CN101808672A - 新的干细胞系、其应用以及培养方法 - Google Patents

新的干细胞系、其应用以及培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101808672A
CN101808672A CN200780053496A CN200780053496A CN101808672A CN 101808672 A CN101808672 A CN 101808672A CN 200780053496 A CN200780053496 A CN 200780053496A CN 200780053496 A CN200780053496 A CN 200780053496A CN 101808672 A CN101808672 A CN 101808672A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cornu cervi
growing
application
stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200780053496A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101808672B (zh
Inventor
M·采盖尔斯基
M·博赫尼亚
I·卡尔科辛斯基
W·杰维斯泽克
Original Assignee
Stem Cells Spin Sp zoo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PL382287A external-priority patent/PL209210B1/pl
Priority claimed from PL383134A external-priority patent/PL211674B1/pl
Application filed by Stem Cells Spin Sp zoo filed Critical Stem Cells Spin Sp zoo
Publication of CN101808672A publication Critical patent/CN101808672A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101808672B publication Critical patent/CN101808672B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/10—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of tendons or ligaments

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

来自正在生长的鹿(鹿科(Cervidae))角的新的干细胞系，和所述细胞在人和动物中重构结缔组织，优选地骨、软骨或脂肪组织中的应用；以及培养它们的方法，和来自正在生长的鹿角的组织在制备稳定的干细胞系MIC-1中的应用。

Description

新的干细胞系、其应用以及培养方法
本发明涉及来自正在生长的鹿(鹿科(Cervidae))角的新的干细胞系，和所述细胞在人和动物中重构结缔组织，优选地骨、软骨或脂肪组织中的应用，以及正在生长的鹿角组织用于得到被命名为MIC-1的稳定的干细胞系的应用。本发明的另一个方面是用于培养如此获得的细胞系的方法。
寻找用于重构耳朵(ear lobe)和鼻子的软骨网格(lattice)的理想材料已经有一百多年了，并且仍在积极地寻求中。自体肋骨软骨已经在面部外科手术中用作重构材料，并且仍在最经常被如此使用。不幸的是，获得它所需的时间使该程序大大地复杂化，使受试者经受较大的术后不适，并且增加了在取样位点处随后出现并发症的可能性。而且，在儿童中，可用于收获的肋骨软骨的量常常太少，以致于不能重构耳朵或鼻子；而在成年人中，它可能是钙化的和不能用的。在寻找理想的有机重构材料中的重要一步是起始于20世纪90年代期间的Vacanti等人的研究。该开创性研究使用了合成的、生物相容的、生物可降解的且多孔的聚合物网状物，其用分离的人软骨细胞进行了浸渍。能够离体生长的软骨细胞的数目是有限的，然而，它对于再生效率有着直接的重要性。该技术是非常昂贵、繁琐的，并且需要专业设备。许多植入物还随着时间过去而失去了其形状。在大多数情况下，特别的困难起因于物种相容性的问题，这是因为，针对所引入的外来组织发生强烈的免疫反应，这导致植入物排斥。
21世纪初是关于在所有种类的组织(包括结缔组织)的再生和重构中使用干细胞的非常活跃发展的时期。干细胞以在体内以及在体外均具有大的增殖潜力为特征，并且，能够植入它们是对于移植学中的显著进步来说的一个契机。然而，在大多数组织的情况下，非常难以获得确定的细胞系。此外，收集人干细胞需承担伦理学问题，以及转移病毒性疾病和肿瘤的风险。
现有技术揭示了仅仅与从各种人组织获得专门分化为成骨细胞的干细胞有关的解决方案。申请WO 2005/085422和US 2005/0048644描述了从脂肪组织中分离的干细胞，其被用于治疗运动器疾病。申请WO 2005/038012揭示了从人胎儿组织获得能够分化为成骨细胞和成软骨细胞的干细胞的方法。申请2007/0122902揭示了从胎盘血分离和培养多能干细胞的方法。还进行了一些尝试以基因修饰能够再生出软骨和骨的细胞，如专利说明书US6398816所叙述的。最多的伦理学争论由涉及从胚胎组织分离干细胞的申请(WO 03068937A2、WO 02064755A2、WO 0038583A1)而引起。
在现有技术中被广泛描述的人干细胞的应用引发了许多问题，这些问题是需要在这方面继续进行研究的证据。一些主要的问题是由使用胚胎组织所引发的伦理学顾虑，遗传缺陷的危险，以及转移病毒性疾病和肿瘤的风险。因此，真实而迫切地需要这样的干细胞系，其应用将会排除上述问题的风险。
每年，成熟的鹿(鹿科)角(其由骨组织构成)被丢弃并迅速重新生长。在出生后，它作为总是存在于顶孔(foramen)上的角柄(pedicel)的延伸进行发育。生长区、主干芽基(stem blastema)和鹿角起于顶孔的特定区域，即所谓的鹿角发生性骨膜(antlerogenicperiosteum)。芽和正在生长的鹿角由特殊形式的骨-软骨(其是一种软骨和骨的混合物)构成。鹿角出现于鹿科39个物种的所有雄性中。
鹿的鹿角生长、其形状和随后的矿化是复杂并同时迅速的过程。鹿角由于所谓的软骨内成骨过程而生长。在我们的气候带中，在从四月至六月的这三个月期间生长是特别迅速的。两厘米的日生长使得正在生长的鹿角成为哺乳动物中生长最快的器官之一。这需要许多类型细胞的激活和合作，而干细胞在该过程的起始和继续中起着特殊的作用。鹿角发生性细胞具有间充质起源，并且它们中的一些可被认为是成年体细胞干细胞。
现有技术描述了鹿角组织的特性，所述鹿角组织被认为是哺乳动物组织中生长最快的骨形式。已进行了一些尝试以利用该组织的生长特性，主要通过分离出生长因子。申请WO 93/19085揭示了分离出生长因子以作为能够再生受损骨组织的物质的方法。作者揭示了获得分离自梅花鹿(Cervus nippon)鹿角的提取物的方法，所述提取物刺激造血干细胞和巨核细胞的生长。申请WO 2004/112806揭示了用于治疗神经元功能障碍的组合物，其基于从鹿角获得的生长因子标志物。然而，到目前为止，已证明不可能从鹿角获得稳定的干细胞系(其可以成功地用于重构结缔组织损伤)，也没有培养其的方法。
本发明的目标是获得稳定的干细胞系，其用于在人和动物中重构结缔组织，优选地软骨、骨或脂肪组织。此外，本发明的目标是差地诱导免疫应答的干细胞系，这将使得它们能够用于异种植入物中，即是跨物种的。本发明的一个特别的目标是获得用于培养这种类型的细胞的方法。本发明的目标还是获得此类干细胞系，所述干细胞系的应用将会绕开伦理学顾虑、形成遗传缺陷的危险以及病毒性疾病和肿瘤转移的风险。
出乎意料地，上述目标已在本发明中达到。
本发明的主题是应用来自正在生长的鹿角的组织，优选地来自正在生长的鹿角的侧支(lateral outgrowth)尖端的组织，以获得干细胞系。反过来，本发明的另一个主题是所获得的干细胞系在制备用作跨物种植入物的制剂中的应用。本发明的另一个主题是所获得的干细胞系在制备用于重构结缔组织损伤的制剂中的应用，所述结缔组织优选地为骨、软骨或脂肪组织。本发明的下一个主题是源于正在生长的鹿(鹿科)角的被命名为MIC-1的新的干细胞系，其以登录号DSMACC2854保藏在DSMZ库中。本发明的下一个主题是MIC-1细胞在重构结缔组织损伤中的应用，所述结缔组织优选地为骨、软骨或脂肪组织。
本发明还涉及这样的方法，即基于原代培养物，直接从其中或从先前冷冻的细胞，培养源自正在生长的鹿角(特别是欧洲鹿)的干细胞。
本发明这个方面的关键点在于这样的事实：从在无菌条件下收集的并均质化的鹿角断片(fragments)建立所述原代培养物，然后分离出细胞并通过使用包含10％胎牛血清、谷氨酰胺和所选抗生素的MEM作为生长培养基来进行培养，其中于37℃在5％CO2的气氛中进行维持。在第五次传代后，将细胞进行冷冻或者在相同的培养基上在上述条件下进行维持，其中在确定了正确的细胞数目(至少2×106)后，将它们在胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液中进行胰蛋白酶消化，并在完全培养基中进行离心。将沉淀物悬浮在新鲜的MEM中，并使用被切成对于损伤替换而言所需的尺寸的纤维蛋白海绵(fibrinsponges)来制备网格片段(lattice fragments)。将其置于无菌小瓶(vial)中，并添加细胞悬浮液(至少2×106个细胞/1ml液体)。通过离心使细胞沉降在所述网格上，并移除上清液。
出乎意料地，证实了异种细胞可以是人干细胞的替代物。在寻找此类细胞的来源的同时，将注意力转向了鹿角，后者以其独一无二的、独特的生长和更新过程为特征。研究结果显示，在参与每年鹿角更新的细胞中，存在有一群被赋予了高增殖潜力的细胞。这些细胞形成了有限的一批经分化的细胞，它们除了参与其他过程外，尤其还参与受损的软骨、骨和脂肪组织的再生。由于鹿角发生性细胞的分化程度低、从而诱导低水平的免疫应答，因此证实，接受由所述细胞构成的、异种的、跨物种的植入物的可能性非常大。所进行的分析以及干细胞研究得出这样的结论，即存在有建立稳定的干细胞系的迫切需要。出乎意料地，证实了，鹿角发生性细胞由于其低水平的分化而诱导弱的免疫应答，由于此，它们在动物和人中在异种植入物的植入和接受方面非常有用。显示了，来源于正在生长的鹿(鹿科)角的侧突(lateralprotrusions)尖端的组织可以是稳定的干细胞系的有价值的来源。由本发明者所进行的研究显示，许多来自鹿角发生性骨膜的这些细胞在生长过程中向上逐渐地改变它们的位置。
以图解形式呈现了本发明的主题，其中图1a和图1b显示了在植入到兔耳中的软骨之内后，鹿角发生性细胞的苏木精和伊红(H+E)染色(×200)。这些细胞正在修复软骨中的损伤。
给本说明书增补了所要求保护的本发明的实施例。它们仅意在更好地阐明本解决方案的性质，而不应当是对所要求的保护范围的限制。
实施例1
干细胞系从鹿角中的分离和其应用
出乎意料地，显示了，来自正在生长的鹿角，优选地来自正在生长的鹿(鹿科)角的侧突尖端的组织切除物可以是稳定的干细胞系的有价值的来源，这是因为，如本发明者的研究所显示的，随着鹿角生长，它们的位置从鹿角发生性骨膜开始缓慢地向上移动。由于上述原因，为了获得新的干细胞系，在无菌条件和浅的极小量注射的麻醉(常用于动物治疗)下，收集正在生长的鹿(鹿科)角的顶端侧突的圆形断片(1.5cm×0.2mm)。通过使用光学显微术，确定了，切片的中心部分被血管占据，其附近是众多的、小的、稠密充填的细胞。在外围，这些细胞的数目大大增加。所述细胞的一部分较大和在形态学上更为成熟，并且令人想起软骨细胞(成软骨细胞、软骨细胞)。在这些细胞之间存在着具有数目渐增的胶原纤维的基质。正在生长的鹿角的外层是神经支配的、血管化的带毛皮肤，即所谓的鹿茸(velvet)。在移去该层后，以机械方式使切片降解直至获得细微的断片，对径为几百微米。借助于迁移来分离增殖性细胞。从分离出的细胞来建立原代培养物，其中使用添加有10％胎牛血清以及青霉素和链霉素溶液的培养基。液体占生长室容积的至少20％。培养物在标准条件下于37℃在包含5％CO2的气氛中进行维持，通过至少三次传代。将所得到的细胞系进行冷冻，并在标准低温容器中保持在液氮中。当变得需要增殖该细胞系时，将它解冻并且以相同的方式进一步培养经过对于产生足够数目的干细胞而言所需的时间段。
干细胞的存在通过经培养的细胞的实际永生性、不存在分化形态学特征以及阳性免疫细胞化学结果来确认。
在来自鹿角切片的细胞以及经培养的细胞上，通过使用电子显微术来进行超微结构研究。特别地，检查了小的、卵形的、未分化的细胞的超微结构。确定了，在所述两种情况下，它们都以包含活跃的、松散包装的染色质和核仁的大细胞核为特征。少量的细胞质围绕细胞核并且包含大范围的粗面内质网、线粒体、空泡和糖原颗粒。在表面上观察到微绒毛。该研究显示，在经培养的细胞之中，总是存在具有广泛增殖潜力的小的、非粘附的、未分化的、卵形的乳白色细胞。这些细胞以在液氮中进行冷冻并解冻后高的存活率、活性为特征。它们重建了它们的生命功能。
在组织学样品上进行的免疫细胞化学反应显示出大量的表达抗原Ki-67和PCNA的增殖性细胞。位于正在生长的鹿角中心的血管附近和之中发现了经标记的细胞。相当数目的具有明确地更加区带定向化的定位的这些细胞，位于更外围并且在紧在皮肤腺体的外分泌部分的下面被发现。在腺体本身之内和在上皮的增殖层中都观察到经标记的细胞。关于血管增殖标志物CD31和CD34的存在的反应是阴性的。使用抗-Bcrp1和抗-c-kit抗体(指明干细胞)，在皮肤和其紧邻的软骨膜之间的强烈细胞分裂区带中获得了阳性鉴定。
在倒置相差显微镜下观察干细胞系培养物几天之后，对所得到的干细胞系进行的检查显示，正在发生自发分裂，因为正在进行细胞分化。使用经H+E染色的微量培养载玻片获得了类似的结果。
培养物总是具有小的、非粘附的、卵形的乳白色细胞。这些细胞随着时间过去而变得较大并且长出外周突起，借助于所述突起，这些细胞常常相互粘附或粘附于基层。细胞生长是无限制的，并且在许多次传代后它们仍保持分裂的能力。
对于从鹿角获得的干细胞的应用进行了研究以回答经培养的异种细胞在相异组织中是否将会存活和承担其生命功能这一问题。为了确定这一点，尝试着使用来自正在生长的鹿角的干细胞异种植入物在兔耳软骨中使损伤再生。
从在无菌条件下收集的并经降解的正在生长的鹿角断片建立原代培养物，分离出细胞并通过使用具有10％胎牛血清以及谷氨酰胺和所选抗生素的溶液的MEM培养基进行培养，其中于37℃在包含5％CO2的气氛中进行维持。在第五次传代后，将细胞进行冷冻或者将培养物在相同的培养基中在上述条件下进行维持。在出现合适数目的细胞(至少2×106)后，使用在0.02％EDTA中的胰蛋白酶来使它们脱离，并且在整个培养基中进行离心。将沉淀物悬浮在新鲜的MEM中，并使用被切成对于损伤替换而言所需的尺寸的纤维蛋白海绵来制备网格片段。将其置于无菌小瓶中，并添加细胞悬浮液(至少2×106个细胞/1ml液体)。通过离心使细胞沉降在所述网格上，并移除上清液。所述植入物由在网格(其为纤维蛋白海绵)上的根据本发明而获得的经培养的细胞构成。在实验(E组)和对照(C组)植入后，在同时进行的临床观察期间观察愈合。所有参加试验的动物良好地经受了外科手术。术后伤口经历了迅速而正确的愈合。手术后8天去除缝线。在由悬挂在纤维蛋白海绵上的干细胞所构成的软骨膜内植入物的位点处，所述干细胞参与再生过程，而不具有免疫滴度，也没有植入物排斥。强烈的再生过程导致在该实验的起初3周中软骨厚度出现明显的增加。然后，该过程逐渐慢下来。在该实验的第7周期间，新形成的耳朵结构软骨被未改变的皮肤所覆盖，稍微不平，并且比周围的软骨厚大约15％。在接下来的2周中，未观察到耳朵厚度的额外增加。移植入对照兔中的于生理盐水中进行浸泡的纤维蛋白海绵经历了降解，而没有坏死或免疫滴度，但其中植入了纤维蛋白海绵的区域仍是凸起的。9周后，这些点仍然显著更薄，并且两侧均由未改变的皮肤覆盖。在此，没有观察到再生过程，只有瘢痕形成。
在第4周期间，在再生区域的外围四周，观察到大量排列成带的增殖性的、未分化的细胞。在某些区域，在它们之间出现小血管。在植入物的中心，细胞布局变得更稀疏，并且在它们之间出现胶原纤维。起初，它们具有规则的带状布局，随后，它们的布局变得混乱，常常交织在一起。众多的成纤维细胞和纤维细胞变得定位于胶原纤维之间，并且较不经常存在软骨细胞，以及出现淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的局部积累。再生区带的中心被基底基质所占据，后者经历通过众多结缔组织细胞(例如成纤维细胞、成软骨细胞、成骨细胞)以及众多浓缩基质(condensed matrix)结构来进行的组构和重新构造。在形态学上，这些结构类似于骨-软骨棒和骨棒，其包含带有活性成骨细胞的孔。9周后，观察到细胞数目减少，而同时胶原纤维数目增加。在更为矿化的基底基质中观察到众多钙化和单个骨化中心。
所进行的免疫细胞化学研究使得能够在植入物内定位表达干细胞所特征性的蛋白质Thy-1和CX-CR4的细胞。发现经标记的细胞邻近血管和在血管内，以及在位于植入物和耳朵软骨之间边界处以及位于骨-软骨棒重构区带处的强烈增殖性的、未分化的细胞的区带中。
电子显微术使我们能够得出下面的结论：
在4周和9周时的再生区带的电子显微术图像中的大多数之中，观察到相对较多的细胞，随同大量胶原纤维一起。在再生3周后，它们的细胞质包含大范围的具有常常膨胀的潴泡的粗面ER、众多具有均一的基质和轮廓不清晰的嵴的线粒体以及众多空泡。这些细胞中的细胞核包含大量的松散编织的染色质。还观察到小的、被膜的细胞质碎片，它们从细胞中脱离并且变成细胞外基质的一部分并参与其矿化。在该实验的第9周期间，细胞数目更少，但是胶原的量增长。在许多细胞中，细胞膜和核被膜显示出内陷，并且染色质变得浓缩。众多细胞经历凋亡，并且显示出凋亡细胞所典型的细胞核，其中染色质浓缩，并且它们的细胞质变得片段化。在3周后，软骨生长明显减慢，而在9周后，在耳朵中的软骨结构之中的损伤被完全修复。在此，电子显微术显示出众多的凋亡细胞。凋亡负责正在生长的鹿角的形态发生并且也是对再生发挥调节作用的一种机制，其尤其限制了过度的细胞生长。在骨生长和重新构造期间，在骨骼发育的过程中，也出现类似的调节过程。
通过使用电泳，将实验和对照动物的血清分级分离成诸如白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白、β2球蛋白和γ球蛋白的蛋白质。将各个级分以绝对单位和相对单位进行定量，并计算出白蛋白对球蛋白的比率。血清蛋白质的电泳分离表明了广泛范围的级分的行为，其中包括急性期蛋白和免疫球蛋白。白蛋白是阴性反应性级分，而包含在α1、α2、β1、β2球蛋白级分中的蛋白质在不同程度上和以多样化的速率阳性地发生反应。可以合理地忽略术后创伤和组织完整性的破坏作为急性期反应的诱导剂的作用，这是因为，来自两个组的所有动物经历了相同的操作程序。当比较用鹿角发生性细胞进行了植入的实验组和对照组动物的蛋白质模式时，我们只观察到β2球蛋白级分的小的增加，在统计学显著性的边界线上。这与同时观察到的低的针对异种细胞的炎症水平相关。有限的血管发生和大规模的胶原合成(伴随着缺乏将可能激活蛋白水解的嗜中性粒细胞浸润)是鹿角发生性细胞的再生活性的证据。出于同样原因，术后动物的免疫应答是非常弱的并且不伴有植入物排斥。
下表显示了来自实验组和对照组的兔血清蛋白质的电泳分离。
根据本发明而获得的鹿角发生性细胞不被不同物种(兔)的代表性组的动物所排斥。相反地，它们随同容忍了它们的存在的宿主组织一起参与了软骨的再生。这促进了这样的推测，即也存在在人中使用以此方式获得的干细胞的现实可能性。根据本发明的细胞植入物使得能够避免在使用标准方法时所遇到的在人中进行结缔组织再生中的一系列困难，所述标准方法具有转移病毒性或遗传性疾病或肿瘤的风险。还避免了与为此目的而获得人干细胞相关的伦理学顾虑。在鹿角发生性细胞植入方面的成功尝试表明，由于组织相容性抗原的有限的表达，因而存在有很大的在再生医学中使用异种干细胞的可能性。因此，在将来，鹿角发生性细胞可以用于结缔组织的重构。
实施例2
MIC-1干细胞系的建立以及其特征
在经由极小量注射的麻醉下，在无菌条件下，在最强烈生长的时期(五月)，从正在生长的赤鹿(Cervus elaphus)鹿角的尖端侧部断片(tip lateral fragments)收集1.5cm×0.2mm的圆形切除物。以机械方式使所收集的切除物降解，直至获得100至900微米的细微的断片。保留一半的经降解的组织以用于光学和电子显微镜分析。借助于细胞迁移，从经降解的鹿角的部分中分离出增殖性细胞。将分离出的细胞置于培养瓶中。所用的培养基为来自CAMBREX的SmGM-2SingleQuots，其具有1mM/ml L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(SIGMA，Germany)。将细胞置于培养箱中，在那里它们在标准条件下于+37℃在包含5％CO2的气氛中生长。以每周大约5百万个细胞的效率，将该细胞系维持四个月。将所得到的MIC-1细胞系进行冷冻，并置于在低温容器中的-176℃液氮之中。
随后，进行比较的和ID检查。将用于显微镜分析的样品在4％经缓冲的福尔马林中进行固定，脱水，并包埋在石蜡块中。将显微镜载玻片进行H+E染色。用下列抗体进行免疫细胞化学分析：抗-Ki-67和抗-PcNA(增殖标志物)，抗-CD-31和抗-CD-34(血管标志物)，以及抗-CX-CR4、抗-c-kit、抗-Thy-1和抗-Bcrp-1(干细胞标志物)。
在卡可酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.4)中的2.5％戊二醛之中固定用于电子显微术的材料，然后脱水并包埋在Epon 812树脂中。用常规方法使切片形成反差(contrast)，并在JEM-100B电子显微镜上进行观察。
在微量培养制备物上进行免疫细胞化学反应，以尝试用特异性标志物来鉴定干细胞：抗-CXCR4、抗-c-kit、抗-Thy-1和抗-Bcrp-1。使用抗-c-kit和抗-Thy-1抗体，只在小的、卵形的、频繁分裂的细胞的情况下获得了特异的、阳性的膜反应。我们未观察到抗原Bcrp-1和CXCR4的表达。在具有细胞质突起的更加分化的细胞中未观察到上面提及的抗原的表达。用针对抗-Bcrp-1和抗-c-kit的抗体，使用针对干细胞的特异性抗体，在石蜡切片上也获得了阳性免疫细胞化学结果。
使用电子显微术来研究经培养的细胞和来自鹿角切片的细胞的超微结构。我们主要检查了小的、卵形的、未分化的细胞的超微结构。在这两种情况下，它们都以具有松散的染色质和核仁的大细胞核为特征。少量的细胞质围绕细胞核并且包含大范围的粗面ER、线粒体、空泡和糖原颗粒。在细胞膜上观察到微绒毛。
MIC-1干细胞系的基因分型
在11种多态的二和四核苷酸微卫星的基础上，测定了来自赤鹿的MIC-1干细胞系的基因型。为了进行比较，使用了梅花鹿(东北梅花鹿(Cervus nippon hortulorum)DNA。
使用QIAGEN Multiplex PCR Kit(Qiagen)以及合适的正向和反向引物对，制备了PCR反应混合物。正向引物的5’末端用荧光染料FAM、HEX或TET进行标记，并且在合成之后用HPLC进行纯化。在下面的条件下，在GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)循环变温器中进行PCR：
-初始变性：95℃，15分钟
Figure G2007800534967D00121
-最终延伸：72℃，10分钟
在ABIPrism 310(Applied Biosystem)系统上，使用毛细管电泳来进行基因分型。
MIC-1干细胞系的基因型
编号   多态性标志物   GenBank登录号   MIC-1细胞基因型   梅花鹿基因型
  1   T108   AF191798   147bp   143/155bp
编号   多态性标志物   GenBank登录号   MIC-1细胞基因型   梅花鹿基因型
  2   T156   AF192396   130/158bp   158/166bp
  3   T193   AF192398   189bp   221/237bp
  4   T501   AF442815   244/256bp   252/256bp
  5   T115   AF193021   168/204bp   180bp
  6   T107   AF193019   243/247bp   243bp
  7   T172   AF192397   161/165bp   173/185bp
  8   T507   AF442816   199/203bp   139bp
  9   Haut14   AF236378   106/132bp   120/148bp
  10   CSSM19   AF232761   141/145bp   147/155bp
  11   CSSM66   AF232764   165/179bp   175/189bp
bp-碱基对
引物序列
  编号   引物名称   序列
1 T108   正向5’-CATGTGGAGATAGGTAGACAGA-3’反向5’-CCATTCTGAGTAGCTGATTCA-3’
2 T156   正向5’-TCTTCCTGACCTGTGTCTTG-3’反向5’-GATGAATACCCAGTCTTGTCTG-3’
3 T193   正向5’-AGTCCAAGCCTGCTAAATAA-3’反向5’-CTGCTGTTGTCATCATTACC-3’
  编号   引物名称   序列
4 T501   正向5’-CTCCTCATTATTACCCTGTGAA-3’反向5’-ACATGCTTTGACCAAGACC-3’
5 T115   正向5’-AATGTCTGACTCTAGGTGAGTG-3’反向5’-TTTGCTATCTGAGCCACTAG-3’
6 T107   正向5’-ACATCCGTTCAGGTGTGA-3’反向5’-CCAGAGGTAAGATAAATGGTGA-3’
7 T172   正向5’-AGCATCTCCCCTTTCAACA-3’反向5’-CTTCCCAACCCAAGTATCG-3’
8 T507   正向5’-AGGCAGATGCTTCACCATC-3’反向5’-TGTGGAGCACCTCACACAT-3’
9 Haut14   正向5’-CCAGGGAAGATGAAGTGACC-3’反向5’-TGACCTTCACTCATGTTATTAA-3’
10 CSSM19   正向5’-TTGTCAGCAACTTCTTGTATCTTT-3’反向5’-TGTTTTAAGCCACCCAATTATTTG-3’
11 CSSM66   正向5’-AATTTAATGCACTGAGGAGCTTGG-3’反向5’-ACACAAATCCTTTCTGCCAGCTTGA-3’
MIC-1干细胞系于2007年7月26日保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，Braunschweig)，其是具有用于专利保护的国际保藏单位(IDA)资格的机构。该专利保藏物被指定有编号DSMACC2854。
实施例3
MIC-1细胞系在异种植入物中的应用
在无菌条件下从处于麻醉下的动物中收集正在生长的鹿角的1.5cm×0.2mm的圆形断片。将所收集的组织断片分为四个部分。将用于细胞培养的那部分置于试管中，浸没在10ml培养基(添加有100U.I./ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的来自Cambrex的MEM)中。在实验室条件下，将切片在含有所述抗生素的培养基中洗涤几次，接着，以机械方式使其降解成对径为几百微米的小断片。借助于其自发迁移，从该材料中分离出增殖性细胞。在分离后，将细胞悬浮在具有10％胎牛血清、100U.I./ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、1mM/ml L-谷氨酰胺的完全培养基(以占培养室至少20％的体积)中，然后，将它们转移至25cm2的培养瓶中。在Kendro培养箱中，在标准条件下，意即于+37℃和在5％CO2中对该培养物进行维持。在获得完整的单层后，用具有0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶使细胞从培养瓶上脱离，并将其转移至连续培养瓶中。从这样的原代细胞系得到连续细胞系，并且在第五次传代后在添加10％二甲亚砜(DMSO)的情况下使细胞冷冻并保存于-176℃的液氮中。为了制备用于植入的细胞，使第五代解冻，并将细胞在相同的完全培养基中进一步进行培养。在产生了合适数目的细胞(5×106)后，使用胰蛋白酶和EDTA将它们从基层上脱离，然后在培养基中进行离心。培养基中的血清使胰蛋白酶失活，并且将所产生的沉淀物悬浮在没有血清、L-谷氨酰胺而且也没有抗生素的新鲜MEM中。在Bürker室中对细胞进行计数，并以2×106个细胞/植入物取样出悬浮液以用于沉降在网格上。将纤维蛋白海绵用于此目的，它们也在外科手术中使用以用于止血，在此用作用于粘附细胞的载体。将海绵置于无菌的塑料小瓶中，并添加包含2×106个细胞/1ml干净MEM的悬浮液。然后，将此进行离心，从而细胞沉降到海绵上。离心在Hereus离心机上以大约700rpm进行10分钟。倾析掉上清液，以准备将在纤维蛋白海绵上的细胞进行植入。关于植入，我们使用了来自如上所进行的培养的细胞，其在用于植入的网格(其为纤维蛋白海绵)上。
该实验采用了12只兔，其中6只在实验组(E)中，而6只作为对照组(C)。这些是重3.5-4.0kg的8月龄的白色加利福尼亚兔。在耳朵的中间，在其外侧我们进行了标准的外科手术准备。对皮肤表面进行刮毛、清洁和消毒。从耳朵边缘大约1cm处，我们切除了1×1cm的一瓣皮肤和软骨膜。然后，我们切除和移去了0.8×0.8cm的一片裸露的软骨。使用电凝法来阻塞小的、流血的血管。在6只E组兔中，采用一块用细胞悬浮液浸透的切成一定尺寸的纤维蛋白海绵来填充软骨损伤，总是在右侧。对6只C组兔，施行相同的操作程序，这些兔植入了用生理盐水浸透的纤维蛋白海绵。然后，用皮肤-软骨膜瓣覆盖植入物。用单层缝线来闭合伤口。然后，用过氧化氢洗涤伤口，并让其保持无遮盖的状态，而不进行包扎。使用肌内施用的50000U.I./kg青霉素，在抗生素保护下进行外科手术。手术后4和9周，借助于临床观察，从所述两组动物中的植入物位点之中离体收集实验材料。以穿过耳朵的整个厚度的切除物形式来收集材料，其包含植入物和动物自身的软骨。固定所获得的材料，以用于免疫细胞化学检查和电子显微术。
关于免疫细胞化学，所述材料在4％经缓冲的福尔马林中进行固定，脱水，并包埋在石蜡中。光学显微术切片用H+E和甲苯胺(T)进行染色。将石蜡切片用于免疫细胞化学，其中使用抗-CX-CR4、抗-c-kit和抗-Thy-1抗体，它们识别对于干细胞来说特异的蛋白质。
在卡可酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.4)中的2.5％戊二醛之中固定用于电子显微术的材料，然后脱水并包埋在Epon 812树脂中。在手术后4周，在2ml从侧耳静脉收集的血液样品上进行血清蛋白质的电泳。以标准方式，将血液于37℃温育0.5小时，然后离心5分钟以分离血清。使用高电压水平电泳，在经缓冲的琼脂糖凝胶上施行分离。使用光密度计装置在600nm处进行定量，从而获得各个蛋白质级分。还测定了白蛋白对球蛋白的比率。从电泳获得的结果经过统计学分析，其中使用Student′s t-检验，以0.05的α水平。该检验使用Statistica7.0(Stat Soft)来进行。
对照和实验动物的血清的电泳分离产生诸如白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白、β2球蛋白和γ球蛋白的蛋白质级分。将各个级分以绝对值和相对值进行量化，并计算出白蛋白对球蛋白的比率。电泳显示了广泛范围的级分的行为，其中包括急性期蛋白和免疫球蛋白。在该情况下，白蛋白是阴性应答性级分，而在α1、α2、β1和β2球蛋白级分中的蛋白质在不同程度上和以多样化的速率阳性地发生反应。可以合理地忽略术后创伤和组织完整性的破坏作为急性期反应的诱导剂的作用，这是因为，来自两个组的所有动物经历了相同的操作程序。当比较用鹿角发生性细胞进行了植入的实验组和对照组动物的蛋白质模式时，我们只观察到β2球蛋白级分的小的增加，在统计学显著性的边界线上。这与同时观察到的低的针对异种细胞的炎症水平相关。有限的血管发生和大规模的胶原合成(伴随着缺乏将可能激活蛋白水解的嗜中性粒细胞浸润)是鹿角发生性细胞的再生活性的证据。出于同样原因，术后动物的免疫应答是非常弱的并且不伴有植入物排斥。
下表显示了来自实验组和对照组的兔血清蛋白质的电泳分离。
Figure G2007800534967D00181

Claims (7)

1.正在生长的鹿角的组织在建立新的干细胞系中的应用。
2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述干细胞系从正在生长的鹿角的尖端侧部断片获得。
3.根据权利要求1的应用，其特征在于，将所获得的干细胞系用于制备用于植入的制剂，优选地异种植入物。
4.根据权利要求1的应用，其特征在于，将所获得的干细胞系用于制备用于重构结缔组织损伤的制剂，所述结缔组织优选地选自软骨、骨或脂肪组织。
5.源自正在生长的鹿(鹿科)角的被命名为MIC-1的新的干细胞系，其以登录号DSM ACC2854保藏在DSMZ。
6.根据权利要求5的新的干细胞系，其用于在重构结缔组织损伤中应用，所述结缔组织优选地选自软骨、骨或脂肪组织。
7.用于以在5％CO2的气氛中和在37℃下的原代培养物开始，直接从该培养物或者从先前冷冻的细胞，培养源自正在生长的鹿角，特别是赤鹿鹿角的干细胞的方法，其特征在于，从在无菌条件下收集的并磨成粉状的正在生长的鹿角断片建立所述原代培养物，分离出细胞并在包含10％胎牛血清以及谷氨酰胺和所选抗生素的溶液的MEM培养基中进行培养；在第五次传代后，将细胞进行冷冻或者在相同的培养基上在上面所描述的条件下进一步进行培养。当产生至少2×106个细胞时，使用胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)来使它们脱离，在培养基中进行离心，并将所获得的沉淀物重悬浮在干净的MEM中；从具有对于替换所失去的组织的体积而言所需的尺寸的纤维蛋白海绵块来制备网格片段，由此将它们放置在无菌小瓶中，并补充包含至少2×106个细胞/1ml液体的细胞悬浮液，然后通过离心使细胞沉降在海绵上，随后倾析掉上清液。
CN2007800534967A 2007-04-25 2007-12-10 干细胞系、其应用以及培养方法 Expired - Fee Related CN101808672B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL382287A PL209210B1 (pl) 2007-04-25 2007-04-25 Sposób hodowli komórek macierzystych wyprowadzonych z rosnącego poroża jeleniowatych
PLP.382287 2007-04-25
PL383134A PL211674B1 (pl) 2007-08-11 2007-08-11 Linia komórek macierzystych i jej zastosowanie
PLP.383134 2007-08-11
PCT/PL2007/000080 WO2008133536A2 (en) 2007-04-25 2007-12-10 New stem cell lines, their application and culture methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101808672A true CN101808672A (zh) 2010-08-18
CN101808672B CN101808672B (zh) 2013-05-01

Family

ID=39926215

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007800534967A Expired - Fee Related CN101808672B (zh) 2007-04-25 2007-12-10 干细胞系、其应用以及培养方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US8278096B2 (zh)
EP (1) EP2144639B1 (zh)
KR (1) KR101178153B1 (zh)
CN (1) CN101808672B (zh)
AU (1) AU2007352480B2 (zh)
CA (1) CA2685148C (zh)
DK (1) DK2144639T3 (zh)
ES (1) ES2400282T3 (zh)
HK (1) HK1147218A1 (zh)
NZ (1) NZ581109A (zh)
PT (1) PT2144639E (zh)
SI (1) SI2144639T1 (zh)
WO (1) WO2008133536A2 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011210042B2 (en) 2010-01-26 2016-01-21 Stem Cells Spin S.A. Cell homogenate from stem cells derived from growing deer antlers, a method of obtaining it and its use
EP2830646B1 (en) 2012-03-27 2018-03-07 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
KR101459674B1 (ko) * 2012-05-25 2014-11-10 중앙대학교 산학협력단 녹용 세포의 배양 방법
EP2950807B1 (en) 2013-01-30 2018-03-28 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use in treating metabolic disorders
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
AP2016009663A0 (en) 2014-07-30 2016-12-31 Ngm Biopharmaceuticals Inc Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
EA036985B1 (ru) 2014-10-31 2021-01-25 НДжМ БИОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. Композиции и способы лечения метаболических расстройств
PE20190126A1 (es) 2016-03-31 2019-01-17 Ngm Biopharmaceuticals Inc Proteinas de union y metodos de uso de las mismas

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10026480A1 (de) * 2000-05-29 2001-12-13 Augustinus Bader Verfahren zur Herstellung eines empfängerspezifischen Gewebe-Transplantats oder -Implantats
CN1590537A (zh) * 2003-09-02 2005-03-09 中国人民解放军第四军医大学口腔医学院 外胚间充质干细胞的分离和培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008133536A3 (en) 2009-03-26
DK2144639T3 (da) 2012-12-10
EP2144639B1 (en) 2012-08-22
HK1147218A1 (en) 2011-08-05
AU2007352480B2 (en) 2012-06-21
KR101178153B1 (ko) 2012-08-29
CN101808672B (zh) 2013-05-01
WO2008133536A2 (en) 2008-11-06
US8278096B2 (en) 2012-10-02
NZ581109A (en) 2012-06-29
EP2144639A2 (en) 2010-01-20
CA2685148C (en) 2014-09-09
SI2144639T1 (sl) 2013-03-29
KR20090131677A (ko) 2009-12-29
ES2400282T3 (es) 2013-04-08
AU2007352480A1 (en) 2008-11-06
PT2144639E (pt) 2012-12-06
US20100184217A1 (en) 2010-07-22
CA2685148A1 (en) 2008-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101808672B (zh) 干细胞系、其应用以及培养方法
ES2693609T3 (es) Lámina de células cultivadas, método para su producción y método para su aplicación
CN102317445B (zh) 细胞、人工细胞构建体或三维复合组织装配体的冷冻保存方法
JP3808900B2 (ja) 結合組織細胞に部分的又は完全に分化した骨髄幹細胞の有効培養物及びヒアルロン酸誘導体より成る三次元の生体親和性で且つ生分解性のマトリックスから構成される生物学的物質
CN1323228A (zh) 用于软骨细胞移植的方法、器械和材料
CN110478528B (zh) 一种新型的促组织修复材料的制备方法及其应用
WO2013176131A1 (ja) 移植用人工組織体製造のための鋳型基材
CN107446885B (zh) 一种间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料及其应用
JP6434014B2 (ja) 球状軟骨細胞治療剤の製造方法
CN104263698B (zh) 临床治疗级细胞治疗用成纤维细胞规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法
CN101014375A (zh) 角膜上皮片及其制作方法
CN1836034A (zh) 生产神经元的方法
CN1297658C (zh) 一种用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法
RU2449755C2 (ru) Способ устранения костных дефектов с восстановлением в них костной ткани
CN115433711A (zh) 一种鹿茸干细胞细胞外基质及其制备方法和运用
RU86455U1 (ru) Биоинженерная конструкция
CN107224618A (zh) 促进骨再生的活性支架材料、其制备方法及应用
CN115210362A (zh) 用于心脏类器官培养和移植的脱细胞心脏组织衍生支架及其制备方法
WO2016088373A1 (ja) 移植用培養細胞シート、移植用培養細胞シートの製造方法、及び、移植用の骨組織作製方法
CN106256381A (zh) 有序修复材料及其制备方法和用途
Hayashi et al. Immature muscular tissue differentiation into bone‐like tissue by bone morphogenetic proteins in vitro, with ossification potential in vivo
JP3951023B2 (ja) 細胞致死化処理骨に生細胞を搭載した骨補填システム
CN106834222A (zh) 一种培育带血管蒂骨瓣的方法
JP2005013717A (ja) 培養表皮及びその培養方法
CN102552984A (zh) 骨组织工程支架材料及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1147218

Country of ref document: HK

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: STEM CELLS SPIN SA

Free format text: FORMER OWNER: STEM CELLS SPIN SP.Z.O.O.

Effective date: 20111011

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20111011

Address after: Wroclaw

Applicant after: Stem Cells Spin S.A.

Address before: Wroclaw

Applicant before: Stem Cells Spin Sp.z.o.o.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130501

Termination date: 20191210

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee