PL211674B1 - Linia komórek macierzystych i jej zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowych linii komórek macierzystych z rosnącego poroża jeleniowatych (Cervidae) i zastosowania tych komórek do rekonstrukcji tkanki łącznej, korzystnie tkanki kostnej, chrzestnej albo tłuszczowej, u ludzi i zwierząt, a także zastosowania tkanki z rosnącego poroża jeleniowatych do produkcji stabilnej linii komórek macierzystych o symbolu MIC-1.

Poszukiwania idealnego materiału do rekonstrukcji rusztowania chrzęstnego małżowin usznych i nosa mają ponad stuletnią historię i są wciąż intensywnie prowadzone. Własna żebrowa chrząstka gospodarza była i jest najczęściej używana, jako materiał rekonstrukcyjny w chirurgii twarzowej. Niefortunnie czas potrzebny do jej pozyskania utrudnia zabieg, naraża pacjenta na dodatkowy pooperacyjny dyskomfort, przedłuża rekonwalescencję i zwiększa prawdopodobieństwo pojawienia się późniejszych komplikacji w miejscu pobrania materiału. Ponadto u dzieci ilość możliwej do pozyskania chrząstki żebrowej jest często zbyt mała dla odtworzenia rusztowania małżowiny usznej lub nosa, a u dorosłych może być ona skostniała i nieprzydatna do formowania. Za istotny etap w poszukiwaniu najodpowiedniejszego materiału organicznego do rekonstrukcji mogą być uważane badania Vacantiego i wsp. rozpoczęte w latach 90 XX wieku. W pionierskich eksperymentach użyto wówczas syntetycznej, biokompatybilnej, biodegradalnej, porowatej siatki polimerowej, którą impregnowano izolowanymi ludzkimi chondrocytami. Ilość chondrocytów możliwych do uzyskania poprzez namnażanie ich poza ustrojem jest jednak ograniczona, a ma ona bezpośredni związek z wydajnością procesu regeneracji. Technologia jest bardzo kosztowna, uciążliwa, wymagająca specjalistycznej aparatury. Wiele wszczepów traci też stopniowo pierwotny kształt. Szczególnych trudności przysparza kwestia zgodności gatunkowej, w większości przypadków, bowiem dochodzi do silnej reakcji immunologicznej na wprowadzoną obcą tkankę, co skutkuje odrzuceniem przeszczepu.

Początek XXI wieku to okres dynamicznego rozwoju badań nad wykorzystaniem komórek macierzystych do regeneracji i odbudowy wszystkich rodzajów tkanek, w tym tkanki łącznej. Komórki macierzyste tak in vivo jak i in vitro cechują się bardzo dużym potencjałem proliferacyjnym, a możliwość ich wszczepiania to szansa na istotny postęp w transplantologii. W przypadku większości tkanek wyjątkowo trudne jest jednak pozyskiwanie ukierunkowanych linii komórkowych. Co więcej, z pobieraniem ludzkich komórek macierzystych wiążą się też często problemy etyczne oraz zagrożenie transferem chorób wirusowych i nowotworowych.

W stanie techniki ujawniono rozwią zania dotyczące pozyskiwania komórek macierzystych róż nicujących się w osteoblasty wyłącznie z różnego typu ludzkich tkanek. W zgłoszeniach WO 2005//085422, US 2005/0048644 ujawniono komórki macierzyste, izolowane z tkanki tłuszczowej, wykorzystywane w leczeniu chorób układu ruchu. W zgłoszeniu WO 2005/038012 ujawniono metodę pozyskiwania komórek macierzystych, zdolnych do różnicowania się w osteoblasty lub chondroblasty z ludzkich tkanek płodowych. Zgłoszenie US 2007/0122902 ujawnia metodę izolacji i hodowli multipotentnych komórek macierzystych otrzymywanych z krwi pępowinowej. Podejmowano również próby genetycznej modyfikacji komórek zdolnych do regeneracji tkanki chrzestnej i kostnej, co zostało ujawnione w opisie patentowym US 6398816. Najwięcej kontrowersji natury etycznej budzą zgłoszenia dotyczące komórek macierzystych pozyskiwanych z tkanki embrionalnej (WO 03068937A2, WO 02064755A2, WO 0038583A1).

Stosowanie ludzkich komórek macierzystych szeroko opisywanych w stanie techniki wiąże się z wystę powaniem wielu problemów, które stanowią o silnej potrzebie prowadzenia dalszych badań w tym kierunku. Do głównych przeszkód należą kwestie etyczne związane ze stosowaniem komórek embrionalnych, niebezpieczeństwo powstania defektów genetycznych oraz zagrożenie transferem chorób wirusowych i nowotworowych. Istnieje więc pilne zapotrzebowanie na linie komórek macierzystych, których stosowanie wykluczyłoby ryzyko wystąpienia powyższych przeszkód.

Każdego roku dojrzałe poroże jeleniowatych (Cervidae), zbudowane z tkanki kostnej, jest zrzucane i w krótkim czasie szybko odrasta. Rozwija się ono po urodzeniu jako przedłużenie zawsze obecnych szypuł i wypustek pnia, znajdujących się na kości czołowej. Centra wzrostu, blastema pni i poroż a powstają z wyspecjalizowanego regionu koś ci czoł owej, tak zwanej okostnej antlerogenicznej. Szypuły i wzrastające poroże buduje specyficzna tkanka kostnochrzęstna, będąca mieszaniną chrząstki i kości. Poroża występują u wszystkich samców z 39 gatunków rodziny jeleniowatych).

Wzrost poroża u jelenia szlachetnego, jego kształt i późniejsza mineralizacja, jest wieloetapowym, skomplikowanym, szybko przebiegającym procesem. Poroże rozrasta się dzięki zmodyfikowanemu kostnieniu śródchrzęstnemu, tak zwanej ossyfikacji endochondralnej. W naszym klimacie wzrost

PL 211 674 B1 jest wyjątkowo gwałtowny w okresie trzech miesięcy, to jest od kwietnia do czerwca. Dwu centymetrowe przyrosty dzienne powodują, że wzrastające poroże jest jednym z najszybciej rosnących organów u ssaków. Wymaga to uaktywnienia i współuczestnictwa wielu typów komórek, a szczególnie istotną rolę w inicjacji i kontynuacji procesu wzrostu pełnią komórki macierzyste. Komórki porożogenne są pochodzenia mezenchymalnego, część z nich można zaliczyć do dorosłych somatycznych komórek macierzystych.

Ze stanu techniki znane są własności tkanki poroża jeleniowatych rozpoznawanej jako najszybciej rosnąca postać kości wśród tkanek ssaczych. Podejmowano próby wykorzystania własności wzrostowych tkanki przede wszystkim poprzez izolację czynników wzrostu. W zgłoszeniu WO 93/19085 ujawniono sposób izolacji czynnika wzrostu, jako substancji zdolnej do regeneracji uszkodzonej tkanki kostnej. Ujawniono sposób pozyskiwania ekstraktu izolowanego z poroży jelenia wschodniego (Cervus nippon), który stymuluje wzrost hematopoetycznych komórek macierzystych i megakariocytów. Zgłoszenie WO 2004/112806 ujawnia kompozycję do leczenia zaburzeń neuronalnych sporządzoną w oparciu o markery czynnika wzrostu pozyskiwane z poroża jeleniowatych. Jak dotąd, jednakże nie udało się otrzymać stabilnej linii komórek macierzystych pochodzącej z poroża jeleniowatych, która mogłaby skutecznie zostać wykorzystana do rekonstrukcji uszkodzeń tkanki łącznej.

Celem wynalazku jest uzyskanie stabilnych linii komórek macierzystych do rekonstrukcji tkanki łącznej, korzystnie tkanek chrzestnych, kostnych albo tłuszczowych, zarówno ludzkich jak i zwierzęcych. Ponadto, celem wynalazku są linie komórek macierzystych wywołujących słabą indukcję odpowiedzi immunologicznej, dzięki czemu możliwe będzie przyjęcie się ich wszczepów ksenogenicznych, to jest obcogatunkowych. Celem wynalazku jest również pozyskanie takich linii komórek macierzystych, których wykorzystanie pozwoliłoby na uniknięcie problemów natury etycznej, niebezpieczeństwa powstania defektów genetycznych oraz zagrożenia transferem chorób wirusowych i nowotworowych. Nieoczekiwanie określony powyżej cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie tkanki z rosnącego poroża jeleniowatych, korzystnie z końcowych bocznych fragmentów rosnącego poroża jeleniowatych, do uzyskiwania linii komórek macierzystych. Kolejno, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie uzyskanej linii komórek macierzystych do otrzymywania preparatów służących do wszczepów międzygatunkowych. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie uzyskanej linii komórek macierzystych do uzyskiwania preparatów do rekonstrukcji ubytków tkanki łącznej, korzystnie tkanki kostnej, chrzestnej albo tłuszczowej. Następnie przedmiotem wynalazku jest nowa linia komórek macierzystych o symbolu MIC-1 wyprowadzona z rosnących poroży jeleniowatych (Cervidae) zdeponowana w DSMZ pod numerem DSM ACC2854. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie komórek MIC -1 w rekonstrukcji ubytków tkanki łącznej, korzystnie tkanki kostnej, chrzestnej albo tłuszczowej.

Nieoczekiwanie okazało się, że alternatywą dla ludzkich komórek macierzystych mogłyby być komórki obcogatunkowe. Poszukując źródła takich komórek zwrócono uwagę na ewentualność wykorzystania poroża jeleniowatych, charakteryzującego się szczególnym, nigdzie indziej niespotykanym procesem odnowy i wzrostu. Wyniki przeprowadzonych badań dowodzą, że wśród tych, które uczestniczą w corocznej odnowie poroża obecna jest pula komórek obdarzonych dużym potencjałem proliferacyjnym. Powstaje z nich ograniczona liczba typów komórek zróżnicowanych, uczestniczących między innymi w regeneracji uszkodzonej chrząstki i kości. Ponieważ komórki porożogenne są komórkami nisko zróżnicowanymi, powodującymi słabą indukcję odpowiedzi immunologicznej, nieoczekiwanie okazało się, że szansa przyjęcia się ich przeszczepów ksenogenicznych, to jest obcogatunkowych, jest wyjątkowo duża. Przeprowadzona analiza i badania nad komórkami macierzystymi prowadzą do wniosku, że istnieje silna potrzeba pozyskania stabilnych linii komórek macierzystych. Nieoczekiwanie okazało się, że komórki porożogenne ze względu na niskie zróżnicowanie wywołują słabą odpowiedź immunologiczną dzięki czemu doskonale nadają się do pomyślnego wykonywania i przyjęcia się ich wszczepów obcogatunkowych, tym samym zarówno dla zwierząt jak i ludzi. Wykazano, że tkanki pochodzące z końcowych bocznych fragmentów wzrastającego poroży jeleniowatych (Cervidae) mogą stanowić cenne źródło dla stabilnej linii komórek macierzystych. Jak pokazują przeprowadzone przez Wynalazców badania, wraz ze wzrostem poroża ich część z okostnej antlerogenicznej zmienia swoją lokalizację przemieszczając się stopniowo ku górze.

Przedmiot wynalazku uwidoczniono na rysunku, na którym Fig. 1a i Fig. 1b przedstawiają wybarwione hematoksyliną i eozyną (x200) komórki porożogenne po przeszczepie w obrębie chrząstki małżowiny usznej królika regenerujące ubytek chrząstki.

PL 211 674 B1

Niniejszy opis został wzbogacony o umieszczone poniżej przykłady realizacji zastrzeganego wynalazku. Służą one jedynie lepszemu zobrazowaniu istoty przedmiotowego rozwiązania i nie powinny być uznawane za ograniczające zakres żądanej ochrony.

P r z y k ł a d 1.

Uzyskiwanie linii komórek macierzystych z rosnących poroży jeleniowatych i jej zastosowanie

Nieoczekiwanie okazało się, że wycinki tkanki pochodzącej z rosnących poroży jeleniowatych, korzystnie z końcowych bocznych fragmentów wzrastającego poroża jeleniowatych (Cervidae) mogą stanowić cenne źródło dla stabilnej linii komórek macierzystych, bowiem, jak pokazują przeprowadzone przez Wynalazców badania, wraz ze wzrostem poroża ich część z okostnej antlerogenicznej zmienia swoją lokalizację przemieszczając się stopniowo ku górze. W związku z powyższym, w celu pozyskania nowej linii komórek macierzystych w płytkiej narkozie, przeprowadzonej systemem zdalnej iniekcji (wielokrotnie stosowanej w zabiegach pielęgnacyjnych), pobiera się jałowo z końcowych bocznych fragmentów wzrastającego poroża jeleniowatych (Cervidae), wycinek w postaci krążka o średnicy około 1,5 cm i grubości 0,2 mm. Na podstawie badań w mikroskopie świetlnym stwierdzono, że centralną cześć badanych wycinków zajmują naczynia krwionośne, w sąsiedztwie, których znajdują się liczne, małe, gęsto ułożone obok siebie komórki. Obwodowo ilość komórek znacznie się zwiększa. Część z nich jest większa i bardziej dojrzała morfologicznie i przypomina komórki chrzestne (chondroblasty, chondrocyty). Między tymi komórkami pojawia się istota podstawowa z rosnącą ilością włókien kolagenowych. Zewnętrzną warstwą rosnącego poroża jest natomiast unerwiona, unaczyniona skóra owłosiona, tak zwany aksamit. Po zdjęciu aksamitu wycinki rozdrabnia się mechanicznie, aż do uzyskania mikroskopijnych fragmentów o wymiarach rzędu setek mikrometrów. Proliferujące komórki wyizolowuje się wykorzystując zjawisko migracji. Z wyizolowanych komórek zakłada się hodowlę pierwotną, stosując jako płyn wzrostowy medium hodowlane z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej oraz roztworu glutaminy z penicyliną i streptomycyną, w ilości co najmniej 20% objętości komory hodowlanej. Hodowlę prowadzi się w standardowych warunkach w atmosferze z dodatkiem 5% CO2 i temperaturze 37°C, przez czas co najmniej trzech pasaży. Wyhodowaną linię komórkową zamraża się i przechowuje w ciekłym azocie w standardowych naczyniach mrożeniowych. W przypadku konieczności zwiększenia zasobów linii komórkowej rozmraża się ją, a następnie poddaje dalszej hodowli w ten sam sposób, w czasie potrzebnym do wytworzenia niezbędnej ilości komórek macierzystych. Obecność komórek macierzystych potwierdza praktyczna nieśmiertelność komórek hodowlanych, brak cech różnicujących związanych z morfologią badanych komórek oraz dodatnie wyniki reakcji immunocytochemicznych.

W badaniach za pomocą mikroskopii elektronowej określano ultrastrukturę komórek pochodzących z wycinków poroża jak i komórek hodowlanych. Oceniano przede wszystkim ultrastrukturę małych owalnych komórek niezróżnicowanych. Okazało się, że w obu przypadkach cechuje je obecność dużego jądra komórkowego z aktywną luźną chromatyną i jąderkiem. Niewielka ilość cytoplazmy otaczająca jądro zawiera duże ilości siateczki śródplazmatycznej ziarnistej, mitochondria, wakuole i ziarna glikogenu. Na powierzchni błony komórkowej obserwuje się mikrokosmki. Badania te wykazały, że wśród komórek otrzymanych z hodowli są zawsze obecne małe nieprzytwierdzone, niezróżnicowane, owalne, opalizujące komórki obdarzone dużym potencjałem proliferacyjnym. Komórki te cechują się dużą przeżywalnością, po przetrzymywaniu w ciekłym azocie i późniejszym rozmrożeniu są ponownie aktywne, czyli podejmują swoje życiowe funkcje.

Reakcje immunocytochemiczne przeprowadzone na preparatach histologicznych wykazały dużą ilość komórek proliferujących, z ekspresją antygenów Ki-67 i PCNA. Wyznakowane komórki znajdują się obok i w obrębie naczyń krwionośnych położonych centralnie w rosnącym porożu. Duża ich część o wyraźnie strefowej lokalizacji znajduje się bardziej obwodowo i położona jest bezpośrednio pod odcinkami wydzielniczymi gruczołów skóry. Wyznakowane komórki obserwuje się zarówno w obrę bie samych gruczoł ów, jak i w warstwie rozrodczej naskórka. Reakcja na obecność markerów proliferacji naczyń CD31, CD34 była negatywna. Pozytywne znakowanie z użyciem specyficznych przeciwciał anty-Bcrp1 i, anty-c-kit, znakujących komórki macierzyste uzyskano natomiast w strefie intensywnych podziałów komórkowych między skórą, a bezpośrednio leżącą pod nią ochrzęstną.

Badania na wyprowadzonej linii komórek macierzystych przeprowadzone po kilku dniach obserwacji hodowli komórkowej w mikroskopie odwróconym kontrastowo-fazowym, wykazały zachodzenie spontanicznych podziałów i różnicowanie się komórek. Podobne obrazy uzyskano na preparatach mikrohodowli barwionych metodą H+E.

W hodowli zawsze obecne są mał e nieprzytwierdzone, niezróż nicowane, owalne, opalizują ce komórki. Z czasem rosnąc stają się większe, uzyskując obwodowe wypustki, którymi niejednokrotnie łączą się między sobą, a także z podłożem. Wzrost komórek jest nieograniczony i po wielu pasażach zachowują one swą aktywność podziałową.

PL 211 674 B1

Podczas badań nad zastosowaniem pozyskanych komórek macierzystych z poroża jeleniowatych poszukiwano odpowiedzi na pytanie czy użyte obcogatunkowe komórki hodowlane przetrwają i podejmą swoje funkcje ż yciowe w obrę bie obcej tkanki. W tym celu podję to próbę wykorzystania ksenogenicznego wszczepu komórek macierzystych z rosnącego poroża jelenia szlachetnego do regeneracji ubytku chrząstki małżowiny usznej królika.

Hodowlę pierwotną zakłada się z pobranych jałowo fragmentów wzrastającego poroża jelenia, które się rozdrabnia, wyizolowuje komórki i hoduje, stosując jako płyn wzrostowy medium hodowlane MEM z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej oraz roztworu glutaminy i dobranych antybiotyków, prowadząc ją w atmosferze z dodatkiem 5% CO2 i temperaturze 37°C. Po wyprowadzeniu piątego pasażu komórki zamraża się lub nadal prowadzi się hodowlę w warunkach wyżej opisanych, na identycznym podłożu hodowlanym, a po uzyskaniu odpowiedniej liczby komórek, co najmniej 2 x 10⁶, odkleja się je za pomocą trypsyny z 0,02% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i odwirowuje w pełnym medium hodowlanym. Uzyskany osad zawiesza się w czystym medium MEM i przygotowuje fragmenty rusztowania, do którego wykorzystuje się kawałki gąbki fibrynowej, o wymaganych do uzupełnienia ubytku chrząstki lub kości wymiarach. Umieszcza się go w jałowych ampułkach, dodaje zawiesinę komórek w stężeniu, co najmniej 2 x 10⁶/1 ml. Komórki osadza się na rusztowaniu z gąbki fibrynowej poprzez wirowanie, a następnie zlewa supernatant. Do wszczepów użyto komórek z hodowli uzyskanej sposobem zgodnym z wynalazkiem, na rusztowaniu, którym była gąbka fibrynowa. Podczas obserwacji klinicznych, przeprowadzanych jednocześnie po wszczepach doświadczalnych (grupa E)+ i kontrolnych (grupa C), obserwowano i porównywano przebieg procesu gojenia. Wszystkie zwierzęta biorące udział w eksperymencie zniosły zastosowane procedury chirurgiczne dobrze. Rany pooperacyjne uległy prawidłowemu wygojeniu przez rychłozrost. Szwy usuwano w 8 dobie po zabiegu. W miejscach gdzie śródochrzęstnowo lokowano zawieszone na gąbce fibrynowej somatyczne komórki macierzyste obserwowano ich udział w procesach regeneracyjnych, bez odczynu zapalnego i reakcji odrzutu wszczepu. Wynikiem intensywnie zachodzącego procesu regeneracji był wyraźny przyrost grubości chrząstki w czasie pierwszych 3 tygodni doświadczenia. Proces ten ulegał następnie stopniowemu spowolnieniu. W 7 tygodniu doświadczenia, pokryte niezmienioną skórą, nowo powstałe rusztowanie małżowiny usznej o lekko nierównej powierzchni, było grubsze o około 15% od otaczającej je chrząstki własnej zwierzęcia. Przez kolejne 2 tygodnie nie obserwowano już przyrostu grubości małżowiny. Wszczepiana królikom z grupy kontrolnej gąbka fibrynowa, nasączona roztworem soli fizjologicznej, ulegał wchłonięciu bez objawów martwicy i odczynu zapalnego, a obszary gdzie usunięto chrząstkę pozostawały wklęsłe. Po 9 tygodniach miejsca te były nadal znacznie cieńsze, pokryte obustronnie niezmienioną skórą. Nie zaobserwowano tu żadnych procesów regeneracyjnych, a jedynie proces bliznowacenia.

W 4 tygodniu, na obwodzie obszaru regeneracji obserwuje się dużą ilość proliferuj ą cych, pasmowato ułożonych, niezróżnicowanych komórek. W pewnych obszarach pojawiają się między nimi małe naczynia krwionośne. W centrum przeszczepu ułożenie komórek staje się rzadsze, a między nimi pojawiają się włókna kolagenowe. Początkowo mają one regularny pasmowaty przebieg, a następnie ich układ staje się chaotyczny, często wzajemnie przeplatają się. Między włóknami kolagenowymi lokalizują się liczne fibroblasty, fibrocyty w mniejszej ilości chondrocyty, a także czasami miejscowe skupiska limfocytów i granulocytów kwasochłonnych. Centrum obszaru regeneracji zajmuje istota podstawowa organizująca się i ulegająca przebudowie z licznymi typowymi komórkami tkanki łącznej takimi jak fibroblasty, chondroblasty, osteoblasty oraz liczne struktury zagęszczonej macierzy. Morfologicznie struktury te podobne są do beleczek chrzęstno-kostnych i kostnych, w obrębie których w tak zwanych zatokach erozyjnych obecne są aktywne osteoklasty. Po 9 tygodniach, w miejscach regeneracji obserwuje się zmniejszoną liczbę komórek i wzrost ilości włókien kolagenowych. W bardziej zmineralizowanej istocie podstawowej obecne są liczne zwapnienia i pojedyncze ogniska kostnienia.

Przeprowadzone reakcje immunocytochemiczne pozwoliły zlokalizować komórki wykazujące obecność charakterystycznych dla komórek macierzystych białek Thy-1, CX-CR4 w obrębie obszaru wszczepu. Wyznakowane komórki znajdowały się obok i w obrębie naczyń krwionośnych oraz w strefie intensywnie proliferujących, niezróżnicowanych komórek na granicy wszczepu i chrząstki małżowiny usznej, a także w miejscach przebudowy beleczek chrzestno kostnych.

Na podstawie mikroskopii elektronowej można stwierdzić co następuje:

na większości oglądanych elektronogramów z miejsc regeneracji, zarówno w 4 jak i w 9 tygodniu doświadczenia obserwuje się stosunkowo, liczne komórki, oraz dużą ilość włókien kolagenowych. Większość z obserwowanych komórek to fibroblasty, chondroblasty i osteoblasty. Po upływie 3 tygodni regeneracji cytoplazma ich zawiera duże ilości szorstkiej siateczki śródplazmatycznej o często rozdętych kanałach, liczne mitochondria z obecnością homogennej macierzy i niewyraźnym konturze grzebieni mitochon6

PL 211 674 B1 drialnych oraz wodniczki i wakuole. Jądra tych komórek zawierają duże ilości luźnej chromatyny. Obserwuje się także niewielkie obłonione fragmenty cytoplazmy, które odrywają się od komórek i stają się częścią substancji międzykomórkowej, uczestnicząc w jej mineralizacji. W 9 tygodniu doświadczenia liczba komórek jest mniejsza a wzrasta ilość kolagenu. W wielu komórkach zarówno błona komórkowa jak i otoczka jądrowa wykazują inwaginacje, a chromatyna jądrowa ulega kondensacji. Liczne komórki ulegają apoptozie i w nich występują charakterystyczne dla komórek apoptotycznych jądra komórkowe, w których chromatyna jądrowa jest skondensowana, a cytoplazma ich ulega fragmentacji. Po upływie 3 tygodni przyrost grubości chrząstki ulegał wyraźnemu spowolnieniu, natomiast po 9 tygodniach doświadczenia ubytek rusztowania chrzęstnego małżowiny był już całkowicie odbudowany. Na elektronogramach obserwowano tu liczne komórki apoptotyczne. Aktywne procesy apoptotyczne są odpowiedzialne za morfogenezę rosnącego poroża. Są też jednym z mechanizmów mających wpływ na regulację procesu regeneracji, miedzy innymi ograniczając nadmierny rozrost komórkowy. Podobne procesy regulacyjne mają miejsce podczas rozwoju szkieletowego, wzrastania kości i ich przebudowie.

W wyniku elektroforetycznego rozdziału surowicy zwierząt eksperymentalnych i kontrolnych otrzymano frakcje białek takich jak albuminy, globuliny α1, α2, β1, β2 i gammaglobuliny. Pojedyncze frakcje określono w wartościach względnych i bezwzględnych oraz określono stosunek albumin do globulin. Elektroforetyczny rozdział białek surowicy obrazuje zachowanie się szerokiego spektrum frakcji, do których zaliczamy białka ostrej fazy i immunoglobuliny. Albuminy są tu frakcją reagującą ujemnie, a białka zawarte we frakcjach α1, α2, β1, β2 globulin reagują w różnym stopniu i z różną dynamiką dodatnio. Rolę urazu operacyjnego i naruszenia ciągłości tkanek jako czynnika indukującego odpowiedź ostrej fazy można było, naszym zdaniem pominąć, bowiem wszystkie zwierzęta z grup E i C przebyły identyczną technicznie procedurę chirurgiczną. Przy porównaniu proteinogramów grupy eksperymentalnej i kontrolnej u zwierząt, którym wszczepiono komórki porożogenne zaobserwowano jedynie nieznaczne, na granicy istotności statystycznej, podwyższenie frakcji β2 globulin. Korelowało to z obserwowanym równocześnie w badaniach mikroskopowych słabym odczynem zapalnym na obcogatunkowe komórki. Umiarkowana angiogeneza i masywna synteza kolagenu, przy braku nacieku neutrofilowego uruchamiającego procesy proteolityczne, przemawia za odtwórczym działaniem komórek porożogennych. Odpowiedź immunologiczna u operowanych zwierząt była tym samym słabo wyrażona i nie towarzyszyła jej reakcja odrzucenia przeszczepu.

W poniższej tabeli został przedstawiony elektroforetyczny rozdział białek surowicy krwi królików z grupy kontrolnej i eksperymentalnej.

	Grupa C N 6	Grupa E N 6
Białko całkowite		g/l	60,9±14,7	57,4±11,3
Albuminy		g/l	41,7±3,6	37,6±7,2
	%	67,2±4,83	65,8±4,68
Globuliny	Alfa 1	g/l	2,8±1,6	1,7±0,8
%	4,22±2,05	2,98±1,27
Alfa 2	g/l	3,8±1,2	2,6±0,7
%	5,95±1,36	5,28±1,06
Beta 1	g/l	5,3±1,4	4,9±1,7
%	8,57±2,07	11,01±4,6
Beta 2	g/l	2,03±0,75	2,4±0,62
%	3,37±1,26	4,18±1,16
Gamma	g/l	6,35±1,73	7,03±1,89
%	10,38±2,83	12,42±2,79
Albuminy/Globuliny		2,04±0,61	1,97±0,42

Uzyskiwane zgodnie z wynalazkiem komórki porożogenne nie zostały odrzucone przez reprezentatywną grupę obcogatunkową zwierząt, jakimi są króliki, a przeciwnie brały one udział w regenePL 211 674 B1 racji tkanki chrzęstnej wraz z udziałem tolerujących ich obecność tkanek gospodarza. Pozwala to wnioskować, że istnieje realna perspektywa stosowania tak otrzymanych komórek macierzystych również u ludzi. Wszczepy komórek według wynalazku pozwalają na uniknięcie szeregu trudności regeneracji tkanki łącznej u ludzi znanymi sposobami, niosącymi niebezpieczeństwo transferu chorób wirusowych, nowotworowych czy genetycznych, a także, co jest niezwykle istotne, pozbycie się problemów etycznych związanych z pozyskiwaniem ludzkich komórek macierzystych do tego celu. Udana próba wszczepu komórek porożogennych wskazuje, że dzięki niskiej ekspresji antygenów specyficzności tkankowej, istnieje znaczne prawdopodobieństwo możliwości stosowania obcogatunkowych komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej. Tak więc komórki porożogenne mogą w przyszłości znaleźć zastosowanie przy regeneracji tkanki łącznej.

P r z y k ł a d 2.

Uzyskanie linii komórek macierzystych MIC-1 i jej charakterystyka

Z koń cowych bocznych fragmentów wzrastają cego poroż a jelenia szlachetnego (Cervus Elaphus), w okresie najintensywniejszego wzrostu, w miesiącu maju, pobrano jałowo, w narkozie przeprowadzonej systemem zdalnej iniekcji, wycinki w postaci krążka o średnicy około 1,5 cm i grubości 0,2 mm. Pobrane wycinki rozdrobniono mechanicznie do uzyskania mikroskopijnych fragmentów o wymiarach około 100 - 900 mikrometrów. Połowę rozdrobnionej tkanki, pozostawiono do badań mikroskopowych i mikroskopowo-elektronowych. Z przeznaczonego do hodowli rozdrobnionego poroża wyizolowano proliferujące komórki, wykorzystując zjawisko migracji. Wyizolowane komórki umieszczono w butelkach hodowlanych. Jako płyn wzrostowy zastosowano medium: SmGM-2 SingleQuots firmy CAMBREX, z dodatkiem L-Glutaminy w ilości 1 mM/ml, Penicyliny w ilości 100 j /ml. Streptomycyny w ilości 0,1 mg/ml firmy SIGMA. Komórki umieszczono w cieplarce, gdzie rosły w standardowych warunkach w atmosferze z dodatkiem 5% CO2 i temperaturze +37°C. Linię prowadzano przez cztery miesiące, z wydajnością około 5 milionów komórek w okresie jednego tygodnia. Wyhodowaną linię komórkową MIC -1 poddano zamrożeniu i umieszczono w naczyniach mrożeniowych w ciekłym azocie w temperaturze -176°C.

Następnie przeprowadzono badania porównawcze i identyfikacyjne. Do badań mikroskopowych, pobrany materiał został utrwalony w 4% roztworze zbuforowanej formaliny, odwodniony i zatopiony w bloczkach parafinowych. Skrawki do badań mikroskopowych barwiono hematoksyliną i eozyną (H+E). Na skrawkach parafinowych wykonano reakcje immunocytochemiczne przy użyciu następujących przeciwciał: anty-Ki-67 i anty-PcNA (markery proliferacji), anty-CD-31 i anty-CD-34 (markery naczyń krwionośnych) oraz anty-CX-CR4, anty-c-kit, anty-Thy-1 i anty-Bcrp-1 (markery komórek macierzystych).

Materiał do badań mikroskopowo elektronowych utrwalano 2,5% aldehydem glutarolowym w buforze cacodylowym (0,1 M) pH 7,4, a nastę pnie odwoniono i zatopiono w Eponie 812. Skrawki kontrastowano metodą rutynową i oglądano w mikroskopie elektronowym JEM-100 B.

Na preparatach mikrohodowli wykonano reakcje, immunocytochemiczne, podejmując próbę wyznakowania komórek macierzystych. Zastosowano specyficzne przeciwciała znakujące je: antyCXCR4, anty c-kit, anty-Thy-1 i anty-Bcrp-1. Specyficzną dodatnią reakcję błonową uzyskano tylko w mał ych, owalnych, czę sto dzielą cych się komórkach z przeciwciał ami anty c-kit i anty-Thy-1. Nie obserwowano ekspresji antygenów-Bcrp-1 i CXCR4. Nie wykazano także ekspresji żadnych ww. antygenów w komórkach bardziej zróżnicowanych, posiadających wypustki. Pozytywny wynik reakcji immunocytochemicznej uzyskano również na skrawkach parafinowych, używając specyficznych przeciwciał znakujących komórki macierzyste z przeciwciałami anty-Bcrp1 i anty-c-kit.

Mikroskopią elektronową badano ultrastrukturę tak komórek hodowlanych jak i tych pochodzących z wycinków poroża. Oceniano przede wszystkim ultrastrukturę małych owalnych komórek niezróżnicowanych. W obu przypadkach cechuje je obecność dużego jądra komórkowego z aktywną luźną chromatyną i jąderkiem. Niewielka ilość cytoplazmy otaczająca jądro zawiera duże ilości siateczki śródplazmatycznej ziarnistej, mitochondria, wakuole i ziarna glikogenu. Na powierzchni błony komórkowej obserwuje się mikrokosmki.

Genotypowanie linii komórek macierzystych MIC-1

Genotyp linii komórek macierzystych MIC-1 pochodzących z jelenia Cervus elaphus określono na podstawie 11 polimorficznych dwu- i cztero-nukleotydowych mikrosatelit. Materiał porównawczy stanowiło DNA jelenia Dybowskiego Cervus nippon hortulorum.

Do przygotowania mieszaniny reakcyjnej PCR wykorzystano zestaw QIAGEN Multiplex PCR Kit (Qiagen) oraz odpowiednie pary starterów forward i reverse. Startery forward znakowane były na końcu 5' barwnikiem fluorescencyjnym: FAM, HEX lub TET, po syntezie wszystkie startery oczyszczane

PL 211 674 B1 cykle metodą HPLC. Reakcję PCR przeprowadzano w termocyklerze GeneAmp PCR System 9700 (Applied

Biosystems) w następujących warunkach:

> denaturacja wstępna: 95°C, 15 min.

> denaturacja: 94°C, 30 sek.

> przyłączanie starterów: 57°C, 90 sek.

> wydłużanie: 72°C, 60 sek.

> wydłużanie końcowe: 72°C, 10 min.

Genotypowanie przeprowadzono z wykorzystaniem metody elektroforezy kapilarnej na aparacie ABIPrism 310 (Applied Biosystems).

GENOTYP linii komórek macierzystych MIC-1

Lp.	Polimorficzny marker	Nr dostępu w Banku Genów	Genotyp komórek MIC-1	Genotyp jelenia Dybowskiego
1	T108	AF191798	147 pz	143/155 pz
2	T156	AF192396	130/158 pz	158/166 pz
3	T193	AF192398	189 pz	221/237 pz
4	T501	AF442815	244/256 pz	252/256 pz
5	T115	AF193021	168/204 pz	180 pz
6	T107	AF193019	243/247 pz	243 pz
7	T172	AF192397	161/165 pz	173/185 pz
8	T507	AF442816	199/203 pz	139 pz
9	Haut14	AF236378	106/132 pz	120/148 pz
10	CSSM19	AF232761	141/145 pz	147/155 pz
11	CSSM66	AF232764	165/179 pz	175/189 pz

pz-pary zasad.

Sekwencja starterów

Lp.	Nazwa startera	Sekwencja
1	T108	forward 5'- CATGTGGAGATAGGTAGACAGA-3' reverse 5'- CCATTCTGAGTAGCTGATTCA-3'
2	T156	forward 5' - TCTTCCTGACCTGTGTCTTG -3’ reverse 5'- GATGAATACCCAGTCTTGTCTG -3’
3	Tl 93	forward 5'- AGTCCAAGCCTGCTAAATAA-3' reverse 5'- CTGCTGTTGTCATCATTACC-3'
4	T501	forward 5'- CTCCTCATTATTACCCTGTGAA-3' reverse 5'- ACATGCTTTGACCAAGACC-3
5	Tl 15	forward 5'- AATGTCTGACTCTAGGTGAGTG-3' reverse 5' - TTTGCTATCTGAGCCACTAG-3'
6	Tl 07	forward 5'- ACATCCGTTCAGGTGTGA-3' reverse 5' - CCAGAGGTAAGATAAATGGTGA-3'
7	T172	forward 5'- AGCATCTCCCCTTTCAACA-3' reverse 5'- CTTCCCAACCCAAGTATCG-3'
8	T507	forward 5'- AGGCAGATGCTTCACCATC-3' reverse 5'- TGTGGAGCACCTCACACAT-3'
9	Hautl4	forward 5'- CCAGGGAAGATGAAGTGACC-3' reverse 5'- TGACCTTCACTCATGTTATTAA-3'
10	CSSM19	forward 5'- TTGTCAGCAACTTCTTGTATCTTT-3' reverse 5'- TGTTTTAAGCCACCCAATTATTTG-3'
11	CSSM66	forward 5'- AATTTAATGCACTGAGGAGCTTGG-3' reverse 5'- ACACAAATCCTTTCTGCCAGCTTGA-3'

PL 211 674 B1

Linia komórek macierzystych MIC-1 została zdeponowana 26 lipca 2007 roku w DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH w Braunschweig instytucji posiadającej status międzynarodowego ośrodka depozytowego do celów postępowania patentowego (IDA). Depozytowi patentowemu nadano numer DSM ACC2854.

P r z y k ł a d 3.

Wykorzystanie linii komórek MIC-1 do wszczepów międzygatunkowych

Fragment tkanki rosnącego poroża w postaci krążka o średnicy 1,5 cm i grubości 0,2 mm pobiera się w sposób sterylny podczas narkozy zwierzęcia. Pobrany fragment tkanki dzieli się na cztery części. Jedną część przeznaczoną do hodowli komórkowej umieszcza się w probówce, zanurzając ją w 10 ml medium hodowlanego - MEM firmy Cambrex z dodatkiem penicyliny 100 U.I./ml i streptomycyny 0,1 mg/ml. W warunkach laboratoryjnych wycinek kilka razy płucze się medium z dodatkiem wymienionych antybiotyków. Następnie metodą mechaniczną rozdrabnia się go na małe fragmenty wielkości 0,5 - 1 mm. Z tak rozdrobnionego fragmentu poroża wyizolowuje się proliferujące komórki wykorzystując zjawisko ich samoczynnej migracji. Po izolacji komórki zawiesza się w pełnym medium hodowlanym, w ilości co najmniej 20% objętości komory hodowlanej, z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej, penicyliny 100 U.l./ml, streptomycyny 0,1 mg/ml, L-Glutaminy 1 mM/ml i przenosi do butelek hodowlanych o powierzchni 25 cm². Hodowlę prowadzi się w inkubatorze Kendro, w standardowych warunkach, to jest w temperaturze +37°C, w atmosferze z dodatkiem 5% CO2. Po uzyskaniu pełnego monolayeru, komórki odkleja się od podłoża butelek hodowlanych przy użyciu enzymu 0,05% trypsyny z 0,02% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i przenosi się do kolejnych butelek hodowlanych. Z tak otrzymanej linii pierwotnej, poprzez kolejne pasaże wyprowadza się linię ciągłą, a po uzyskaniu pią tego pasażu komórki zamraża się z dodatkiem 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowuje w ciekłym azocie w temperaturze -176°C. W celu przygotowania komórek do wszczepu odmraża się pasaż piąty, poddając komórki dalszej hodowli, stosując identyczne pełne medium hodowlane. Po uzyskaniu odpowiedniej ilości komórek 5x10⁶ odkleja się je od podłoża butelek hodowlanych za pomocą trypsyny i EDTA, następnie odwirowuje w pełnym medium hodowlanym, wykorzystując fakt, że surowica zawarta w medium inaktywuje działanie enzymu trypsyny, a otrzymany osad zawiesza się w czystym medium MEM bez surowicy, L-Glutaminy, i antybiotyków. Komórki liczy się w komorze Burkera i sporzą dza zawiesinę 2 x 10⁶ komórek do jednego wszczepu, przygotowują c je do osadzenia na rusztowaniu. Do tego celu wykorzystuje się fragmenty gąbki fibrynowej, stosowanej w chirurgii np. przy tamowaniu krwawień, a tu jako nośnik do hodowli adherentnych komórek. Umieszcza się je w jałowych ampułkach plastikowych, dodaje zawiesinę komórek w ilości 2 x 10⁶ komórek/ 1 ml czystego płynu MEM bez dodatków, następnie odwirowuje go, a komórki w tym czasie osiadają na gąbce fibrynowej. Wirowanie prowadzi się w wirówce firmy Hereus przez 10 minut przy około 700 obr/min. Odwirowany płyn - supernatant - zlewa się, otrzymując gotowe do wszczepu komórki zawieszone na gąbce fibrynowej. Do przeszczepów użyto komórek z hodowli uzyskanej powyższym sposobem, na rusztowaniu dla przeszczepów, którym była gąbka fibrynowa.

Do doświadczenia użyto 12 królików, 6 - jako grupa eksperymentalna (E) i 6 - jako grupa kontrolna (C), ośmiomiesięcznych samic, rasy białej kalifornijskiej, o ciężarze około 3,5-4,0 kg. W połowie wysokości małżowiny usznej, na jej zewnętrznej powierzchni, standardowo przygotowano pole operacyjne. Powierzchnia skóry była golona, oczyszczana i dezynfekowana. Około 1 cm od wolnego brzegu małżowiny, na jej powierzchni grzbietowej, odpreparowywano uszypułowany przyśrodkowo płat skórno-ochrzęstnowy, o wymiarach 1 x 1 cm. Następnie wypreparowywano i usuwano fragment obnażonej chrząstki o wymiarach 0.8 x 0.8 cm. Drobne, krwawiące naczynia zamykano elektrokoagulacją. U 6-ciu królików z grupy E, każ dorazowo prawostronnie, w przygotowanym ł oż u, to jest w kieszeni ochrzęstnowej, umieszczano dopasowany do wymiarów ubytku chrząstki płatek gąbki fibrynowej nasączonej zawiesiną komórkową. W identyczny sposób 6-ciu królikom z grupy C wszczepiano gąbkę fibrynową nasączoną solą fizjologiczną. Na miejsca wszczepów nakładano płaty skórno-ochrzęstnowe. Rany zamykano jednowarstwowo nićmi chirurgicznymi. Następnie przemywano je wodą utlenioną i pozostawiano odkryte, bez zakł adania opatrunków. Zabiegi przeprowadzano w osłonie antybiotykowej, podając wszystkim królikom domięśniowo penicylinę 50 000 U.l./kg. Kierując się obserwacjami klinicznymi, zarówno w grupie E i C, po 4 i 9 tygodniach od dnia zabiegu, z miejsc operowanych pobierano przyżyciowo materiał doświadczalny, którym były wycinki obejmujące całą grubość małżowiny, zawierające zarówno wszczep jak i pozostawioną chrząstkę własną zwierzęcia. Pozyskany materiał utrwalono do badań immunohistochemicznych oraz w mikroskopie elektronowym.

PL 211 674 B1

Do badań immunocytochemicznych pobrany materiał został utrwalony w 4% roztworze zbuforowanej formaliny, odwodniony i zatopiony w bloczkach parafinowych. Skrawki do badań mikroskopowych barwiono hematoksyliną i eozyną (H + E) oraz toluidyną (T). Na skrawkach parafinowych wykonano reakcje immunocytochemiczne przy użyciu przeciwciał anty-CX-CR4, anty-c-kit i anty-Thy-1, wykrywających białka charakterystyczne dla komórek macierzystych.

Do badań w mikroskopie elektronowym materiał utrwalono 2,5% aldehydem glutarowym na buforze cocodylowym (0,1 M, pH 7,4), a następnie odwadniano go i zatapiano w Eponie 812.

Badania elektroforetyczne białek surowicy krwi wykonano w czwartym tygodniu po zabiegu, pobierając od każdego królika z grupy doświadczalnej i z grupy kontrolnej, po 2 ml krwi z żyły usznej brzeżnej. Krew inkubowano w sposób standardowy w temperaturze 37°C przez 0,5 godziny, a następnie wirowano przez 5 minut dla uzyskania surowicy. Elektroforetyczny rozdział surowicy przeprowadzono na zbuforowanym żelu agarozowym, elektroforezą wysokonapięciową poziomą. Odczytu dokonywano densytometrem przy długości fali 600 nm, otrzymując poszczególne frakcje białek oraz określano stosunek albumin do globulin. Uzyskane wyniki badań elektroforetycznych poddano analizie statystycznej z użyciem testu t-Studenta. Za istotne statystycznie przejęto różnice, gdzie p < 0,05. Przy wykonaniu obliczeń wykorzystano program Statistica ver. 7.0 (Stat Soft, Kraków, Poland).

W wyniku elektroforetycznego rozdziału surowicy zwierząt eksperymentalnych i kontrolnych otrzymano frakcje białek takich jak albuminy, globuliny α1, α2, β1, β2 gammaglobuliny. Pojedyncze frakcje określono w wartościach względnych i bezwzględnych oraz określono stosunek albumin do globulin. Elektroforetyczny rozdział białek surowicy obrazuje zachowanie się szerokiego spektrum frakcji, do których zaliczamy białka ostrej fazy i immunoglobuliny. Albuminy są tu frakcją reagującą ujemnie, a białka zawarte we frakcjach α1, α2, β1, β2 globulin reagują w różnym stopniu i z różną dynamiką dodatnio. Rolę urazu operacyjnego i naruszenia ciągłości tkanek jako czynnika indukującego odpowiedź ostrej fazy można było, naszym zdaniem pominąć, bowiem wszystkie zwierzęta z grup E i C przebyły identyczną technicznie procedurę chirurgiczną. Przy porównaniu proteinogramów grupy eksperymentalnej i kontrolnej u zwierząt, którym wszczepiono komórki porożogenne zaobserwowano jedynie nieznaczne, na granicy istotności statystycznej, podwyższenie frakcji β2 globulin. Korelowało to z obserwowanym równocześnie w badaniach mikroskopowych słabym odczynem zapalnym na obcogatunkowe komórki. Umiarkowana angiogeneza i masywna synteza kolagenu, przy braku nacieku neutrofilowego uruchamiającego procesy proteolityczne, przemawia za odtwórczym działaniem komórek porożogennych. Odpowiedź immunologiczna u operowanych zwierząt była tym samym słabo wyrażona i nie towarzyszyła jej reakcja odrzucenia przeszczepu. W poniższej tabeli został przedstawiony elektroforetyczny rozdział białek surowicy krwi królików z grupy kontrolnej i eksperymentalnej.

	Grupa G N 6	Grupa E N 6
Białko całkowite	g/l	60,9±14,7	57,4±11,3
Albuminy	g/l	41,7±3,6	37,6±7,2
%	67,2±4,83	65,8±4,68
Globuliny	Alfa 1	g/l	2,8±1,6	1,7±0,8
%	4,22±2,05	2,98±1,27
Alfa 2	g/l	3,8±1,2	2,6±0,7
%	5,95±1,36	5,28±1,06
Beta 1	g/l	5,3±1,4	4,9±1,7
%	8,57±2,07	11,01±4,6
Beta 2	g/l	2,03±0,75	2,4±0,62
%	3,37±1,26	4,18±1,16
Gamma	g/l	6,35±1,73	7,03±1,89
%	10,38±2,83	12,42±2,79
Albuminy/Globuliny	2,04±0,61	1,97±0,42

PL 211 674 B1

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Linia komórek macierzystych o symbolu MIC -1 wyprowadzona z rosnących poroży jeleniowatych (Cervidae) zdeponowana w DSMZ pod numerem DSM ACC2854.
2. 2. Linia komórek macierzystych według zastrz. 1, do zastosowania w rekonstrukcji ubytków tkanki łącznej, korzystnie wybranej z grupy obejmującej tkankę chrzestną, tkankę kostną i tkankę tłuszczową.
3. 3. Zastosowanie tkanki rosnącego poroża jeleniowatych do uzyskiwania linii komórek macierzystych.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że linie komórek macierzystych uzyskuje się z końcowych bocznych fragmentów wzrastającego poroża.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że uzyskiwane linie komórek macierzystych są wykorzystywane do otrzymywania preparatów służących do wszczepów, korzystnie wszczepów międzygatunkowych.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że uzyskiwane linie komórek macierzystych są wykorzystywane do uzyskiwania preparatów do rekonstrukcji ubytków tkanki łącznej, korzystnie wybranej z grupy obejmującej tkankę chrzestną, tkankę kostną i tkankę tłuszczową.