ES2400282T3 - Nueva línea de células madre y su aplicación - Google Patents

Abstract

Una línea de células madre designada como MIC - 1 derivada de los cuernos en desarrollo de ciervo (Cervidae)depositada en el banco DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2854.

Description

Nueva línea de células madre y su aplicación

La presente invención se refiere a una línea de células madre estable designada por MIC-1.

La búsqueda del material ideal para la reconstrucción de la red cartilaginosa de los lóbulos de las orejas y la nariz se

5 realiza desde hace más de cien años y aún se sigue persiguiendo activamente. Se ha usado y aún se sigue usando más a menudo el cartílago costal autólogo como material reconstructivo en cirugía facial. Desafortunadamente, el tiempo requerido para obtenerlo complica enormemente el procedimiento, somete al paciente a un malestar postquirúrgico mayor e incrementa la probabilidad de posteriores complicaciones en las zonas de muestreo. Además, en niños, la cantidad de cartílago costal disponible para su recogida a menudo es demasiado pequeña para

10 reconstruir el lóbulo de la oreja o la nariz, mientras que en adultos puede estar calcificado e inservible. Una etapa importante en la búsqueda del material reconstructivo orgánico ideal consistió en la investigación de Vacanti et al, iniciada durante los años 80. Esta investigación pionera hizo uso de una malla de polímero sintético, biocompatible, biodegradable y poroso que se impregnó con condrocitos humanos aislados. Sin embargo, el número de condrocitos que pueden hacerse crecer ex vivo es limitado, y es de importancia directa para la eficiencia en la regeneración. La

15 tecnología es muy cara, tediosa y requiere un equipo especializado. Además, muchos implantes pierden su forma con el tiempo. Surgen dificultades particulares debido al problema de la compatibilidad entre especies en la mayoría de los casos, puesto que se produce una reacción inmunitaria fuerte contra el tejido exógeno introducido, lo que da como resultado un rechazo del implante.

El comienzo del siglo XXI es un periodo de desarrollo muy dinámico en el uso de células madre en la regeneración y

20 reconstrucción de toda clase de tejidos, incluido el tejido conjuntivo. Las células madre se caracterizan por un gran potencial de proliferación, tanto in vivo como in vitro, y la posibilidad de implantarlas es una oportunidad para el progreso significativo en transplantología. En el caso de la mayoría de los tejidos, sin embargo, es muy difícil obtener determinadas líneas celulares. Además, la recogida de células madre humanas conlleva problemas éticos, así como el riesgo de transferir enfermedades víricas y tumores.

25 El estado de la tecnología revela soluciones que corresponden únicamente a la obtención de células madre que se diferencian en osteoblastos exclusivamente a partir de varios tejidos humanos. Las solicitudes WO 2005/085422 y US 2005/0048644 describen células madre aisladas de tejido lípido, usadas en el tratamiento de enfermedades del aparato locomotor. La solicitud WO 2005/038012 revela un procedimiento de obtención de células madre que se pueden diferenciar en osteoblastos o condroblastos a partir de tejido fetal humano. La solicitud 2007/0122902 revela

30 un procedimiento de aislamiento y cultivo de células madre pluripotentes a partir de sangre de placenta. También se han realizado intentos para modificar genéticamente células que pueden regenerar cartílago y hueso, como se relaciona por la descripción de la patente US 6398816. El mayor número de controversias éticas se plantean por las aplicaciones relacionadas con el aislamiento de células madre a partir de tejido embrionario (documentos WO03068937A2, WO02064755A2, WO0038583A1).

35 La aplicación de células madre humanas, descrita ampliamente en el estado de la tecnología, conlleva muchos problemas que son evidencia de la necesidad de continuar con la investigación en este respecto. Algunos de los problemas principales son las consideraciones éticas que entraña el uso de tejido embrionario, el daño de defectos genéticos así como el riesgo de transferir enfermedades víricas y tumores. Por tanto, existe una necesidad real y apremiante de obtener líneas de células madre, de las que su aplicación excluiría el riesgo de los problemas

40 anteriores.

Cada año, los cuernos desarrollados del ciervo (Cervidae), hechos de tejido óseo, se caen y vuelven a crecer rápidamente. Se desarrolla de forma postnatal como una extensión de los pedículos, que siempre están presentes en el orificio. Las regiones de crecimiento, blastema del tallo y cuernos surgen de una zona especializada del orificio, la denominada periostio formador del cuerno. Los brotes y cuernos en desarrollo se construyen a partir de una forma

45 específica de osteocartílago, que es una mezcla de cartílago y hueso. Los cuernos se producen en todos los machos de las 39 especies en la familia de los ciervos.

El crecimiento de los cuernos en el ciervo, su forma y posterior mineralización son procesos complejos y a la vez rápidos. Los cuernos crecen debido al denominado proceso de osificación endocondral. En nuestra zona climática, el crecimiento es particularmente rápido durante un periodo de tres meses, de abril a junio, el crecimiento diario de dos

50 centímetros hace que los cuernos en desarrollo sean uno de los órganos que crecen más rápidamente en mamíferos. Esto requiere la activación y la colaboración de muchos tipos de células, y las células madre desempeñan un papel particular en la iniciación y continuación del proceso. Las células productoras de cuernos son de origen mesenquimal, y algunas de ellas se pueden considerar células madre somáticas adultas.

El estado de la tecnología describe las propiedades del tejido de los cuernos del ciervo, reconocido como la forma de

55 hueso que crece más rápidamente entre los tejidos de mamíferos. Se han realizado intentos para utilizar las propiedades de crecimiento de este tejido, principalmente a través del aislamiento de factores de crecimiento. La solicitud WO 93/19085 revela un procedimiento de aislamiento de un factor de crecimiento, como sustancia que puede regenerar el tejido óseo dañado. Los autores revelaron un procedimiento de obtención de un extracto aislado de los cuernos del ciervo Sika (Cervus nippan), que estimula el crecimiento de células madre hematopoyéticas y megacariocitos. La solicitud WO 2004/112808 revela una composición para el tratamiento de disfunciones neuronales, a base de marcadores de factores de crecimiento obtenidos a partir de cuernos de ciervo. Sin embargo, hasta la fecha, no ha sido posible obtener una línea de células madre estable a partir de cuernos de ciervo, lo que se

5 podría usar con éxito en la reconstrucción de lesiones del tejido conjuntivo, ni un procedimiento para cultivar las mismas.

El objetivo de la presente invención es obtener una línea estable de células madre para la reconstrucción de tejido conjuntivo, preferentemente cartílago, hueso o tejidos grasos, tanto humano como animal. Además, un objetivo de la presente invención es una línea de células madre que induce pocas respuestas inmunitarias, lo que permitirá que se

10 use en implantes xenogénicos, es decir, de especies cruzadas. Un objetivo de la presente invención también es la obtención de esta línea de células madre cuya aplicación evitaría consideraciones éticas, el peligro de formación de defectos genéticos así como los riesgos de transferencia de enfermedades víricas y tumores.

Inesperadamente, el objetivo establecido anteriormente se ha logrado en la presente invención.

El objeto de la presente invención es una nueva línea de células madre designada MIC-1 derivada de los cuernos en

15 desarrollo del ciervo (Cervidae), depositada en el banco DSMZ con el número de referencia DSM ACC2854. El siguiente objeto de la presente invención es la línea de células madre anterior para su uso en la reconstrucción de lesiones del tejido conjuntivo.

El siguiente objeto de la invención es la línea de células madre depositada con el número de referencia DSM ACC2854 para su uso en implantación.

20 Inesperadamente, resultó que las células xenogénicas podrían ser una alternativa a las células madre humanas. Durante la búsqueda de fuentes de estas células, la atención se dirigió a los cuernos de los ciervos, caracterizados por su proceso de crecimiento y renovación peculiar sin precedentes. Los resultados de la investigación muestran que entre las células que participan en la renovación anual de los cuernos, hay un grupo de células provistas de un potencial de proliferación alto. Estas forman un conjunto limitado de células diferenciadas que participan, entre otros

25 procesos, en la regeneración de cartílago, hueso y tejido adiposos dañados. Puesto que las células productoras de cuernos están poco diferenciadas, lo que induce un nivel bajo de respuesta inmunitaria, resultó que las posibilidades de aceptar implantes xenogénicos, de especies cruzadas, compuestos de dichas células son muy altas.

El análisis realizado y la investigación sobre células madre conduce a la conclusión de que existe una necesidad urgente de establecer líneas de células madre estables. Inesperadamente, resultó que las células productoras de

30 cuernos inducen una repuesta inmunitaria débil debido a su bajo nivel de diferenciación, gracias a lo que son muy útiles en la implantación y aceptación de implantes xenogénicos, tanto en animales como en el ser humano.

Las Fig. 1a y Fig. 1b presentan tinción de hematoxilina y eosina (H+-E) (x200) de células productoras de cuernos tras su implantación dentro del cartílago en una oreja de conejo. Estas células están reparando una lesión en el cartílago.

35 La presente descripción se ha complementado con ejemplos de realizaciones de la presente invención que se reivindica. Estos están destinados únicamente a ilustrar mejor la naturaleza de la presente invención, y no deben limitar el alcance de la protección solicitada.

Ejemplo 1.

Aislamiento de una línea de células madre a partir de cuernos de ciervo y su aplicación

40 Inesperadamente, se mostró que las escisiones de tejido a partir de cuernos en desarrollo de ciervo, preferentemente a partir de las puntas de las protrusiones laterales de los cuernos en desarrollo de ciervo (Cervidae) puede constituir una fuente valiosa de una línea de células madre estable, puesto que, tal como muestra la investigación de los inventores, junto con el crecimiento de los cuernos, su posición se mueve lentamente hacia arriba desde el periostio productor del cuerno. Por los motivos anteriores, para obtener una nueva línea de células

45 madre, se recogen fragmentos circulares de las protrusiones laterales apicales de cuernos en desarrollo de ciervo (Cervidae) de 1,5 cm por 0,2 mm bajo condiciones estériles y anestesia inyectada de forma remota, superficial (usada a menudo en tratamiento animal). Con el uso de microscopía óptica, se determinó que la porción central de las secciones estaban ocupadas por vasos sanguíneos, próximos a ellos están numerosas células pequeñas, compactadas densamente. Periféricamente, el número de estas células se incrementa considerablemente. Una

50 porción de las células es mayor y más madura morfológicamente y es reminiscente de células de cartílago (condroblastos, condrocitos). Entre estas células, existe una matriz con un número creciente de fibras de colágeno. La capa externa del cuerno en desarrollo es una piel con pelo inervada, vascularizada, la denominada terciopelo. Tras la retirada de esta capa, las secciones se degradan mecánicamente hasta que se obtienen fragmentos microscópicos, de cientos de micrómetros de diámetro. Las células en proliferación se aíslan usando migración. Se

55 establece un cultivo principal a partir de las células aisladas, usando un medio de cultivo con una adición de suero de ternero fetal al 10 % así como una solución de penicilina y estreptomicina. El líquido ocupa al menos el 20 % del volumen de la cámara de crecimiento. El cultivo se mantiene bajo condiciones estándar en una atmósfera que contiene CO2 al 5 % a 37 ºC, a través al menos de tres pasos. La línea celular derivada se congela y se mantiene en nitrógeno líquido en criorecipientes estándar. Cuando se hace necesario proliferar la línea, se descongela y se cultiva adicionalmente de manera idéntica, durante un periodo necesario para generar un número suficiente de células madre.

5 Se confirma la presencia de células madre por la inmortalidad virtual de las células cultivadas, la ausencia de características morfológicas de diferenciación y los resultados inmunocitoquímicos positivos.

Se realizaron estudios ultraestructurales usando microscopía electrónica en células a partir de secciones de cuerno así como de células cultivadas. En particular, se examinó la ultraestructura de células no diferenciadas pequeñas, ovales. Se determinó que en ambos casos, se caracterizan por un núcleo celular grande, que contiene cromatina 10 activa, poco compactada y un nucleolo. Una pequeña cantidad de citoplasma rodea el núcleo y contiene un retículo endoplásmico rugoso extenso, mitocondrias, vacuolas y gránulos de glucógeno. Se observan microvellosidades sobre las superficies. Esta investigación mostró que entre las células cultivadas, siempre existen células pequeñas, no adherentes, no diferenciadas, ovales opalizadas con un potencial de proliferación extenso. Estas células se caracterizan por una tasa de supervivencia alta, actividad tras congelación en nitrógeno líquido y descongelación.

15 Restablecen sus funciones vitales.

Las reacciones inmunocitoquímicas realizadas sobre muestras histológicas mostraron un gran número de células en proliferación, que expresan los antígenos Ki-67 y PCNA. Las células marcadas se encontraron en la proximidad y dentro de los vasos sanguíneos situados centralmente en el cuerno en desarrollo. Un buen número de estas, con una localización decididamente más orientada a la zona, se situaron más periféricamente y se encontraron 20 inmediatamente debajo de las porciones exocrinas de las glándulas cutáneas. Se observan células marcadas tanto dentro de las propias glándulas como en la capa proliferativa del epitelio. Las reacciones para determinar la presencia de marcadores de proliferación vascular, CD31 y CD34 fueron negativas. Se obtuvo la identificación positiva usando anticuerpos anti-Bcrp1 y anti-c-kit, lo que denota células madre, en la zona de división celular intensiva entre la piel y su pericondrio inmediatamente adyacente. El examen de la línea de células madre derivada 25 después de varios días de observación del cultivo de la línea de células madre bajo un microscopio de contraste de fase inversa mostró que se producían divisiones espontáneas así como la diferenciación celular. Se obtuvieron resultados similares usando portaobjetos de microcultivo teñidos usando H+E. El cultivo siempre poseyó células pequeñas, no adherentes, ovales, opalescentes. Con el tiempo, estas se hacen más grandes y crecen protrusiones periféricas, mediante las que se adhieren frecuentemente entre sí o al sustrato. El crecimiento celular es ilimitado y

30 después de muchos pasos mantienen la capacidad de dividirse.

La investigación sobre la aplicación de células madre obtenidas a partir de los cuernos de ciervo se realizó para responder a la cuestión de si las células xenogénicas cultivadas sobrevivirían y realizarían sus funciones vitales dentro del tejido extraño. Para establecer eso, se realizó un intento de uso de un implante xenogénico de células madre a partir de un cuerno en desarrollo de ciervo para regenerar una lesión en el cartílago de la oreja de un

35 conejo.

Se establece el cultivo principal a partir de fragmentos de cuerno en desarrollo de ciervo recogidos bajo condiciones estériles, que se degradan, las células se aíslan y se cultivan usando medio de cultivo MEM con suero de ternero fetal al 10 % y una solución de glutamina y antibióticos seleccionados, mantenido en una atmósfera que contiene CO2 al 5 % a 37 ºC. Después del quinto paso, las células se congelan o el cultivo se mantiene bajo las condiciones 40 anteriores, en un medio idéntico. Después de la aparición de un número apropiado de células (al menos 2 x 106) se separan usando tripsina en EDTA al 0,02 % y se centrifuga en el medio completo. El precipitado se suspende en MEM recién preparado y se producen fragmentos de red usando esponjas de fibrina cortadas en un tamaño necesario para el reemplazo en la lesión. Se coloca en viales estériles y se añade la suspensión celular (al menos 2 x 106 células /1 ml de líquido). Las células se asientan sobre la red por centrifugación, y se retira el sobrenadante. 45 Los implantes consistieron en células cultivadas obtenidas de acuerdo con la presente invención, sobre una red que era una esponja de fibrina. Se observó la curación durante la observación clínica realizada simultáneamente tras la implantación experimental (grupo E) y de control (grupo C). Todos los animales que tomaron parte en el ensayo llevaron bien la cirugía. Las heridas postquirúrgicas experimentaron una curación rápida, apropiada. Se retiraron las suturas 8 días tras la cirugía. En las zonas de implantes intrapericondriales que consistían en células madre 50 suspendidas sobre la esponja de fibrina, las células madre participaron en el proceso regenerativo, si valores inmunitarios ni rechazo al implante. El proceso regenerativo intenso dio como resultado un incremento notable en el grosor del cartílago durante las 3 semanas iniciales del experimento. Después, este proceso se ralentizó gradualmente. Durante la semana 7 del experimento, se cubrió el cartílago estructural de lóbulo de oreja nuevamente formado con piel inalterada, ligeramente irregular y aproximadamente un 15 % más gruesa que el

55 cartílago circundante. No se observó un crecimiento adicional en el grosor del lóbulo de oreja durante las 2 semanas siguientes. La esponja de fibrina empapada en solución salina fisiológica implantada en los ratones de control experimentó una degradación sin necrosis ni valores inmunitarios, pero las zonas en las que se había implantado permanecieron convexas. Después de 9 semanas, estas manchas aún eran considerablemente más finas y se cubrieron en ambos lados por piel inalterada. No se observaron procesos regenerativos aquí, sólo cicatrices.

60 Durante la semana 4, alrededor de la periferia de la zona de regeneración, se observa un gran número de células en proliferación no diferenciadas agrupadas en bandas. En determinadas zonas, aparecen vasos sanguíneos pequeños

entre ellas. En el centro del implante, la distribución de las células se vuelve escasa y aparecen fibras de colágeno entre ellas. Inicialmente, tienen una distribución regular, similar a una banda, y posteriormente su distribución se vuelve caótica con frecuente entrelazado. Numerosos fibroblastos y fibrocitos se vuelven localizados entre las fibras de colágeno, y menos frecuentemente condrocitos, así como acumulaciones locales de linfocitos y granulocitos 5 eosinófilos. El centro de la zona de regeneración está ocupado por una matriz basal que experimenta una organización y reestructuración por numerosas células de tejido conjuntivo tales como fibroblastos, condroblastos, osteoblastos así como numerosas estructuras de una matriz condensada. Morfológicamente, estas estructuras son similares a las barras osteocartilaginosas y óseas, que contienen poros con osteoclastos activos. Tras 9 semanas, se observa una disminución en el número de células junto con un incremento en el número de fibras de colágeno. Se

10 observan numerosas calcificaciones y centros de osificación sencillos en la matriz basal más mineralizada.

La investigación inmunocitoquímica realizada hizo posible localizar células que expresaban las proteínas en Thy-1 y CX-CR4, característico de células madre, dentro del implante. Se encontraron células marcadas adyacente a y dentro de vasos sanguíneos así como en la zona de células no diferenciadas en proliferación intensa en el límite entre el implante y el cartílago de lóbulo de oreja, así como en las zonas de reconstrucción de las barras

15 osteocartilaginosas.

La microscopía electrónica permite realizar las siguientes conclusiones: En una mayoría de las imágenes de microscopía electrónica de las zonas de regeneración, tanto a las 4 como a las 9 semanas, se observan células relativamente numerosas junto con un gran número de fibras de colágeno. Tras 3 semanas de regeneración, su citoplasma contiene RE rugoso extenso con cisternas frecuentemente dilatadas, numerosas mitocondrias con una 20 matriz homogénea y crestas poco delineadas, así como numerosas vacuolas. Los núcleos en estas células contienen grandes cantidades de cromatina poco compactada. También se observan fragmentos de citoplasma pequeños unidos a membrana, que se separan de las células y se vuelven una parte de la matriz extracelular y participan en su mineralización. Durante la semana 9 del experimento, el número de células es más pequeño, pero la cantidad de colágeno crece. En muchas células, tanto la membrana celular como la envoltura nuclear presentan 25 invaginaciones y la cromatina se condensa. Numerosas células sufren apoptosis y presentan núcleos típicos de células apoptósicas, en los que la cromatina se condensa y su citoplasma se fragmenta. Tras 3 semanas, el crecimiento del cartílago disminuyó marcadamente, mientras que, tras 9 semanas, la lesión en la estructura cartilaginosa en el lóbulo de oreja se reparó completamente. La microscopía electrónica mostró ahí numerosas células apoptósicas. La apoptosis es responsable de la morfogénesis de los cuernos en desarrollo y también es un

30 mecanismo que ejerce un efecto regulador sobre la regeneración, lo que limita, entre otros, el crecimiento celular excesivo. Se producen procesos reguladores similares durante el desarrollo esquelético, durante el crecimiento óseo y la reestructuración.

Con el uso de electroforesis, los sueros de animales de experimentación y de control se fraccionaron en proteínas tales como albúminas, globulinas α1, α2, β1, β2 y gammaglobulinas. Se cuantificaron fracciones individuales en 35 unidades absolutas y relativas, y se calculó la proporción de albúminas con respecto a globulinas. Las separación electroforética de las proteínas séricas demuestra el comportamiento de un amplio espectro de fracciones, lo que incluye proteínas de fase aguda e inmunoglobulinas. Las albúminas son la fracción que reacciona negativamente, mientras que las proteínas contenidas en las fracciones de globulina α1, α2, β1, β2 reaccionan positivamente a diferentes grados a tasas variables. El papel del traumatismo postquirúrgico y la ruptura de la integridad tisular como 40 inductores de respuesta de fase aguda se puede ignorar razonablemente, puesto que todos los animales de ambos grupos experimentaron procedimientos idénticos. Cuando se compara los patrones proteicos de los grupos experimental y de control de animales implantados con células productoras de cuernos, sólo se observo un pequeño incremento en la fracción de globulina β2, en el límite de significación estadística. Esto se correlacionó con el bajo nivel de inflamación observado simultáneamente contra células xenogénicas. La angiogénesis limitada y la síntesis

45 de colágeno masiva, acompañado por una falta de infiltración neutrófila que activaría la proteólisis son pruebas de la actividad regenerativa de las células productoras de cuernos. La respuesta inmunitaria de animales postquirúrgicos fue por la misma razón muy débil y no estaba acompañada de rechazo de implante.

La tabla a continuación presenta la separación electroforética de proteínas séricas de conejo de los grupos de experimentación y de control.

Grupo C Grupo E N 6 N 6

Proteína total g/l 60,9±14,7 57,4±11,3

g/l 2,8±1,6 1,7±0,8

Alfa 1

% 4,22±2,05 2,98±1,27

g/l 3,8±1,2 2,6±0,7

Alfa 2

% 5,95±1,36 5,28±1,06

Globulinas

Beta 1 g/l % (continuación) 5,3±1,4 8,57±2,07 4,9±1,7 11,01 ±4,6

Beta 2

g/l % 2,03±0,75 3,37±1,26 2,4±0,62 4,18±1,16

Gamma

g/l % 6,35±1,73 10,38±2,83 7,03±1,89 12,42±2,79

Albúminas/Globulinas

2,04±0,61 1,97±0,42

Las células productoras de cuernos obtenidas de acuerdo con la presente invención no fueron rechazadas por un grupo representativo de animales de una especie diferente (conejos). Por el contrario, tomaron parte en la 5 regeneración del cartílago junto con los tejidos huésped que toleraron su presencia. Esto facilita la especulación de que existen posibilidades realistas de uso de las células madre obtenidas de esta manera también en seres humanos. Los implantes celulares de acuerdo con la presente invención hacen posible evitar una serie de dificultades en la regeneración de tejido conjuntivo en seres humanos que cuando se usan procedimientos estándar, que llevan el riesgo de transferir enfermedades víricas o genéticas o tumores. También se evitan consideraciones

10 éticas conectadas con la obtención de células madre humanas para este fin. Este intento exitoso en la implantación de células productoras de cuerno indica que debido a la expresión limitada de antígenos de histocompatibilidad, existe una gran probabilidad de uso de células madre xenogénicas en medicina regenerativa. Por tanto, en el futuro, las células productoras de cuerno pueden encontrar un uso en la reconstrucción de tejido conjuntivo.

Ejemplo 2.

15 Establecimiento de la línea de células madre MIC-1 y sus características

Se recogieron escisiones circulares de 1,5 cm por 0,2 mm a partir de fragmentos lateral de punta de los cuernos en desarrollo de Cervus elaphus, durante el periodo de crecimiento más intensivo (mayo), bajo condiciones estériles, bajo narcosis por medio de inyección remota. Las escisiones recogidas se degradaron mecánicamente hasta que se obtuvieron fragmentos microscópicos de 100 a 900 micrómetros. Se retuvo la mitad del tejido degradado para 20 análisis de microscopía óptica y electrónica. Se aislaron células en proliferación a partir de la porción del cuerno degradado usando migración celular. Las células aisladas se colocaron en matraces de cultivo. El medio usado fue SmGM-2 SingleQuots de CAMBREX, con L-glutamina a 1 mM/ml, penicilina a 100 U /ml y estreptomicina a 0,1 mg/ml (SIGMA, Alemania). Las células se colocaron en un incubador, donde se hicieron crecer en condiciones estándar en una atmósfera que contenía CO2 al 5 % a +37 ºC. Se mantuvo la línea durante cuatro meses, a una

25 eficiencia de aproximadamente 5 millones de células por semana. La línea celular MIG-1 derivada se congeló y se colocó en criorecipientes en nitrógeno líquido a 176 ºC.

Posteriormente, se realizaron exámenes comparativos y de ID. Se fijaron las muestras para análisis microscópicos en formalina tamponada al 4 %, se deshidrató y se impregnó en bloques de parafina. Los portaobjetos del microscopio se tiñeron con H+E.

30 Se realizaron análisis inmunocitoquímicos usando los siguientes anticuerpos: anti-Ki-67 y anti-PcNA (marcadores de proliferación), anti-CD-31 y anti-CD-34 (marcadores de vasos sanguíneos) y anti-CX-CR4, anti-c-kit, anti-Thy-1 y anti-Bcrp-1 (marcadores de células madre).

Se fió al material para microscopía electrónica en glutaraldehído al 2,5 % en tampón de cacodilato (0,1 M) pH 7,4, y después se deshidrató y se impregnó en resina Epon 812. Se contrastaron las secciones usando un procedimiento

35 rutinario y se observó en un microscopio electrónico JEM-100 B.

Se realizaron reacciones inmunocitoquímicas en preparaciones de microcultivos en un intento de identificar células madre usando marcadores específico: anti-CXCR4, anti c-kit, anti-Thy-1 y anti-Bcrp-1. Se obtuvo una reacción de membrana positiva, específica sólo en el caso de células pequeñas, ovales con división frecuente usando los anticuerpos anti-c-kit y anti-Thy-1. No se observó la expresión de los antígenos Bcrp-1 y CXCR4. La expresión de los

40 antígenos mencionados anteriormente no se observó en células más diferenciadas que poseían protrusiones citoplásmicas. También se obtuvieron resultados inmunocitoquímicos positivos en secciones de parafina, usando anticuerpos específicos contra células madre con anticuerpos contra anti-Bcrp1 y anti-c-kit.

Se usó microscopía electrónica para estudiar la ultraestructura tanto de las células cultivadas como de las de las secciones de cuerno. Principalmente, se examinó la ultraestructura de células pequeñas, ovales, no diferenciadas.

45 En ambos casos, se caracterizan por un núcleo celular grande que posee cromatina laxa y un nucleolo. Un pequeño volumen de citoplasma rodea el núcleo y contiene un RE rugoso extenso, mitocondrias, vacuolas y gránulos de glucógeno. Se observan microvellosidades sobre la membrana celular.

Genotipado de la línea de células madre MIC-1

Se determinó el genotipo de la línea de células madre MIC-1 a partir del ciervo Cervus elaphus en base a 11 microsatélites de dos y cuatro nucleótidos polimórficos. Para su comparación, se usó ADN de ciervo Sika (Cervus nippon hortulorum).

5 Se preparó la mezcla de reacción PCR usando el kit de PCR QIAGEN Multiplex (Qiagen) y pares de cebadores directo e inverso apropiados. Los cebadores directos se marcaron en el extremo 5X con fluorocromos FAM, HEX o TET, y la siguiente síntesis se purificó usando HPLC. Se realizó la PCR en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems), bajo las siguientes condiciones:

•

desnaturalización inicial: 95 ºC, 15 min.

•

desnaturalización: 94 ºC, 30 s.

•

fusión: 57 ºC, 90 s.

32 ciclos

•

elongación: 72 ºC, 60 s.

• Elongación final: 72 ºC, 10 min. 10 Se realizó el genotipado usando electroforesis capilar en un sistema ABIPrism 310 (Applied Biosystems).

GENOTIPO de la línea de células madre MIC-1

N.º

Marcador polimórfico Registro GenBank Genotipo celular MIC-1 Genotipo de ciervo Sika

1

T108 AF191798 147 pb 143/155 pb

2

T156 AF192396 130/158 pb 158/166 pb

3

T193 AF192398 189 pb 221/237 pb

4

T501 AF442815 244/256 pb 252/256 pb

5

T115 AF193021 168/204 pb 180 pb

6

T107 AF193019 243/247 pb 243 pb

7

T172 AF192397 161/165 pb 173/185 pb

8

T507 AF442816 199/203 pb 139 pb

9

Haut14 AF236378 106/132 pb 120/148 pb

10

CSSM19 AF232761 141/145 pb 147/155 pb

11

CSSM66 AF232764 165/179 pb 175/189 pb

pb -pares de base.

Secuencias de cebador

N.º

Nombre de cebador Secuencia

1

T108 directo 5'-CATGTGGAGATAGGTAGACAGA-3' inverso 5' -CCATTCTGAGTAGCTGATTCA-3'

2

T156 directo 5'-TCTTCCTGACCTGTGTCTTG -3' inverso 5'-GATGAATACCCAGTCTTGTCTG -3'

3

T193 directo 5'-AGTCCAAGCCTGCTAAATAA-3' inverso 5'-CTGCTGTTGTCATCATTACC-3'

4

T501 directo 5'-CTCCTCATTATTAC C CTGTG AA-3' inverso 5'-ACATGCTTTGACCAAGACC-3'

5

T115 directo 5'-AATGTCTGACTCTAGGTGAGTG-3' inverso 5'-TTTGCTATCTGAGCCACTAG-3'

6

T107 directo 5'-ACATCC GTTC AG GTGTG A-3' inverso 5'-CCAGAGGTAAGATAAATGGTGA-3'

7

T172 directo 5'-AGCATCTCCCCTTTCAACA-3' inverso 5'-CTTCCCAACCCAAGTATCG-3'

8

T507 directo 5'-AGGCAGATGCTTCACCATC-3' inverso 5'-TGTGGAGCACCTCACACAT-3'

(continuación)

N.º

Nombre de cebador Secuencia

9

Haut14 directo 5'-CCAGGGAAGATGAAGTGACC-3' inverso 5'-TGACCTTCACTCATGTTATTAA-3'

10

CSSM19 directo 5'-TTGTCAG CAACTTCTTGTATCTTT-3' inverso 5'-TGTTTTAAGCCACCCAATTATTTG-3'

11

CSSM66 directo 5'-AATTTAATGCACTGAGGAGCTTGG-3' inverso 5'-ACACAAATCCTTTCTGCCAGCTTGA-3'

Se depositó la línea de células madre el 26 de julio de 2007 en DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig, una institución con la condición de organismo de depósito internacional 5 para la protección de patentes (IDA). Al depósito de patentes se le asignó el número DSM ACC2854.

Ejemplo 3.

Aplicación de la línea celular MIC-1 en implantes xenogénicos

Se recogió un fragmento circular de un cuerno en desarrollo de 1,5 cm por 0,2 mm bajo condiciones estériles a partir de un animal bajo narcosis. El fragmento de tejido recogido se divide en cuatro partes. La parte destinada para el 10 cultivo celular se coloca en un tubo de ensayo, se sumerge en 10 ml de medio de cultivo -MEM de Cambrex con la adición de 100 U.I./ml de penicilina y 0,1mg/ml de estreptomicina. Bajo condiciones de laboratorio, se lava la sección varias veces en el medio que contenía dichos antibióticos. A continuación, se degrada mecánicamente en fragmentos pequeños de varios cientos de micrómetros de diámetro. Se aíslan las células en proliferación a partir de este material usando su migración espontánea. Tras el aislamiento, se suspenden las células en medio de cultivo 15 completo, en un volumen de al menos un 20 % de la cámara de cultivo, con suero de ternero fetal al 10 %, 100 U.l./ml de penicilina, 0,1mg/ml de estreptomicina, 1 mM/ml de L-glutamina. Después, se transfieren en frascos de cultivo de 25 cm2. El cultivo se mantiene en un incubador Kendro bajo condiciones estándar, es decir +37º C, en CO2 al 5 %. Después de que se obtiene una monocapa completa, las células se separan de los matraces de cultivo usando tripsina al 0,05 % con EDTA al 0,02 % EDTA y se transfieren en matraces de cultivo sucesivos. Una línea 20 continua se deriva de esta línea principal, y después del quinto paso, las células se congelan con la adición de dimetilsulfóxido (DMSO) al 10 % y se almacenan en nitrógeno líquido a -176º C. Para preparar las células para su implantación, el quinto paso se descongela y las células se cultivan adicionalmente en un medio completo idéntico. Después de que se produzca un número apropiado de células (5 x 106) se separan del sustrato usando tripsina y EDTA, y después se centrifuga en el medio. El suero dentro del medio inactiva la tripsina y el precipitado producido 25 se suspende en MEM recién preparado sin suero, L-glutamina ni antibióticos. Se cuentan las células en una cámara Bürker y se muestrea una suspensión de 2 x 106 células por implante para su asentamiento sobre la red. Se usan fragmentos de esponja de fibrina para este fin, lo que también se usa en cirugía para hemostasis, aquí como vehículo para células adherentes. La esponja se coloca en un vial de plástico estéril y se añade la suspensión que contenía 2 x 106 células / 1ml de MEM limpio. Después, esto se centrifuga, y las células se asientan sobre la

30 esponja. Se realiza la centrifugación sobre una centrífuga Hereus durante 10 minuto a aproximadamente 700 rpm. Se decanta el sobrenadante, dejando listo para implantar las células sobre la esponja de fibrina. Para la implantación, se usan células de un cultivo llevado a cabo como antes, sobre una red para su implantación, que era una esponja de fibrina.

El experimento hizo uso de 12 conejos, 6 en el grupo de experimentación (E) y 6 como el grupo de control (C). Éstos

35 eran conejos California blancos de 8 meses que pesaban 3,5-4,0 kg. En el medio del lóbulo de la oreja, sobre su lado exterior, se llevó a cabo una preparación quirúrgica estándar. Se afeitó la superficie cutánea, se lavó y se desinfectó. Aproximadamente a 1 cm del borde del lóbulo, se extirpó un colgajo de piel y pericondrio de 1 x 1 cm. Después, se extirpó y se retiró un fragmento del cartílago descubierto de 0,8 x 0,8 cm. Se detuvieron vasos sangrantes pequeños usando electrocoagulación. En los 6 conejos E, la lesión del cartílago se llenó con una pieza

40 de esponja de fibrina cortada a medida saturada con la suspensión celular, siempre sobre el lado derecho. Se llevó a cabo un procedimiento idéntico para los 6 conejos C, a los que se les implantó una esponja de fibrina saturada con solución salina fisiológica. Después, se cubrieron los implantes con los colgajos de piel-pericondrio. Se cerraron las heridas con sutura en capa única. Después se lavaron con peróxido de hidrógeno y se dejaron sin cubrir, sin vendaje. Se realizó la cirugía bajo una pantalla antibiótica con 50 000 U.I. / kg de penicilina administrada por vía

45 intramuscular. Con el uso de observación clínica, se recogió material experimental ex vivo a partir de las zonas de implante en ambos grupos de animales, 4 y 9 semanas tras la cirugía. Se recogió el material en forma de escisiones a través de todo el grosor completo del lóbulo de oreja, que contenía el cartílago tanto del implante como el propio animal. Se fijó el material obtenido para el examen inmunocitoquímico y microscopía electrónica.

Para inmunocitoquímica, se fijó el material en formalina tamponada al 4 %, se deshidrató y se impregnó en parafina.

50 Se tiñeron secciones para microscopía óptica con H+E y toluidina, T. Se usaron secciones de parafina para la inmunocitoquímica usando los anticuerpos anti-CX-CR4, anti-c-kit y anti-Thy-1, que reconocen proteínas específicas para células madre.

Se fijó el material para la microscopía electrónica en glutaraldehído al 2,5 % e tampón de cacodilato (0,1 M, pH 7,4), y después se deshidrató y se impregnó en resina Epon 812. Se realizó la electroforesis de proteínas séricas 4 semanas tras la cirugía, en muestras de 2 ml de sangre recogida de la vena lateral de la oreja. Se incubó la sangre 5 de forma estándar a 37º C durante 0,5 horas, y después se centrifugó durante 5 minutos para separar el suero. Se realizó la separación sobre gel agarosa tamponado, usando electroforesis horizontal de alto voltaje. Se realizó la cuantificación usando un conjunto densitómetro a 600 nm, obteniendo fracciones de proteínas individuales. También se determinó la proporción de albúmina con respecto a globulina. Los resultados obtenidos a partir de la electroforesis se sometieron a análisis estadístico usando la prueba t de Student, a un nivel α de 0,05. Se realizó la

10 prueba usando el programa Statistica 7.0 (Stat Soft).

La separación electroforética de los sueros de animales tanto de control como de experimentación proporcionó fracciones de proteínas tales como albuminas, globulinas α1, α2, β1, β2 y gammaglobulinas. Se cuantificaron las fracciones individuales en valores absolutos y relativos, y se calculó la proporción de albuminas con respecto a globulinas. La electroforesis muestra el comportamiento de un amplio espectro de fracciones, que incluyen proteínas 15 de fase aguda e inmunoglobulinas. En este caso, las albúminas son la fracción que responde negativamente, mientras que las proteínas en las fracciones de globulina α1, α2, β1, β2 reaccionan positivamente a diferentes grados y a tasas variables. El papel del traumatismo postquirúrgico y la ruptura de la integridad tisular como inductores de respuesta de fase aguda se puede ignorar razonablemente, puesto que todos los animales de ambos grupos experimentaron procedimientos idénticos. Cuando se compara los patrones proteicos de los grupos experimental y 20 de control de animales implantados con células productoras de cuernos, sólo se observo un pequeño incremento en la fracción de globulina β2, en el límite de significación estadística. Esto se correlacionó con el bajo nivel de inflamación observado simultáneamente contra células xenogénicas. La angiogénesis limitada y la síntesis de colágeno masiva, acompañado por una falta de infiltración neutrófila que activaría la proteólisis son pruebas de la actividad regenerativa de las células productoras de cuernos. La respuesta inmunitaria de animales postquirúrgicos

25 fue por la misma razón muy débil y no estaba acompañada de rechazo de implante.

La tabla a continuación presenta la separación electroforética de proteínas de suero sanguíneo de conejo a partir de los grupos tanto de experimentación como de control.

Grupo E Grupo C N 6 N 6

Proteína total g/l 57,4±11,3 60,9±14,7

g/l 37,6±7,2 41,7±3,6

Albúminas % 65,8±4,68 67,2±4,83

g/l 1,7±0,8 2,8±1,6

Alfa 1

% 2,98±1,27 4,22±2,05

g/l 2,6±0,7 3,8±1,2

Alfa 2

% 5,28±1,06 5,95±1,36

g/l 4,9±1,7 5,3±1,4

Globulinas Beta 1

% 11,01±4,6 8,57±2,07

g/l 2,4±0,62 2,03±0,75

Beta 2

% 4,18±1,16 3,37±1,26

g/l 7,03±1,89 6,35±1,73

Gamma

% 12,42±2,79 10,38±2,83

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una línea de células madre designada como MIC -1 derivada de los cuernos en desarrollo de ciervo (Cervidae) depositada en el banco DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2854.

2. 2.

   Una línea de células madre de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en la reconstrucción de lesiones del tejido conjuntivo.

3. 3.

   Una línea de células madre de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en implantación.