刻，将小鼠再用氯胺酮麻醉。它们用每只小鼠处于90-μl接种体积中的约2×104细胞培养物感染剂量(CCID50)的A/Victoria/3/75(H3N2)病毒鼻内(i.n.)感染。在感染前不久给予使用奥塞米韦和利巴韦林的第一口服治疗(通过管饲)，然后每天一次持续7连续日(以12小时的间隔)。存在通过口腔管饲接受水的20只安慰剂-处理的动物，和开始时每个药物-处理组12只小鼠。保持小鼠21天，以观察死亡，且每隔一天作为一组称重。
金刚烷胺通过Alzet泵以3mg/ml或10mg/ml施用，以分别递送4mg/kg/天或13mg/kg/天；奥塞米韦通过口腔管饲法以30mg/kg/天或10mg/kg/天施用；利巴韦林通过口腔管饲法以7mg/kg/天或21mg/kg/天施用。药物作为单一治疗或以六种可能的三联组合施用。
所有的单一治疗在防止死亡中针对感染均是高度有效的，例外的是3mg/ml的金刚烷胺和7mg/kg/天的利巴韦林。死亡的时间在这些剂量显著增加，且使用3mg/ml金刚烷胺27％的存活率(11只中有3只存活)显著不同于安慰剂对照。
所有的组合治疗防止死亡率达90-100％。这是未曾预料到的，这是基于下述事实：奥塞米韦单一治疗本身在10和30mg/kg/天提供92-100％的存活益处，以这些有效剂量的奥塞米韦是所有组合的成分。10mg/ml剂量的金刚烷胺同样是92％保护性的，因此使用该药剂的组合将同样是高度保护性的。
3mg/ml的金刚烷胺和7mg/kg/天的利巴韦林使得这些组中的足够多的小鼠死亡，以显示不同于安慰剂对照的死亡延迟。其他剂量的每种化合物是高度保护性的。组合中所用的化合物表现出与两种剂量的奥塞米韦或10mg/ml剂量的金刚烷胺相似的死亡模式。
所有的三联组合方案等价于或优于所有的单一治疗方案的事实表明，三种药物在组合中在测试的剂量不是拮抗性的。如果在该三种药物的任一种之间存在显著的拮抗性，预计三联组合将产生低于单一治疗的功效。
综上所述，存活数据对于评估通过使用组合的药物获得的益处没有用。然而，证明体重数据对于评估组合的化合物的益处是有用的。感染引起安慰剂组的体重严重下降。感染过程中的体重减少在10mg/ml金刚烷胺组中最小，但是体重减少在其他5个单一治疗组中(即，金刚烷胺3mg/ml，奥塞米韦10或30mg/kg/天，和利巴韦林7或21mg/kg/天)更明显。使用动物研究的UK/EU死亡率标准(死亡＝20％体重减少)，我们发现10mg/kg/天的奥塞米韦保护40％的小鼠，3mg/ml的金刚烷胺保护10％，且7mg/kg/天的利巴韦林保护0％。当以相同药物浓度用作三联组合时，100％的小鼠得到保护。因为10mg/ml的金刚烷胺作为单一治疗时高度保护性的；在单一治疗和该组合之间不存在体重方面的较大不同，但是仍然存在不同，这支持该组合是更优越的。三联组中的耐药性形成比在单一治疗组中记录的少得多(0相对于2％)。
这些结果证明包含金刚烷胺、奥塞米韦、和利巴韦林的三联组合在为感染A型流感(H3N2)病毒的小鼠提供功效和耐药性益处中是有效的。
实施例3B：金刚烷胺、奥塞米韦、和利巴韦林的三联组合对治疗小鼠中流感的作用
重复上述实验，不同的是治疗的起始直到小鼠感染病毒后24或48小时才开始，且使用下述药物浓度：金刚烷胺28mg/kg/天，奥塞米韦10mg/kg/天，和利巴韦林40mg/kg/天。
在治疗在感染后24小时起始的研究中，至感染后第9天，金刚烷胺单一治疗和奥塞米韦单一治疗组具有100％的死亡率(使用UK/EU死亡率标准)；利巴韦林单一治疗组具有20％的存活；且三联组合治疗组具有90％的存活。
在治疗在感染后48小时起始的研究中，至第9天，所有组均具有超过20％的体重减轻。然而，三联组合治疗组具有约22％的最少量的体重减轻；利巴韦林单一治疗组具有约26％的体重减轻；金刚烷胺单一治疗和奥塞米韦单一治疗组分别具有接近35％的体重减轻。至第13天，所有治疗组已经开始增重，但是三联组合治疗组中的增重显著更高----在该组中的动物为约90％它们的初始体重。相比较，利巴韦林单一治疗组中的动物为约80％它们的初始体重，奥塞米韦单一治疗和金刚烷胺单一治疗组中的动物不比未治疗的对照更好(约65-70％它们的初始体重)。
实施例4：金刚烷胺，奥塞米韦和利巴韦林组合在烧瓶中培养的H5N1感染的MDCK细胞中的抗病毒活性的剂量响应研究
我们设计该实验来评估金刚烷胺，奥塞米韦，和利巴韦林组合在抑制A/Indonesia/05/2005(H5N 1)和A/Vietnam/I 204/2004(H5N1)病毒复制和产生耐药性突变体中的剂量响应抗病毒活性。本实验的目的是证明与无药物相比的病毒负荷的减少和与单一治疗的组合的协同作用。MDCK细胞在96-孔板中生长为单层。在T＝0时，向细胞中加入150μL 20TCID50/mL的病毒。此后立即，向孔中加入50μL药物，单独的或组合的，以提高指示的终浓度。药物以下述浓度在单一治疗中进行检测：金刚烷胺，0.00032，0.001，0.0032，0.01，0.032，0.1，0.32，1，3.2，10，32和100μg/ml；奥塞米韦，0.0001，0.00032，0.001，0.0032，0.01，0.032，0.1，和0.32，1.0，3.2，10，32μg/ml；和利巴韦林，0.00032，0.001，0.0032，0.01，0.032，0.1，0.32，1，3.2，10，32和100μg/ml μg/ml。检测每种药物在组合中的六种剂量：金刚烷胺，0，0.01，0.032，0.1，0.32，和1.0μg/ml；奥塞米韦，0，0.00032，0.001，0.0032，0.01，0.032μg/ml；和利巴韦林，0，0.032，0.1，0.32，1，和3.2μg/ml。
在T＝72小时，合并来自一式两份样品的每个孔的100μL上清，且冷冻用于TCID50分析。剩余的细胞单层通过MTS染色测定细胞存活力。
实施例5：延长释放的盐酸金刚烷胺，利巴韦林和磷酸奥塞米韦的试剂盒
参考图1A，排列按照本发明的泡眼包装(10)来提供多行(12)，每行(12)包括多个剂量(14)。在本实施例中，存在这样的两行(12)，每行包括7个剂量，尽管行或剂量的数目可以便利地进行改变。
每个剂量包括多个不同种类的剂型，其按类型在每行中一起分组在独立的泡眼(20)中，形成次行(18)。第一种剂型(A)包含金刚烷胺，第二种(B)包含利巴韦林，第三种(C)包含奥塞米韦。对于给定剂量的不同种剂型以这种方式分组在一起，以有利于遵守指示的给药方案。在该实施例中，单一剂量包括两个金刚烷胺胶囊(A)，两个利巴韦林胶囊(B)和一个奥塞米韦胶囊(C)，尽管关于每种剂量的每种剂型的数目也可以按需要而改变。图1A所示的泡眼包装设置用于在7天的时间期间内便利的BID给药每种活性剂。图1B所示的泡眼包装与图1A所示的相同，不同的是奥塞米韦QD给药。
该实施例的金刚烷胺胶囊(A)分别包含125mg延长释放形式的盐酸金刚烷胺(例如，如按照USSN 11/285,905所制备)，且排列在第一和第四次行(18)的每个泡眼(20)中，尽管每个胶囊可以按需要包含或多或少的金刚烷胺或不同的金刚烷胺盐形式。
该实施例的利巴韦林胶囊(B)分别包含200mg立即释放形式的利巴韦林，例如，利巴韦林USP胶囊(Schering)，且排列在第二和第五次行(18)的每个泡眼(20)中，尽管每个胶囊可以按需要包含或多或少的利巴韦林。
该实施例的奥塞米韦胶囊(C)分别包含75mg奥塞米韦，例如，TAMIFLUTM(Roche Pharmaceuticals(罗氏制药))，且排列在第三和第六次行(18)的每个泡眼(20)中，尽管每个胶囊可以按需要包含或多或少的奥塞米韦。
所示泡眼包装还包括说明书，其指示两种金刚烷胺胶囊、两种利巴韦林胶囊和一种奥塞米韦胶囊每天两次的典型的成人剂量。应该理解该实施例的泡眼包装包含足以用于给药一周的剂型，其包括28个包含125mg盐酸金刚烷胺的胶囊，28个包含200mg利巴韦林的胶囊，和14个包含75mg磷酸奥塞米韦的胶囊。因此，每个日常剂量的每种活性剂的相对百分数为35wt.％盐酸金刚烷胺，55wt.％利巴韦林和10wt.％磷酸奥塞米韦。
实施例6：盐酸金刚烷胺、利巴韦林和磷酸奥塞米韦的试剂盒
设置与实施例5的泡眼包装相似的泡眼包装，以提供每行7个泡眼(20)的3个次行(18)的两行(12)。将两个片剂或胶囊的100mg立即释放形式的盐酸金刚烷胺(A)，例如，SymmetrelTM(EndoPharmaceuticals或Novartis)包装在第一和第四次行(18)的每个泡眼(20)中。将两个胶囊的200mg立即释放形式的利巴韦林，例如，利巴韦林USP胶囊(Schering)包装在第二和第五次行的每个泡眼(20)中。将一个胶囊的75mg奥塞米韦，例如，TamifluTM(Roche Pharmaceuticals(罗氏制药))包装在第三和第六次行的每个泡眼(20)中。所述泡眼包装还包括说明书，指示两个金刚烷胺片剂或胶囊、两个利巴韦林胶囊和一个奥塞米韦胶囊每天两次的典型成人剂量。所述泡眼包装包含足以用于一周给药的剂型。
实施例7：延长释放的盐酸金刚烷胺和利巴韦林的试剂盒
参考图2，按照本发明的不同的泡眼包装(30)包括两行(32)，每行中的两个次行(38)的每个包含7个泡眼(40)，以提供每行两排7个剂量(34)。每个剂量(34)包括两种不同的活性剂，即金刚烷胺(A)和利巴韦林(B)，其分别包含在不同类型的剂型中。每种剂量(34)的每种剂型排列在独立的泡眼(40)中。每种剂量(34)的金刚烷胺(A)和利巴韦林(B)剂型分组在一起，以有助于遵守给药方案。
在该实施例中，每种剂量(34)包括两个金刚烷胺胶囊(A)和两个利巴韦林胶囊(B)。将两个胶囊(A)的125mg延长释放形式的盐酸金刚烷胺(按照USSN 11/285,905制备)包装在第一和第三次行(38)的每个泡眼(40)中。将两个胶囊的200mg立即释放形式的利巴韦林(B)，例如，利巴韦林USP胶囊(Schering)包装在第二和第四次行(38)的每个泡眼(40)中。
该泡眼包装(30)还包括说明书，指示两个金刚烷胺延长释放胶囊(A)和两个利巴韦林胶囊(B)每天两次(BID)的典型的成人剂量(34)。所述泡眼包装包含足以用于一周给药的剂型。所述试剂盒可以与独立包装的神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦或扎那米韦联合使用。因此，任选地，所述说明书可以包括进一步的指示，以共同施用与金刚烷胺和利巴韦林剂型联合的一个胶囊的75mg奥塞米韦，例如，TamifluTM(Roche Pharmaceuticals(罗氏制药))(未显示)每天一次或两次。任选地，向受试者独立地提供来自该试剂盒的奥塞米韦或扎那米韦作为另外开的药物。
实施例8：延长释放的盐酸金刚烷胺、利巴韦林和奥塞米韦的试剂盒
参考图3A，用于施用盐酸金刚烷胺(amantadine chloride)、利巴韦林和奥塞米韦组合的另一种试剂盒包括泡眼包装(50)，其限定两行(52)泡眼，每行(52)包括两个7个泡眼(60)的次行(58)，每个次行每行限定7个剂量(54)。行(52)作为将每个剂量(54)所需要的两种不同类型的剂型(D，E)分组在一起。每个剂量(54)包括多个一种类型(D)的胶囊和一个另一种类型(E)的胶囊。
在本实施例中，每个剂量存在3个一种类型(D)的胶囊，但是当需要时可以使用更少或更多的所述胶囊。所述一种类型(D)的胶囊包括利巴韦林和盐酸金刚烷胺，其中盐酸金刚烷胺提供为延长释放制剂，且利巴韦林处于立即释放制剂中，该两种制剂共同包封。
另一种类型(E)的胶囊包括奥塞米韦，且与金刚烷胺-利巴韦林胶囊(D)分组在一起，以有助于遵守指示的说明书。如果需要可以使用每个剂量(54)多于一个胶囊的另一种类型(E)。该实施例的泡眼包装(50)因此设置用于在7天的时间期间内BID给药活性成分。图3B所示的泡眼包装与图3A所示的相同，不同的是奥塞米韦QD给药。
实施例9：延长释放的盐酸金刚烷胺、利巴韦林和奥塞米韦的试剂盒
图4中显示按照本发明的不同泡眼包装(70)。所述泡眼包装(70)以与上述实施例5-8相似的方式限定两行(72)泡眼(80)。然而，在该实施例中，不存在次行，每行包括单排7个泡眼(80)，每个泡眼容纳多个均为相同类型的剂型(F)，以便在每个泡眼内有足够的剂型(F)形成单一剂量(74)。因此，每行(72)提供7个剂量(74)。
在该实施例中的每个剂型(F)包括延长释放形式的盐酸金刚烷胺，利巴韦林和任选的奥塞米韦。
因此，所述泡眼包装(70)设置为在7天的时间期间内BID给药每种活性剂。所述试剂盒可以单独使用，特别是在所述剂型包括金刚烷胺，利巴韦林和奥塞米韦的情形中，或与独立包装的神经氨酸酶抑制剂，例如，奥塞米韦联合使用。
实施例10：使用ER金刚烷胺，ER奥塞米韦，和IR利巴韦林组合在流感患者中的多剂量安全研究
我们设计表4所述的临床研究，以确定与IR利巴韦林共同施用的金刚烷胺和奥塞米韦的延长释放组合制剂的安全性和药物代谢动力学。
表4
  目的   为了确定重复药物剂量的安全性和药物代谢动力学
  剂量：  选择的剂量是基于先前的单一递增剂量(SAD)研究：例如，100mg金刚烷胺SR+75mg奥塞米韦+400mg利巴韦林，100mg金刚烷胺SR+75mg奥塞米韦+600mg利巴韦林，200mg金刚烷胺SR+75mg奥塞米韦+400mg利巴韦林，200mg金刚烷胺SR+75mg奥塞米韦+600mg利巴韦林，200mg金刚烷胺SR+150mg奥塞米韦+600mg利巴韦林，或200mg金刚烷胺SR+150mg奥塞米韦+800mg利巴韦林，QD，7天
  同时的对照  金刚烷胺IR或金刚烷胺IR加奥塞米韦IR(均按照供应商标记给药)
  途径：  口服
  受试者群体：  诊断患有流感的男性或女性
  结构：  4组
  研究部位：  TBD
  盲性：  患者盲的
  受试者分配方法：  每组内随机等量男性和女性，且组内相等的年龄分布
  总样品大小  24名受试者，每给药组6名
  初级功效终点：  无
  剂量：  选择的剂量是基于先前的单一递增剂量(SAD)研究：例如，100mg金刚烷胺SR+75mg奥塞米韦+400mg利巴韦林，100mg金刚烷胺SR+75mg奥塞米韦+600mg利巴韦林，200mg金刚烷胺SR+75mg奥塞米韦+400mg利巴韦林，200mg金刚烷胺SR+75mg奥塞米韦+600mg利巴韦林，200mg金刚烷胺SR+150mg奥塞米韦+600mg利巴韦林，或200mg金刚烷胺SR+150mg奥塞米韦+800mg利巴韦林，QD，7天
  不利事件：  每天监测至少两次，监测关于高剂量的金刚烷胺或奥塞米韦报道的行为、心血管、和肠胃作用(包括头昏、头痛、混乱、便秘、高血压、咳嗽、恶心、腹泻、呕吐)。
  血液收集  在研究期间的第一天通过导管，然后其余的研究时间每天2-4次
  分析  测定以测量金刚烷胺、奥塞米韦、利巴韦林和潜在的其他生理学参数，不利事件
实施例11：静脉内三联组合抗病毒药物治疗对于治疗严重禽流感的安全性和功效的2期临床试验
我们设计该研究来：1)评估静脉内三联组合抗病毒药物治疗(TCAD)在治疗患有严重禽流感的患者中的安全性和耐受性；2)评估在治疗过程中TCAD的抗病毒功效的速率和程度，其通过负反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测上呼吸道和下呼吸道的、胃肠道(粪便)，和血液(病毒血)，鼻和喉中的病毒核酸(RNA)而进行评估；和3)通过焦磷酸测序(或等价的)评估在治疗过程中抗病毒药物抗TCAD的速率和程度。
研究大小：12名患者
包括标准：1)年龄≥1岁；2)发烧≥38.0℃；3)至少一种呼吸症状：咳嗽，呼吸困难(呼吸短促)，和/或喉咙疼痛；4)在最后7天开始的病态(发烧、呼吸症状、或组成型症状发作)；和5)在病态发作时间前14天内具有由满足下述标准中的一种而定义的关于禽流感的流行性危险的迹象：(a)在受试者的村落或周围(在2km半径内)存在死亡的或病的鸟类；(b)受试者具有直接的鸟类或家禽接触(健康的或病的鸟类或家禽)；(c)受试者与患有已知的或怀疑的禽流感的人有面对面接触；或(d)受试者可能在实验室暴露于H5N1病毒。
排除标准：1)对盐酸金刚烷胺、扎那米韦、和/或利巴韦林，和或对这些药物产品的任何成分的过敏性或严重不耐性的历史(由研究者判断)；和2)由研究者利用即用信息确定的对于患者临床症状的备选的解释(即，排除流感)。
筛选标准：1)下述样品通过定量RT-PCR检测H5，然而，开始TCAD治疗的决定不依赖于来自这些检测的结果的接收：鼻拭样x 2；口咽(喉)拭样x 2；鼻咽吸出物(NPA；因为NPA是对于某些受试者的强迫性检测，故可以省略NPA或可以用鼻洗液替代NPA用于研究者的判断)；支气管小泡灌洗液(BAL)或气管内管吸出物；血液样品(对于病毒血，CBC，和血清化学)；和≥12岁女性的孕期尿液。
TCAD给药方案：治疗的持续时间最少5天，但是可以由医师基于关于每名个体患者的益处/危险评估而确定延长。用于5天治疗的试剂盒包括：1)10小瓶包含～4ml在具有或不具有缓冲剂的水中的100mg/ml金刚烷胺，2)10小瓶包含15ml在具有或不具有缓冲剂的水中的75mg/ml利巴韦林，和3)10小瓶包含～7ml在具有或不具有缓冲剂的水中的10mg/ml扎那米韦，或者，作为扎那米韦的备选物，10小瓶冻干的奥塞米韦。
对于治疗，将来自金刚烷胺小瓶的3.3ml吸取到注射器中，且注射到500ml 0.9％或5％葡萄糖/0.45％盐水的输注包中，产生0.66mg/ml的金刚烷胺浓度；输注体积速率设定为40ml/min，其导致26mg/小时(630mg/天)的输注给药速率。将来自利巴韦林小瓶的13.5ml吸取到注射器中，并且注射到500ml盐水输注包中，产生2.03mg/ml的利巴韦林浓度；输注体积速率设定为40ml/min，其导致84.6mg/小时(2030mg/天)的输注给药速率。将6.5ml扎那米韦吸取到注射器中，且注射到500ml盐水输注包中，产生0.13mg/ml的扎那米韦浓度；输注体积速率设定为40ml/min，其导致5.3mg/小时(127mg/天)的输注给药速率。作为扎那米韦的备选物，将5ml水吸取到注射器中，且注射到冻干的奥塞米韦的小瓶中，以重构该无菌粉剂，产生46mg/ml磷酸奥塞米韦的浓度；输注体积速率设定为40ml/min，其导致18.4mg/小时(442mg/天)的输注给药速率。在这些输注速率，每12小时需要准备新的每种抗病毒药剂包。
安全性：监测不利事件。使用分级成人和儿科不利事件严重性的AIDS表格的NIH部分(NIH Division of AIDS Table for Grading the Severityof Adult and Pediatric Adverse Events)(DAIDS AE分级表格)来评估不利事件的严重性。
临床评估：临床评估包括：住院死亡率；在治疗过程中临床失败的比率和程度[临床失败定义为死亡、严重呼吸急促(对于年龄≥12岁的呼吸速率≥30，对于年龄为6-12岁的速率≥40，对于年龄3-6岁的速率≥45，对于年龄为1-3岁的速率≥50)；严重呼吸困难(不能说出完整的句子，或使用辅助呼吸肌)；通过经皮方法在房间空气动脉氧饱和＜92％；需要机械通风或ICU住院]；对于受试者28-天的死亡率；对于受试者180-天的死亡率；对于受试者任何时候使用机械通风；对于患有禽流感的受试者ICU住院的次数；对于受试者在任何时候发展急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；对于受试者住院治疗的持续时间；由不存在发烧，无或最少症状，不需要减少药物，和恢复正常活动所定义的症状持续时间。
病毒学终点：病毒学评估包括：治疗过程中由负RT-PCR关于鼻和喉拭样、血液、NAL和BAL样品的病毒RNA评估的病毒负荷和释放的速率和程度；由焦磷酸测序确定的出现金刚烷胺或扎那米韦抗病毒药物耐药性的速率和程度；和耐药性变体的遗传表征。

Claims (20)

1.用于治疗或预防人患者中的流感的组合物，所述组合物包括：10-60重量百分比(wt.％)的金刚烷胺和30-80wt.％的利巴韦林，其中所述重量百分比是基于所述组合物中活性剂的总重。
2.权利要求1的组合物，其还包括0.5-30wt.％的奥塞米韦。
3.权利要求1的组合物，其采用用于口服施用的单位剂型。
4.权利要求3的组合物，其包括25-125mg金刚烷胺和50-200mg利巴韦林。
5.权利要求3的组合物，其包括至少125mg处于延长释放形式的金刚烷胺，和少于200mg的利巴韦林。
6.权利要求5的组合物，其中所述金刚烷胺处于延长释放的形式。
7.权利要求1的组合物，其采用在小瓶中的冻干粉末形式。
8.权利要求1的组合物，其采用在小瓶中的无菌液体形式。
9.用于治疗或预防患者中的流感的方法，所述方法包括：向所述患者施用有效量的第一、第二和第三抗病毒药剂组合，所述组合包括：
a)选自由金刚乙胺和金刚烷胺组成的组的M2抑制剂；
b)选自由利巴韦林和viramidine组成的组的RNA聚合酶抑制剂；和
c)选自由奥塞米韦、奥塞米韦羧酸盐、扎那米韦、和peramivir组成的组的神经氨酸酶抑制剂(NAi)。
10.权利要求9的方法，其中所述第一和第二抗病毒药剂以这样的量施用，相对于用作单一治疗时流感病毒对所述第三抗病毒药剂的敏感性，所述量增加流感病毒对组合中的第三抗病毒药剂的敏感性至少2倍。
11.权利要求9的方法，其中所述抗病毒药剂通过选自由下列各项组成的组的方法施用给患者：口服、肠胃外、吸入、以及它们的组合。
12.权利要求1的方法，其中所述患者以维持血浆浓度在0.3-1.5μg/ml持续至少48小时的量施用金刚烷胺。
13.权利要求1的方法，其中所述患者以200-500mg/天的量肠胃外或口服施用金刚烷胺。
14.权利要求9的方法，其中所述患者口服施用处于延长释放形式的金刚烷胺。
15.权利要求9的方法，其中所述流感病毒耐受金刚烷胺或奥塞米韦单一治疗。
16.用于治疗或预防患者中的流感的试剂盒，所述试剂盒包括金刚烷胺和利巴韦林。
17.权利要求16的试剂盒，其用于口服治疗或预防，所述试剂盒包括：多种剂型，所述多种组成一个或多个剂量，每个剂量包括治疗或预防有效量的利巴韦林和金刚烷胺组合。
18.权利要求16的试剂盒，其中所述金刚烷胺和利巴韦林作为独立的剂型配制。
19.权利要求16的试剂盒，其中所述金刚烷胺和利巴韦林共同配制为单一剂型。
20.权利要求16的试剂盒，其还包括奥塞米韦。
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