CN109321580B - 水稻控制茎秆强度基因BC-n及其应用 - Google Patents

水稻控制茎秆强度基因BC-n及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种控制茎秆强度基因BC‑n及其在水稻育种中的应用。本发明公开了一种水稻控制茎秆强度基因BC‑n，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；水稻控制茎秆强度基因BC‑n编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明还同时公开了水稻控制茎秆强度基因BC‑n在水稻育种中的应用：降低水稻茎秆机械强度，便于水稻秸秆的还田或加工。

Description

水稻控制茎秆强度基因BC-n及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种控制茎秆强度基因BC-n及其在水稻育种中的应用。
背景技术
水稻是三大粮食作物之一，是全球近一半人口赖以生存的基本粮食，随着人口的增加和耕地面积的减少，人们对水稻的产量要求越来越高。脆秆突变体属于一类纤维素、半纤维素、木质素含量改变，茎秆机械强度降低的突变体，是研究植物茎秆机械强度遗传机制及植物细胞壁合成机理的重要材料。
关于水稻脆性突变体的研究早在20世纪60年代就已经开始，目前，水稻中发现并命名的脆秆突变体有20多个，有10个水稻脆秆相关调控基因已被克隆[1,2]。以BC(brittleculm)命名的水稻脆性突变体有12个(BC1-BC12)。其中bc5是茎节脆性基因，是唯一显性脆秆基因，与bc11是等位基因[3]。BC1基因编码类COBRA蛋白，在水稻发育阶段的厚壁细胞和维管束中表达。该基因的突变会造成细胞壁厚度和纤维素含量的减少，同时木质素的含量增多，导致茎秆和叶片变脆[4]。BC3编码一个经典的发动蛋白OsDRP2B,该基因突变后表现出茎秆厚壁细胞次生壁变薄，茎秆细胞壁中纤维素含量显著降低，茎秆机械强度减弱[5]。BC6基因编码OsCesA9蛋白，对纤维素在次生壁的合理沉积具有重要作用；BC6具有与BC1相似的表达模式，BC6基因的突变同样会造成茎秆和叶片变脆，且无矮化和叶尖焦黄等多效性表型[6]。BC14编码水稻UDP-葡萄糖核糖转运因子，该基因突变会导致细胞壁多糖糖基合成缺陷，致使次生细胞壁纤维素合成受阻,细胞壁中纤维素含量降低，引起水稻茎秆机械强度降低[7]；CEF1(CulmEasily Fragile1)调控OsCesA的表达，进而响细胞壁中纤维素含量及茎秆的机械强度[8]。此外，BC10具有糖基转移酶的功能，可通过调节细胞壁纤维素的合成和阿拉伯半乳聚糖蛋白的含量来控制水稻茎秆机械强度[9]。
虽然已有的水稻脆秆突变体和基因对茎秆机械强度分子机理的揭示起到了重要的作用，但是其分子机理有待进一步研究，本发明通过图位克隆技术分离并克隆到控制茎秆强度基因BC-n，该基因编码一种与水稻茎秆脆性相关的蛋白质，细胞学和生物化学分析表明，该基因影响水稻茎秆、叶片、叶鞘中细胞的厚度和纤维素的含量，转基因功能互补实验鉴定了该基因的功能。
上文中涉及的参考文献如下：
1.蒋钰东,何沛龙,廖红香,等.水稻茎秆脆性及叶尖枯死突变体fld1的鉴定与基因定位.植物学报,2014,49(6):663-671；
2.江云珠,沈希宏,曹立勇.水稻茎秆性状的研究进展.中国稻米,2012,18:1-7；
3.Zhang B,Zhou Y.Rice brittleness mutants:a way to open the'BlackBox'of monocot cell wall biosynthesis.J INTEGR PLANT BIOL,2011,53(2):136-142(Zhang B,Zhou Y.水稻脆性突变体:一种打开单子叶植物细胞壁生物合成的“黑盒子”的方法.植物学报,2011,53(2):136-142)；
4.Liu L,Shangguan K,Zhang B,et al.Brittle Culm1,a COBRA-like protein,functions in cellulose assembly through binding cellulose microfibrils.PlosGenetics,2013,9(8):e1003704(Liu L,Shangguan K,Zhang B,等.Brittle Culm1,一个COBRA类蛋白，通过结合纤维素微原纤维在纤维素组装中起作用.公共科学图书馆遗传学,2013,9(8):e1003704)；
5.Xiong GY,Li R,Qian Q,et al.The rice dynamin-related protein DRP2Bmediates membrane trafficking,and thereby plays a critical role in secondarycell wall cellulose biosynthesis.Plant J,2010,64(1):56-70(Xiong GY,Li R,QianQ,等.水稻动力相关蛋白DRP2B介导膜运输,并因此在次生细胞壁纤维素生物合成中起关键作用.植物杂志,2010,64(1):56-70)；
6.Kotake T,Aohara T,Hirano K,et al.Rice Brittleculm 6 encodes adominant-negative form of CesA protein that perturbs cellulose synthesis insecondary cell walls.J Exp Bot,2011,62(6):2053-2062(Kotake T,Aohara T,HiranoK,等.Rice Brittleculm 6编码CesA蛋白的显性失活形式,其扰乱次生细胞壁中的纤维素合成.实验植物学杂志,2011,62(6):2053-2062)；
7.Zhang BC,Liu XL,Qian Q,et al.Golgi nucleotide sugar transportermodulates cell wall biosynthesis and plant growth in rice.Proc Natl Acad SciUSA,2011,108(12):5110-5115(Zhang BC,Liu XL,Qian Q,等.高尔基核糖转运蛋白调节水稻的细胞壁生物合成和植物生长.美国科学学院学报,2011,108(12):5110-5115)；
8.Ye YF,Liu BM,Zhao M,et al.CEF1/OsMYB103L is involved in GA-mediatedregulation of secondary wall biosynthesis in rice.Plant Mol Biol,2015,89(4-5):385-401(Ye YF,Liu BM,Zhao M,等.CEF1/OsMYB103L参与GA介导的水稻次生壁生物合成调控.植物分子生物学,2015,89(4-5):385-401)；
9.Zhou YH,Li SB,Qian Q,et al.BC10,a DUF266-containing and Golgi-located type II membrane protein,is required for cell-wall biosynthesis inrice(Oryza sativa L.).Plant J,2009,57(3):446-462(Zhou YH,Li SB,Qian Q,等.BC10是一种DUF266-高尔基体II型膜蛋白,是水稻细胞壁生物合成的必需物质.植物杂志,2009,57(3):446-462)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种水稻控制茎秆强度基因BC-n及其在水稻育种中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻控制茎秆强度基因BC-n，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还同时提供了上述水稻控制茎秆强度基因BC-n编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还同时提供了上述水稻控制茎秆强度基因BC-n在水稻育种中的应用：降低水稻茎秆机械强度，从而便于水稻秸秆的还田或工业加工。
作为本发明的应用的改进：获得机械强度降低的转基因水稻。
进一步地，上述氨基酸序列还包括添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
进一步地，上述核苷酸序列还包括添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
本发明还提供了一种培育植物脆秆的方法，包括用植物表达载体转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株；转化采用农杆菌介导法或基因枪法；从而获得机械强度降低的转基因水稻。
本发明的水稻脆秆突变体是由粳稻品种中花11的EMS诱变体库中筛选得到的。该突变体除了茎秆、叶片、叶鞘表现出脆性外，还表现出叶片早衰的现象。本发明采用图位克隆的方法克隆分离了水稻控制茎秆强度的基因BC-n。BC-n基因是由LOC_Os03g52630基因发生了单碱基突变而来的，即序列SEQ ID NO：1的第685位核苷酸G突变为A，导致编码的氨基酸发生了改变，生物信息学分析显示BC-n编码了一个糖苷水解酶。
通过转基因技术，进行功能互补的转基因研究，结果表明本发明获得了使突变体BC-n的表型得以恢复为野生型的转基因水稻，证明了本发明正确克隆了BC-n基因。
综上所述，本发明分离并克隆鉴定了控制水稻控制茎秆强度基因BC-n，并通过互补实验进行基因功能验证。图位克隆的结果表明，该基因编码了一个糖苷水解酶。本发明为培育机械强度降低的新品种，对于解决秸秆焚烧难题、实现秸秆就地还田、保护环境等方面具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是野生型和BC-n突变体分蘖期的表型图。
图2是BC-n基因的定位图；
A：BC-n基因的精细定位，利用bc-n/TN1的F2群体的637株突变单株，将BC-n基因定位在第3号染色体的定位于B3-19和B3-23标记之间；
B：BC-n界定在283.3Kb区域；
C：BC-n基因的结构示意图，通过对该区域的NIP和bc-n亲本基因组DNA序列测序比对分析，结果发现在基因BC-n(LOC_Os03g52630)的第三个外显子上的第685位核苷酸G替换为A。
图3是功能互补实验转基因水稻cp的表型。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定，以下实施例中的若未特别说明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、突变体材料的获得
通过EMS化学诱变粳稻品种中花11：取1mL原生质体原液，加9mL稀释缓冲液，得到108个/mL原生质体悬液，分装每份0.5mL，之后取5μl EMS原液(10M/L MES)，加入0.5mL原生质体悬液，30℃培养诱变。
从而筛选到一份控制茎秆强度突变体BC-n。该突变体的性状经过多代自交已稳定遗传，在大田条件下观察和比较突变体与野生型整个生长周期植株形态都表现出脆秆的表型，茎秆易折断且叶片黄化。所有水稻材料种植于浙江省金华市浙江师范大学生化学院试验田，常规管理。
实施例2、植株的表型分析
BC-n突变体除了茎秆、叶片、叶鞘表现出脆性外(茎秆易折断)，还表现出叶片早衰(叶片变黄)的现象。
实施例3、群体构建和遗传分析
将突变体BC-n和常规籼稻TN1、ZF802进行杂交配组，F1植株均表现出正常野生型表型，说明BC-n受隐性核基因控制。将F1进行自交，得F2；统计F2分离群体分离比(表1)，结果表明，正常表型的植株和突变体表型的植株的分离比经过卡方检验接近3:1分离，这表明BC-n的脆秆表型是由一对单隐性核基因控制。
表1、水稻脆秆突变体BC-n的遗传分析
Figure BDA0001835831020000051
实施例4、BC-n基因的精细定位
利用本实验室保存的均匀分布于水稻12条染色体的SSR引物对突变体与TN1、ZF802进行多态性筛选。然后用21个BC-n/TN1的F2中脆秆单株进行连锁分析，初步确认目标基因所在的染色体位置。基因组DNA采用CTAB法提取。具体步骤如下：
①、称取0.1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入600μl的CTAB溶液(2％(m/V)CTAB，100mmol/L Tris-Cl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl；pH8.0)配制的DNA提取缓冲液，65℃水浴40分钟。再加600μl的氯仿:异戊醇(24:1的体积比)，并混匀。10,000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。
②、在上述步骤①离心后所得的上清液中加2/3～1倍体积预冷(至4℃)的异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀。13,000rpm离心8分钟，倒出上清液。
③、再用70％(体积浓度)的已醇200μl洗涤上述步骤②所得的DNA沉淀物。
④、将上述洗涤后的DNA晾干并溶于100μl TE缓冲液或纯水中。
⑤、紫外分光光度法检测上述步骤④所得的DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。完整合适的DNA用于PCR扩增，不完整的DNA则重新提取，直至获得完整的DNA。
PCR反应体系采用10μL体系：DNA模板1μL，10×PCR缓冲液1μL，正反向引物(10μmol/L)各0.5Μl,dNTPs 1μL，rTaq酶0.2μL，加ddH2O补足10μL。PCR扩增程序如下：94℃下预变性4min；94℃下变性30s，55℃～60℃下退火30s(温度因引物不同而异)，72℃下延伸30s，40个循环；最后72℃下延伸10min。PCR产物用4％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像仪拍照并读胶。利用筛选的134对SSR引物进行BC-n基因连锁分析发现在第3号染色体的SSR标记B3-23处表现出连锁现象。在连锁标记上下游设计新的Indel标记，用这21个单株将目的基因区间锁定在分子标记M1与M2之间。在此区间再次设计新的分子标记，用678个F2单株最终将该基因定位在M2和M3之间大约283.3kb的区间内。引物序列见表2。
表2精细定位所用分子标记
Figure BDA0001835831020000061
根据水稻基因组数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)数据信息，发现共有24个开放阅读框(ORF)。其中包括了9个表达蛋白，12个反转座子蛋白，24个功能蛋白。利用PCR的方法，将突变体和野生型中这24个基因所在的基因组序列扩增出来，测序分析，发现只有一个基因(LOC_Os03g31550)出现突变，该基因的编码区685位核苷酸G突变为A，导致编码的氨基酸发生改变(由Val变成Met)。
水稻控制茎秆强度基因BC-n的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；基因BC-n编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。相应的，中花11的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
实施例5、植物转化
扩增水稻中花11品种中BC-n基因的5’-UTR至3’-UTR的基因组DNA片段(即，SEQ IDNO：1中的第1位～第1863位)；然后连入pEASY-Blunt Cloning Vector(TransGen Biotech公司)中，之后再连入到pCAMBIA1300载体中。
质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。利用突变体成熟胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养2周后，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体(pCAMBIA1300-COLD2)的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有50mg/L Hygromycin的筛选培养基上光照培养14天左右(光照强度为13200LX，温度为32℃)。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下(光照强度为13200LX，温度为32℃)培养一个月左右得到抗性转基因植株。对互补苗植株进行脆秆鉴定，转入了控制茎秆强度基因BC-n的水稻其茎秆的机械强度恢复至野生型茎秆的机械强度，早衰的现象也不见了，恢复到了野生型中花11的状态。
注：突变体的茎秆用手就能轻轻折断，野生型则不能。
实施例6、控制茎秆强度基因BC-n在水稻育种中的应用
在生产实践中，可将所述突变体中的基因转化植物细胞，再将转化后的植物细胞培育成植株。通过该转基因方法，利用植物表达载体转化植物细胞以培育脆秆水稻。由于作物秸秆柔韧，机械难以粉碎，机收后秸秆过长，耕作时不易翻压进土壤，造成秸秆长期不腐解，直接影响下一季作物播种和生长。秸秆焚烧还带来严重的环境污染和生物质资源浪费。脆秆突变体BC-n表现出脆秆的特性，因此，可通过将此基因转化到水稻中使茎秆更脆，收获时秸秆易粉碎、机械能耗低，从根本上解决秸秆还田问题，同时有助于秸秆的加工，用于饲料或工业原料。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江师范大学
<120> 水稻控制茎秆强度基因BC-n及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1863
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
atgttcgggc gggacccgtg gggcgggccg ctggagatct cgaatgcgga ctcggcgacg 60
gacgacgacc ggagccggga cctggacagg ggggcgctga tgcggcagct ggacgagacg 120
cagcagagct ggctcctggc cgggccgggc gaccaggccg gcaagaagaa gaagaagtac 180
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cgcccccctc ctcctccccc cgaccagtac acccaggccc tccacaaggc cctcatgttc 360
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ggagctcagg ttcttctgag caggttgcgg cttttcctaa gtcctggata tccttacgaa 1200
gaaatactga gaacatttca caaccaaaca gacaatgtta tgtgctcgta tctgccgatg 1260
tacaattcat tcaactttac caaaggagga atgatacagc tcaaccacgg aaggcctcag 1320
ccacttcagt atgttgtcaa tgcggctttc cttgcctctc tatacagcga ttacctggat 1380
gctgcagata cacctgggtg gtattgtgga cctactttct acactacaga agtcctccgc 1440
aaatttgcaa ggtcacagct cgattatgtc ctaggtaaga acccactgaa gatgagctac 1500
gttgtgggtt ttggaaacaa gtaccccaag cgcgctcatc acagaggtgc atcaatccct 1560
cataatggtg tcaaatatgg atgcaaagga ggctttaaat ggagggagac taagaagcca 1620
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gatgtccgta caaactacaa ttacacggag cctactcttg cagcaaatgc tggcctggtg 1740
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ttctctgcag ttcctccgat gtttccaact cccccacctc caccgtcagc ttggaaacca 1860
tga 1863
<210> 3
<211> 621
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 3
Met Phe Gly Arg Asp Pro Trp Gly Gly Pro Leu Glu Ile Ser Asn Ala
1 5 10 15
Asp Ser Ala Thr Asp Asp Asp Arg Ser Arg Asp Leu Asp Arg Gly Ala
20 25 30
Leu Met Arg Gln Leu Asp Glu Thr Gln Gln Ser Trp Leu Leu Ala Gly
35 40 45
Pro Gly Asp Gln Ala Gly Lys Lys Lys Lys Lys Tyr Val Asp Leu Gly
50 55 60
Cys Met Val Leu Asp Arg Lys Ile Phe Met Trp Thr Val Gly Thr Ile
65 70 75 80
Leu Gly Val Gly Leu Phe Ile Gly Phe Val Met Met Ile Val Lys Leu
85 90 95
Val Pro His Lys Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Gln Tyr Thr Gln
100 105 110
Ala Leu His Lys Ala Leu Met Phe Phe Asn Ala Gln Arg Ser Gly Pro
115 120 125
Leu Pro Lys His Asn Gly Val Ser Trp Arg Gly Asn Ser Cys Met Lys
130 135 140
Asp Gly Leu Ser Asp Ser Thr Val Arg Lys Ser Leu Val Gly Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Asp Ala Gly Asp Ala Ile Lys Phe Asn Tyr Pro Met Ala Trp Ser
165 170 175
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195 200 205
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Ile Val Ala Gln Val Gly Val Gly Asp Thr Ser Lys Gly Gly Ala Gln
225 230 235 240
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260 265 270
Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Ile Val Phe Lys Asp Ser Lys Thr
275 280 285
Tyr Ser Asp Lys Leu Val Arg Gly Ala Lys Ala Leu Tyr Lys Phe Gly
290 295 300
Arg Leu Gln Arg Gly Arg Tyr Ser Pro Asn Gly Ser Asp Gln Ala Ile
305 310 315 320
Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Tyr Trp Asp Glu Phe Val Trp Gly Gly Ala
325 330 335
Trp Met Tyr Phe Ala Thr Gly Asn Asn Thr Tyr Leu Ser Val Ala Thr
340 345 350
Ala Pro Gly Met Ala Lys His Ala Gly Ala Tyr Trp Leu Asp Ser Pro
355 360 365
Asn Tyr Gly Val Phe Thr Trp Asp Asp Lys Leu Pro Gly Ala Gln Val
370 375 380
Leu Leu Ser Arg Leu Arg Leu Phe Leu Ser Pro Gly Tyr Pro Tyr Glu
385 390 395 400
Glu Ile Leu Arg Thr Phe His Asn Gln Thr Asp Asn Val Met Cys Ser
405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Lys Met Ser Tyr Val Val Gly Phe Gly Asn Lys Tyr Pro Lys Arg Ala
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515 520 525
Lys Gly Gly Phe Lys Trp Arg Glu Thr Lys Lys Pro Asn Pro Asn Ile
530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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<210> 4
<211> 621
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 4
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610 615 620

Claims (4)

1.水稻控制茎秆强度基因BC-n，其特征是：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述的水稻控制茎秆强度基因BC-n编码的蛋白质，其特征是：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.如权利要求1所述的水稻控制茎秆强度基因BC-n在水稻育种中的应用，其特征是：降低水稻茎秆机械强度，便于水稻秸秆的还田或加工。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：获得机械强度降低的转基因水稻。
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