CN102552984A - 骨组织工程支架材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨组织工程支架材料及其制备方法，该方法包括以下步骤：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液、二甲基砜溶液和羟基磷灰石悬浊液混合，得到混合悬浊液；将所述混合悬浊液进行冷冻干燥，得到骨组织工程支架材料。与现有技术相比，本发明由于引入了具有生物活性的二甲基砜(MSM)，一方面提高了支架的生物相容性和生物活性，另一方面，本发明采用冷冻干燥技术，有效防止了二甲基砜的丢失，延长二甲基砜的释放时间，从而延长了药效作用时间。同时，二甲基砜具有廉价和容易获得的特点，并且在丙酮等溶剂中稳定性和溶解性较好，更适合临床应用和推广。实验结果表明，本发明制备的骨组织工程支架材料具有良好的生物相容性和生物活性。

Description

骨组织工程支架材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，更具体地说，涉及一种骨组织工程支架材料及其制备方法。

背景技术

由外伤、肿瘤或先天缺陷等原因引起的骨缺失是临床医生的常见难题，我国每年骨缺失或骨损伤患者约300万人，骨骼不建全人群则达1000万人。尽管人体自身对骨组织的缺失有一定的再生和修复功能，但是人体自身的再生和修复局限于小面积的骨缺失，而较大的骨缺失则需要采用自体或同种异体松质骨、异种骨、金属材料以及人工合成材料等其它骨移植技术来治疗。目前临床常用的治疗方法存在各种各样的缺陷，例如，自体骨往往来源稀少，手术耗时长，需要异位取骨造成患者的二次损伤，且供体部位易造成感染、疼痛和血肿；异体骨或异种骨存在免疫排斥反应、传播疾病或引发感染的风险；金属合金以及人工合成有机材料虽然临床上广泛应用，但在生物学和力学性能上存在各种各样的缺陷，如易被腐蚀、力学传导性能差、易断裂等。因此，骨组织工程技术的建立和发展为骨缺损移植提供了一条可选的有前景的解决方案。

骨组织工程的研究主要集中在两个方面，一是骨组织诱导，即采用可降解的具有骨传导和骨诱导能力的多孔支架充填缺损部位，引导成骨细胞及该区域其他细胞长入并吸附于骨组织工程支架上。由于成骨细胞可分泌大量的纤维和基质，从而随着基质堆积，骨组织逐渐形成并重新塑形。具有骨组织诱导作用的物质主要为生物陶瓷类材料，如羟基磷灰石等。二是细胞传输，将自体成骨细胞或成骨母细胞种植于骨传导支架内并移植于骨缺损处，对骨缺损的愈合具有重要的作用。成骨细胞的移植有助于骨组织长入和细胞外基质(ECM)的形成，移植细胞释放的生长因子还可促进骨诱导和骨再生。具有细胞传输功能的生物支架材料除了胶原等天然材料外，最受关注的为可降解合成高分子如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等。该类材料具有良好的生物相容性和可降解吸收性，在体内以水解和酶解的方式进行，降解产物易于代谢和排除体外，而且易于加工、塑形和消毒。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是LA(丙交酯)与GA(乙交酯)的共聚物，已被FDA许可并广泛应用于人类的生物可降解高分子材料。但是，PLGA的骨引导和诱导性相对较差，必须有足够的种子细胞或生长因子才能起到很好的骨修复作用，对其临床应用有一定的限制。人工合成的羟基磷灰石(HA)具有良好的生物活性和骨传导性，与骨组织的键合能力强，作为良好的骨组织缺损填充材料已经得到普遍关注。但是在骨修复中，单纯应用HA存在脆性大、易碎和降解能力差等缺陷，限制了其临床应用。而HA/PLGA复合材料可以兼具两者的优点，并能克服两者的机械性差、降解速度快、骨结合力弱等缺点。尽管HA的复合在一定程度上可以提高PLGA的生物活性和骨引导、诱导能力，但是，HA/PLGA复合材料仍然不能满足修复大面积骨缺损的需要，其生物相容性和生物活性有待进一步提高。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种骨组织工程支架材料及其制备方法，该方法制备的骨组织工程支架材料具有良好的生物相容性和生物活性。

本发明提供一种骨组织工程支架材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤a)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液、二甲基砜溶液和羟基磷灰石悬浊液混合，得到混合悬浊液；

步骤b)将所述混合悬浊液进行冷冻干燥，得到骨组织工程支架材料。

优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液按照如下方法制备：

向1，4-二氧六环中加入聚乳酸-羟基乙酸共聚物，搅拌后得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液。

优选的，所述二甲基砜溶液按照如下方法制备：

向丙酮中加入二甲基砜，搅拌后得到二甲基砜溶液。

优选的，所述羟基磷灰石悬浊液按照如下方法制备：

向1，4-二氧六环中加入羟基磷灰石，超声分散后得到羟基磷灰石悬浊液。

优选的，所述羟基磷灰石与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶(7～12)。

优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚、二甲基砜和羟基磷灰石的总和与二甲基砜的质量比为100∶(0.01～5)。

优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚、二甲基砜和羟基磷灰石的总和与二甲基砜的质量比为100∶(0.01～1)。

优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的浓度为7～15wt％；所述二甲基砜溶液的浓度为7～15wt％；所述羟基磷灰石悬浊液的浓度为7～15wt％。

优选的，所述将混合悬浊液进行冷冻干燥步骤具体为：

步骤b1)将所述混合悬浊液放入组织工程支架模具中，在2～4℃下冷冻保存20～30小时；

步骤b2)去除步骤b1)得到的冷冻保存产物中的溶剂，得到骨组织工程支架材料。

相应的，本发明还提供一种骨组织工程支架材料，由以下成分组成：

聚乳酸-羟基乙酸共聚物、二甲基砜和羟基磷灰石。

从上述的技术方案可以看出，本发明提供了一种骨组织工程支架材料及其制备方法，该方法包括以下步骤：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液、二甲基砜溶液和羟基磷灰石悬浊液混合，得到混合悬浊液；将所述混合悬浊液进行冷冻干燥，得到骨组织工程支架材料。与现有技术相比，本发明由于引入了具有生物活性的二甲基砜(MSM)，将小二甲基砜(MSM)与羟基磷灰石(HA)和生物降解聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)复合，所制备的骨组织工程支架材料能够促进骨引导和诱导过程中的骨基质形成，提高了支架材料的生物活性、生物相容性和骨再生能力，从而达到骨修复的目的；另一方面，本发明采用冷冻干燥技术，有效防止了二甲基砜的丢失，延长二甲基砜的释放时间，从而延长了药效作用时间。同时，二甲基砜具有廉价和容易获得的特点，并且在丙酮等溶剂中稳定性和溶解性较好，更适合临床应用和推广。实验结果表明，本发明制备的骨组织工程支架材料具有良好的生物相容性和生物活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1～5采用的冷冻干燥示意图；

图2为本发明实施例1～5制备的组织工程支架材料的孔径方向示意图；

图3为本发明实施例1制备的组织工程支架材料的扫描电镜图片；

图4为本发明实施例2制备的组织工程支架材料的扫描电镜图片；

图5为本发明实施例3制备的组织工程支架材料的扫描电镜图片；

图6为本发明实施例4制备的组织工程支架材料的扫描电镜图片；

图7为本发明实施例5制备的组织工程支架材料的扫描电镜图片；

图8为成骨细胞在实施例1～5制备的二甲基砜/羟基磷灰石/PLGA组织工程支架材料中的三天的增值率；

图9为实施例1～5制备的组织工程支架材料在修复兔子桡骨缺损4周的I型胶原的柱状图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明公开了一种骨组织工程支架材料的制备方法，包括以下步骤：步骤a)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液、二甲基砜溶液和羟基磷灰石悬浊液混合，得到混合悬浊液；步骤b)将所述混合悬浊液进行冷冻干燥，得到骨组织工程支架材料。

本发明采用的羟基磷灰石(HA)具有良好的生物活性和骨传导性，与骨组织的键合能力强，但是，在骨修复中单纯应用HA存在脆性大、易碎和降解能力差等缺陷。而聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是LA(丙交酯)与GA(乙交酯)的共聚物，具有较强的力学性能和可降解性，而且其降解速率可以根据LA和GA的比例进行调节，是骨和软骨组织工程中广泛应用的支架材料。但PLGA的骨引导和诱导性相对较差，必须有足够的种子细胞或生长因子才能起到很好的骨修复作用。二甲基砜(MSM)是一种有机硫化物，是人体胶原蛋白合成的必要物质，而胶原蛋白是软骨细胞和骨细胞必须物质，同时也是维护人体生物硫元素平衡的主要药物。MSM对糖类的代谢起促进作用，益能促进伤口愈合。

因此，本发明通过将小分子含硫化合物二甲基砜(MSM)与羟基磷灰石(HA)和生物降解聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)复合，所制备的骨组织工程支架材料能够促进骨引导和诱导过程中的骨基质形成，提高了支架材料的生物活性和骨再生能力，从而达到骨修复的目的。同时，应用冷冻干燥技术制备组织工程支架材料，确保了在支架材料制备过程中MSM的生物活性，减少MSM在制备过程中的损失。

本发明采用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液优选按照如下方法制备：向1，4-二氧六环中加入聚乳酸-羟基乙酸共聚物，搅拌后得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，即形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的1，4-二氧六环溶液。所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的浓度与制备的骨组织工程支架材料的孔径等密切联系，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的浓度优选为7～15wt％，更优选为8～12wt％，最优选为10wt％。同时，所述二甲基砜溶液优选按照如下方法制备：向丙酮中加入二甲基砜，搅拌后得到二甲基砜溶液，即形成二甲基砜的丙酮溶液。所述二甲基砜溶液的浓度与制备的骨组织工程支架材料的孔径等密切联系，所述二甲基砜溶液的浓度优选为7～15wt％，更优选为8～12wt％，最优选为10wt％。同时，所述羟基磷灰石悬浊液优选按照如下方法制备：向1，4-二氧六环中加入羟基磷灰石，超声分散后得到羟基磷灰石悬浊液，所述超声分散的时间优选为20～60分钟，优选为30～50分钟，更优选为30分钟。同理，所述羟基磷灰石悬浊液的浓度与制备的骨组织工程支架材料的孔径关系密切，为了得到适当孔径的骨组织工程支架材料，所述羟基磷灰石悬浊液的浓度优选为7～15wt％，更优选为8～12wt％，最优选为10wt％。

为了保证制备的骨组织工程支架材料的综合性能，本发明采用的羟基磷灰石与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比优选为1∶(7～12)，更优选为1∶(8～10)，更优选为1∶9。所述聚乳酸-羟基乙酸共聚、二甲基砜和羟基磷灰石的总和与二甲基砜的质量比优选为100∶(0.01～5)，更优选为100∶(0.01～1)，更优选为100∶(0.1～1)。上述质量比均为溶液中的溶质之间的重量比关系，本发明通过调节溶质满足上述的质量比关系，保证了制备的骨组织工程支架材料能够促进骨引导和诱导过程中的骨基质形成，提高支架的生物活性和骨再生能力，具有良好的生物相容性，达到骨修复的目的。

按照本发明，所述将混合悬浊液进行冷冻干燥步骤具体为：步骤b1)将所述混合悬浊液放入组织工程支架模具中，在2～4℃下冷冻保存20～30小时；步骤b2)去除步骤b1)得到的冷冻保存产物中的溶剂，得到骨组织工程支架材料。所述组织工程支架模具优选采用离心管，所述离心管的厚度优选为1mm，长度优选为80mm，直径优选为15mm；所述冷冻保存的温度优选为3～4℃，更优选为4℃；所述冷冻保存的时间优选为20～28小时，更优选为22～26小时。在步骤b2)中，优选采用真空泵抽取的方法去除步骤b1)得到的冷冻保存产物中的溶剂，所述溶剂为聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液、二甲基砜溶液和羟基磷灰石悬浊液中的溶剂，即1，4-二氧六环和丙酮。通过上述冷冻干燥方法处理后，得到了多孔的骨组织工程支架材料。

本发明制备的骨组织工程支架材料为MSM/HA/PLGA复合材料，由于引入了MSM，增强了多孔支架的生物活性；同时采用冷冻干燥技术，制备支架材料过程中有效的防止MSM的丢失，并且延长MSM的释放时间，从而更好的应用于临床。一方面，MSM在60℃容易升华，若采用现有技术中高温的方法制备支架，易导致MSM大量升华，支架的MSM含量会明显下降。另一方面，MSM具有较好的水溶性，如果采用现有技术中的水浸方法制备多孔支架，也会导致MSM的大量丢失。因此本发明选用冷冻干燥技术，引入MSM制备了具有生物活性的多孔符合材料支架即MSM/HA/PLGA复合材料，并且，冷冻干燥流程操作简便，设备简单，容易掌握，可以高效地制备支架材料。

本发明制备的骨组织工程支架材料由聚乳酸-羟基乙酸共聚物、二甲基砜和羟基磷灰石组成，由于将MSM生物活性小分子化合物引入到HA/PLGA多孔支架中，制备的支架具有优良的生物相容性和生物活性。同时，聚乳酸-羟基乙酸共聚物、二甲基砜和羟基磷灰石均为分析纯，来源丰富，价格低廉。

为了进一步说明本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例采用的化学试剂均为市购。

实施例1～5

1)向1000mL二氧六环溶液中加入100g PLGA，向100ml丙酮溶液中加入10g二甲基砜，在室温下25℃下搅拌过夜，至完全溶解；

2)向500ml二氧六环溶液中加入羟基磷灰石，超声仪超声处理30分钟，均匀的分散到溶液中，得到羟基磷灰石悬浊液；

3)将以上溶液和悬浊液混合，配制成浓度为10wt％混合液，其中MSM占MSM/HA/PLGA的比例分别为0、0.01％、0.1％、1％、10％，HA∶PLGA＝1∶9；

4)将混合的溶液和悬浊液移到10ml离心管中，试管的厚度约为1mm，长度80mm，直径15mm，管子的四周没有进行任何保护，然后将混合液快速放到4℃冰柜中，保存24小时；

5)将冷冻好的样品放到4℃的冰箱内，利用真空泵抽取1，4-二氧六环和丙酮14天，以形成多孔支架，支架保存在真空干燥箱内备用。

本实施例采用的冷冻干燥过程如图1所示，包括冰柜101、干燥器102、样品103、冷阱104、液氮105、暖壶106和真空泵107。装有样品103的干燥器102保存到4°冰柜中，通过胶管连接到冷阱104中，冷阱104放置到盛有液氮105的暖壶106中，然后连接到真空泵107中。当二氧六环和丙酮抽吸到冷阱104中时，由于周围的液氮环境，有机溶剂形成冰晶，防止其进入真空泵107中，避免造成对真空泵的损害及挥发到周围环境危害实验人员的健康以及对环境的污染。

图2为冷冻干燥法制备支架的孔径方向示意图；图3～图7分别为实施例1～5制备的骨组织工程支架材料的扫描电镜照片，其中，图3无MSM；图4为0.01％MSM；图5为0.1％MSM；图6为1％MSM；图7为10％MSM。从扫描电镜照片可以看出，冷冻干燥方法制备的支架孔径具有典型的方向性。并且，孔是呈管状并且相互连结，管状孔的排列方向与晶体形成的方向一致，显示具有良好的贯通性。孔排列是按照由圆柱的中轴到圆柱的边缘排列，孔径分布范围在70～425um，平均孔径157.2±62.6μm。通过对比图3～图7得到，小含量的MSM没有对支架的空隙造成明显的影响，但是当含量达到支架的10％时，可以看到支架空隙的断裂，预示支架的机械性能会有明显的下降。

实施例6～10

分别将涂有HA/PLGA、0.01％MSM/HA/PLGA、0.1％MSM/HA/PLGA、1％MSM/HA/PLGA和10％MSM/HA/PLGA的圆形盖玻片放入24孔培养板中，空白对照组为纯培养基。

UV照射灭菌60min，在材料上接种小鼠成骨细胞，密度为每孔2×10⁴个细胞，37℃，5％CO₂培养箱培养。在3d、7d和14d取出24孔培养板，每孔加入100μlMTT溶液，放入培养箱继续培养4h。吸弃培养液，每孔加750μl盐酸异丙醇溶液(0.4mol/L)，于培养箱内孵育15min，吹打混匀后每孔取200μl移入96孔培养板中，用全自动酶标仪在540nm处检测各孔光吸收值(OD值)。图8为成骨细胞在实施例1～5制备的二甲基砜/羟基磷灰石/PLGA组织工程支架材料中的三天的增值率，横坐标为支架材料，增坐标为OD值。从图中可以看出，在培养3d时，有支架材料的实验组的增殖情况均优于空白组。支架材料租0.01％MSM/HA/PLGA、0.1％MSM/HA/PLGA和1％MSM/HA/PLGA优于HA/PLGA和10％MSM/HA/PLGA组；而10％MSM/HA/PLGA则低于HA/PLGA。

结果表明，一定含量的MSM能有效的促进成骨细胞的增值如0.01％MSM/HA/PLGA、0.1％MSM/HA/PLGA、1％MSM/HA/PLGA等材料组，但是当含量达到支架材料的10％时，MSM则抑制了成骨细胞的增值。

实施例11～16

建立兔挠骨中段20mm长的骨缺损模型，建立模型的方式与发明专利CN101085374A中记载的一致，随机分为4组：空白对照组、单纯羟基磷灰石/PLGA材料组、0.01％MSM/HA/PLGA、0.1％MSM/HA/PLGA、1％MSM/HA/PLGA和10％MSM/HA/PLGA，将支架材料植入到桡骨缺损处。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测支架材料对成骨基因表达的影响。

图9为实施例1～5制备的二甲基砜/羟基磷灰石/PLGA组织工程支架材料在修复兔子桡骨缺损4周的I型胶原的柱状图，横坐标为支架材料，增坐标为OD值。从图中可以看出，支架材料组据优于空白组，MSM在支架中的含量为0.01％、0.1％、1％时优于纯HA/PLGA和10％MSM/HA/PLGA组。纯HA/PLGA材料组优于10％MSM/HA/PLGA。

从以上实施例可以看出，1、含有一定量的MSM的支架材料具有比纯HA/MSM支架材料具有更好的生物活性；2、MSM的含量不同对成骨细胞具有不同的影响，适量MSM得到的骨组织工程支架材料具有良好的生物相容性和生物活性。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液、二甲基砜溶液和羟基磷灰石悬浊液混合，得到混合悬浊液；

步骤b)将所述混合悬浊液进行冷冻干燥，得到骨组织工程支架材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液按照如下方法制备：

向1，4-二氧六环中加入聚乳酸-羟基乙酸共聚物，搅拌后得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二甲基砜溶液按照如下方法制备：

向丙酮中加入二甲基砜，搅拌后得到二甲基砜溶液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述羟基磷灰石悬浊液按照如下方法制备：

向1，4-二氧六环中加入羟基磷灰石，超声分散后得到羟基磷灰石悬浊液。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述羟基磷灰石与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶(7～12)。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚、二甲基砜和羟基磷灰石的总和与二甲基砜的质量比为100∶(0.01～5)。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚、二甲基砜和羟基磷灰石的总和与二甲基砜的质量比为100∶(0.01～1)。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的浓度为7～15wt％；所述二甲基砜溶液的浓度为7～15wt％；所述羟基磷灰石悬浊液的浓度为7～15wt％。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将混合悬浊液进行冷冻干燥步骤具体为：

步骤b1)将所述混合悬浊液放入组织工程支架模具中，在2～4℃下冷冻保存20～30小时；

步骤b2)去除步骤b1)得到的冷冻保存产物中的溶剂，得到骨组织工程支架材料。

10.一种骨组织工程支架材料，其特征在于，由以下成分组成：

聚乳酸-羟基乙酸共聚物、二甲基砜和羟基磷灰石。

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