CN101835494A - 制造酰肼的改良方法 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示自肼及酰基氯制备酰肼的方法，其包含以下步骤：(a)在低温下制备包含肼及惰性溶剂的实质上已搅拌均匀的浆液；及(b)向所述浆液中连续添加酰基氯。所述方法可避免或限制产生不期望的双酰肼副产物。所述方法可用于制备用以将卡奇霉素(calicheamicin)连接至单克隆抗体的3-甲基-3-巯基丁酸酰肼分子。

Description

制造酰肼的改良方法
技术领域
本发明涉及自肼及酰基氯制备酰肼的改良合成方法。所述酰肼产物具有可用于将卡奇霉素连接至单克隆抗体的经保护硫醇基团。
背景技术
麦罗塔(MYLOTARG)
Figure G2008800216526D00011
(吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin))也称为CMA-676或仅CMA，其由通过酸可水解连接体与卡奇霉素结合的抗CD33的单克隆抗体组成。当经衍生化的卡奇霉素与DNA小沟结合时，其干扰DNA进展并最终造成癌细胞死亡。所述市售产品以麦罗塔
Figure G2008800216526D00012
名称作为靶向第一抗体的化学治疗剂出售，且当前已批准用于治疗老年患者的急性髓性白血病(AML)。
统称为卡奇霉素或LL-E33288复合物的抗菌及抗肿瘤剂强效家族成员阐述于美国专利第4,970,198号；第4,939,244号及第5,079,233号中。所述家族成员可用于与作为载体的单克隆抗体形成治疗有用的免疫偶联物。抗体可为抗-CD33抗体(例如，hp67.6)、抗-CD22抗体(例如，G544)、抗-路易斯Y抗体(anti-Lewis Y antibody)(例如，G193)、抗-5T4抗体(例如，H8)或抗-CD20抗体(例如，利妥昔单抗(rituximab))。卡奇霉素家族成员优选为N-酰基卡奇霉素，更优选为N-乙酰基γ卡奇霉素。卡奇霉素家族成员含有甲基三硫醚，其可与合适硫醇反应形成二硫醚，同时引入可用于将卡奇霉素衍生物连接至载体的酰肼官能团。所述与卡奇霉素的反应的实例在美国专利第5,053,394号中给出。所述卡奇霉素酰肼衍生物经由形成腙而连接至单克隆抗体。例如，将药物的酰肼衍生物连接至氧化抗体的一般方法阐述于麦克恩(T.J.McKearn)等人，美国专利第4,671,958号中。美国专利第5,770,701号涉及制备目标形式的LL-E33288复合物的二硫醚化合物的方法。使连接体4-(4-乙酰基-苯氧基)丁酸与卡奇霉素酰肼衍生物(优选为卡奇霉素N-乙酰基γ二甲基酰肼)缩合以提供羧酸腙，所述羧酸腙用N-羟基琥珀酰亚胺进一步处理，得到准备用以与所选生物大分子偶联的OSu酯(N-琥珀酰亚胺基氧基)。卡奇霉素含有通过造成双链DNA断裂的-S-S-键结还原而激活的烯二炔弹头。因此，其中酰基含有巯基官能团的经单酰基化的肼可用于将卡奇霉素连接至单克隆抗体。3-甲基-3-巯基丁酸酰肼(也称为DMH连接体或CL-332258)是用于将卡奇霉素连接至单克隆抗体以制造(例如)吉妥单抗奥佐米星或伊妥单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)的优选含巯基N-酰肼。随后将经衍生化的卡奇霉素激活以与经人源化的单克隆抗体偶联得到CMA-676。当前，DMH连接体可通过5步反应方法经由中间体对-甲氧基苄基硫醚酰肼5制备。(化学方程式I-V)。在于USA实施的本制造过程中，对-甲氧基-苄基硫醇与3，3-二甲基丙烯酸的迈克尔加成(Michael addition)是经哌啶辅助(化学方程式I)。
化学方程式I
Figure G2008800216526D00021
所得硫醚酸(1)与草酰氯在二氯甲烷中反应形成对-甲氧基苄基硫醚酰氯(2)(化学方程式II)。
化学方程式II
Figure G2008800216526D00022
在低温(-70℃)下将酰氯(2)缓慢添加至肼/二氯甲烷(比率为约28％，v/v)的混合物中。以约74％产率形成对应的对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)(化学方程式III)：
化学方程式III
Figure G2008800216526D00023
然而，期望产物对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)通常含有约20％的不期望副产物双甲氧基苄基硫醚酰肼(参见下文化学方程式VI)。在酸性条件下移除苄基保护基团(化学方程式IV)，随后酸盐中和及纯化(化学方程式V)，以45％产率提供3-甲基-3-巯基丁酸酰肼(5)。
化学方程式IV
Figure G2008800216526D00031
不期望副产物双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)是自产物对-甲氧基苄基硫醚酰肼与起始材料对-甲氧基苄基硫醚酰氯的反应产生(化学方程式VI)。所述副产物产生导致产率及质量较低。
化学方程式VI
Figure G2008800216526D00032
使用原始方法程序，产生约20％的量的双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)。显然，自化学方程式III存在所述含量或更高含量的不期望副产物非我们所乐见。本发明阐述克服此问题并使不期望副产物的产率降低的技术。
发明内容
本发明的某些实施例提供合成酰肼(例如，3-甲基-3-巯基丁酸酰肼(4))同时将副产物双甲氧基苄基硫醚酰肼(例如，(6))的含量自约20％减少至约3-5％的方法。在本发明一个实施例中，将甲氧基苄基硫醚酰氯(2)溶液添加至经搅拌的肼/二氯甲烷混合物中，所述混合物较原始方法中的混合物更加稀释(例如，体积比＝14％，相对于原始方法中的约24％至32％v/v)。优选稀释体积比为约14％v/v。任选地且不加限制，其它非反应性(或惰性)经卤化溶剂(替代二氯甲烷或与其组合)可用于本文所述的本发明实施例中，以形成向其中添加酰氯的肼混合物。所述其它溶剂的优选实例包括四氯化碳、氯仿、二氯乙烷及氯苯。在某些实施例中，二氯甲烷(或对应惰性溶剂)的量加倍，此可显著减少不期望双酰肼副产物的量。在某些实施例中，将甲氧基苄基硫醚酰氯溶液以稳定速率连续地而非逐份添加至肼/二氯甲烷浆液中。在某些实施例中，调节添加速率以使反应温度保持在-68℃至-75℃。在某些实施例中，于圆底烧瓶中使用介于300rpm至400rpm之间的搅动速度，或于莫顿(Morton)型烧瓶中使用270rpm的搅动速度。本发明某些方法以91.1％浓度以85％产率获得对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)，形成约4.7％的双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)。
在本发明的另一实施例中，已发现，尽管通过使用更加稀释的二氯甲烷系统已获得改良，但仍需要刮掉反应器容器底部及侧部的冰冻结晶的肼。先前标准操作是将二氯甲烷/肼溶液一起冷却至约-70℃。此使得相当部分的肼在容器侧部结晶及沉淀。为确保所有肼都可为反应所利用，需要自容器壁刮掉所述物质以使其形成可搅拌的浆液。为避免所述情形，发明了作为本发明某些实施例一部分的替代程序。所述替代程序涉及将二氯甲烷冷却至-68℃至-75℃，优选为-70℃，随后向所述冷二氯甲烷中缓慢逐滴添加肼以形成均匀浆液。此新程序可形成更加均匀的肼浆液，此使得烧瓶内壁上形成的结晶肼最少化，并减少或消除了刮削烧瓶的需要。此使得反应可利用期望量的肼，有助于减少双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)的形成。
本发明的某些实施例提供涉及向相当稀释(自原始方法角度)且可搅拌的经冷却肼/二氯甲烷非均质混合物(优选具有约14％的肼浓度)中连续添加甲氧基苄基硫醚酰氯(2)溶液的方法。将甲氧基苄基硫醚酰氯溶液以大致稳定的速率连续地而非逐份添加至肼/二氯甲烷浆液中。优选调节添加速率以使反应温度保持在-68℃至-75℃。优选为于圆底烧瓶中介于300rpm至400rpm之间的搅动速度，或于莫顿型烧瓶中270rpm的搅动速度。本发明某些实施例的改良方法使副产物双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)的含量自先前所达成的约20％含量降低至约3-5％或更低。中间体1的改良合成使得合成吉妥单抗奥佐米星的总方法效率得以提高。
本发明的某些实施例提供自肼及酰基氯制备酰肼的方法，其包含以下步骤：(a)制备包含肼及惰性溶剂的实质上已搅拌均匀的浆液；及(b)向所述浆液中连续添加酰基氯。在所述实施例的另一方面中，在添加步骤(b)中所述酰基氯实质上逐滴添加至所述浆液中。
本发明的某些实施例提供自酰基卤及肼制备酰肼的方法。在一个实施例中，所述制备是经由酰基氯的亲电酰基羰基与肼的亲核氮间的化学反应实现。与适于本发明的酰基羰基连接的特定取代基可为不妨碍酰肼键结形成的任一部分，包括纳入保护基团以防止妨碍酰肼键结形成的所述部分。保护基团的使用及移除阐述于麦克妙(McOmie)，有机化学中的保护基团(Protecting Groups in Organic Chemistry)，普雷那姆出版社(Plenum Press)，NY，1973；及格林(Greene)及伍兹(Wuts)，有机合成中的保护基团(Protecting Groups in Organic Synthesis)，第4版，约翰威利父子出版公司(JohnWiley & Sons)，NY，2006中。例如，在本发明的某些实施例中，酰基卤包含经保护硫醇。经保护硫醇的实例包括但不限于苄基硫醚。
在本发明的另一方面中，酰基氯具有以下结构：
Figure G2008800216526D00051
其中P是硫醇保护基团，R1及R2各选自由C1-C5烷基组成的群组，且L是亚烷基连接体。亚烷基连接体L的实例包括但不限于L是-(CH2)n-，其中n是1至5的整数。在某些实施例中，R1及R2相同，例如当R1及R2二者均为相同的C1-C5烷基时。C1-C5烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基，包括其直链及具支链同分异构体二者。硫醇保护基团的实例包括但不限于苄基，其中苯基部分任选地经取代。可选取代基的实例包括但不限于烷氧基，例如甲氧基、乙氧基及其类似物。因此，在本发明的一个实施例中，酰基氯具有以下结构：
Figure G2008800216526D00052
本发明的另一实施例是自肼及酰基氯制备酰肼的方法，其包含制备包含肼及惰性溶剂的实质上已搅拌均匀的浆液的第一步骤。在所述实施例的另一方面中，惰性溶剂是二氯甲烷。
本发明的另一实施例是自肼及酰基氯制备酰肼的方法。在所述实施例的另一方面中，酰肼产物具有以下结构：
其中P是硫醇保护基团，且L及R1及R2可如上所述。在所述实施例的再一方面中，P是任选地在苯环上经取代的苄基。在所述实施例的另一方面中，P是对-甲氧基苄基，且R1及R2各选自由C1-C5烷基组成的群组，且L是亚烷基连接体。亚烷基连接体的实例包括但不限于L是-CH2-。在一个实施例中，R1及R2各独立为甲基。
本发明的另一实施例是按照本发明方法制备的酰肼产物。在一个实施例中，期望酰肼具有以下结构：
Figure G2008800216526D00054
或其盐。在本发明的再一实施例中，酰肼是3-甲基-3-巯基丁酸酰肼。
在本发明的另一方面中，期望酰肼产物含有小于5％的具有以下结构的双酰肼副产物：
Figure G2008800216526D00061
其中R及R’是任选地经取代的烷基、杂烷基或杂烷芳基。
在所述实施例的另一方面中，双酰肼副产物中的R及R’部分各为
其中P是硫醇保护基团，R1及R2各选自由C1-C5烷基组成的群组，且L是亚烷基连接体。亚烷基连接体L的实例包括但不限于-CH2-。在所述实施例的另一方面中，R1及R2各独立为甲基。在所述实施例的另一方面中，P是任选地在苯环上经取代的苄基；实例包括但不限于P是对-甲氧基苄基。
本发明的另一实施例是自肼及酰基氯制备酰肼的方法，其中所述酰肼产物含有小于5％的具有以下结构的双酰肼副产物：
Figure G2008800216526D00063
本发明的另一实施例是自肼及酰基氯制备酰肼的方法，其包含制备包含肼及惰性溶剂的实质上已搅拌均匀的浆液的第一步骤及随后向所述浆液中连续添加酰基氯的第二步骤。在所述实施例的另一方面中，调节所述酰氯溶液的连续添加以使反应温度保持在约-68℃至约-75℃。在所述实施例的再一方面中，所述肼浆液实质上均匀。
在本发明的另一实施例中，酰肼键结是按照包含以下步骤的方法制备：(a)将包含经搅拌惰性溶剂的反应容器冷却至期望低温；(b)以连续方式向所述反应容器中添加肼，由此制备包含肼及惰性溶剂的实质上已搅拌均匀的浆液；(c)以连续方式向所述浆液中添加酰氯，由此形成酰肼键结。在所述实施例的另一方面中，惰性溶剂是二氯甲烷。
在本发明的另一实施例中，肼浆液是通过包含以下步骤的方法制备：(a)将惰性溶剂冷却至约-68℃至约-75℃温度，及(b)向所述冷惰性溶剂中逐滴添加溶解于惰性溶剂中的肼。在所述实施例的另一方面中，惰性溶剂是二氯甲烷。在所述实施例的又一方面中，将所述肼浆液在约270rpm至约400rpm的速度下搅拌。
本发明的另一实施例是制备卡奇霉素家族成员与作为载体的单克隆抗体的免疫偶联物的方法，其包含按照本发明方法制备经单酰基化的肼(其中酰基含有S经保护的巯基官能团)，移除保护基团并使用所得酰肼来制备所述免疫偶联物。本发明的另一实施例是制备吉妥单抗奥佐米星或伊妥单抗奥佐米星的方法，其包含按照本发明方法制备连接体3-甲基-3-巯基丁酸酰肼并使用所述连接体来制造吉妥单抗奥佐米星或伊妥单抗奥佐米星的步骤。
附图说明
图1是制备对-甲氧基苄基硫醚酸(1)的示意性方法。
图2是制备对-甲氧基苄基硫醚酰氯(2)及对-甲氧基苄基硫醚酸酰肼(3)的示意性方法。
图3是制备DMH连接体(5)的示意性方法。
具体实施方式
对-甲氧基苄基硫醇在哌啶中经历与3，3-二甲基丙烯酸的迈克尔加成。试剂的量影响反应结果。在一个实施例中，对-甲氧基苄基硫醇的量略微莫耳过量于3，3-二甲基丙烯酸，例如介于0.354(2.3mol)与0.362kg(2.35mol)之间的范围内。若量低于所述范围，则随后可能不完全反应。若量高于所述范围，则过量试剂可能使处理变得复杂。将反应混合物加热(注意不要超过约98℃)最少约15小时以避免形成过多杂质。通过用二氯甲烷稀释并用盐酸水溶液及随后水洗涤移除哌啶。在添加HCl之前及期间需要将温度保持高于50℃且低于90℃以避免反应产物沉淀。如实验部分所指示，将反应物进一步冷却并随后用二氯甲烷萃取。
所用溶剂的量随反应规模成正比调整，以获得最佳结果及纯化。将所得CH2Cl2产物溶液用硫酸镁干燥，净化，在真空中浓缩，随后用庚烷稀释以沉淀粗中间体，将粗中间体过滤并用庚烷洗涤。纯化是通过将粗物质再溶解于二氯甲烷中并再次用庚烷沉淀实现。将经纯化的对-甲氧基苄基硫醚酸(1)过滤分离，用庚烷洗涤并在真空中干燥。
使用草酰氯以二氯甲烷作为溶剂将对-甲氧基苄基硫醚酸(1)转化成对应酰氯。草酰氯应对于对-甲氧基苄基硫醚酸莫耳过量存在以完全反应。通过在真空中浓缩以移除二氯甲烷/过量草酰氯而将酰氯产物分离为油状物。将所得油状物用二氯甲烷稀释，并在约3-5小时时间内于65℃至75℃温度范围内缓慢添加至肼与二氯甲烷的经稀释混合物中。
本发明的一个方面是形成包含肼及诸如二氯甲烷等惰性溶剂的均匀浆液。根据本发明的一个实施例，均匀浆液是通过将液体肼缓慢逐滴添加至在开始添加肼之前已经预冷却至约68℃至-75℃(优选为-70℃)的二氯甲烷中来制备。相反，将肼存于二氯甲烷中的预混合溶液冷却至相同温度会不利地导致形成结晶肼，结晶肼集中在反应容器的侧部。不受限于理论，我们认为将肼缓慢逐滴添加至经预冷却的二氯甲烷中并控制二氯甲烷中肼的最大浓度使得形成较小、较均匀的肼晶体，所述肼晶体仍悬浮于二氯甲烷的经搅拌混合物中并实质上不会冻结在容器壁上。形成实质上均匀的浆液有助于确保肼仍与经搅拌的二氯甲烷接触且可为与引入的酰氯溶液的反应所利用。形成均匀浆液排除了现有方法中所需要的刮削反应烧瓶内部的需要。另外，此确保反应可以利用期望量的肼，此也使所形成的双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)的量减少。
二氯甲烷中的肼浓度影响作为副产物形成的双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)的量。在现有方法中，肼/二氯甲烷的浓度为约24-32％v/v。将肼/二氯甲烷(更加稀释肼)的比率减半至约12-16％v/v(优选为约14％v/v)使得所形成的不期望双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)的量降低(见表1)。
表1改良后的方法结果
  实验编号   酰肼浓度*(％)   双酰肼副产物(％)   经校正酰肼产率(％)
  1.1   91.61   9.69   85.4
  实验编号   酰肼浓度*(％)   双酰肼副产物(％)   经校正酰肼产率(％)
  1.2   95.08   5.76   87.7
  1.3   96.16   4.13   89.6
  1.4   93.76   7.36   85.7
*通过高压液相色谱测定
在本发明的某些实施例中，将酰氯溶液以稳定速率连续地而非逐份添加至肼/二氯甲烷浆液中。所添加酰氯的量及其添加速率二者均影响期望的甲氧基苄基硫醚(3)的产率。若添加太少酰氯，则可能形成过多量的双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)副产物。而且，若酰氯的添加时间太短，少于3hr，则可能形成过多量的双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)副产物。可调节添加速率，以使反应温度保持在-68℃至-75℃。若反应温度升至较高温度，则也可能形成过多量的双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)副产物。优选为于圆底烧瓶中以300rpm至400rpm之间的搅动速度或在莫顿型烧瓶中以270rpm的搅动速度搅拌肼浆液。所述改良方法的两个方面-使用更加稀释的肼/二氯甲烷混合物及形成均匀浆液使得副产物双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)的含量自约20％减少至约3-5％。形成肼的改良方法步骤使合成连接体3-甲基-3-巯基丁酸酰肼的总效率得以提高，且因此也使制备麦罗塔
Figure G2008800216526D00081
(吉妥单抗奥佐米星)的总效率得以提高。
反应完成后，在真空中浓缩反应混合物，并用氢氧化钠的甲醇溶液(约4-5％)处理残留物。将所述溶液在真空中浓缩，用二氯甲烷稀释，用水洗涤，经硫酸镁干燥，净化并在真空中浓缩成浓缩物。应注意使用足量硫酸镁以完全干燥产物，以免在下一合成步骤中出现产物分解或产物结晶的干扰。将最终浓缩物用1.33倍对-甲氧基苄基硫醚酸(1)重量的二氯甲烷稀释，并将所述溶液添加至7.6倍对-甲氧基苄基硫醚酸(1)重量的二乙醚中。将1.83倍对-甲氧基苄基硫醚酸(1)重量的诸如庚烷、己烷、辛烷或异己烷(优选为庚烷)等脂族烃溶剂添加至所得浆液中，以完成沉淀。将对-甲氧基苄基硫醚酰肼(6)过滤分离，用庚烷洗涤，并在真空中干燥。
在苯甲醚存在下使用三氟乙酸作为溶剂用三氟甲磺酸处理对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)。必须注意，在添加及随后反应时间期间反应温度不应超过约20℃以避免形成不期望杂质。在对-甲氧基苄基保护基团的解离完成后，使反应混合物在甲醇中骤冷，并过滤以移除固体副产物。将滤液在真空中浓缩，溶解于水中，用二氯甲烷洗涤，并用阴离子交换树脂处理以得到3-甲基-3-巯基丁酸酰肼(5)。通过过滤移除树脂，并随后向粗产物溶液中添加盐酸水溶液以形成HCl盐。将批料在真空中浓缩，溶解于乙醇中，通过过滤净化并在真空中浓缩。将所述浓缩物用乙酸乙酯稀释并在真空中浓缩。再次，将残留物用乙酸乙酯稀释，随后过滤分离。将湿滤饼与乙酸乙酯加热至约48℃至55℃，冷却，过滤并抽吸干燥。通过在水中用阴离子交换树脂处理将干燥HCl盐转化成游离碱。通过过滤移除树脂，并在真空中浓缩滤液。将浓缩物溶解于乙醇中，在真空中浓缩，在二乙醚中制浆，并在真空中浓缩。作为最终纯化，将3-甲基-3-巯基丁酸酰肼(5)溶解于二氯甲烷中，通过过滤净化，并用硅石(其随后通过过滤移除)处理。通过在真空中浓缩来分离溶液中的经纯化产物。在一优选纯化方法(展示于实例15中)中，在20℃±3℃下将3-甲基-3-巯基丁酸酰肼(5)溶解于50份(v/w)二氯甲烷中，搅拌30分钟并过滤。将所得溶液用0.7-1份(w/w，相对于粗连接体)硅胶处理，搅拌30分钟，过滤，并在旋转蒸发器上浓缩至干燥。所得固体用正庚烷研磨。分离并在真空中干燥后，以约76％产率获得自由流动固体形式的3-甲基-3-巯基丁酸酰肼(5)。
本发明的一个方面是提供含有小于5％的不期望副产物双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)的对-甲氧基苄基硫醚酰肼的方法。所述改良方法包含用于使硫醚酰氯与肼结合以形成对-甲氧基苄基硫醚酰肼的改进方法。所述方法步骤示意性地显示于化学方程式I中。不期望副产物双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)是自产物对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)与起始材料对-甲氧基苄基硫醚酰氯(2)的结合产生。产生不期望的双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)导致质量及产率较低。
在本发明的另一方面中，所述方法揭示内容可概念性地理解为涵盖较宽应用。具体反应顺序(化学方程式III)可根据化学方程式VII加以推广：
化学方程式VII
Figure G2008800216526D00091
当在方法步骤中物质阐述为连续添加时，则意指所述添加是在一段时间内稳定地而非逐份或一次性地发生。逐滴添加液体或通过稳定流添加液体是连续添加的实例。在某些实施例中，连续添加是通过将反应放热的物质的添加速率控制在足够缓慢以使反应物温度保持在一定温度范围内的速率实现。
本文所用的浆液是指固相与液相的组合，其充分混合在一起且通常冷却至支持固相及液相二者均存在的温度，而所述混合物在环境温度下将为纯液体。有时，浆液用以指相同物质的固体/液体混合物的混合物，例如冰/水混合物，其中冰相对细碎并与液体水充分混合。在本发明上下文中，浆液可指自两种物质(例如肼及诸如二氯甲烷等溶剂)的组合形成的固体/液体混合物。在经冷却的肼/二氯甲烷浆液中，认为液相含有二氯甲烷与肼的混合物，而认为固相主要为肼。
术语“烷基”包括具有1个至10个碳原子的直链或具支链烷基，且优选为具有1个至5个碳原子的低碳数烷基。例如，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、2-甲基丁基、正己基、异己基、庚基、异庚基、辛基、异辛基、壬基、癸基及其类似物。术语“亚烷基”包括具有1个至10个碳原子的烷烃的直链及具支链二价基团，例如亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基、亚丁基及亚戊基。
术语“杂烷基”是指其中一或多个碳原子被杂原子(氧、硫、氮或磷原子)置换的本文所定义烷基，且可任选地含有额外杂原子。术语杂烷芳基是指如上所述但进一步经芳基部分取代的杂烷基部分，其中所述芳基部分可任选地经取代。任选地经取代的芳基包括苯基及经取代苯基。在经取代苯基中，一个、两个或三个可选取代基可能取代苯环上的氢，且位于苄基碳的亚甲基的邻位、间位及/或对位(或其它连接点)。在实例1中，甲氧基位于亚甲基的对位。可选芳基取代基的非限制性实例包括C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、C1-C5卤代烷基、C1-C5卤代烷氧基，其中与烷基或烷氧基碳连接的氢原子可被卤素原子置换，如(例如)在-CF3及-OCF3中。
以下非限制性实例阐释本发明。
实例1
对-甲氧基苄基硫醚酸(1)的原始制备
参考化学方程式I，向装备有热电偶、机械搅拌器、顶部带有N2入口的回流冷凝器及250mL压力平衡加料漏斗的5L圆底烧瓶中加入400g，465mL，4.70mol哌啶。将3，3-二甲基丙烯酸(215g，2.15mol)逐份添加至经搅拌的5L反应烧瓶中。将反应物在N2中剧烈搅拌。添加期间使反应温度保持低于35℃至40℃(注：强放热，即，排放气体)。将对-甲氧基苄基硫醇(386g，323mL，2.32mol)经由压力平衡加料漏斗经15分钟加入(5L)反应烧瓶中。将混合物在N2中边搅拌边加热至82℃至88℃。使反应温度在所述范围内保持15分钟。注：放热。将澄清黄色混合物在N2中边搅拌边加热至92℃至95℃，保持最少15小时。取1mL样品用于HPLC分析。当以面积计3，3-二甲基丙烯酸剩余小于3％时，认为反应完成。通过移除加热包将反应物冷却至70℃至75℃。
将3M盐酸溶液(1,900mL，2,090g)经由1L压力平衡加料漏斗添加至经搅拌的黄色溶液中，同时保持温度低于90℃。最终温度为70℃至75℃。通过施用冷水浴将混合物冷却至20℃至25℃。将二氯甲烷(1,600g，1,210mL)加入至所述非均质混合物中。将所述混合物搅拌5分钟。检测烧瓶中上部水性层的pH值，并视需要添加3M HCL直至所述水性层的pH值小于2。将所述5L反应烧瓶的全部所含物转移至4L分液漏斗中。使所述两层分离最少10分钟。将有机(底)层自分液漏斗转移回5L反应烧瓶中。将水性(顶)层自分液漏斗转移至(4L)爱伦美氏烧瓶(Erlenmeyer flask)中。经10分钟将3M盐酸溶液(1,050mL，1,154g)经由1,000mL压力平衡加料漏斗加入至5L容器中的二氯甲烷溶液中。检测烧瓶中上部水性层的pH值，并视需要添加3M HCL直至所述水性层的pH值小于2。将所述5L反应烧瓶的全部所含物转移至4L分液漏斗中。记录合并的体积。使所述两层分离最少10分钟。将有机(底)层自分液漏斗转移至4L干净爱伦美氏烧瓶中。将水性(顶)层自分液漏斗转移至4L干净爱伦美氏烧瓶中。将水性层合并至5L反应烧瓶中。
向先前步骤中所获得的水溶液中加入二氯甲烷(305mL，400g)。将混合物搅拌最少5分钟。将5L烧瓶的全部所含物转移至6L分液漏斗中，并记录合并的体积。使所述两层沉降至少5分钟。将有机(底)层自分液漏斗转移至4L爱伦美氏烧瓶中。用1,000mL水洗涤所述二氯甲烷溶液。将混合物充分搅拌1至2分钟，并随后使其沉降最少10分钟。分离水性层。量测烧瓶中水性层的pH值。合并水性层并丢弃。向二氯甲烷溶液中添加无水硫酸镁(110g)，并搅拌至少15分钟。将(5L)反应烧瓶在800mL、900mL及1,000mL水平处预作标记。使用抽吸，通过带有滤纸(沃特曼(Whatman)#1)的15cm布氏漏斗(Buchner funnel)将黄色混合物过滤至5L反应烧瓶中。用300mL，400g二氯甲烷冲洗烧瓶及滤饼。如下对所述二氯甲烷溶液实施浓缩：给5L圆底烧瓶装备机械搅拌器及配备有热电偶的克氏蒸馏头(Claisen still head)。使所述蒸馏头与30cm简易冷凝器相连，并使所述冷凝器与配备有在冰浴中冷却的1L烧瓶的接受器应接管连接。使所述接受器应接管与冰冷捕获器相连。使所述冷捕获器与真空泵相连。
在15℃至35℃温度下于真空中将二氯甲烷自5L烧瓶中的溶液中蒸馏出来，直至瓶容积达到约900mL。丢弃馏出物。将5L反应烧瓶的所含物的温度调节至15℃至20℃。经最少约10分钟将庚烷(2,442mL，1,670g)经由压力平衡加料漏斗加入至经搅拌的浓缩溶液中。在添加约1,000ml，684g庚烷后形成沉淀。经最少20分钟边搅拌边将非均质混合物冷却至0℃至5℃温度，并在所述温度下维持最少30分钟。通过带有沃特曼#1滤纸的30cm布氏漏斗来过滤5L反应烧瓶的所含物。滤液收集在4L抽吸烧瓶中。用2×310mL，2×212g庚烷冲洗5L反应烧瓶至滤饼中。抽吸干燥所述滤饼，直至实质上收集不到滤液且持续最少25分钟。滤饼高约20mm。滤饼重约601g。丢弃滤液。将滤饼转移至装备有热电偶、机械搅拌器、N2入口及1L压力平衡加料漏斗的5L圆底烧瓶中。向5L反应烧瓶中加入二氯甲烷(750mL，990g)，并搅拌直至所有固体都溶解(约10分钟)。向所述5L反应烧瓶中加入庚烷(1,060mL，725g)。使用冰浴经最少15分钟将非均质溶液冷却至0℃至5℃，并随后搅拌至少30分钟。观察到稠非均质溶液。在带有沃特曼#1滤纸的30cm布氏漏斗上过滤5L反应烧瓶的所含物。滤液收集在4L抽吸烧瓶中。用2×310mL，2×212g庚烷冲洗5L反应烧瓶至滤饼中。抽吸干燥所述滤饼，直至实质上收集不到滤液(最少20分钟)。滤饼高约20mm。滤饼重约632g。丢弃滤液。将湿滤饼转移至干燥盘中。给含有对-甲氧基苄基硫醚酸的干燥盘覆盖上干净滤纸。将产物在38℃至40℃且28-30英寸汞柱真空的真空烘箱中干燥约20小时。
实例2
对-甲氧基苄基硫醚酰氯(2)的原始制备
参考化学方程式II，将对-甲氧基苄基硫醚酸(400g，1.57mol)加入至装备有热电偶、机械搅拌器、顶部带有N2入口的回流冷凝器及0.5L压力平衡加料漏斗的5L圆底烧瓶中。向所述5L反应烧瓶中加入二氯甲烷(1,600g，1,212mL)。将澄清溶液加热至20℃至25℃。向0.5L压力平衡加料漏斗中加入二氯甲烷(300g)及草酰氯(110g，78mL)。经由加料漏斗添加350mL草酰氯/二氯甲烷溶液，同时使反应温度保持在20℃至30℃。将澄清黄色溶液在20℃至25℃下搅拌最少30分钟，直至起泡平息。重复添加草酰氯。将350ml草酰氯/二氯甲烷溶液经由压力平衡加料漏斗添加至反应烧瓶中，同时使反应温度保持在20℃至30℃(添加时间约为45分钟)。将反应混合物加热至约32℃至38℃。使经搅拌溶液在所述温度范围内维持最少1小时。取1mL样品用于HPLC分析。当以面积计甲氧基苄基硫醚酸起始材料剩余小于3％时，认为反应完成。经最少5分钟将反应物冷却至23℃至28℃。将溶液转移至配衡3L圆底烧瓶中。用100ml，132g二氯甲烷将反应烧瓶冲洗至3L烧瓶中。通过旋转蒸发器且浴温设置在33℃至36℃且压力为25-28英寸汞柱在真空中浓缩反应溶液，直至无挥发物剩余。最终重量为1,367g，且对-甲氧基苄基硫醚酰氯的净重为500.3g。丢弃馏出物。
实例3
对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)的原始制备
参考化学方程式III，给5L莫顿型圆底烧瓶装备热电偶、机械搅拌器、顶部带有N2入口的回流冷凝器及0.5L压力平衡加料漏斗。将对-甲氧基苄基硫醚酰氯溶解于500ml，660g二氯甲烷中。将溶液转移至2L爱伦美氏烧瓶中。添加500ml二氯甲烷以使溶液总体积补充至1,300mL。
在5L莫顿型圆底烧瓶(RBF)(莫顿型)中，加入2,400g、1,818mL二氯甲烷及256g、245mL、98％浓度、7.8mol的无水肼。机械搅拌器速度设置为255-270rpm。使用干冰/丙酮将混浊浆液冷却至-69℃至-72℃。
将酰氯溶液经由0.5L压力平衡加料漏斗逐滴添加至5L反应烧瓶中，同时使反应温度保持在-68℃至-72℃。重要的是，调节甲基苄基硫醚酰氯溶液至经搅拌肼/二氯甲烷浆液中的添加速率，以确保反应温度低于-67℃。约3小时后完成添加。使经搅拌反应物维持在-68℃至-72℃最少30min。取1mL样品用于HPLC分析。通过移除冰浴使溶液升温至室温(20℃至30℃)。
将反应混合物转移至配衡3L圆底烧瓶中。在真空中通过旋转蒸发器浓缩反应溶液。浴温设置为32℃至36℃且压力为25-28英寸汞柱。移除所有挥发物。最终重量为1,490.7g，且粗固体对-甲氧基苄基硫醚酰肼的净重为630g。丢弃馏出物。
向粗对-甲氧基苄基硫醚酰肼固体中添加甲醇(1,250g，1,580mL)，并将非均质混合物在33℃至36℃下在5L圆底烧瓶中混合最少5分钟直至获得澄清溶液。将粗对-甲氧基苄基硫醚酰肼/甲醇溶液转移至5L反应烧瓶中。
在28℃至34℃下经8分钟将1,312g 4％氢氧化钠/甲醇溶液加入至5L反应烧瓶中。将澄清混合物在33℃至36℃下搅拌20分钟。形成浅色沉淀。
在带有滤纸(沃特曼#1)的30cm布氏漏斗上过滤5L反应烧瓶的所含物。用200mL，158g甲醇冲洗(5L)反应烧瓶。将滤液转移至配衡3L圆底烧瓶中。在真空中通过旋转蒸发器浓缩反应溶液。浴温设置为36℃至40℃且压力为25-28英寸汞柱。移除所有挥发物。最终重量为1,484g，且粗对-甲氧基苄基硫醚酰肼固体的净重为622.7g。丢弃馏出物。将固体溶解于700g，530mL二氯甲烷中。将非均质混合物在旋转蒸发器(非真空)中于33℃至36℃下混合最少10分钟直至获得澄清溶液。
在真空中通过旋转蒸发器浓缩所述溶液。浴温设置为36℃至40℃，压力为28-30英寸汞柱。移除所有挥发物。最终重量为1,494.2g，且粗对-甲氧基苄基硫醚酰肼固体的净重为632.5g。丢弃馏出物。用2,100mL，2,772g二氯甲烷溶解固体。将非均质混合物在20℃至25℃下混合最少5分钟直至获得澄清溶液。向所述二氯甲烷溶液中添加110g无水硫酸镁，并将混合物搅拌1小时。使用抽吸，通过带有滤纸(沃特曼#1)的15cm布氏漏斗(Buchner funnel)将黄色混合物过滤至5L反应烧瓶中。用500mL，660g二氯甲烷冲洗烧瓶及滤饼。将滤液转移至配衡3L圆底烧瓶中。在真空中通过旋转蒸发器浓缩溶液。浴温设置为32℃至35℃，压力为20-25英寸汞柱。移除所有挥发物。最终重量为1,090g，且粗对-甲氧基苄基硫醚酰肼固体的净重为643g。丢弃馏出物。
用400mL，528g二氯甲烷溶解固体。将非均质混合物在35℃至40℃下混合最少5分钟直至获得澄清黄色溶液。将4,260mL，3,040g醚加入至装备有热电偶、机械搅拌器、N2入口及2L压力平衡加料漏斗的12L圆底烧瓶中。使用盐水及冰将醚在12L烧瓶中冷却至0℃至-10℃。将黄色对-甲氧基苄基硫醚酰肼/二氯甲烷溶液(上文制备)经由压力平衡加料漏斗添加至经300-400rpm快速搅拌的醚中，同时使温度保持在0℃至-10℃。加入1,070mL，732g庚烷。将所述非均质混合物在0℃至-5℃下搅拌20分钟。通过带有滤纸(沃特曼#1)的30cm布氏漏斗过滤(12L)反应烧瓶的所含物。滤液收集在4L抽吸烧瓶中。用1,070mL，732g庚烷将5L反应烧瓶冲洗至滤饼中。丢弃滤液。将所述滤饼抽吸干燥最少50分钟，直至实质上收集不到滤液。滤饼高15mm。滤饼重429g。将湿滤饼转移至干燥盘中。给含有甲氧基苄基硫醚酸的干燥盘覆盖上干净滤纸。将产物在38℃至40℃且28-30英寸汞柱真空的真空烘箱中干燥至少18小时。
使用实例1-3的方法的典型批料反应的结果汇总于表2中。
表2在增添方法改良之前的典型批料
  批料编号   酰肼浓度(％)   双酰肼副产物(％)   经校正酰肼产率(％)
  2.1   78.5   22.1   67.8
  2.2   78.4   19.3   74.8
实例4
对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)的改进制备
为减少副产物双甲氧基苄基硫醚酰肼(6)的含量，对影响分离产物对-甲氧基苄基硫醚酰肼中所述副产物形成的反应参数进行研究。重复实例3的程序。在-78℃下，肼/CH2Cl2溶液是不可搅拌的冰冻混合物。胶粘块粘着于反应烧瓶上，而搅拌桨在空气中旋转。将硫醚酰氯/CH2Cl2溶液逐滴添加至所述肼/CH2Cl2(28％v/v)冰冻混合物中，同时使温度保持在约-72℃。添加结束时的HPLC分析(温度为-72℃)显示反应很少。此与其是快速反应的预期相反。此可能是由于反应中缺少适当混合所致。使大量未反应的反应混合物升温。当温度达到约-50℃时，成为可搅拌的非均质混合物，随后快速放热，推动温度立即到-28℃，反应颜色由黄色变成灰白色。此得出无效混合可能导致有利于产生双酰肼的局部反应的假定。升温至室温并如实例3中实施反应，提供作为主要产物的双酰肼(82％，HPLC面积％)。此远远高于通常不期望含量20％。我们推断所添加的硫醚酰氯(2)/CH2Cl2溶液未与肼的冰冻块有效混合。
实例5
温度对对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)制备的影响
实例5重复实例4的相同反应，只是在0℃下而非在约-72℃下实施。将硫醚酰氯/CH2Cl2溶液逐滴添加至可搅拌的肼/CH2Cl2(28％v/v)均质溶液中。在所述情形下，形成39％(HPLC面积％)的双酰肼。所述条件意味着较低温度及搅拌是影响不期望副产物形成的因素。实例3.1及3.2的结果汇总于表3中。
表3对-甲氧基苄基硫醚酰肼的制备随温度的变化
实例6
肼浓度对对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)制备的影响
随后检验在低温下使用较低浓度的肼的影响。结果汇总于下表4中。在-65℃至-72℃下通过将肼/CH2Cl2稀释至5％及19％浓度(相对于28％(v/v))来制备肼/CH2Cl2的可搅拌非均质混合物。分别在19％及5％的肼/CH2Cl2浓度下实施的表4中的实验4.1及4.2提供可搅拌的非均质混合物，其与硫醚酰氯反应获得双酰肼副产物含量分别为3％及5％的期望产物。使用较少肼(表4中的实验4.3使用5mol当量，相对于10mol当量)重复相同反应产生仅3％的双酰肼。相对于硫醚酸，肼的典型量为5mol当量。使肼的量加倍至10mol当量(表4：实验4.1及4.2)不会显著改变最终产物中双酰肼的含量。
将酰氯以较快速率(参见表4中的实验4.4及4.5，其使用1mL/min，相对于0.25mL/min)添加至稀释肼/CH2Cl2非均质混合物(5％及19％)中分别产生含量为3％及9％的双酰肼。双酰肼的含量急剧下降(自82％至3％，参见上文表3中的实验3.1及表4中的实验4.4)可能归因于一或多个以下因素：温度、浓度、肼的量、添加速率及混合。表4中的实验4.5中产生9％的双酰肼可能由起始无效搅拌造成。
表4在肼/CH2CL2的多种稀释下制备对-甲氧基苄基硫醚酰肼
Figure G2008800216526D00151
实例7
温度对对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)制备的影响
温度对产物中双酰肼含量的影响在表5中予以检验。在将硫醚酰氯于-20℃及-72℃(表5：实验5.1及5.2)下添加至经搅拌肼/CH2Cl2(19％v/v)混合物中的实验中，分别产生28％及4％含量的双酰肼。在实验5.3及5.4(表5)中观察到类似结果。以上结果表明，较低反应温度(约-70℃)对于获得较低含量(3-5％)的双酰肼是必需的。
表5温度对所形成双酰肼含量的影响
Figure G2008800216526D00152
实例8
肼浓度对对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)制备的影响
对表4中实验的检验揭示-70℃左右的添加温度及19％或5％(v/v)的肼/CH2Cl2浓度产生的结果相当。所述观察结果在表6中进一步予以检验。在表6中的实验6.1、6.2及6.4(其中硫醚酰氯是以19％、14％及10％浓度添加至肼/CH2Cl2的非均质混合物中)中，分别产生6％、13％及4％含量的双酰肼。反应体积、烧瓶尺寸及搅动速度保持恒定。结果显示以19％浓度的反应与以10％浓度的反应的结果相当。以30g规模重复14％的肼/CH2Cl2浓度实验(表6中的实验6.3)，获得仅含有3％双酰肼杂质的期望产物。实验6.2中双酰肼的含量较高归因于起始快速添加酰氯造成反应温度在快速调节之前达到峰值-57℃。
表6肼/CH2CL2浓度对所形成双酰肼含量的影响
Figure G2008800216526D00161
实例9
混合速度对对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)制备的影响
检验混合的影响(表7)。实验7.2及7.1显示较快混合(400rpm相对于200rpm)产生较少双酰肼(22％相对于40％)。考虑到与表8中20mL液体存于100mL烧瓶中相比50mL烧瓶中肼/CH2Cl2的起始液体含量(36mL)，两个实验中双酰肼的含量高于平常可能是由无效混合造成。此意味着除混合速度外，必须考虑反应器的几何结构及液体含量。
表7混合对所形成双酰肼含量的影响
Figure G2008800216526D00162
实例10
按比例放大对对-甲氧基苄基硫醚酰肼(3)制备的影响
在19％或5％(v/v)的肼/CH2Cl2浓度下制备对-甲氧基苄基硫醚酰肼产生的结果相当。虽然在-70℃下浓度为19％的肼/CH2Cl2通常为可搅拌的混合物，但存在其可能变成较差混合的冰冻混合物的风险。若制造规模批料(400g)是在5％的肼/CH2Cl2浓度下进行，则可能需要较大的反应器(20L莫顿型)。然而，若所述制程是在14％的肼/CH2Cl2浓度下进行，则反应可使用玻璃反应器5L莫顿型圆底烧瓶实施。当所述制程是在14％v/v的肼/CH2Cl2浓度下以20g规模(表8中的实验8.1)进行时，则分离产物对-甲氧基苄基硫醚酰肼含有4.4％(HPLC面积％)的副产物双甲氧基苄基硫醚酰肼杂质。在按比例放大的制造条件下重复上述条件(肼/CH2Cl2浓度为14％)(表8中的实验8.2)产生含有4.2％(HPLC面积％)的副产物双甲氧基苄基硫醚酰肼杂质的对-甲氧基苄基硫醚酰肼。
表8在14％的肼/CH2CL2浓度下制备对-甲氧基苄基硫醚酰肼
Figure G2008800216526D00171
原始方法(表9，实验9.1)提供含有19.3％副产物双酰肼的78.4％浓度的产物对-甲氧基苄基硫醚酰肼。表9实验9.2中的改进方法利用将甲氧基苄基硫醚酰氯溶液连续添加至更加稀释且可搅拌的肼/二氯甲烷非均质混合物中(浓度为14％)。制得含有4.7％副产物双酰肼的91.1％浓度的产物对-甲氧基苄基硫醚酰肼。
表9用于制备对-甲氧基苄基硫醚酰肼的改进方法与先前方法的比较
Figure G2008800216526D00172
以下条件确保形成低含量的双酰肼副产物且推荐用于制造对-甲氧基苄基硫醚酰肼。所述反应条件视为本发明某些实施例的方面：
1.调节甲氧基苄基硫代酰氯溶液至肼/CH2Cl2混合物中的添加速率，以使反应温度保持在-68℃至-75℃。
2.在高混合速度(300rpm至400rpm)下有效混合(起始液体体积占反应器尺寸的30-40％液体体积)。在5L莫顿型烧瓶中保持在260-270rpm速度下混合。
3.肼/CH2Cl2的可搅拌均匀混合物(浓度为5-19％，v/v)。在一个实例中，肼/CH2Cl2的比率为14％，v/v。
4.起始液体体积占反应器尺寸的30-40％液体体积。
以下实例11-15联合阐释本发明的优选实施例。
实例11
对-甲氧基苄基硫醚酸中间体(1)的改进制备
安装具有冷凝器、N2入口、搅拌器及温度探针/控制器的5L反应烧瓶。在N2气氛中向所述容器中加入哌啶(0.402kg)。边搅拌边逐份添加3，3-二甲基丙烯酸(0.215kg)，随后对-甲氧基苄基硫醇(0.358kg)。经最少15分钟将反应混合物逐渐加热至82℃至88℃且保持所述反应温度直至观察到放热。使温度不超过95℃。当放热完成后，继续加热至92℃至98℃并保持最少15小时。
制备3升3M HCl水溶液。移除加热包并使反应混合物冷却至70℃至75℃。缓慢添加1.9L HCl溶液。用水浴继续冷却直至烧瓶所含物达到20℃至30℃温度。添加CH2Cl2(1.64kg)，并将烧瓶所含物搅拌最少5分钟。检测pH值并视需要使用HCl溶液调节至小于2。将反应混合物转移至分液漏斗中，分离各相，并将较低的有机产物层排放回反应烧瓶中。将上部水性层转移至分离烧瓶中。将剩余HCl溶液添加至有机相中并搅拌最少5分钟。检测pH值并视需要用刚刚制备的3M HCl溶液调节至小于2。
将反应烧瓶的所含物返回至分液漏斗中，并使各层分离最少5分钟。将较低的有机相排放至干净爱伦美氏烧瓶中，并将水性层排放至反应烧瓶中。将来自先前萃取的水相以及CH2Cl2(0.400kg)添加至反应烧瓶中。将反应物搅拌最少5分钟，随后将反应烧瓶的所含物转移至分液漏斗中，并使各层分离最少5分钟。使较低的有机产物相与先前的有机产物相合并，并转移至反应烧瓶中。合并的水相作为废物丢弃。向反应烧瓶中加入水(1.00kg)并搅拌最少5分钟。将混合物转移至分液漏斗中，并使各相分离最少5分钟。将较低的产物有机相排放至干净爱伦美氏烧瓶中。水相作为废物丢弃。将有机产物溶液经无水MgSO4干燥，随后吸滤至5L 4颈烧瓶中。
用CH2Cl2(0.350kg)将爱伦美氏烧瓶及滤饼冲洗至5L 4颈烧瓶中。蒸馏出CH2Cl2以使瓶容积为900±50mL。将浓缩物的温度调节至15℃至20℃，并随后通过添加庚烷(1.67kg)沉淀。将混合物冷却至约5℃并搅拌最少30分钟，随后对批料实施吸滤并用庚烷(2×0.272kg)冲洗产物饼。取样产物以进行干燥失重分析(LOD)，并取样滤液以进行固体含量预测。若所述滤液含有大于0.110kg，则将其浓缩并用庚烷处理以如先前沉淀第二批产物。称重潮湿产物饼，并使用LOD数据计算干重。产物的干燥质量等于常数A(kg)。将潮湿产物返回至5L烧瓶中，并溶解于CH2Cl2(最小值为1.76×Akg，最大值为2.20×Akg)中。缓慢添加庚烷(4.56×Akg)，开始沉淀。将浆液冷却至0℃至5℃，随后陈化最少30分钟。对批料实施吸滤，并用庚烷(2份，每份0.272kg)冲洗产物饼。继续过滤，直至滤液流动实质上停止。将湿产物饼转移至称量皿(tared dish)中，获得重量，随后将滤液转移至合适废物容器中。将所述饼在不高于38℃的真空烘箱中干燥，直至满足小于1.0％的干燥失重LOD指标。提交样品供分析。
实例12A
对-甲氧基苄基硫醚酰氯(2)的制备
安装装备有冷凝器、水洗涤器、温度探针、1L加料漏斗、N2入口及搅拌器的5L反应烧瓶。在N2气氛中边搅拌边加入CH2Cl2(1.6kg)，随后加入对-甲氧基苄基硫醚酸(0.400kg)。在加料漏斗中制备草酰氯(0.220kg)及CH2Cl2(0.600kg)的溶液。添加约一半草酰氯溶液，同时使温度保持在20℃至30℃范围内(放热！)。观察到在搅拌最少30分钟时放出CO2/CO，随后添加剩余草酰氯溶液，同时保持温度介于20℃与30℃之间。搅拌反应物直至气体放出减少(约30min)，随后将混合物加热至33℃至38℃。使所述温度保持约60分钟，直至气体放出减少。取样反应物，且使用HPLC来测定剩余酸的量。当起始材料的量不多于5％时，断定反应完全。若未完全反应，则在33℃至38℃下再继续搅拌1小时，随后再次取样并测试。移除加热包并使反应混合物冷却至20℃至30℃。将混合物转移至3L单颈烧瓶中，随后用CH2Cl2冲洗。在旋转蒸发器上浓缩批料，直至移除大部分挥发物。
实例12B
对-甲氧基苄基硫醚酰肼中间体(3)的制备
安装带有冷凝器、N2入口、热电偶、搅拌器及2L加料漏斗的5L4颈莫顿型反应烧瓶。在N2气氛中加入CH2Cl2(2.40kg)并冷却至-75℃至-65℃。加入无水肼(0.252kg)以得到均匀肼冰浆液，而不在烧瓶侧壁上形成肼晶体。将硫醚酰氯溶液转移至加料漏斗中，视需要在CH2Cl2中冲洗以使溶液体积为1.30L。
以稳定速率经最少3小时逐滴添加酰氯溶液，同时使温度保持介于-65℃至-75℃之间(优选介于-70℃至-75℃之间)。添加完成后，将反应在-65℃至-75℃下搅拌最少30分钟。使批料升温至20℃至25℃。通过HPLC取样反应物，且若剩余酰氯的量不多于5％则断定反应完全。若此刻未完全反应，则在20℃至25℃下继续搅拌最少1小时，随后再次取样。在旋转蒸发器上浓缩3L烧瓶中的批料。视需要用CH2Cl2将所述批料冲洗至烧瓶中。将浓缩物用MeOH(1.25kg)稀释，并转移至装备有搅拌器、热电偶及N2入口的5L反应烧瓶中，视需要用MeOH冲洗。
在N2气氛中添加NaOH(0.0640kg)存于MeOH(1.25kg)中的溶液，并搅拌最少20分钟。通过吸滤净化批料，并视需要用MeOH冲洗。将滤液转移至3L配衡烧瓶中(视需要用MeOH冲洗)，并在旋转蒸发器上浓缩直至移除所有挥发物，随后在真空中继续最少30分钟。停止施用真空并添加CH2Cl2(0.704kg)。继续旋转以使浓缩物溶解，随后重新开始施用真空并浓缩成固体残留物。获得残留物的重量并使用CH2Cl2(2.84kg)将所述残留物转移至分液漏斗中。搅动混合物以得到溶液。
用两份水(每份1.00kg)洗涤CH2Cl2溶液。向CH2Cl2溶液中添加无水MgSO4(0.300至0.420kg)并旋动约15分钟直至溶液澄清。对批料实施吸滤，视需要用CH2Cl2冲洗。将滤液转移至3L配衡烧瓶中，并在旋转蒸发器上浓缩成固体残留物。获得残留物的重量，并将其溶解于CH2Cl2(不少于0.532kg)中。将溶液转移至与装备有搅拌器、热电偶及N2入口的12L 4颈反应烧瓶连接的1L加料漏斗中。在N2气氛中向烧瓶中加入醚(3.04kg)。将醚冷却至0℃至-10℃。
将对-甲氧基苄基硫醚酰肼溶液添加至快速搅拌的醚溶剂中，同时使温度保持介于-10℃与0℃之间。使用CH2Cl2(0.0660kg)将其它溶液冲洗至烧瓶中。向加料漏斗中加入庚烷(0.732kg)并缓慢添加至稀薄浆液中，再次保持相同的温度范围。将所得浆液在相同温度下搅拌最少60分钟。通过滤纸对批料实施吸滤。用庚烷(2份，每份0.366kg)冲洗产物饼，并抽吸干燥直至形成湿滤饼。将湿滤饼转移至称量皿中并获得滤饼重量。将滤饼在真空烘箱(不高于38℃)中干燥直至LOD不大于2.0％。获得干燥对-甲氧基苄基硫醚酰肼的重量，并提交样品供测试。
实例13
制备硫醇去保护的中间体(4)
道威克斯(Dowex)SRB OH阴离子交换树脂是通过向大布氏漏斗中添加2.4kg树脂并用水(4份，每份2.40kg)随后MeOH(4份，每份1.92kg)洗涤来制备。将树脂在烧杯中用水覆盖并浸泡最少1小时，随后过滤出水。将树脂转移至合适储存容器中。安装装备有搅拌器、热电偶、N2入口及250mL加料漏斗的5L反应烧瓶。在N2气氛中加入三氟乙酸(2.80kg)并冷却至5℃至10℃。逐份添加硫醚酰肼(0.380kg)(放热！)，同时使温度保持介于5℃与15℃之间。将溶液冷却至0℃至5℃。
向加料漏斗中加入三氟甲磺酸(0.243kg)并添加至反应混合物中，同时使温度保持介于0℃至10℃之间。添加完成后，添加苯甲醚(0.0152kg)。将反应混合物在10℃至15℃下搅拌最少两小时或直至反应颜色为深红色且不进一步变化。取样反应物并通过TLC进行测试，且若反应混合物含有不多于4％的起始材料则断定为反应完全。安装装备有搅拌器、N2入口及2L加料漏斗的12L反应烧瓶。加入MeOH(3.01kg)。将容器在N2气氛中冷却至0℃至5℃。将反应混合物转移至加料漏斗中，并随后以适中速率添加至经冷却的MeOH中，使反应温度保持在0℃至5℃。形成白色沉淀。用额外MeOH(0.0790kg)将反应烧瓶冲洗至加料漏斗中。将白色浆液在0℃至5℃下搅拌约15分钟。通过滤纸对批料实施吸滤，并用MeOH(2份，每份0.600kg)冲洗产物饼。在通过滤饼的滤液流动实质上停止后，将滤液转移至3L配衡烧瓶(视需要用MeOH冲洗)中，并在旋转蒸发器上浓缩成半固体残留物。
将残留物再溶解于MeOH(0.600kg)中并如先前再次浓缩。将残留物再溶解于CH2Cl2(0.600kg)中，如先前再次浓缩并获得残留物重量。将残留物再溶解于水(1.52kg)中并将溶液转移至6L分液漏斗中。用CH2Cl2(3份，每份0.927kg)洗涤残留物。将合并的有机相转移至合适废物容器中。将含有产物的水相转移至烧杯中，并通过添加膨胀树脂将pH值调节至6.5-7.5pH单位。视需要用三氟乙酸调节pH值。在达到期望的pH值范围后，将浆液搅拌约30分钟，并再次检测pH值，并视需要调节。对批料实施吸滤并用水(2份，每份0.600kg)冲洗树脂。添加37％HCl溶液(0.160kg)。量测pH值以确保其小于1.5。若需要则添加额外HCl。将水溶液转移至3L配衡烧瓶(视需要用水冲洗)中，并在旋转蒸发器上浓缩成固体残留物。获得残留物重量。将残留物溶解于无水EtOH(1.20kg)中并再次浓缩。将残留物再溶解于无水EtOH(1.65-2.85kg)中并加热至50℃至65℃。对所述热溶液实施吸滤。将滤液转移至3L配衡烧瓶中，并在旋转蒸发器上浓缩所述乙醇溶液直至蒸馏实质上终止。分份加入EtOAc(8.21kg)并如先前进行浓缩。加入四份EtOAc(2.74kg)并冷却至20℃至25℃。将反应物搅拌约15分钟。对批料实施吸滤并用EtOAc(2份，每份0.135kg)冲洗。继续抽吸，直至滤液流动实质上停止。将滤饼抽吸干燥约60分钟。丢弃滤液。
获得潮湿产物饼的重量且所述质量(kg)在随后计算中用作常数B。将产物转移至装备有冷凝器、搅拌器、N2入口及热电偶的12L反应烧瓶中。在N2中加入EtOAc(45.1×Bkg)，并将浆液边搅拌边加热至48℃至53℃。在达到50℃后，停止加热。移除加热包并将浆液冷却至20℃至25℃。对批料实施吸滤并用EtOAc(2份，每份0.270kg)冲洗。继续抽吸，直至滤液流动实质上停止。将滤饼在不高于38℃的真空烘箱中干燥最少12小时。获得滤饼重量且产物质量(kg)(等于常数C)用于随后计算中。
实例14
制备游离碱酰肼(5)
将粗盐酸盐产物(4)与水(20.0×Ckg)在12L 4颈反应烧瓶中混合并搅拌以得到溶液。用经处理的树脂调节溶液的pH值直至达到6.5-7.5pH单位范围。将批料搅拌约15分钟，随后再次检测pH值且视需要调节以获得6.5-7.5pH单位的值。对批料实施吸滤并用水(3.00×Ckg)，随后用无水EtOH(2份，每份5.30×Ckg)冲洗。继续吸滤，直至滤液流动实质上停止。将产物滤液转移至3L配衡烧瓶中并视需要用无水EtOH冲洗。在旋转蒸发器上浓缩批料直至蒸馏实质上停止。将产物残留物再溶解于无水EtOH(1.58×Ckg)中并如先前进行浓缩。将产物残留物再溶解于无水醚(2.57×Ckg)中并如先前进行浓缩。在蒸馏实质上停止后，使用高真空继续干燥并继续蒸发最少两个小时。残留物的净重是常数D。使用CH2Cl2(66.3×D kg)将浓缩物转移至装备有搅拌器组件、温度探针及氮气入口的12L反应烧瓶中。将混合物在15℃至30℃下搅拌最少30分钟。过滤批料，将滤液收集在第二12L反应烧瓶中。使用CH2Cl2(3.98×Dkg)通过过滤器将第一烧瓶冲洗至第二烧瓶中。含有批料的第二烧瓶装备有搅拌器组件、温度探针及氮气入口。边搅拌边加入硅胶(0.700×D kg)且继续搅拌约30分钟。对批料实施吸滤并用CH2Cl2(2份，每份3.98×Dkg)洗涤硅石，将合并的滤液收集在10L抽吸烧瓶中。将批料在旋转蒸发器上于约30℃下浓缩至1L烧瓶中。视需要用CH2Cl2将10L烧瓶冲洗至蒸发器中。继续蒸馏直至其实质上停止。将旋转蒸发器切换到高真空源并在35℃至40℃下继续蒸发约3小时。
通过将旋转蒸发器浴调节至0℃至5℃同时以最大速率旋转烧瓶使油状产物结晶。在产物凝固后继续蒸发约30分钟。取样游离碱产物(5)并测试残留二氯甲烷并干燥，直至对残留溶剂的测试可以接受。获得最终重量，将产物包装在具有惰性衬层的带有盖子的琥珀玻璃瓶中，并提交样品供测试。
产率
所述5步制程的总产率限值不低于理论值的33％(0.105kg)且最高与最低产率的差必须不大于15％。先前制程的限值为理论值的33-43％；然而，我们预期通过在酰肼形成反应中增加二氯甲烷所获得的副产物形成减少将使产率提高。有效批料中的实际产率将用以界定生产批料的产率范围。
实例15
3-甲基-3-巯基丁酸酰肼，Cl-332258(DMH连接体)的最终纯化
向装备有机械搅拌器、N2入口、回流冷凝器及温度控制装置的2L 4颈反应烧瓶中加入二氯甲烷(1,000mL，1,325g)。向反应烧瓶中加入DMH连接体(20g)。在N2中，将浆液在20±3℃下搅拌最少30分钟。通过350mL中号尺寸烧结玻璃布氏漏斗对所得混浊DMH连接体溶液进行过滤。将滤液收集在装备有机械搅拌器、N2入口、回流冷凝器及温度控制装置的干净的2L 4颈圆底烧瓶中。将反应烧瓶用20mL，26.5g二氯甲烷冲洗至干净反应烧瓶中。将硅胶(20g)加入至反应烧瓶中的溶液中，同时使温度保持在15℃至25℃。将浆液在N2中于20±3℃下搅拌最少30分钟。通过(350mL，中号尺寸)烧结玻璃布氏漏斗过滤非均质混合物。将滤液收集在干净的2L单颈圆底烧瓶中。用二氯甲烷(50mL，66.3g)将反应烧瓶冲洗至滤饼中，将滤液收集在单颈烧瓶中。使用旋转蒸发器(浴＝35±5℃)及机械式吸水器15-30mm Hg，随后高真空(7-10mm Hg)将滤液浓缩至干燥。将所得白色固体冷却至0-5℃并在7mm Hg的高真空中干燥2小时。向硬固体中加入正庚烷(100mL，68.4g)并在室温下搅拌最少10分钟，直至获得均匀悬浮液。
通过经滤纸(#1沃特曼)在15cm布氏漏斗上吸滤来分离产物。用正庚烷母液随后2×50mL，2×34.2g正庚烷洗涤将2L烧瓶冲洗至滤饼中。将滤饼在室温下抽吸干燥最少5分钟。将滤饼转移至放置在真空干燥器中的琥珀玻璃瓶中，并在真空(小于10mm Hg)中于20-25℃下将潮湿滤饼14.34g干燥3小时至恒重。产量：14.21g。75.9％，理论产量：18.7g。
Figure G2008800216526D00221

Claims (35)

1.一种自肼及酰基氯制备酰肼的方法，其包含以下步骤：
(a)制备包含肼及惰性溶剂的实质上已搅拌均匀的浆液；及
(b)向所述浆液中连续添加酰基氯。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述酰基氯实质上逐滴添加至所述浆液中。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述酰基氯进一步包含经保护的硫醇。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述酰基氯包含苄基硫醚。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述酰基氯具有以下结构：
Figure F2008800216526C00011
其中P是硫醇保护基团；
R1及R2各选自由C1-C5烷基组成的群组；
L是亚烷基连接体。
6.如权利要求5所述的方法，其中L是-CH2-。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中R1及R2各独立为甲基。
8.如权利要求5、6或7所述的方法，其中P是任选地在苯环上经取代的苄基。
9.如权利要求8所述的方法，其中P是对-甲氧基苄基。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中所述酰基氯具有以下结构：
11.如权利要求1至10中任一权利要求所述的方法，其中所述惰性溶剂是二氯甲烷。
12.如权利要求1、2或11所述的方法，其中所述酰肼产物具有以下结构：
Figure F2008800216526C00013
其中P是硫醇保护基团；
R1及R2各选自由C1-C5烷基组成的群组；
L是亚烷基连接体。
13.如权利要求12所述的方法，其中L是-CH2-。
14.如权利要求12所述的方法，其中R1及R2各独立为甲基。
15.如权利要求12所述的方法，其中P是任选地在苯环上经取代的苄基。
16.如权利要求15所述的方法，其中P是对-甲氧基苄基。
17.如权利要求12所述的方法，其中所述期望酰肼是
Figure F2008800216526C00021
或其盐。
18.如权利要求1至16中任一权利要求所述的方法，其中所述酰肼含有小于5％的具有以下结构的双酰肼副产物：
Figure F2008800216526C00022
其中R及R’是任选地经取代的烷基、杂烷基或杂烷芳基。
19.如权利要求18所述的方法，其中R及R’是
Figure F2008800216526C00023
其中P是硫醇保护基团；
R1及R2各选自由C1-C5烷基组成的群组；
L是亚烷基连接体。
20.如权利要求19所述的方法，其中L是-CH2-。
21.如权利要求20所述的方法，其中R1及R2各独立为甲基。
22.如权利要求19所述的方法，其中P是任选地在苯环上经取代的苄基。
23.如权利要求22所述的方法，其中P是对-甲氧基苄基。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述双酰肼副产物具有以下结构：
25.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中调节所述酰氯溶液的连续添加，以使反应温度保持在约-68℃至约-75℃。
26.如权利要求1至25中任一权利要求所述的方法，其中所述肼浆液实质上均匀。
27.一种制备含有酰肼键结的化合物的方法，其包含以下步骤：
(a)将包含经搅拌惰性溶剂的反应容器冷却至期望低温；
(b)以连续方式向所述反应容器中添加肼，由此制备包含所述肼及所述惰性溶剂的实质上已搅拌均匀的浆液；
(c)以连续方式向所述浆液中添加酰氯，由此形成酰肼键结。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述惰性溶剂是二氯甲烷。
29.一种制备肼浆液的方法，其包含以下步骤：
(a)将惰性溶剂冷却至约-68℃至约-75℃的温度；及
(b)向所述冷惰性溶剂中逐滴添加溶解于惰性溶剂中的肼。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述惰性溶剂是二氯甲烷。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中所述肼浆液是在约270rpm至约400rpm速度下搅拌。
32.一种制备3-甲基-3-巯基丁酸酰肼的方法，其包含按照权利要求16所述的方法制备酰肼的步骤。
33.一种制备卡奇霉素(calicheamicin)家族成员与作为载体的单克隆抗体的免疫偶联物的方法，其包含按照如权利要求3所述的方法制备其中酰基含有S经保护的巯基官能团的经单酰基化的肼，移除所述S经保护的巯基官能团的保护基团，并使用所述所得酰肼来制备所述免疫偶联物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述所得酰肼是3-甲基-3-巯基丁酸酰肼。
35.如权利要求34所述的方法，其中3-甲基-3-巯基丁酸酰肼用作连接体来制造吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)或伊妥单抗奥佐米星(inotuzumabozogamicin)。
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