CN101812109A - 一种黄芪甲苷的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黄芪甲苷的工业制备方法，该方法是将黄芪总皂苷提取物在酸水中结晶分离黄芪甲苷，具体工艺如下：提取，大孔树脂柱分离，酸碱除杂，碱水解提高含量，酸水结晶，重结晶等步骤，最终获得含量98％以上黄芪甲苷单体。本工艺具有环保、经济、提取率高等特点。

Description

一种黄芪甲苷的制备方法

技术领域

本发明涉及用豆科植物黄芪提取、分离、制备具有生物活性的黄芪甲苷的方法，属于中药提取加工领域。

背景技术

黄芪甲苷主要存在于豆科黄芪属植物中，具有调节免疫功能，抑制炎症、抗氧化、强心、改善血液流变学、降血压、镇静、镇痛和调节代谢等活性。

黄芪甲苷在黄芪药材中含量很低(0.1-1‰)。用常规的植物化学方法提取分离黄芪甲苷成本很高。现有的制备黄芪甲苷的文献(CN1283462A，JP57165400，JP62012791，JP62012792)方法均为用硅胶柱层析多次分离，以氯仿、甲醇等有毒有机溶剂洗脱分离，要求较高的生产设施和人员防护条件，由于试剂、生产设施、人员防护要求使产品成本高，转移率低、对环境会产生不利影响。申请号200410007963.1的专利：使用提取、浓缩、碱处理、有机溶剂萃取反复分离等方法纯化精制黄芪甲苷；申请号200410013950.4的专利：黄芪药材水提醇沉，上清液经浓缩后，浓缩液经丁醇萃取，获得黄芪甲苷提取物；申请号200610012687.6的专利：通过提取浓缩、醇沉、碱水解、滤取水解的产生沉淀得黄芪甲苷粗品；申请号200510020977.0的专利：黄芪提取、大孔树脂富集、碱水解转化、溶剂萃取和纯化精制等步骤，最后得到黄芪甲苷产品；申请号200710043678.8的专利：水提取黄芪、碱处理、大孔吸附树脂吸附、水洗、稀醇液洗、较高浓度醇液洗脱黄芪甲苷、浓缩及结晶步骤。上述提取制备黄芪甲苷的方法，虽然没有用多次硅胶柱层析，没有用氯仿、甲醇等有毒有机溶剂分离，但收率极低，产品的纯度不稳定，有时得到的主要成分不是目标化合物，而是无机盐。

本发明提供了更加便捷、更加经济、更加环保、提取率更高的用黄芪提取制备黄芪甲苷的方法。

发明内容

本发明提供了用黄芪提取制备黄芪甲苷的新方法，本方法适用工业化生产。黄芪是指豆科黄芪属植物，包括蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(bge.)hsiao.、膜荚黄芪(A.membranaceus(Fisch.)Bge.)、金翼黄芪(A.chrysopterus Bge.)、梭果黄芪(A.ernestii Comb.)、多花黄芪(A.floridus Benth.)、塘谷耳黄芪(A.tongolensis Ulbr.)、扁茎黄芪(A.complanatus R.Br.)。

本发明技术路线有三条，但均存在制备成黄芪总皂苷溶液，酸化结晶分离得到黄芪甲苷的技术特征。

方法一：

1、提取，黄芪用水、或水与甲醇、乙醇、丙酮等溶剂组成的二种及多种混合溶剂提取，提取液浓缩并且不含有机溶剂(如无有机溶剂时也可以直接上柱)，加水至合适的体积，去除沉淀(如有沉淀)。

2、上样，上述提取水溶液，通过常规处理后的大孔树脂柱，常规水洗脱至近无色，并且糖试验反应阴性。其中，大孔树脂为非极性或者弱极性大孔树脂，包括苯乙烯树脂，乙烯基苯乙烯树脂，甲基苯乙烯树脂，丙烯晴树脂。例如D101型，AB-8型，HPD100型，D140型，DA型，树脂用量为药材重量的0.1-5.0倍。

3、碱洗酚酸物质，树脂柱用碱水洗脱至无色；碱水是氢氧化钠、氢氧化钾的水溶液，浓度为0.02mol-1.0mol/L。

4、酸洗无机盐，碱洗后的树脂柱用水洗脱至中性，再用酸水洗脱，继续用水洗脱至中性；酸水是磷酸、盐酸、硫酸、醋酸或者甲酸的水溶液，浓度为0.02mol-1.0mol/L，酸的用量为0.2-1.0N/kg药材。

5、洗脱和浓缩，用大极性有机溶剂或者其含水的混合溶剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至小体积并且不含有机溶剂。大极性有机溶剂是甲醇、乙醇或者丙酮。

6、水解，洗脱液浓缩后加碱碱化，加热水解；碱为氢氧化钠或者氢氧化钾，水解碱浓度为0.1-1.0N/L，水解温度40-100℃，得到黄芪总皂苷溶液。

7、结晶，黄芪总皂苷溶液滴加酸酸化，放置析晶。酸性液体是磷酸、盐酸、硫酸、丙酸、醋酸、甲酸或者是它们的水溶液，优选醋酸、甲酸，酸化的PH值为6-1，优选PH值2.5-4.5。

8、重结晶，滤取上述结晶，用甲醇或者稀乙醇、稀甲醇进行重结晶，得黄芪甲苷精品，含量98％以上。

上述步骤中碱洗与酸洗顺序可以互相调换，同时，碱洗酚酸物质、酸洗无机盐和水解步骤可以省略，步骤7酸水结晶是关键步骤。

方法二：

1、提取与浓缩，黄芪用水、或水与甲醇、乙醇、丙酮等溶剂组成的二种及多种混合溶剂提取，提取液浓缩至小体积，药材/提取液约为1/1-3/1(w/v)，放置后去除沉淀。

2、碱水解，上述澄清水溶液加入碱水后，加热回流水解1-3小时。

3、萃取，水解液中和后用丁醇、乙酸乙酯萃取，分取有机层，浓缩至干.。

得到黄芪总皂苷，用水溶解得到黄芪总皂苷溶液。

4、结晶，黄芪总皂苷溶液滴加酸性液体使其PH值为5-1，放置析晶，酸性液体是磷酸、盐酸、硫酸、丙酸、醋酸、甲酸或者是它们的水溶液。

5、重结晶，滤取上述结晶，用甲醇或者稀乙醇、稀甲醇进行重结晶，得黄芪甲苷精品，含量98％以上。

上述步骤中，步骤4酸水结晶是关键步骤。

方法三：

1、碱水提取，黄芪用碱水提取，去除沉淀(如有沉淀)。

碱水是氢氧化钠、氢氧化钾的水溶液，浓度为0.01mol-1.0mol/L。

2、上样，上述提取水溶液，通过常规处理后的大孔树脂柱，常规水洗脱至近无色，并且糖试验反应阴性。

大孔树脂为非极性或者弱极性大孔树脂，包括苯乙烯树脂，乙烯基苯乙烯树脂，甲基苯乙烯树脂，丙烯晴树脂。例如D101型，AB-8型，HPD100型，D140型，DA型，树脂用量为药材重量的0.1-5.0倍。

3、酸洗无机盐，碱洗后的树脂柱用水洗脱至中性，再用酸水洗脱，继续用水洗脱至中性。酸水是磷酸、盐酸、硫酸、醋酸或者甲酸的水溶液，浓度为0.01mol-1.0mol/L，酸的用量为0.2-1.0N/kg药材。

4、洗脱和浓缩，用大极性有机溶剂或者其含水的混合溶剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至小体积并且不含有机溶剂，得到黄芪总皂苷溶液。大极性有机溶剂是甲醇、乙醇或者丙酮。

5、结晶，黄芪总皂苷溶液滴加酸性液体使其PH值为6-1，放置析晶。酸性液体是磷酸、盐酸、硫酸、丙酸、醋酸、甲酸或者是它们的水溶液。

6、重结晶，滤取上述结晶，用甲醇或者稀乙醇、稀甲醇进行重结晶，得黄芪甲苷精品，含量98％以上。

上述步骤中酸洗无机盐也可以省略，步骤5酸水结晶是关键步骤。

上述三种方法，其中共有的技术特征是结晶方法，均为用酸水进行结晶，酸水为磷酸、盐酸、硫酸、丙酸、醋酸、甲酸的水溶液，优选醋酸、甲酸；酸化的PH值为6-1，优选PH值2.5-4.5。

黄芪甲苷的含量测定方法可以参照中国药典(2005年版)所述方法进行。

具体实施方式

用以下的实施例对本发明作具体说明，但本发明并不限于下列实施例包含的内容。

[实施例一]取蒙古黄芪的干燥根500g，用70％的甲醇4000ml回流提取1小时，滤取提取液，药渣二次加70％的甲醇4000ml回流提取1小时，滤取提取液，药渣三次加70％的甲醇4000ml回流提取1小时，滤取提取液，合并三次提取液，浓缩至1000ml，并且无乙醇味，加水1000ml，去除沉淀，上已常规处理好的D101型大孔树脂(2.5kg，D101型大孔树脂为苯乙烯型)分离柱，用水常规洗去杂质，至糖试验反应阴性，上述树脂柱用0.1％氢氧化钠水洗脱酚酸物质至无色，水洗脱至中性，再用0.1％盐酸水2500ml洗脱无机盐，水洗脱至中性。用70％乙醇水洗脱，收集洗脱液；浓缩至小体积并且不含乙醇，加1N氢氧化钠溶液至PH值大于13，加热100℃水解1小时；水解液放置冷却，滴加冰醋酸至PH值约为4，摇匀，放置析晶，滤取结晶，用甲醇进行重结晶，既得黄芪甲苷精品0.25g，含量98％以上。

[实施例二]取膜荚黄芪的干燥根1kg，用50％的甲醇8000ml回流提取1小时，滤取提取液，药渣二次加50％的甲醇8000ml回流提取1小时，滤取提取液，药渣三次加50％的甲醇8000ml回流提取1小时，滤取提取液，合并三次提取液，浓缩至1000ml，并且无甲醇味，加水1000ml，去除沉淀，上已常规处理好的D2型大孔树脂(400g，D2型大孔树脂为乙基苯乙烯型)分离柱，用水常规洗去杂质，至糖试验反应阴性，树脂柱用0.5％氢氧化钾水洗脱酚酸物质至无色，水洗脱至中性，再用0.5％硫酸水1000ml洗脱无机盐，水洗脱至中性；用50％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至100ml并且不含乙醇；加氢氧化钾至PH值大于13，加热80℃水解2小时；放冷，滴加稀盐酸酸化PH为1左右，摇匀放置析晶，滤取结晶，用25％乙醇进行重结晶，既得黄芪甲苷精品0.48g，含量98％以上。

[实施例三]金翼黄芪的干燥根2kg，用30％的甲醇16升回流提取1小时，滤取提取液，药渣二次加30％的甲醇16升回流提取1小时，滤取提取液，药渣三次加30％的甲醇16升ml回流提取1小时，滤取提取液，合并三次提取液，浓缩至1000ml，并且无甲醇味，加水1000ml，去除沉淀，上已常规处理好的DM2型大孔树脂(200g，DM2型大孔树脂为2-甲基苯乙烯型)分离柱，用水洗去杂质，至糖试验反应阴性，树脂柱用4％氢氧化钠水洗脱酚酸物质至无色，水洗脱至中性，再用1％磷酸水5000ml洗脱无机盐，水洗脱至中性，用甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用水500ml，加氢氧化钠4g溶解，加热100℃水解1小时；放冷，滴加甲酸酸化，放置析晶，滤取结晶，用20％甲醇进行重结晶，既得黄芪甲苷精品0.54g，含量98％以上。

[实施例四]梭果黄芪的干燥根500g，用60％的丙酮2000ml回流提取1小时，滤取提取液，药渣二次加60％的丙酮2000ml回流提取1小时，滤取提取液，药渣三次加60％的丙酮2000ml回流提取1小时，滤取提取液，合并三次提取液，浓缩至1000ml，并且无丙酮味，加水1000ml，去除沉淀，上已常规处理好的MD型大孔树脂(1.5kg，MD型大孔树脂为α-甲基苯乙烯型)分离柱，用水常规洗去杂质，至糖试验反应阴性，树脂用2.5％氢氧化钾水洗脱酚酸物质至无色，水洗脱至中性，再用0.5％乙酸水1000ml洗脱无机盐，水洗脱至中性，用80％甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至100ml并且不含甲醇，加氢氧化钾1g溶解，100℃水解0.5小时，放冷，滴加甲酸酸化PH为3，摇匀放置析晶，滤取结晶，用甲醇进行重结晶，既得黄芪甲苷精品0.15g，含量98％以上。

[实施例五]取多花黄芪的干燥根1kg，用45％的丙酮5000ml回流提取1小时，滤取提取液，药渣二次加45％的丙酮5000ml回流提取1小时，滤取提取液，药渣三次加45％的丙酮5000ml回流提取1小时，滤取提取液，合并三次提取液，浓缩至200ml，并且无丙酮味，去除沉淀，加入0.5克氢氧化钠溶解后，90℃水解1小时，用醋酸中和，正丁醇萃取，分取有机层，浓缩至干.，用水溶解，滴加丙酸使其PH值为4.5，摇匀放置析晶，滤取结晶，用甲醇重结晶，既得黄芪甲苷精品0.28g，含量98％以上。

[实施例六]塘谷耳黄芪的干燥根500g，用30％的甲醇3000ml回流提取1小时，滤取提取液，药渣二次加30％的甲醇2500ml回流提取1小时，滤取提取液，药渣三次加30％的甲醇2500ml回流提取1小时，滤取提取液，合并三次提取液，浓缩至200ml，并且无甲醇味，去除沉淀，加入氢氧化钠1克溶解后，100℃水解2小时，水解液中和后乙酸乙酯萃取，分取有机层，浓缩至干，用水溶解，滴加甲酸PH值为2，摇匀放置析晶，滤取结晶，用20％乙醇重结晶，既得黄芪甲苷精品0.18g，含量98％以上。

[实施例七]取扁茎黄芪的干燥根500g，用1.0％氢氧化钠水溶液4000ml加热提取1小时，滤取提取液，药渣二次加1.0％氢氧化钠水溶液4000ml加热提取1小时，滤取提取液，药渣三次加1.0％氢氧化钠水溶液4000ml加热提取1小时，滤取提取液，合并三次提取液，去除沉淀，上已常规处理好的AB-8型大孔树脂(1.5kg，AB-8型大孔树脂为苯乙烯型)分离柱，用水常规洗去杂质，至糖试验反应阴性，用1％醋酸水1500ml洗脱无机盐，水洗脱至中性，用60％乙醇水洗脱，收集洗脱液，浓缩至100ml并且不含乙醇，滴加丙酸使其PH值为5，摇匀放置析晶，滤取上述结晶，用甲醇重结晶，既得黄芪甲苷精品0.14g，含量98％以上。

[实施例八]取蒙古黄芪的干燥根500g，用50％的乙醇4000ml回流提取1小时，滤取提取液，药渣二次加50％的乙醇4000ml回流提取1小时，滤取提取液，药渣三次加50％的乙醇4000ml回流提取1小时，滤取提取液，合并三次提取液，浓缩至100ml，并且无乙醇味，去除沉淀，加入氢氧化钠1克溶解后，60℃水解3小时，水解液中和后用异丁醇萃取，分取有机层，浓缩至干，残渣用水溶解，滴加盐酸使其PH值为1.5，摇匀放置析晶，滤取上述结晶，用15％乙醇重结晶，既得黄芪甲苷精品0.26g，含量98％以上。

[实施例九]取蒙古黄芪的干燥根500g，用0.1％氢氧化钠水溶液4000ml煎煮1.5小时，滤取提取液，药渣二次加0.1％氢氧化钠水溶液3000ml煎煮1小时，滤取提取液，药渣三次加0.1％氢氧化钠水溶液4000ml煎煮0.5小时，滤取提取液，合并三次提取液，去除沉淀(如有沉淀)，上已常规处理好的D101型大孔树脂(0.1kg，D101型大孔树脂为苯乙烯型)分离柱，用水常规洗去杂质，至糖试验反应阴性，再用1％醋酸水600ml洗脱无机盐，水洗脱至中性，用40％乙醇水洗脱，收集洗脱液，浓缩至100ml，滴加醋酸使其PH值为4.2，摇匀放置析晶，滤取上述结晶，用30％乙醇重结晶，既得黄芪甲苷精品0.45g，含量98％以上

[实施例十]取膜荚黄芪的干燥根1kg，用0.4％氢氧化钠水溶液6000ml煎煮1.5小时，滤取提取液，药渣二次加0.4％氢氧化钠水4000ml煎煮1小时，滤取提取液，药渣三次加0.4％氢氧化钠水4000ml煎煮1小时，滤取提取液，三次提取液合并，去除沉淀(如有沉淀)，上已常规处理好的D101型大孔树脂(0.1kg，D101型大孔树脂为苯乙烯型)分离柱，用水常规洗去杂质，糖试验反应阴性，再用2％醋酸水600ml洗脱无机盐，水洗脱至中性，用50％丙酮水洗脱，收集洗脱液，浓缩至200ml并且不含丙酮，滴加甲酸使其PH值为2.0，摇匀放置析晶，滤取上述结晶，用甲醇进行重结晶，既得黄芪甲苷精品0.43g，含量98％以上

[实施例十一]取蒙古黄芪的干燥根2kg，用水12升煎煮1小时，滤取提取液，药渣二次加水8升煎煮1小时，滤取提取液，药渣三次加水8升煎煮1小时，滤取提取液，合并三次提取液，去除沉淀(如有沉淀)，上已常规处理好的D101型大孔树脂(3kg，D101型大孔树脂为苯乙烯型)分离柱，用水常规洗去杂质，糖试验反应阴性，树脂用4％氢氧化钠水洗脱酚酸物质至无色，水洗脱至中性，再用0.5％甲酸水1600ml洗脱无机盐，水洗脱至中性，用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至300ml并且不含乙醇，加碱氢氧化钠3g溶解，加热100℃水解1小时，放冷，滴加醋酸酸化，摇匀放置析晶，滤取上述结晶，用甲醇进行重结晶，既得黄芪甲苷精品1.25g，含量98％以上。

[实施例十二]取膜荚黄芪的干燥根10kg，用水60升煎煮30小时，滤取提取液，药渣二次加水50升煎煮1小时，滤取提取液，药渣三次加水50升煎煮1小时，滤取提取液，合并三次提取液，去除沉淀，上已常规处理好的DA型大孔树脂(1kg，DA型为丙烯晴树脂)分离柱，用水常规洗去杂质，糖试验反应阴性，树脂柱用0.04％氢氧化钠水洗脱酚酸物质至无色，水洗脱至中性，再用2％乙酸水2500ml洗脱无机盐，水洗脱至中性，用40％丙酮水洗脱，收集洗脱液，浓缩至500ml并且不含丙酮，加2克溶解，100℃水解1小时，放冷，滴加甲酸酸化，摇匀放置析晶，滤取上述结晶，用甲醇进行重结晶，既得黄芪甲苷精品6.58g，含量98％以上。

Claims (10)

1.一种用于制备黄芪甲苷的方法，其特征是：

黄芪总皂苷溶液加酸酸化的条件下结晶分离黄芪甲苷。

2.按照权利要求1所述的方法，其中酸化用的酸是盐酸、硫酸、丙酸、醋酸、甲酸或者是它们的水溶液，优选醋酸、甲酸。

3.按照权利要求1所述的方法，其中黄芪总皂苷溶液加酸酸化的PH值为1-6，优选PH值2.5-4.5。

4.按照权利要求1所述的方法，其中黄芪总皂苷溶液制备方法如下：

①、提取，取黄芪饮片或者黄芪段，用溶剂提取，提取液制成澄清水溶液；

②上样，上述澄清水溶液，通过大孔树脂柱，常规水洗脱至糖反应试验阴性；

③碱洗酚酸物质，已上样树脂柱用碱水洗脱至无色；

④酸洗无机盐，碱洗后的树脂柱用水洗脱至中性，再用酸水洗脱，继续用水洗脱至中性；

⑤洗脱和浓缩，用甲醇、乙醇、或者其含水的混合溶剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至小体积并且不含有机溶剂；

⑥水解，洗脱液浓缩液碱化，加热水解，得到黄芪总皂苷溶液。

5.按照权利要求4所述的方法，其②中大孔树脂为非极性或者弱极性大孔树脂，包括苯乙烯树脂，乙烯基苯乙烯树脂，甲基苯乙烯树脂，丙烯晴树脂。

6.按照权利要求4所述的方法，其③中碱水是氢氧化钠、或氢氧化钾的水溶液，浓度为0.02mol-1.0mol/L。

7.按照权利要求4所述的方法，其④中酸水是磷酸、盐酸、硫酸、醋酸或者甲酸的水溶液，浓度为0.02mol-1.0mol/L，酸的用量为0.2-1.0N/kg药材。

8.按照权利要求4所述的方法，其⑥中碱化用碱是氢氧化钠或者氢氧化钾，水解碱浓度为0.1-1.0N/L，水解温度40-100℃。

9.按照权利要求4所述的方法，其中黄芪是蒙古黄芪、膜荚黄芪、金翼黄芪、梭果黄芪、多花黄芪、塘谷耳黄芪或者扁茎黄芪。

10.按照权利要求5所述的方法，其中大孔树脂为D101型大孔树脂，AB-8型大孔树脂，HPD100型大孔树脂，D140型大孔树脂或者DA型大孔树脂，树脂用量为黄芪药材重量的0.1-5.0倍。