CN101791327A - 包含蜂毒和药物粗提物的天然抗生素及其制备方法 - Google Patents
包含蜂毒和药物粗提物的天然抗生素及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及天然抗生素及其生产方法。更特别地，本发明涉及包含作为活性成分的草药粗提物和蜂毒的天然抗生素及其生产方法，该草药提取物是在预定的水热条件下获得的，具有极佳的抗氧化作用，该蜂毒具有极佳的抗菌作用。本发明的天然抗生素具有抗诱发猪腹泻的菌的杀菌作用，因此提高了仔猪的生产率，并且还通过预防和治疗疾病的能力提供了不包含任何抗生素的猪肉。而且，由于本发明的天然抗生素具有极佳的抗菌效果，因此它们能够大幅度降低牛奶中存在的体细胞的数量，还可以替代传统的抗生素，有助于不含抗生素的高品质奶制品如牛奶和奶酪的生产。
Description
技术领域
本发明涉及包含具有极佳抗氧化作用的草药粗提物以及具有极佳抗菌作用的蜂毒的天然抗生素。
本发明还涉及上述抗生素的制备方法，上述抗生素可以替代用于牲畜的传统抗生素，特别是对猪体内诱发猪腹泻的菌和诱发牛乳腺炎的菌具有极佳抗菌活性的上述抗生素。
背景技术
蜂毒包含多种成分。已经知道其中的肽具有抗炎活性、抗菌活性、极佳的止痛活性、增强免疫性等作用。世界上某些地区仍然在使用蜂毒疗法，特别是在东欧，但尽管进行了大量工作来鉴定蜂毒中的药物活性成分，但仍然缺乏对该疗法的有效性的科学证明。
蜂毒的主要药理活性如下：
1.治疗与免疫相关的疾病：
已经知道蜂毒对大多数与免疫相关的疾病是有效的，这是因为蜂毒刺激哺乳动物的免疫系统成功地应对疾病。蜂毒引发的两种主要免疫反应刺激机体的生理系统，然后加强身体的防御。
2.抗炎活性
蜂毒的主要成分对于预防炎症非常有效。就关节炎而言，注射蜂毒素和蜂毒明肽特别有效地预防了水肿的发生。此外，蛋白抑制剂和安度拉平联合治疗还显示出可以预防15-40％的水肿发生。
3.神经毒素作用
蜂蛰伤通常伴随疼痛和炎症。蜂毒中包含的与诱发疼痛和炎症有关的物质被有效地用于开发止痛药，产生哺乳动物针对诱导的回避反应。特别是蜂毒中存在的蜂毒明肽具有镇痛作用，因此被有效用于治疗各种神经疾病、关节炎、风湿性关节炎、痛风、肌肉痛等。
4.溶血活性
最有效的一种蜂针治疗是其溶血活性。蜂针液中存在的蜂毒素、磷脂酶等具有吸收和排泄由挫伤、内出血等导致的淤血的作用，并且提供新鲜的新血液、氧和营养物，由此产生治疗作用和溶血活性。
5.血管舒张作用。
由于组胺物质的作用，蜂针液具有舒张毛细血管、微动脉、微静脉，特别是内脏血管中的血管的作用。因此，它用于治疗寒冷敏感、冻伤、肌肉痛等。
6.降压活性
由于组胺物质的存在，蜂针液具有降血压的活性。甚至在其浓度被稀释至1/250,000,000时，还具有降压活性，对于治疗原发性高血压特别有效。
7.控制自主神经系统
持续的应激可以引起控制交感神经和副交感神经的自主神经系统出现障碍，导致多种疾病的发生。蜂毒含有儿茶酚胺和乙酰胆碱，即保持自主神经系统正常所必需的物质，而且这些物质是有效治疗心身疾病、应激疾病等的神经递质。
8.抗菌活性
蜂毒具有极佳的抗细菌和抗真菌活性，并且还知道它对于病毒性肿瘤的治疗非常有效。特别地，它用于治疗牙周病、扁桃腺炎、睑腺炎、化脓性疾病非常有效。
金银花(Lanicera japonica)属于忍冬科，已知其具有如免疫反应、抗炎和抗氧化的生理活性。
已知茵陈蒿(Artemisia capillaries)具有抗炎、缓解发热、祛痰、改善排尿和癫痫的作用，并且还具有如抗氧化的药理作用。
已知鱼腥草(Houttuynia cordata)对排尿、疖、解毒、水肿和抗氧化有作用。
已知茶(Camellia sineis)具有各种治疗作用，特别是对抗氧化和预防体重增加有作用。
已经知道用包含茵陈蒿和鱼腥草的混合物的饲料喂养断奶仔猪显示出体重增加和腹泻频率明显降低。
由于发布的报告中指出向猪饲料中添加抗生素对于预防和治疗疾病是有效的，并且还提高了饲养效率(Hays，1977；Zimmerman，1986)，因此抗生素已经在猪饲料的生产中广泛使用。然而，从公共健康的角度出发，对抗生素耐药菌的关注日益增长(Braude，1978；Kunin，1993；Cassell，1995)，已经有关于开发猪养殖业中抗生素替代物方面的积极研究。在韩国，从2012年起，将禁止在牲畜养殖场中使用传统的抗生素，因此从天然物质中开发抗生素替代物的需求很迫切。
牛乳腺炎是世界范围内在奶牛中最频繁发生的炎症疾病，它是由奶牛乳房感染细菌或真菌所引起的。牛奶中体细胞数量的增加导致由其生产的牛奶的质量下降，奶量下降以及产生用于治疗的医疗费用。在韩国，已经进行各种研究工作以解决上述问题，同时引入对牛奶质量分级的体系。
由于乳腺炎的过程和起因是非常复杂的，存在超过80种的引起乳腺炎的菌，很难采用现在可用的几种特定抗生素进行有效治疗。而且，抗生素的连续使用导致抗生素耐药菌增加，因此降低疗效，并且由于牛奶中存在抗生素，因而已经在特定时间内停止使用每种抗生素。因此，迫切需要开发可以替代传统抗生素用于治疗牛乳腺炎的安全且有效的药物。
已经有很多关于蜂毒促进实验动物生长，强化免疫功能以及治疗各种家畜疾病的疗效的报道，实际上它已经在农场中被用于上述目的。
蜂毒是具有强抗菌和抗炎作用的天然物质，已知其没有副作用方面的危险，并且治疗后其残留物与抗生素不同，因此已经长期用于关节炎、疼痛等的治疗，并且采用蜂毒的治疗方法的开发还在持续研究中。
发明内容
技术问题
作为改善牲畜生产的持续研究的结果，本发明人考虑到蜂毒的极佳抗菌活性以及如金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶的草药的极佳抗氧化活性，成功地生产出新型天然抗生素，其中包含作为活性成分的蜂毒和草药粗提物。
因此，本发明的目的在于提供可以替代传统抗生素的天然抗生素，传统抗生素具有治疗后存留在牲畜体内的缺点。
技术方案
本发明涉及包含蜂毒和草药粗提物的天然抗生素，该草药粗提物获自选自金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶中的至少一种的混合物。
本发明还涉及生产上述天然抗生素的方法，包括：
在100-120℃和1-1.2个大气压的水热条件下，通过李比希(Liebig)冷凝器从干燥的粉碎的混合物产物中获得提取物，该混合物包含选自金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶中的至少一种；
在减压条件下浓缩得到的提取物，随后过滤得到草药粗提物；以及
将草药粗提物和蜂毒混合后灭菌。
有益效果
本发明的上述天然抗生素增强了抗诱发猪腹泻的菌的抗菌效果，因此能够预防和治疗仔猪疾病，改善仔猪的生产并提供不含抗生素的猪肉。
而且，本发明的天然抗生素具有极佳的抗诱发牛乳腺炎的菌的抗菌作用，因此能够显著地减少牛奶中存在的体细胞的数量，替代传统的抗生素，从而提供不含抗生素残留物的高品质奶制品。
发明的实施方式
本发明涉及包含作为活性成分的蜂毒和草药粗提物的天然抗生素，其中草药粗提物来自包含选自金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶中的至少一种的混合物。
更具体地，本发明的天然抗生素包含0.01-5重量％的上述蜂毒，5-20重量％的上述草药粗提物和75-95％的溶剂。
就溶剂而言，对其种类和用量没有限制。本发明使用的溶剂包括水、蒸馏水、生理盐水等，它们与上述蜂毒和草药粗提物可以混溶，优选为生理盐水。
下文中进一步详细说明了上述天然抗生素的成分。
蜂毒
本发明的天然抗生素包含作为活性成分的蜂毒，已知蜂毒具有极佳的抗炎活性、神经毒素活性、溶血活性、血管舒张活性，能够控制自主神经系统，因此在治疗免疫相关疾病中有效。
在本发明中，包含相对于天然抗生素总重量的0.01-5％的蜂毒。如果蜂毒的含量低于0.01％，抗菌作用显著降低。同时，如果含量超过5％，可能有毒。因此，优选保持上述范围。
草药粗提物
金银花属于忍冬科，已知其具有如免疫反应、抗炎和抗氧化的生理活性。
茵陈蒿已经被长期使用，其具有抗炎、缓解发热、祛痰、改善排尿和癫痫的作用，并且还具有如抗氧化的药理作用。
已知鱼腥草对排尿、疖、解毒、水肿和抗氧化有作用。
已知茶具有各种治疗作用，特别是具有抗氧化以及对预防体重增加有作用。
已经知道用包含茵陈蒿和鱼腥草的混合物的饲料喂养断奶仔猪显示出体重增加量和腹泻频率明显降低。
作为活性成分的本发明的草药粗提物是在水热条件下从混合物中提取的，该混合物为选自金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶中的至少一种的混合物。相对于本发明的总的天然抗生素，其中包含5-20重量％的草药粗提物。如果草药粗提物的含量低于5重量％，会导致抗氧化效果降低。相反地，如果含量大于20重量％，将会导致毒性并且可能影响天然抗生素的物理性质。因此，优选保持上述范围。
除了0.01-重量5％的蜂毒和5-20重量％的草药粗提物之外，本发明的天然抗生素还包含溶剂
本发明的上述草药粗提物可以通过以下方法获得，即在100-120℃和1-1.2个大气压的水热条件下，回流选自金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶中的至少一种的混合物，由此获得提取物，然后将提取物在减压条件下浓缩，随后过滤。如果温度低于100℃，水溶性活性成分可能不会被有效地提取。如果温度高于120℃，得到的提取物可能含有除了活性成分之外的其它成分。如果在高于上述1-1.2个大气压范围的压力下进行回流，可能导致抗菌活性被破坏。优选进行回流2个小时或更长时间。
在从选自金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶中的至少一种的混合物获取草药粗提物的过程中，优选在水热条件下从包含重量比为1∶1.5-2.0∶1.0-2.0∶2.0-2.5的金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶的混合物获取提取物，该比例也是优选的，它可以使提取物的抗氧化作用最大化。
上述天然抗生素的生产方法说明如下。
上述天然抗生素可以由这样的方法获得，该方法包括：在100-120℃和1-1.2个大气压的水热条件下，通过回流1.5-2.5小时从干燥的粉碎的混合物产物中获得提取物，该混合物包含选自金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶中的至少一种；在减压条件下浓缩得到的提取物后过滤，得到草药粗提物；以及将草药粗提物和蜂毒混合后灭菌。
本发明的上述天然抗生素可以以牲畜饲料添加剂的形式使用，并且可以通过与药学上可接受的载体、成形剂(forming agent)、稀释剂等组合，用于制备粉剂、丸剂、胶囊、片剂和注射剂形式的药物。
附图说明
图1显示了测试例1中DPPH自由基清除活性DPPH自由基去除能力的结果。
图2显示了测试例3中仔猪体重增加和体重增加率的结果。
图3显示了测试例3中仔猪的成活率结果。
具体实施方式
参考以下实施例进一步描述本发明，然而，它们不应被理解为对本发明的范围的限制。
实施例1：天然抗生素的制备
在100℃和1.2大气压下，将100g重量比为1∶2.0∶2.0∶2.5的干燥金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶组成的混合物用1L蒸馏水回流2小时得到提取物。减压下浓缩提取物，获得200mL浓缩的提取物。浓缩的提取物通过0.45μm滤膜，最终获得草药粗提物。
采用蜂毒收集器(Chungin tec，韩国)收集源自西方的蜜蜂的蜂毒，并除去杂质。通过液相色谱(AKTA explorer，Amersham Pharmacia Biotech美国)将得到的纯蜂毒与Sigma产品，蜂毒素、蜂毒明肽、磷脂酶，即标准蜂毒进行比较。
将0.1g上述蜂毒和10g上述草药粗提物加到烧杯中，添加生理盐水至100mL，搅拌混合，然后灭菌，最终得到100mL天然抗生素，其中包含0.1重量％的蜂毒和10％的草药粗提物。
实施例2-3
采用与实施例1相同的方法生产具有以下表1所示组成的天然抗生素。
实施例4-8
使用与实施例1相同的方法生产天然抗生素，除了实施例4中使用的草药粗提物来自金银花，实施例5中使用的草药粗提物来自鱼腥草，实施例6中使用的草药粗提物来自茵陈蒿，实施例7中使用的草药粗提物来自绿茶叶。在实施例8中，以相等的重量比混合金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶制备粗提物，用于生产具有以下表1所示组成的天然抗生素。
对比例1
使用与实施例1相同的方法生产天然抗生素，除了仅采用实施例1中获得的蜂毒和生理盐水，不使用草药粗提物，天然抗生素的组成如以下表1所示。
对比例2
使用与实施例1相同的方法生产天然抗生素，除了仅采用实施例1中获得的草药粗提物和生理盐水，不使用蜂毒，天然抗生素的组成如以下表1所示。
表1
| 类别 | 蜂毒(重量％) | 草药粗提物(重量％) | 生理盐水(重量％) |
| 实施例1 | 0.1 | 10 | 89.9 |
| 实施例2 | 0.01 | 20 | 79.9 |
| 实施例3 | 5 | 5 | 90 |
| 实施例4 | 0.1 | 10 | 89.9 |
| 实施例5 | 0.1 | 10 | 89.9 |
| 实施例6 | 0.1 | 10 | 89.9 |
| 实施例7 | 0.1 | 10 | 89.9 |
| 实施例8 | 0.1 | 10 | 89.9 |
| 对比例1 | 0.1 | - | 99.9 |
| 类别 | 蜂毒(重量％) | 草药粗提物(重量％) | 生理盐水(重量％) |
| 对比例2 | - | 10 | 90 |
测试例1：DPPH自由基清除活性DPPH自由基去除能力进行实验测试实施例1-8和对比例1-2制备的天然抗生素去除
DPPH(2，2-苯基-1-苦基肼基)自由基的DPPH自由基清除活性，结果如图1所示。
采用浓度为10％的实施例1中制备的天然抗生素进行DPPH抗氧化反应，维生素C用作阳性对照。采用以下公式1获得抗氧化能力。
公式1
抗氧化活性＝100-(A/B×100)
在上述公式中，A表示517nm处样品的光密度，而B表示517nm处空白的光密度。
抗菌活性测试
测试例2-1：采用从患有腹泻的猪分离的野生型菌株的抗菌活性测试
采用从患有腹泻的猪分离的野生型菌株测定实施例1中制备的天然抗生素的抗生素后效应(PAE)，方法为Pankuch和Appelbaum的方法(2006PANKUCH，G A；APPELBAUM，P C(2006)Postantibiotic effect ofceftobiprole against 12 Gram-positive organisms.Antimicrobial Agents andChemotherapy 50(11)：3956-3958.)。方法简述如下。
为了PAE测试，通过将过夜的TS琼脂平板在发酵液中悬浮生长制备接种物。在包含3ml含有整个BV或蜂毒素的发酵液的试管中接种，接种量为约5×106cfu/ml，仅含接种物的试管为对照，每个实验中都包括对照。通过在37℃下暴露于1、5和10倍于最小抑菌浓度(MIC)的整个BV或蜂毒素中达1个小时，诱导PAE。在暴露时间结束时，通过离心(8,500g；3分钟)收集培养物，用预先温热的水通过离心和再悬浮来清洗。将测试样品在预先温热的发酵液中稀释至1∶1,000，以除去整个BV和蜂毒素，然后在37℃下孵育18小时。在暴露前和稀释之后立刻测定活力数值。下表2显示了结果，其中显示了抗菌作用与PAE值相关。通过以下公式2获得PAE值。
公式2
PAE＝T-C
在以上公式中，T表示在用天然抗生素处理的测试组中培养至1log10所需的时间，C表示对照组中的该时间。
表2
*接种菌数：2.5±105CFU/mL
测试例2-2：采用从感染牛乳腺炎的原料奶分离的野生型菌株的抗菌活性测试
采用从感染牛乳腺炎的原料奶分离的野生型菌株测定实施例1中制备的天然抗生素的抗生素后效应(PAE)，方法采用测试例2-1中相同的方法，以下表3显示了结果。
表3
*接种菌数：2.5±105CFU/mL
测试例3：仔猪每日增重测试
将由8只健康母猪((Landrace×Yorkshire)×Duroc)生产的120只仔猪置于单个的笼子中(10只猪/笼)。提供的未处理的仔猪对照组未经蜂毒处理。实施例1-8和对比例1-2中制备的天然抗生素经生理盐水稀释后经自动注射给药(出生后第1天1mL抗生素，断奶时2mL)。
仔猪的饲养采用常规管理方法，包括接种疫苗、注射补铁，自由喂食和饮水。
在出生、断奶、饲养时测定仔猪的体重和食用饲料的量。表2中显示了体重和每天的增重率，表3显示了成活率，以下表4显示了饲料的效果和从出生到60天的饲料需要量。
采用K3-EDTA真空管(Vacutainer，BD，美国)从20天大的仔猪的颈静脉收集血液样品，采用自动血液分析仪(Hamat 8，SEAC，意大利)分析血液学数值，以下表5显示了结果。按照以下方法进行血清生化分析。采用血清真空管(Vacutainer，BD，美国)收集血液样品，在4℃下以2,000×g离心30分钟分离血清。采用自动生化分析仪(ADVIA1650，Byer，美国；Cobas Inetra，Roche，瑞士)在首尔医学科学院(Seoul Medical ScienceInstitute)对这样获得的血清进行生化分析。采用SAS的Duncan’s t检验(SAS企业指南3.0)对所有的数据进行方差分析(ANOVA)。
表4
| 类别 | 来治疗组 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 | 实施例8 | 对比例1 | 对比例2 |
| 所需的饲料率 | 2.08 | 1.72 | 1.85 | 1.74 | 1.93 | 1.98 | 1.86 | 1.93 | 1.88 | 1.93 | 1.92 |
| 饲料有效率 | 0.51 | 0.55 | 0.54 | 0.56 | 0.53 | 0.53 | 0.54 | 0.53 | 0.54 | 0.52 | 0.52 |
表5
| 类别 | 来治疗组 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 | 实施例8 | 对比例1 | 对比例2 |
| WBC，k/μL | 15.5 | 15.3 | 15.5 | 15.8 | 15.3 | 15.2 | 15.2 | 15.6 | 15.4 | 15.9 | 15.1 |
| 总蛋白质量(g/dL) | 6.79 | 7.02 | 7.03 | 7.11 | 7.01 | 6.98 | 6.89 | 6.88 | 7.01 | 7.06 | 6.85 |
| 白蛋白(g/dL) | 3.85 | 4.22 | 4.15 | 4.26 | 4.12 | 4.02 | 3.97 | 3.84 | 4.16 | 4.13 | 4.12 |
| IgG(mg/dL) | 322.8 | 332.8 | 328.2 | 334.1 | 325.8 | 332.1 | 325.8 | 324.9 | 329.8 | 325.5 | 324.5 |
测试例4：原料奶中体细胞数量的测试
为了研究天然抗生素对减少牛乳腺炎导致的体细胞数量的作用，将12mL实施例1-8和对比例1-2中制备的每种天然抗生素每天一次，连续5天注射给15头奶牛，这15头奶牛来自京畿道(Gyeonggi-do)的揚平(Yangpyeong)地区，其原料奶中的体细胞数量高于9.99×106/mL。分别在第一次注射后的第3天和第6天采集得到每头奶牛的体细胞数量。对照组(未治疗组)没有给予蜂毒。采用Somacount 150(Bentiey，美国)对原料奶中的体细胞数量进行检测，其中将原料奶无菌(asceptically)收集到灭菌的试管中储存，并转移至冷冻条件下。以下表6显示了结果。
表6
| 类别(单位：体细胞数量×102) | 来治疗组 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 | 实施例8 | 对比例1 | 对比例2 |
| 0天 | 999 | 999 | 999 | 999 | 999 | 999 | 999 | 999 | 999 | 999 | 999 |
| 3天 | 999 | 380 | 860 | 367 | 400 | 396 | 410 | 390 | 385 | 420 | 999 |
| 6天 | 999 | 286 | 600 | 355 | 320 | 305 | 325 | 330 | 290 | 355 | 980 |
如上文所示，本发明的天然抗生素具有足以替代传统抗生素的极佳效果，可以被用作饲料添加剂，并且可以通过将其与药学上可接受的载体、成形剂、稀释剂组合，制成粉剂、丸剂、胶囊、片剂和注射剂应用于其它领域，从而能够为改善公共健康提供无抗生素的奶制品、畜产品。
Claims (5)
1.一种天然抗生素，该抗生素包含作为活性成分的蜂毒和草药粗提物，该草药粗提物为选自金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶中至少一种的混合物的草药粗提物。
2.根据权利要求1所述的天然抗生素，其中所述抗生素包含0.01-5重量％的所述蜂毒，5-20重量％的所述草药粗提物以及75-95重量％的溶剂。
3.根据权利要求1或2所述的天然抗生素，其中所述草药粗提物包含重量比为1∶1.5-2.0∶1.0-2.0∶2.0-2.5的金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶。
4.一种生产天然抗生素的方法，该方法包括：
在100-120℃和1-1.2个大气压的水热条件下，通过回流干燥的粉碎的混合物产物获得提取物，该混合物包含选自金银花、鱼腥草、茵陈蒿和绿茶叶中的至少一种；
在减压条件下浓缩得到的提取物，然后过滤，得到草药粗提物；以及
将草药粗提物和蜂毒混合，随后灭菌。
5.一种包含权利要求1或2所述的天然抗生素的饲料添加剂。
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