TWI479153B - Screening kit for screening anti - influenza drugs and its screening method - Google Patents
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Description
本發明係有關於藥物篩檢方法,特別係指一種抗流感候選藥物之篩選方法及其套組。
按,流行性感冒係一種存在於家禽或是哺乳動物間之傳染性疾病,由屬於正黏液病毒科(Orthomyxoviridae
)之流行性感冒病毒所引起。一般來說,流行性感冒典型會引起急性上呼吸道感染,並伴隨著上下呼吸道發炎現象,而臨床症狀包含有發燒、喉嚨痛、肌肉酸痛、頭痛、咳嗽、虛弱等,會使病患產生不舒服以及虛弱之感受。於較為嚴重之情形下,流行性感冒係會引起肺炎,而使全球每年有超過30萬之小孩以及老年人死亡。更進一步而言,人類流感病毒可分為三類,分別為A型流感病毒、B型流感病毒以及C型流感病毒,其中,以A型流感病毒具有極強變異性,對於大眾健康具最嚴重之威脅性,常見之A型流感病毒為西班牙流感(H1N1)、亞洲流感(H2N2)以及香港流感(H3N2),而西班牙流感係為人類史上最致命之流行性感冒。最近一次大流行係於2009年,豬源性A型流感病毒或稱新型流感病毒(swine origin influenza virus;SOIV)普遍地被散佈於世界各地,並引起1萬8千人死亡。因此,為了對抗流行性感冒,科學家無一不致力於相關治療方法之研究。
流行性感冒病毒之結構自內到外主要可分為核心、基質蛋白以及包膜三部份,其中,核心係包含儲存病毒訊息之遺傳物質與複製該訊息所需之酵素;基質蛋白係構成病毒之外殼骨架,用以緊密結合最外層之包膜,保護病毒核心以及維持病毒空間結構;包膜則是包裹於基質蛋白外之一層磷脂層膜,而於病毒外膜與磷脂雙層膜間係具有紅血球凝聚素(hemagglutinin;HA;H)以及神經氨酸酶(neuraminidase;NA;N),分別扮演侵入宿主細胞以及與宿主細胞分離,於病毒感染宿主之過程中
扮演著重要角色。故,先前研究係以可被人類血清中的抗體辨識之該二醣蛋白作為抗病毒藥物之主要目標。目前最為人所熟知之抗流感藥物克流感(Tamiflu),係為一種神經氨酸酶抑制劑,惟,由於新型流感病毒所產生神經氨酸酶之突變(H274Y),對於克流感該種藥物具有抗性。是以,目前科學家急需研究一種新且有效之抗流感藥物。
先前研究指出A型流感病毒結構蛋白中之核殼蛋白(Nucleocapsid,N)含有498個胺基酸,分子量約為56kDa,其係與RNA在病毒粒子中結合呈螺旋狀,參與病毒感染、複製和病毒包裝。核殼蛋白係為一個三聚體之蛋白質,主要之功用在於和病毒RNA基因組結合,形成20個核苷酸之核醣蛋白複合體(ribonucleoprotein complexes;RNP),並在生物接觸過程中扮演病毒與宿主細胞之間關鍵之接合器。核殼蛋白之單體構型似月牙形,具有四個區域,其中,其頭部(head domain)與身部(body domain)間具有凹槽,係為與RNA相結合之區域。而核殼蛋白除了與RNA作用外,亦與細胞多胜肽產生交互作用,包括肌動蛋白、進核與出核訊息以及細胞內之RNA解旋酶(nuclear RNA helicase)。如上所述,A型流感病毒之核殼蛋白含有498個胺基酸,而該498個胺基酸也高度相似地存在於流感病毒中,並於病毒生長週期中具有多功性,使核殼蛋白成為抗流感藥物發展之新對象。
然而,開發新藥必須要投入大量金錢以及時間,根據美國所作統計,開發新藥上市前平均需要投入5億美元之資金,耗時約12~15年,而研製新藥中僅有不到百分之五能夠進入臨床前研究階段,其中僅有百分之二能夠進入臨床試驗階段,其中又有百分之八十會在上市前被淘汰,因此,如何事先對於欲開發之新藥物有所評估,有效率篩選出可能具有療效新型藥物,再做進一步開發研究,亦即縮短開發新型藥物週期,提高藥物開發效率以及投入資金之回收率。目前已有研發出縮短藥物開發週期之技術,例如建立數據資料庫,藉由比對、分析以及評定,
於進行實驗前先應用程式篩選掉不太可能成功之藥物,亦可用以預測候選藥物於體內吸收、代謝、毒性等,降低研發新藥之淘汰率。惟,利用資料庫之方式必須先瞭解候選藥物之分子結構與特點,以及需預先建立完整資料庫,才能增加比對分析之準確率,如此一來,對於研究單位或是業者而言,執行操作上仍有一定難度。因此,開發一種簡易操作又有效率之藥物篩選方法,其係為絕大多數藥廠最急切需要之研究目標。
因此,本發明之主要目的即在於提供一種抗流感候選藥物之篩選套組,其係包含有一載具,一預定濃度之核殼蛋白溶液,添加於該載具中,據此,將一待測藥物添加入該載具中,與該核殼蛋白溶液相結合,使之表現不同螢光強度,用以篩選該待測藥物,其中:該核殼蛋白溶液係包含有一經純化後之重組核殼蛋白;該載具係可設為一多孔盤,而該核殼蛋白溶液依據需求添加一定量於該多孔盤中之各孔中。本發明之另一目的係在於提供一種抗流感候選藥物之篩選方法,包含下列步驟:
步驟a:製備一預定濃度之核殼蛋白溶液。
步驟b:取一待測藥物,添加於該核殼蛋白溶液中。
步驟c:檢測該核殼蛋白溶液螢光強度之變化,用以篩選出具有抗流感能力之藥物。
更進一步而言,該步驟a更包含有:
步驟a1:構築一重組核殼蛋白之表現載體,包含有一編碼為核殼蛋白之核苷酸序列,其中,該編碼為核殼蛋白之核苷酸序列係以預定限
制酶截切選自於命名為H1N1A/TW/22/2001之台灣種新型流感病毒之核殼蛋白或是豬源性A型流感病毒之核殼蛋白(swine-origin influenza A)而得。
步驟a2:將該表現載體轉型至一宿主內,使該載體表現該重組核殼蛋白,其中,宿主可為一細菌。
步驟a3:萃取並純化該重組核殼蛋白,將之製備成為一預定濃度之重組核殼蛋白溶液。
藉由本發明所提供抗流感候選藥物之篩選方法,可簡化篩選待測藥物之過程,縮短研發新型藥物之週期,降低投入之研發資金,並提高新藥開發之成功率。
本發明所揭一種抗流感候選藥物之篩選套組,其係包含有一載具,一預定濃度之重組核殼蛋白溶液於該載具內,得用以與一待測藥物相結合而表現出不同螢光強度,篩選出具有抗流感功能之候選藥物。此外,本發明更進一步提供抗流感候選藥物之篩選方法,首先,製備一預定濃度之核殼蛋白溶液,並取一待測藥物,添加於該核殼蛋白溶液中,使兩者混合形成一混合物,而後檢測該混合物之螢光強度,即可藉由分析螢光強度之變化而篩選出具有抗流感能力之候選藥物。
需更進一步加以說明者,由新型流感病毒之核殼蛋白結構可知,於遠離其RNA結合處係具有六個色胺酸之殘基。而色胺酸本身係為重要之內在螢光探針,用以於微環境變化下偵測色胺酸變化而得知蛋白質之改變。簡言之,藉由核殼蛋白中色胺酸螢光強度之變化,可知核殼蛋白
是否與待測藥物相結合。
以下,為了更進一步說明本發明,茲舉若干實例並配合圖式做更詳細說明如後。
實例一:建構表現質體
本實例係取由三軍總醫院以及長庚大學提供所提供之台灣種H1N1新型流感病毒之核殼蛋白以及豬源性A型流感病毒之核殼蛋白作為板模。
為了能夠獲得全長重組核殼蛋白,將該二核殼蛋白分別利用引子以聚合酶鏈反應(PCR)擴增。將經聚合酶鏈反應之各該產物以酵素截切於NdeI及XhoI兩切位,得到一核殼蛋白片段,並於各該核殼蛋白之N端連接六個組胺酸作為標記,而以T4連接酶構築於質體(pET21b)上,如第一圖所示。
實例二:純化重組H1N1核殼蛋白以及重組SOIV核殼蛋白
將實例一中所構築好之表現質體轉形至一含有乳糖操縱組之宿主細菌中,於1mM之異丙基半乳糖苷(IPTG)培養基、10℃培養24小時以誘導核殼蛋白產生。將完成培養之細菌以6000xg、4℃離心15分鐘,再以裂解緩衝液裂解細菌小球。而後,以13000xg、4℃離心30分鐘,移除沈澱物,而得到含有可溶性蛋白質之上清液。藉由液相層析法,將該上清液以鎳管柱、15~300mM咪唑洗提,而純化出N端帶有組胺酸標記之重組核殼蛋白,再以無咪唑之緩衝液透析經純化之片段並收集之。
將純化後之台灣種H1N1新型流感病毒之重組核殼蛋白以及豬源性A型流感病毒之重組核殼蛋白分別以十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳,利用考馬斯亮藍(Coomassie blue)之蛋白質定量分析法,結果如第二圖所示,其中,右邊為台灣種H1N1新型流感病毒之重組
核殼蛋白,左邊為豬源性A型流感病毒之重組核殼蛋白。
由第二圖之結果分析可得知該二重組核殼但白經純化後,純度高達90%以上,因此,將該二重組核殼蛋白供以下實例利用。
實例三:以重組核殼蛋白檢測藥物Nucleozin(一)
需先加以說明者,於先前研究中已指出藥物Nucleozin具有連結新型流感病毒之核殼蛋白之能力,而使新型流感病毒喪失複製功能,亦即Nucleozin係為一種目前已知之抗流感藥物。因此,於本實例係利用藥物Nucleozin結合核殼蛋白,以觀察色胺酸所引起之螢光猝滅反應。
首先,取該實例二中之台灣種H1N1新型流感病毒之重組核殼蛋白,製備成一最終濃度為4μM之重組核殼蛋白溶液。取濃度為2μM、4μM、20μM、40μM之藥物Nucleozin,分別添加於該重組核殼蛋白溶液中,形成待測樣品,其中,該核殼蛋白溶液之酸鹼值係為7.5,包含有50mM三羥基甲烷-氯化氫以及150mM氯化鈉。
分別將不同濃度之待測樣品於25℃置放3小時後,以螢光光譜儀於波長300~400nm偵測各該待測樣品之螢光強度,結果如第三圖所示,其中,以未添加任何藥物之樣品作為對照組。
由第三圖之結果顯示,結果顯示於波長331nm時,未添加核殼蛋白之樣品具有220AU之螢光強度,而隨著添加藥物Nucleozin濃度之增加,於各該樣品中所測得之螢光強度隨之減弱。因此,可得知核殼蛋白與藥物Nucleozin間有連結反應,並隨著藥物Nucleozin濃度增加,與核殼蛋白間之連結亦隨之增加,造成核殼蛋白所產生之螢光強度降低,簡言之,螢光強度與藥物濃度間成反比的趨勢。
實例四:以重組核殼蛋白檢測藥物Nucleozin(二)
如同實例三所述流程,將濃度為4μM之藥物Nucleozin添加於重組核殼蛋白溶液中,形成待測樣品,並於25℃下,分別置放1、8
以及16小時。而後,以螢光光譜儀於波長300~400nm偵測各該待測樣品之螢光強度,結果如第四圖所示,其中,以未添加任何藥物之樣品作為對照組。
由第四圖之結果顯示,當各該待測樣品放置時間越長,所測得之螢光強度亦隨時間增加而減少,顯示色胺酸螢光探針係分佈於核殼蛋白,並且藥物Nucleozin能夠誘導其結構隨著時間而改變以及使螢光強度降低。
實例五:以重組核殼蛋白檢測藥物Nucleozin(三)
如同實例三所述流程,分別將濃度為2μM、4μM、20μM、40μM之藥物Nucleozin添加於重組核殼蛋白溶液中,形成待測樣品,並於25℃下,分別置放1、8以及16小時。而後,以螢光光譜儀於波長331nm偵測各該待測樣品之螢光強度,結果如第五圖所示,其中,橫軸為不同放置時間,縱軸係由下列公式所計算得到之數值:(未加入藥物之待測樣品之螢光強度-各待測樣品之螢光強度)/未加入藥物之待測樣品所得之螢光強度。
由第五圖可知於藥物Nucleozin與核殼蛋白比值為0.5以及1時,螢光強度係隨著時間增加而增加,而當藥物Nucleozin與核殼蛋白比值為5以及10時,即使時間增加,螢光強度係維持一定值。因此,顯示出核殼蛋白係具有多個藥物鍵結點。
實例六:以重組SOIV核殼蛋白檢測Nucleozin藥物
於本實例,如同實例三,利用藥物Nucleozin測試豬源性A型流感病毒之重組核殼蛋白之螢光促滅反應。
首先,分別取濃度為2μM、4μM、20μM、40μM之藥物Nucleozin,添加於最終濃度為4μM豬源性A型流感病毒之重組核殼蛋白溶液,形成待測樣品,於25℃下,放置三小時,其中,緩衝液之酸鹼值為7.5,係包含有50mM三羥基甲烷-氯化氫以及150mM氯
化鈉。以螢光光譜儀波長為300~400nm偵測各該待測樣品之螢光強度,其中,以未添加任何藥物之樣品作為對照組,結果如第六圖所示。
由第六圖之結果顯示隨著添加藥物Nucleozin之濃度增加,所測得之螢光強度隨之減弱,亦即藥物添加濃度與螢光強度間呈現反比趨勢。
實例七:比對重組H1N1核殼蛋白及重組SOIV核殼蛋白
取實例三與實例六各該待測樣品所測得之螢光強度,並以下列公式計算出一數值:(將未加入藥物之待測樣品之螢光強度-加入不同濃度藥物之各待測樣品之螢光強度)/未加入藥物之待測樣品之螢光強度
而將所計算出之數據與各該待測樣品之濃度製作成一長條圖,如第七圖所示。
由第七圖之結果顯示,不論核殼蛋白係來自於台灣種新型流感病毒或是豬源性A型流感病毒,對於藥物Nucleozin會產生螢光猝滅反應,其中,又以新型流感病毒之核殼蛋白產生較為顯著之螢光猝滅反應,且經由中和試驗結果可發現藥物Nucleozin對於新型流感病毒較豬流感有更佳的病毒抑制效力。
實例八:篩選未知化合物
取二待測化合物1017及1018,其中,1017之化學結構如下所示:
1018之化學結構如下所示:
將待測化合物1017及1018分別以不同濃度2μM、4μM、20μM、40μM分別添加於最終濃度為4μM之新型流感病毒之重組核殼蛋白溶液中,分別形成待測樣品,放置3小時後,以螢光光譜儀偵測各該待測樣品之螢光強度,並再以實例七中所述之公式計算出各該待測樣品之螢光強度之比值,而結果如第八圖所示。
由第八圖顯示化合物1018能夠顯著減少核殼蛋白之螢光強度,並隨著添加濃度之增加而減弱螢光強度,而化合物1017則無論於何種濃度下,皆無法顯著改變螢光強度。因此,可推論出化合物1018具有作為治療流感藥物之能力。
實例九:化合物1017、1018之中和試驗
本實例係藉由盤式螢光分析驗證化合物1017以及1018是否能夠抑制被流感病毒所感染之細胞的細胞病變效應。
首先,將96孔之組織培養盤中置入200μl之腎細胞(MDCK)懸浮液,其中,該腎細胞懸浮液係以含10%牛血清之液體培養基(DMEM)稀釋成1x105
cells/ml,於37℃、5%二氧化碳之環境下培養16~20小時。以磷酸鹽緩衝液清洗細胞,加入150μl不含血清之培養基,內含有病毒液以及最終濃度達0.0002%之胰蛋白酵素,其中,感染劑量(multiplicity of infectivity(MOI)為0.2每個細胞。而後,再分別加入含有不同濃度之待測化合物1017、1018之50μl液體培
養基,於37℃、5%二氧化碳之環境下培養48小時後,將細胞以甲醛固定以及去活化病毒後,以0.1%結晶紫染色15分鐘,以清水清洗後測定於波長570nm下之吸光值,計算化合物降低病毒引發細胞造成病變現象50%之IC50
,結果如第九圖A及第九圖B所示,其中,第九圖A係為化合物1018之結果,第九圖B係為化合物1017之結果,VC係為病毒感染之控制組。
由第九圖A結果顯示化合物1018的確具有抑制細胞病變效應之功效,而由第九圖B可知化合物1017係無抑制細胞病變效應之功效。
由實例八及實例九可相互驗證出化合物1018的確具有抗流感病毒之能力,並亦證實藉由核殼蛋白所產生之螢光猝滅反應確實可以篩選出具有抗流感病毒功效之藥物。
由上述各該實例之說明,可知本發明所揭之抗流感候選藥物之篩選套組及其篩選方法係藉由核殼蛋白與待測藥物之結合程度,改變核殼蛋白所產生之螢光強度,而可得知待測藥物是否與核殼蛋白結合,篩選出具有抗流感病毒之藥物。因此,本發明所提供之抗流感候選藥物之篩選套組及其篩選方法係具有以下優點:
其一、操作簡單,僅需將適當濃度之候選藥物添加入篩選套組,即可快速得知是否具有抗流感之功效,而縮短篩選候選藥物之流程。
其二、可將製備完成之核殼蛋白溶液置放於多孔盤中,藉由多孔盤可同時地篩選大量候選藥物,節省反覆進行篩選實驗之時間以及所需人力。
其三、可準確篩選出能與核殼蛋白結合之候選藥物,以提昇新藥開發之成功率以及降低投入成本。
上述說明係針對本發明之可行實施例之具體說明,為該實施例並非用以限制本發明之專利範圍,凡未脫離本發明技術特徵所為之等效實施或是變更,均應包含於本案之專利範圍中。
第一圖係為質體pET21b之圖譜。
第二圖係為電泳圖,其中,右邊為經純化新型流感病毒台灣種之重組核殼蛋白之電泳圖,左邊係為豬源性A型流感病毒之重組核殼蛋白之電泳圖。
第三圖係為添加不同濃度之藥物Nucleozin與新型流感病毒台灣種之重組核殼蛋白所被測得螢光強度所作成之曲線圖。
第四圖係為添加藥物Nucleozin經過反應不同時間與新型流感病毒台灣種之重組核殼蛋白所被測得螢光強度所作成之曲線圖。
第五圖係為於添加不同濃度之藥物Nucleozin並分別反應不同時間時,新型流感病毒台灣種之重組核殼蛋白所測得螢光強度,經計算後,以得到相對螢光強度之數值與藥物Nucleozin之濃度與反應時間所作成之直條圖。
第六圖係為係為添加不同濃度之藥物Nucleozin與豬源性A型流感病毒之重組核殼蛋白所被測得螢光強度所作成之曲線圖。
第七圖係為添加不同濃度之藥物Nucleozin,與新型流感病毒台灣種之重組核殼蛋白與豬源性A型流感病毒之重組核殼蛋白分別被測得螢光強度而作成之直條圖。
第八圖係為添加不同濃度之化合物1017以及1018,與新型流感病毒台灣種之重組核殼蛋白被測得螢光強度所作成之直條圖。
第九圖A係為化合物1017中和試驗之結果圖。
第九圖B係為化合物1018中和試驗之結果圖。
Claims (7)
- 一種抗流感候選藥物之篩選套組,包含有:一載具;一預定濃度之核殼蛋白溶液,添加於該載具中,被用以分析該核殼蛋白溶液及其與一待測藥物結合後所表現之螢光強度。
- 依據申請專利範圍第1項所述抗流感候選藥物之篩選套組,其中,該核殼蛋白溶液係含有一經純化之重組核殼蛋白。
- 一種抗流感候選藥物之篩選方法,包含下列步驟:步驟a:製備一預定濃度之核殼蛋白溶液;步驟b:取一待測藥物,添加於該核殼蛋白溶液中;步驟c:分別檢測該核殼蛋白溶液與該待測藥物結合前後之螢光強度,用以運算得到一數值,當該核殼蛋白溶液與該待測藥物具有螢光淬滅現象時,該數值小於1,顯示該待測藥物係為具有抗流感能力之候選藥物,其中,該數值係由下式而得:(該核殼蛋白溶液之螢光強度-加入該待測藥物之該核殼蛋白溶液之螢光強度)/該核殼蛋白溶液之螢光強度。
- 依據申請專利範圍第3項所述抗流感候選藥物之篩選方法,其中,該步驟a更包含有:步驟a1:構築一重組核殼蛋白之表現載體,包含有一編碼為核殼蛋白之核苷酸序列;步驟a2:將該載體轉型至一宿主內,使該載體表現該重組核殼蛋白;步驟a3:萃取並純化該重組核殼蛋白,製備成為一預定濃度之重組核 殼蛋白溶液。
- 依據申請專利範圍第4項所述抗流感候選藥物之篩選方法,其中,該步驟a1中之編碼為核殼蛋白之胺基酸序列係以預定限制酶截切選自台灣種H1N1新型流感病毒之核殼蛋白。
- 依據申請專利範圍第4項所述抗流感候選藥物之篩選方法,其中,該步驟a1中之編碼為核殼蛋白之胺基酸序列係以預定限制酶截切選自豬源性A型流感病毒(swine-origin influenza A)之核殼蛋白。
- 依據申請專利範圍第4項所述抗流感候選藥物之篩選方法,其中,該宿主為一細菌。
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Citations (1)
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TW200904399A (en) * | 2007-03-13 | 2009-02-01 | Adamas Pharmaceuticals Inc | Compositions and kits for treating influenza |
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- 2011-07-01 TW TW100123296A patent/TWI479153B/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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TW200904399A (en) * | 2007-03-13 | 2009-02-01 | Adamas Pharmaceuticals Inc | Compositions and kits for treating influenza |
Non-Patent Citations (1)
Title |
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Kao RY et al., Identification of influenza A nucleoprotein as an antiviral target. Nat Biotechnol. 2010 Jun;28(6):600-5.Epub 2010 May 30. 陳冠任等人,高速篩選系統的建立與新藥物開發,化學66:4 1-7 ,2008.12 * |
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Publication number | Publication date |
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TW201303297A (zh) | 2013-01-16 |
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