CN101798574A - 水稻茎秆机械强度控制基因bc10及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可控制水稻茎秆机械强度的基因，该基因的核苷酸序列选自：(1)编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)与(1)中的核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制水稻茎秆机械强度功能的功能类似物。本发明还提供了该基因编码的蛋白质，含有该基因的表达载体，和利用该表达载体改变植物茎秆机械强度的方法。

Description

水稻茎秆机械强度控制基因BC10及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，更具体地，本发明涉及水稻茎秆机械强度控制基因BC10，该基因编码的蛋白质及其功能类似物，编码其的核苷酸序列，含有该核苷酸的载体和含有该载体的宿主细胞；另外，本发明还涉及控制植物茎秆机械强度的方法和改良植物细胞壁成分、含量和结构育种的方法。

背景技术

植株茎秆的机械强度是植物、尤其是农作物重要的农艺性状。而茎秆的机械强度又与茎秆组织中相关细胞的细胞壁厚度直接有关，是组成植物细胞壁各种多聚物物理特性的综合体现。植物细胞壁是一种复杂的纤维网络结构，由不同的结构多糖、芳香族物质和蛋白质高度有序地组成^[1]，其结构对保持细胞形态，维持植株直立生长的机械支撑力具有重要作用。植物细胞壁的生物合成是一个非常复杂的代谢过程，涉及纤维素、木质素和一些非纤维素成分的合成途径。因此，细胞壁中纤维素、木质素等主要成分的合成与分布以及沉积是影响植株茎秆支撑力的主要影响因素。对不同细胞壁突变体的研究是揭示与茎秆机械强度有关的细胞壁生物合成生理生化以及分子生物学机理的有效途径。

植物茎秆机械强度首先与纤维素的合成与沉积密切相关。1996年Pear等人对EST随机测序，首先从棉花中克隆了植物纤维素合酶催化亚基CesA^[2]。而纤维素合酶在植物体中行使功能最直接的证据则来自于对拟南芥突变体rsw的研究^[3]，该突变体侧根发育异常，且纤维素含量大幅降低，从中以图位克隆的方法分离到拟南芥中第一个纤维素合酶催化亚基基因AtCesA1。生物信息学分析表明，CesA基因是一个庞大的基因家族，它的各成员之间具有极高的保守性^[4]。近年来的研究发现，任何一个目前已克隆的CesA基因发生突变后，都会引起比较严重的表型，这暗示着植物基因组中存在着诸多CesA基因在功能上并不冗余，它们可能分别在不同的发育时期和部位起作用，也可能共同参与了同一个复合体的形成，协同作用完成纤维素的合成、晶体化和沉积^[5]，但分子机理还很不清楚。关于纤维素的沉积，尽管目前已发现一些蛋白在纤维素的沉积中起着至关重要的作用，例如拟南芥脆性纤维基因FRA1(Fragile feber 1)编码的一个kenesin-like蛋白^[6]；FRA2编码的Katanin-like蛋白^[7]以及COBRA蛋白^[8]。但作为细胞壁最主要的组份，纤维素是高度有序并与细胞壁的其他组份有机连接在一起的，目前人们所了解的只是“冰山的一角”。此外，还有大量的糖基转移酶(GT)参与了非纤维素多糖和蛋白多糖的合成与修饰。以拟南芥为例，预测具有415个GT^[9]，但只有极少数被证明具有生化活性和功能^[10-12]。

植物茎秆机械强度也与细胞次生壁的木质化有关。在拟南芥的研究中，发现一些木质化异常的突变体。如Jones在2001年^[13]对一不正常木质部突变体irx4研究证实，木质素代谢途径中的一个关键酶即肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase，CCR)。由於CCR基因的突变，导致木质素合成途径提前终止，细胞壁中木质素含量较正常植株减少了50％，从而导致茎秆支撑力度的下降。

因此，植物茎秆机械强度是一个多基因控制的复杂形状，其机制仍十分不详，了解水稻控制茎秆机械强度的分子机制，对水稻的产量和秸秆的合理利用将产生深远影响。

随着基因组测序工作的开展，人们获得了大量的核苷酸信息。因此在真核生物中有一大类功能未知的结构域被人为归类排序，等待人们的研究结果加以注释。BC10含有一个功能未知结构域DUF266，BC10功能的揭示为具该结构域的其他基因的注解提供了线索。

发明内容

针对上述研究背景，本发明的一个目的是提供一种控制水稻茎秆机械强度的基因，所述基因的核苷酸序列选自：

(1)编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或

(2)与(1)中的核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制水稻茎秆机械强度功能的核苷酸序列。

严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30分钟；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交16小时；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，0.1％SDS)，65℃洗膜2次，每次10-15分钟；加入洗膜液II(10mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，0.1％SDS)，65℃洗膜10-15分钟。

本发明的控制水稻茎秆机械强度的基因优选具有如图4和SEQ IDNO：1所示的DNA序列。

本发明的另一个目的是提供一种由本发明的控制水稻茎秆机械强度的基因所编码的蛋白质，所述蛋白质优选地具有如图5和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明中的SEQ ID NO：2和图5所示的蛋白质含有DUF266结构域。含DUF266结构域的蛋白为植物特有的蛋白，也是第一个功能被揭示的这类蛋白。

本发明的再一个目的是提供一种含有本发明的控制水稻茎秆机械强度的基因的植物表达载体。在一个实施方案中，所述表达载体是如图3所示的pBC10F，该载体可以表达由上述核酸序列编码的多肽。

本发明的又一个目的是提供一种培育植物的方法，该方法可使植物茎秆机械组织细胞壁的结构和成分发生改变，从而引起茎秆机械强度发生变化，所述方法包括下列步骤：用本发明的表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。

关于序列表的说明

SEQ ID NO：1是BC10基因的CDS(氨基酸编码区DNA序列)；

SEQ ID NO：2是BC10基因编码的氨基酸序列。

附图说明

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。

图1.水稻脆秆突变体bc10的表型

图2.BC10基因的图位克隆

图3.pBC10F载体图谱

图4.BC10基因的CDS(氨基酸编码区DNA序列)序列

图5.BC10基因编码的氨基酸序列

图6.BC10表达载体图谱

图7.BC10融合蛋白的体外表达

图8.BC10融合蛋白的酶活分析

具体实施方式

实施例1：

1.水稻材料

水稻(Oryza sativa ssp.)突变体brittle culm10(bc10)，是原始野生型材料粳稻品种“黄金晴”的自发突变体材料(购自中国水稻所)。

2.分析和定位群体

纯合的bc10突变体和水稻品种ZF802(购自中国水稻所)进行杂交，F₁代自交，共得到870株F₂个体，并以此作为定位群体。在苗期每株取2克左右的嫩叶，用来提取DNA。

3.通过简单重复序列(SSR，Simple Sequence Repeat)，序列标记位点(STS，Sequence-tagged Sites)，和酶切扩增多态性序列(CAPS，Cleavedamplified polymorphic sequence)标记定位BC10基因。

采用改进的CTAB方法^[14]从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约100mg水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于100μl超纯水中。每一个SSR、STS或CAPS反应用1μl DNA样品。

4.BC10基因的初步定位

在该阶段，对由150个F₂个体组成的小群体进行SSR和STS分析。我们发现BC10基因与两个标记连锁并位于二者之间。在此基础上，我们设计的PCR引物分别以两个亲本(即bc10突变体和水稻品种ZF802)的基因组DNA为模板进行PCR扩增(94℃预变性5min，94℃ 1min，55℃1min，72℃ 1min，35cycles，72℃延伸10mins)，将BC10基因初步定位在SSR标记RM7349和E3528之间(序列见表1)。

表1克隆BC10基因所用引物序列

为了将BC10定位在一个PAC克隆上，我们用已公布的水稻品种Nipponbare的PAC文库(http://rgp.dna.affrc.go.jp)序列构建了BC10位点附近的重叠群，设计的PCR引物分别以两个亲本(籼稻品种明恢63和du1突变体)的基因组DNA为模板进行PCR扩增(94℃预变性5分钟，94℃1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，35次循环，72℃延伸10分钟)。以此发展了STS和SSR标记(序列见表1)，并用于群体精细定位，最终将其定位在一个PAC克隆AC084817和AC087553上。

5.BC10基因的精细定位

根据公布的PAC克隆AC084817和AC087553的序列(http://rgp.dna.affrc.go.jp)，设计2个新标记M4和M5(序列见表1)，最后通过连锁分析将BC10定位在51kb的范围之内。

6.BC10基因的克隆和全长cDNA的获得

首先对51kb的全长基因组序列用GENSCAN软件(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)预测可能的编码区(ORF)，发现这个区间共有10个ORF。逐个测序比较突变体和野生型之间的区别，发现其中一个ORF具有17个碱基的缺失；缺失发生在该基因的第二个内含子和第三个外显子交界处，从而造成第二个内含子不能被剪切掉，用DNAStar软件(Lasergene)SeqEdit分析，该突变会引起基因的移码和翻译的提前终止。而该范围内的其他基因测序后并没有发现任何变化，这样我们初步确定该基因就是BC10基因。将候选区域的基因组序列和KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA)中的cDNA数据进行Blastn分析，结果在水稻全长cDNA文库中发现该基因的全长cDNA，该基因全长表达序列具有1200bp(图4)，共399个氨基酸(图5)。将氨基酸序列送到GenBank数据库中进行BlastP分析，发现除了在N端第20到42位氨基酸为一次跨膜区外，C端还含有唯一的一个结构域，但其功能却从未有人证实过，被称为DUF266结构域。BlastX搜索同源序列，发现凡具有该结构域的基因均来自于植物，说明它为植物所特有的功能域，可能与细胞壁的生物合成有关。

实施例2水稻茎秆机械强度控制基因BC10的功能互补及转基因研究

含该基因的BAC克隆(购自上海生命所)用Sal I酶切释放出BC10的全部基因组片段，共8696bp，包含起始密码子ATG上游的1980个碱基和终止密码子TAA后的2337个碱基的全长序列，将该基因组片段插入到双元载体pCAMBIA1300(购自CAMIA公司，澳大利亚)中的Sal I位点间，从而获得了用于转化的质粒pBC10F(图3)。质粒通过电击的方法转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105(购自CAMIA公司，澳大利亚)中转化水稻，其过程如下：

1.水稻幼胚培养.将bc10突变体的幼胚脱壳，70％乙醇表面消毒3min后，用0.1％氯化汞5分钟，10％次氯酸钠溶液浸泡20分钟，无菌水冲冼3-4次，点播于NB培养基上诱导愈伤组织，20天左右从成熟胚盾片处长出的愈伤组织继代于NB培养基上，以后每2周继代一次，每次继代时都挑选色泽淡黄较致密的胚性愈伤组织。

2.农杆菌培养.一70℃保存的农杆菌菌株接种于含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培养基上，26-28℃，150rpm暗培养16-18小时活化菌种，YEP固体培养基上划平板，于26-28℃暗培养1天，挑取单菌落于YEP液体培养基中，26-28℃，150rpm悬浮培养16小时，倒入250ml离心管中4000rpm离心收集农杆菌菌体，并用液体培养基悬浮菌体至O.D₆₀₀为0.8-1.0，用于各种水稻材料的转化。

3.水稻材料与农杆菌的共培养.水稻愈伤在与农杆菌菌液感染前均需先在新鲜的继代培养基上培养4天后，才可用于转化。转化时先将经预培养4天的愈伤组织转移到100ml无菌三角锥形瓶中，然后将适量农杆菌悬浮液倒入(保证有足够的菌液把材料淹没)上述含有水稻材料的锥形瓶中，室温下放置20分钟，并不时晃动，然后将水稻材料取出，在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的NB-AS固体培养基上，在26℃条件下暗培养2-3天。共培养后，从固体共培养培养基上取出转化过的水稻材料，转入含有50mg/L潮霉素的选择培养基上进行筛选培养。

4.抗性愈伤组织的筛选及植株再生。第一轮选择2周后，转到第二轮选择培养基上继续筛选2周，然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基或直接转移到分化培养基上分化(16小时光照/天)，再生的小苗在1/2MS上生根壮苗，随后移入温室。共获得pBC10F质粒的转基因株系18个，均完全恢复了野生表型。这一结果证明该基因具有调节水稻茎秆机械强度的作用。

实施例3：BC10蛋白的体外表达和功能验证

1.BC10表达载体的构建：

利用带有XhoI和BamHI的限制性内切酶位点的引物从野生型的cDNA中扩增出BC10基因。所用引物序列如下：

正向：5′-ctcgagAGCTGCACAGATGC-3′

反向：5′-ggatccTGCCACCAGGA GGAGGA-3’

94℃预变性5分钟，94℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 1分钟，35次循环，72℃延伸10分钟获得PCR产物，将PCR产物连接到T-easy载体(购自Promega)，然后通过电击法将连接产物转化DH10B感受态细胞，并用ABI3730DNAanalyzers型测序仪测序(ABI公司，美国)，挑选序列完全正确的克隆。通过XholI和BamHI酶切插入到具相同酶切位点的载体pEGFP-N1(购自Clontech公司)中(图6)，测序验证其编码框的正确性。

2.BC10-GFP融合蛋白的表达

将构建好的质粒，利用质粒提取试剂盒(购自北京天庚生物科技有限公司)纯化好后，利用脂质体转染到中国仓鼠上皮细胞(CHO)(购自ATCCCCL-61)中进行表达。转染表达时，由于含有BC10基因的pEGFP-N1载体同时也具有同框的GFP基因，因此在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，证明BC10能在CHO细胞中表达。转染两天后，收集细胞，并在裂解液(10mMTrisCl，pH8.0，0.1mM EDTA，5mM DTT，0.9％NaCl，和1％Triton X-100)用枪头吹打破碎，在冰上放置两小时后，2700rpm离心分别收集上清和沉淀，用Bio-Rad蛋白分析试剂盒(购自Bio-Rad)定量后取10μg上清和沉淀分别进行Western Blot分析。结果显示，当用GFP单克隆抗体(购自Roche)杂交时，BC10-GFP融合蛋白的信号主要在沉淀中(图7)，说明它的确为一个膜蛋白。

3.BC10-GFP融合蛋白的功能

当我们将BC10蛋白序列送到GenBank中进行保守结构域空间构象比对[conserved domain architecture retrieval tool(CDART)]时发现，DUF266与动物中的修饰蛋白糖基化的Core2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶(C₂GnT)具有一定的同源性，因此我们将在CHO细胞中表达的BC10蛋白进行体外C₂GnT的酶活分析，具体步骤如下：将CHO细胞裂解液沉淀部分的250μg粗蛋白与反应液[50mM HEPES-NaOH，pH7.0；1mM UDP-[glucosamine-U-14C]-GlcNAc(3.7kBq，购自Amersham Pharmacia Biotech)；1mMGalβ1→3GalNAcα1→PNP(购自Sigma)；0.1M GlcNAc；5mM DTT]共50μl在37℃温浴2小时后，加入5ml去离子水终止反应；接着过C18Sep-Pak柱(购自Waters公司)；20ml去离子水充分洗涤柱床后，用4ml甲醇洗脱反应产物；将甲醇冷冻干燥，再溶于1ml甲醇并在液体闪烁检测仪(1450MicroBeta TriLux；Perkin-Elmer)上记录放射性读数，计算酶活。图8显示，与阴性对照比较，BC10的确具有一定的C₂GnT活性，证明BC10为一种糖基转移酶。

参考文献：

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14.Li X，et al.Nature.2003，422(6932)：618-621

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院遗传所

 

<120>水稻茎秆机械强度控制基因BC10及其应用

 

<130>IB087285

 

<160>2

 

<170>PatentIn version 3.1

 

<210>1

<211>1200

<212>DNA

<213>Oryza sativa

 

<400>1

atgaagccgc cgcggaggtg gatgtacggg cggggcggcg ggaaggggaa gccggcgggg    60

ctgctgctgc tgggggtgtt cctctgcttg tcggtggtgc tgctgctgct gctgcacggc    120

tcgtccccgt cgctggaggg cgaggggagg aagcctgagg cggtggaggc ggcgggggga    180

gggggagagg aggaggaggt ggcggtggcg cgggcggagg tggaggaggc gccgctgccg    240

ccggggaacg cgcggctcgc cttcctcttc atcgcccgca accgcctccc gctcgacctc    300

gtctgggacg ccttcttccg cggtgacaag gaagggagat tctccatctt cgtgcactcg    360

cggccggggt tcgtgctcac ccgcgccacc acccgatccg gcttcttcta caatcggcag    420

gtcaacaaca gcgtccaggt ggattggggg gaggcgagca tgatcgaggc tgagcgtgtt    480

ctactcgccc acgcgctcaa ggacccctta aacgagcgct tcgtgttcgt ctccgacagc    540

tgtgtgccat tgtacaactt caactacact tacgactaca taatgtcttc gtcaaccagt    600

tttgttgaca gttttgctga tacaaaagcg ggtcggtata atccaagaat ggacccaatt    660

atcccagtgg aaaattggag aaaaggctcg cagtgggctg tgttaacaag aaaacatgct    720

gaagttgtgg ttgaagatga agaggttttg ccagaattcc agaagcattg caggagaagg    780

cccttaccag agttctggcg ggactgggat cgtcctattc ctgcggaggc atggaaggca    840

cataactgca taccagatga gcactatgtt caaacattgc ttgcacaaca tggtcttgaa    900

gaagagctta cacggaggtc agttacacac agtgcgtggg atctatcatc ttctaaagat    960

cgtgaaaggc gtggatggca tcctgtaaca tacaaaatct cagatgctac tcctgcactt    1020

gtaaaatcca taaaggatat tgataatata tattatgaga ctgaaaatag aaaggagtgg    1080

tgtacaagta atggaaaacc agcaccttgc ttcctttttg caaggaagtt tacacgagca    1140

gctggtctga agcttcttga tttatctttg atagcagcaa atggcgcatc taccatgtaa    1200

 

<210>2

<211>399

<212>PRT

<213>0ryza sativa

 

<400>2

Met Lys Pro Pro Arg Arg Trp Met Tyr Gly Arg Gly Gly Gly Lys Gly

1               5                   10                  15

Lys Pro Ala Gly Leu Leu Leu Leu Gly Val Phe Leu Cys Leu Ser Val

            20                  25                  30

Val Leu Leu Leu Leu Leu His Gly Ser Ser Pro Ser Leu Glu Gly Glu

        35                  40                  45

Gly Arg Lys Pro Glu Ala Val Glu Ala Ala Gly Gly Gly Gly Glu Glu

    50                  55                  60

Glu Glu Val Ala Val Ala Arg Ala Glu Val Glu Glu Ala Pro Leu Pro

65                  70                  75                  80

Pro Gly Asn Ala Arg Leu Ala Phe Leu Phe Ile Ala Arg Asn Arg Leu

                85                  90                  95

Pro Leu Asp Leu Val Trp Asp Ala Phe Phe Arg Gly Asp Lys Glu Gly

            100                 105                 110

Arg Phe Ser Ile Phe Val His Ser Arg Pro Gly Phe Val Leu Thr Arg

        115                 120                 125

Ala Thr Thr Arg Ser Gly Phe Phe Tyr Asn Arg Gln Val Asn Asn Ser

    130                 135                 140

Val Gln Val Asp Trp Gly Glu Ala Ser Met Ile Glu Ala Glu Arg Val

145                 150                 155                 160

Leu Leu Ala His Ala Leu Lys Asp Pro Leu Asn Glu Arg Phe Val Phe

                165                 170                 175

Val Ser Asp Ser Cys Val Pro Leu Tyr Asn Phe Asn Tyr Thr Tyr Asp

             180                 185                 190

Tyr Ile Met Ser Ser Ser Thr Ser Phe Val Asp Ser Phe Ala Asp Thr

        195                 200                 205

Lys Ala Gly Arg Tyr Asn Pro Arg Met Asp Pro Ile Ile Pro Val Glu

    210                 215                 220

Asn Trp Arg Lys Gly Ser Gln Trp Ala Val Leu Thr Arg Lys His Ala

225                 230                 235                 240

Glu Val Val Val Glu Asp Glu Glu Val Leu Pro Glu Phe Gln Lys His

                245                 250                 255

Cys Arg Arg Arg Pro Leu Pro Glu Phe Trp Arg Asp Trp Asp Arg Pro

            260                 265                 270

Ile Pro Ala Glu Ala Trp Lys Ala His Asn Cys Ile Pro Asp Glu His

        275                 280                 285

Tyr Val Gln Thr Leu Leu Ala Gln His Gly Leu Glu Glu Glu Leu Thr

    290                 295                 300

Arg Arg Ser Val Thr His Ser Ala Trp Asp Leu Ser Ser Ser Lys Asp

305                 310                 315                 320

Arg Glu Arg Arg Gly Trp His Pro Val Thr Tyr Lys Ile Ser Asp Ala

                325                 330                 335

Thr Pro Ala Leu Val Lys Ser Ile Lys Asp Ile Asp Asn Ile Tyr Tyr

            340                 345                 350

Glu Thr Glu Asn Arg Lys Glu Trp Cys Thr Ser Asn Gly Lys Pro Ala

        355                 360                 365

Pro Cys Phe Leu Phe Ala Arg Lys Phe Thr Arg Ala Ala Gly Leu Lys

    370                 375                 380

Leu Leu Asp Leu Ser LeuIle Ala Ala Asn Gly Ala Ser Thr Met

385                 390                 395

Claims (7)

1.一种控制水稻茎秆机械强度的基因，该基因的核苷酸序列选自：

(1)编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或

(2)与(1)中的核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制植物茎秆机械强度功能的核苷酸序列，所述严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液中，所述预杂交液是0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，在65℃预杂交30分钟；弃预杂交液，加入杂交液，所述杂交液是0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段，在65℃杂交16小时；弃杂交液，加入洗膜液I，所述洗膜液I是20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，0.1％SDS，在65℃洗膜2次，每次10-15分钟；加入洗膜液II，所述洗膜液II是10mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，0.1％SDS，在65℃洗膜10-15分钟。

2.按照权利要求1所述的基因，其特征在于它具有SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

3.一种由权利要求1或2所述的核苷酸序列编码的蛋白质。

4.按照权利要求3所述的蛋白质，其特征在于它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

5.一种含有权利要求1或2所述的控制水稻茎秆机械强度的基因的植物表达载体。

6.按照权利要求5所述的表达载体，所述表达载体是pBC10F。

7.一种培育植物的方法，所述方法可使植物茎秆机械组织细胞壁的结构和成分发生改变，从而引起茎秆机械强度发生变化，其特征在于包括下列步骤：

用按照权利要求5所述的表达载体转化植物细胞；和

将转化的植物细胞培育成植株。

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