CN101755054A - 在奶中产生外源蛋白的转基因哺乳动物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产对哺乳动物可能有毒的目标蛋白的非人转基因动物。该哺乳动物的特征在于以下事实：其是转基因的，用于在其奶中产生失活形式的目标蛋白，优选重组人胰岛素。不可能在转基因哺乳动物中产生重组人胰岛素，因为该分子在哺乳动物中具有一定程度的生物活性，并可能对哺乳动物是有毒的。因此，本发明涉及克隆遗传构建体，该遗传构建体包含编码修饰的人胰岛素前体的序列，该序列处于表达载体中的β酪蛋白启动子的控制下。本发明还包括将该表达质粒转染至胎牛体细胞，如成纤维细胞中，并通过核移植将牛卵母细胞去核来产生转基因胚胎。本发明产生了能够在其乳腺中产生修饰的人胰岛素前体的转基因牛。此后，可以收集这些转基因哺乳动物的奶，可以在体外将修饰的人胰岛素前体转化成重组的人胰岛素，并将重组的人胰岛素纯化至作为纯生物药品的同质性。

Description

在奶中产生外源蛋白的转基因哺乳动物
发明背景
在过去十年中已经由制药工业通过提取或通过重组技术来普遍地生产人保健中所涉及的蛋白因子和激素。涉及所需基因的遗传构建体在细菌、酵母或哺乳动物细胞系中成功地得到了表达。然而，使用哺乳动物细胞培养物来获得复杂蛋白质，如需要适当糖基化模式的那些，涉及高成本的方法。
在过去十年间已经日益增长地使用重组DNA技术来生产商业上重要的生物材料。为此，已经克隆了编码各种医学上重要的人蛋白质的DNA序列。这些包括胰岛素、纤溶酶原激活剂、α1-抗胰蛋白酶和凝固因子VIII和IX。目前，即使使用新兴的重组DNA技术，通常也从血液和组织中纯化这些蛋白质，这是昂贵而费时的方法，可能带有传播传感因子如导致AIDS和肝炎的那些的风险。
尽管在细菌中表达DNA序列来生产所需的医学上重要的蛋白质看起来是有吸引力的提议，但实际上细菌作为宿主常常证明是不能令人满意的，因为外源蛋白在细菌细胞中不稳定并且没有被正确地加工。
认识到这个问题，已经尝试了在哺乳动物组织培养物中表达所克隆的基因并已经在一些情况下证明了是可行的策略。然而，动物细胞的批量发酵是昂贵的且需要技术的过程。
因此存在对用于生产生物物质如正确修饰的真核多肽的高产率，低成本方法的需要。在这种方法中不存在对人具传染性的因子将是一个优势。
为了在奶中获得大量的人蛋白质，获得所需基因的转基因动物如牛的可能性已经引起了工业的极大兴趣。文献中的几个小组报道了他们生产人血清清蛋白、α抗胰蛋白酶的成功以及在转基因奶牛或山羊中的一些其它实例。
之前已经在小鼠或大鼠中进行了许多实验，将转基因表达限制于乳腺中往往是优选的，因为使用β酪蛋白或乳清蛋白启动子，其只响应哺乳期雌性中的乳腺转录因子。
专门在奶中表达异源蛋白意欲避免对宿主哺乳动物健康的不利影响并提供容易的纯化方法。
在细菌或细胞培养物中表达异源蛋白可能由于该重组蛋白对宿主哺乳动物的毒性作用而受到阻碍或阻止。在文献中可以找到许多实例，其中在特定的系统中不能表达某种蛋白，甚至是天然非毒性的蛋白，因为它对宿主是有害的，甚至引起宿主的死亡。死亡的原因可能是细胞内的高浓度蛋白，高浓度的分泌蛋白或与该蛋白的特异性相互作用和在外源宿主中引起细胞病变活性的一些细胞成分。
已经研发了几种方法来克服这些缺陷，以实现毒性蛋白的异源基因表达，包括使用融合蛋白，修饰原始蛋白序列，分开表达蛋白的不同多肽等。(参见，Protein Expression and Purification(蛋白表达和纯化)，2001年8月，22(3)：422-9)。
在转基因牛中表达重组蛋白时，可以产生相似的作用。在转基因哺乳动物的产生中，将细胞转染以获得携带目标外源基因的转基因克隆，然后将其用于产生转基因哺乳动物。该方法通常导致该目标序列插入到宿主基因组中，如果使用特异性的启动子，这是随后应当导致异源蛋白在靶组织或腺体中的事件，或如果使用通用启动子，将导致全身表达。蛋白表达的水平将取决于多种因素，包括基因组
Figure G2008800228561D00021
入发生的位置。
即使当通过组织特异性启动子指导基因表达时，使用几种蛋白，在许多不同哺乳动物物种中，已经观察到外源蛋白渗漏至外周循环系统中(参见Life Sciences，2006年1月25日；78(9)：1003-9，Epub2005年9月15日；和Journal of Biotechnology，2006年7月13日；124(2)：469-72，Epub 2006年5月23日)。根据表达的水平、渗漏的水平、异源蛋白的性质、物种(宿主和外源蛋白)之间的关系和异源蛋白与宿主受体相互作用的能力，这种渗漏可能具有相关的生物学后果。鉴于与宿主同源蛋白的相似性，这些通过转基因表达的蛋白中的一些可以对外源宿主发挥其天然的生物活性并可以引起能导致哺乳动物死亡的病理作用(参见，Endocrinology1997年7月；138(7)：2849-55)。此外，可能的是：异源蛋白不是通过与相应同源宿主受体的相互作用影响哺乳动物的健康，而是通过当一些异源蛋白在细菌中表达时发生的毒性、非特异性作用影响哺乳动物的健康。
本发明提供了通常与在转基因哺乳动物中表达对该哺乳动物具有毒性作用的蛋白相关的缺陷的创新性解决方法。
发明概述
本发明涉及非人哺乳动物，将其用于生产可能对哺乳动物具有毒性的目标蛋白。该哺乳动物的特征在于以下的事实：其是转基因的，用于在其奶中生产失活形式的目标蛋白。目标蛋白的失活形式是目标蛋白对表达目标蛋白的非人转基因哺乳动物是没有毒性的目标蛋白形式。如在此所用的，毒性意指引起严重的伤害或死亡。目标蛋白的失活形式可以在表达失活形式的目标蛋白的非人转基因哺乳动物中具有一些生物活性；然后，目标蛋白的失活形式对非人转基因哺乳动物是无毒的(即，哺乳动物没有死亡或没有遭受严重的伤害)。可以在体外激活失活形式的蛋白。这种失活蛋白，可能是蛋白的非天然物质，可以是，但不限于，重组修饰的人胰岛素前体。目标蛋白可以是，但不限于，重组人胰岛素。非人转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。
本发明进一步涉及提供用于在哺乳动物的乳房细胞中表达失活形式的目标蛋白的质粒，其中表达通过β酪蛋白启动子来调控。
本发明进一步涉及使用非人转基因哺乳动物生产对非人转基因哺乳动物可能有毒的目标蛋白的方法。通过将蛋白表达为失活蛋白来避免蛋白的潜在毒性。这种失活蛋白，可能是蛋白的非天然物质，可以是，但不限于，修饰的人胰岛素前体。目标蛋白可以是，但不限于，重组人胰岛素。非人转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。
本发明还涉及生产重组胰岛素的方法，包括制备非人转基因哺乳动物，该转基因动物在其奶中产生重组的修饰胰岛素前体，从非人转基因哺乳动物获得奶，从奶中纯化前体，将纯化的前体接受酶切割和转肽作用，以产生重组胰岛素，并将重组胰岛素纯化。重组胰岛素可以是，但不限于，重组人胰岛素。转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。
附图简述
图1显示了表达质粒pβmhuIP的略图，其含有编码修饰的人胰岛素前体(mhuIP)的基因序列和指导其表达至乳房细胞中的启动子。
图2显示了起始构建体的略图，其含有编码mhuIP的序列。
图3显示了表达质粒pNJK IP的略图，其含有编码修饰的人胰岛素前体(mhuIP)的基因序列，指导其表达至乳房细胞中的启动子和鸡β球蛋白绝缘子的编码序列的片段。
图4显示了表达质粒pβKLE IP的略图，其含有编码修饰的人胰岛素前体(mhuIP)的基因序列，指导其表达至乳房细胞中的启动子，牛α乳清蛋白基因的编码序列的大部分和肠激酶切割位点。
发明详述
本发明涉及用于生产对哺乳动物可能有毒的目标蛋白的非人哺乳动物。该哺乳动物的特征在于以下事实：其是转基因的，用于在其奶中生产失活形式的目标蛋白。术语失活蛋白指的是目标蛋白对表达目标蛋白的非人转基因哺乳动物为无毒的形式。在本发明进一步的实施方案中，术语失活蛋白指的是没有进一步翻译后修饰而缺乏生物活性的蛋白。失活蛋白的实例包括前体蛋白(即，前肽)，含有修饰(即，与天然蛋白相比时，氨基酸的取代、添加或缺失)的蛋白，该修饰使得蛋白质在生物上失活，而没有进一步加工，或修饰的前体蛋白(即，与天然前肽相比时含有氨基酸取代、添加或缺失的前肽)。换句话说，通过将蛋白表达为没有杀灭表达目标蛋白的非人转基因哺乳动物的失活蛋白来避免目标蛋白的潜在毒性。这种失活蛋白，可能是蛋白的非天然物质，可以是，但不限于，以下的前体、修饰前体或修饰形式：抗体、激素、生长因子、酶、凝血因子、阿朴脂蛋白、受体、药品、药物、生物药品、保健食品、致癌基因、肿瘤抗原、肿瘤抑制剂、细胞因子、病毒抗原、寄生虫抗原和细菌抗原。优选，失活蛋白是不会在表达修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物中引起低血糖的重组修饰的胰岛素前体。更优选，失活蛋白是重组修饰的胰岛素前体，最优选，是重组修饰的人胰岛素前体。目标蛋白可以是，但不限于，重组胰岛素，更优选，重组哺乳动物胰岛素，最优选，重组人胰岛素。该非人哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的其他物种可以是，但不限于，猪物种、绵羊物种、公山羊物种或啮齿动物物种。
胰岛素是负责控制体内葡萄糖的转运、利用和贮存的主要激素。胰腺的β细胞分泌胰岛素的单链前体，称为胰岛素原。胰岛素原由三个结构域组成：氨基端B链，羧基端A链和中间称为C肽的连接肽。胰岛素原的蛋白水解导致胰岛素原链中某些碱性氨基酸连同连接肽(C肽)的去除，以产生生物活性的多肽胰岛素。
在实施方案中，修饰蛋白为不是蛋白天然存在形式的蛋白质形式。在实施方案中，修饰的胰岛素前体含有氨基端B链和羧基端A链。然而，修饰的胰岛素前体含有修饰的C肽。在修饰的胰岛素前体中，编码在天然存在的胰岛素原中发现的连接C肽的氨基酸由未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸替代。在实施方案中，修饰的C肽含有以下三个氨基酸：Ala-Ala-Lys。此外，修饰的胰岛素前体可以含有修饰的B链。在实施方案中，修饰的B链含有天然存在的B链几乎所有的C-端氨基酸。
在进一步的实施方案中，修饰的胰岛素前体是由53个氨基酸组成的修饰人胰岛素前体，分子量约为6kD。修饰的人胰岛素前体含有具有天然存在B链氨基酸1-29的修饰B链和具有三个氨基酸Ala-Ala-Lys的修饰C肽。可以将修饰的人胰岛素前体接受酶切割和转肽作用，以产生人胰岛素，这对于糖尿病的治疗是必需的，并且其应用也是非常确定的。
本发明还涉及转基因的用于在其奶中生产重组修饰的人胰岛素前体的非人哺乳动物，其特征在于以下的事实：重组修饰的人胰岛素前体没有使哺乳动物不能生存。
本发明进一步涉及用于生产重组人胰岛素的牛物种的转基因哺乳动物。已知人胰岛素在牛中是有活性的。预期表达成熟形式的人胰岛素的牛可能呈现出与低血糖相关的症状，因为转基因蛋白可以渗漏至血流中。因此，表达重组人胰岛素的转基因牛可能是不能生存的。然而，本发明克服了这种缺陷，并使得可以在转基因哺乳动物中表达可能对转基因哺乳动物有毒的蛋白。本发明表达失活形式的目标蛋白。从转基因哺乳动物的奶中纯化失活蛋白，并在体外转化成蛋白的成熟(即，活性)形式。勿庸置疑地，哺乳动物，如牛，将其用作生产表达时对哺乳动物有害的治疗蛋白(例如，人胰岛素)的工具构成了出乎意料的和创新性的贡献。
本发明进一步涉及在其奶中产生重组修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物，其基因组包含整合的质粒，该质粒包含编码修饰的胰岛素前体的核酸，该核酸可操作地连接指导该序列在哺乳动物的乳房细胞中表达的启动子。非人哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的其他物种可以是，但不限于，猪物种、绵羊物种、公山羊物种或啮齿动物物种。修饰的胰岛素前体可以是修饰的哺乳动物胰岛素前体，更优选，修饰的人胰岛素前体，修饰的牛胰岛素前体，修饰的猪胰岛素前体，修饰的绵羊胰岛素前体，修饰的公山羊胰岛素前体，修饰的啮齿动物胰岛素前体，最优选，修饰的人胰岛素前体。启动子可以是β酪蛋白启动子。合适的β酪蛋白启动子包括，但不限于，牛β酪蛋白启动子或公山羊β酪蛋白启动子。其他β酪蛋白启动子包括，但不限于，猪β酪蛋白启动子，绵羊β酪蛋白启动子或啮齿动物β酪蛋白启动子。整合的质粒还可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，整合的质粒可以是pβmhuIP。整合的质粒还可以是pNJK IP或pβKLE IP。
本发明进一步涉及非人转基因哺乳动物，其中在哺乳动物的体细胞和生殖细胞中都发现了上述的整合质粒。
本发明进一步涉及在其奶中产生重组修饰的人胰岛素前体的牛物种的非人转基因哺乳动物，其基因组包含整合的质粒，该质粒包含编码修饰的人胰岛素前体的核酸和指导该序列在哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。合适的β酪蛋白启动子包括，但不限于，牛β酪蛋白启动子或公山羊β酪蛋白启动子。其他β酪蛋白启动子包括，但不限于，猪β酪蛋白启动子，绵羊β酪蛋白启动子或啮齿动物β酪蛋白启动子。整合的质粒还可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，整合的质粒可以是pβmhuIP。整合的质粒还可以是pNJKIP或pβKLE IP。
本发明还涉及包含编码修饰的胰岛素前体的核酸序列和抗性基因的质粒，该核酸序列可操作地连接β酪蛋白启动子，该抗性基因使得可以选择抗生素抗性细胞。合适的β酪蛋白启动子包括，但不限于，牛β酪蛋白启动子或公山羊β酪蛋白启动子。其他β酪蛋白启动子包括，但不限于，猪β酪蛋白启动子，绵羊β酪蛋白启动子或啮齿动物β酪蛋白启动子。在实施方案中，抗生素抗性基因是新霉素抗性基因，其使得可以选择遗传霉素抗性细胞。这样的质粒的实例是pβmhu IP，如图1中所示。这样的质粒的其他实例是pNJK IP，如图3
Figure G2008800228561D00071
和pβKLE IP，如图4中所示。
本发明进一步涉及包含编码修饰的胰岛素前体的核酸序列的质粒，其中修饰的胰岛素前体是修饰的哺乳动物胰岛素前体。修饰的哺乳动物胰岛素前体可以是修饰的人胰岛素前体，修饰的牛胰岛素前体，修饰的猪胰岛素前体，修饰的绵羊胰岛素前体，修饰的公山羊胰岛素前体或修饰的啮齿动物胰岛素前体。在实施方案中，修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人胰岛素前体。
本发明进一步涉及包含编码修饰的胰岛素前体的核酸序列的质粒，该修饰的胰岛素前体不会在表达修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物中引起低血糖。
本发明进一步涉及包含编码含有修饰C肽的修饰人胰岛素前体的核酸序列的质粒。在修饰的人胰岛素前体中，编码在天然存在的人胰岛素原中发现的连接C肽的氨基酸由未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸替代。在实施方案中，修饰的C肽含有以下三个氨基酸：Ala-Ala-Lys。此外，修饰的人胰岛素前体可以含有修饰的B链。在实施方案中，修饰的B链含有天然存在的B链的氨基酸1-29。
本发明进一步涉及包含编码修饰的胰岛素前体的核酸序列的质粒，其进一步包含一个或多个其他遗传元件，这些遗传元件将增强质粒稳定性，增强从质粒转录的mRNA的稳定性，降低修饰的胰岛素前体的降解和/或提高修饰的胰岛素前体的表达。合适的遗传元件包括，但不限于，调控元件(例如，启动子、增强子、绝缘子或转录终止位点)、不是胰岛素基因编码序列的片段或不是胰岛素基因的编码序列。在实施方案中，遗传元件是鸡β球蛋白绝缘子的编码序列的片段。这样的质粒的实例是pNJK IP，如图3中所示的。在其他实施方案中，遗传元件是牛α乳清蛋白基因的编码序列的片段。这样的质粒的实例是pβKLE IP，如图4中所示的。
依据布达佩斯条约的条款将质粒pβmhuIP、pNJK IP和pβKLE IP保藏。保藏的名称和地址是DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkul turen GmbH，Inhoffenstr.7B，D-3
Figure G2008800228561D00081
Braunschweig，德国。pβmhuIP在2008年4月4日保藏于DSMZ，并给予DSMZ保藏号DSM 21359。pNJK IP在2008年4月4日保藏于DSMZ，并给予DSMZ保藏号DSM 21360。pβKLE IP在2008年6月12日保藏于DSMZ。
本发明进一步涉及转染上述遗传构建体的方法。在实施方案中，通过将遗传构建体插入脂质体中并将脂质体接触哺乳动物细胞来将上述遗传构建体转染至哺乳动物细胞中。脂质体可以是阳离子脂质。
在合适的介质中新霉素抗性细胞的选择方法是本领域技术人员已知的。必需小心挑选这样的细胞，以便避免细胞损伤。
本发明还涉及将停止于G0或细胞周期不同时间的细胞核移植至
Figure G2008800228561D00091
核哺乳动物卵母细胞，最优选牛卵母细胞中的方法。
本发明涉及将转基因胚胎移植至激素刺激的哺乳动物子宫，最优选奶牛的子宫中的方法。
本发明进一步涉及制造非人转基因哺乳动物的方法，包括将编码失活目标蛋白的核酸序列克隆至质粒中，借此将该序列可操作地连接至指导该序列在乳房细胞中表达的启动子，形成表达质粒；用该表达质粒转染体细胞使得将质粒掺入到细胞的基因组中，形成转基因体细胞；将成熟卵母细胞去核，形成去核的卵母细胞；将一个转基因体细胞与去核的卵母细胞融合形成单细胞胚胎；将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中；并监视妊娠直到转基因哺乳动物的出生。目标失活蛋白可以是没有在哺乳动物中引起低血糖的修饰胰岛素前体。修饰的胰岛素前体优选是修饰的哺乳动物胰岛素前体，更优选，修饰的人胰岛素前体，修饰的牛胰岛素前体，修饰的猪胰岛素前体，修饰的绵羊胰岛素前体，修饰的公山羊胰岛素前体或修饰的啮齿动物胰岛素前体，并且最优选，修饰的人胰岛素前体。非人转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的其他物种可以是，但不限于，猪物种，绵羊物种，公山羊物种或啮齿动物物种。启动子可以是β酪蛋白启动子。合适的β酪蛋白启动子包括，但不限于，牛β酪蛋白启动子或公山羊β酪蛋白启动子。其他β酪蛋白启动子包括，
Figure G2008800228561D00092
限于，猪β酪蛋白启动子，绵羊β酪蛋白启动子或啮齿动物β酪蛋白启动子。质粒还可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，表达质粒可以是pβmhuIP。表达质粒还可以是pNJK IP或pβKLE IP。
本发明进一步涉及表达失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物的制备方法，该转基因哺乳动物包含编码含有修饰C肽的修饰胰岛素前体的核酸序列。在修饰的胰岛素前体中，编码在天然存在的胰岛素原中发现的连接C肽的氨基酸由未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸替代。在实施方案中，修饰的C肽含有以下三个氨基酸：Ala-Ala-Lys。此外，修饰的人胰岛素前体可以含有修饰的B链。在实施方案中，修饰的B链含有天然存在的B链的几乎所有C-端氨基酸
本发明进一步涉及表达失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物的制备方法，其中体细胞可以是成纤维细胞。此外，转基因体细胞可以分离自在其奶中表达失活形式目标蛋白的雌性转基因动物。转基因体细胞可以是成纤维细胞。
本发明进一步涉及表达失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物的制备方法，其中编码失活形式目标蛋白的核酸序列在哺乳动物的体细胞和生殖细胞中都有发现。
本发明进一步涉及在其奶中产生重组修饰人胰岛素前体的非人牛物种转基因哺乳动物的制备方法，其基因组包含整合的质粒，该质粒包含编码修饰人胰岛素前体的核酸序列和指导该序列在哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。合适的β酪蛋白启动子如上所述。整合的质粒可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，整合的实例可以是pβmhuIP。整合的质粒还可以是pNJK IP或pβKLEIP。
本发明进一步涉及生产失活形式的目标蛋白的方法，包括制备在其奶中产生失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物；从非人转基因哺乳动物获得奶；从奶中纯化失活蛋白；在体外转换目标蛋白的失活形式；和纯化目标蛋白，其中目标蛋白对非人转基因哺乳动物可能是有毒的。失活蛋白可以是，但不限于，以下的前体、修饰前体或形式：抗体、激素、生长因子、酶、凝血因子、阿朴脂蛋白、受体、药品、药物、生物药、营养补给品、致癌基因、肿瘤抗原、肿瘤抑制剂、细胞因子、病毒抗原、寄生虫抗原和细菌抗原。优选，失活蛋白可以是重组修饰的胰岛素前体，更优选，重组修饰的哺乳动物胰岛素，最优选，重组修饰的人胰岛素前体。非人哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的其他物种可以是，但不限于，猪物种、绵羊物种、公山羊物种或啮齿动物物种。
本发明还涉及在非人转基因哺乳动物中生产失活形式目标蛋白的方法，该转基因哺乳动物是通过以下方法制得的：该方法包括将编码失活形式目标蛋白的核酸序列克隆至质粒中，借此将该序列可操作地连接至指导该序列在乳房细胞中表达的启动子，形成表达质粒；用质粒转染体细胞，任选成纤维细胞，使得将质粒掺入到体细胞的基因组中，形成转基因体细胞；将成熟卵母细胞去核，形成去核的卵母细胞；将一个转基因体细胞与去核的卵母细胞融合形成单细胞胚胎；将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中；并监视妊娠直到转基因哺乳动物的出生。目标失活蛋白可以是没有在哺乳动物中引起低血糖的修饰胰岛素前体。修饰的胰岛素前体优选是修饰的哺乳动物胰岛素前体，更优选，修饰的人胰岛素前体，修饰的牛胰岛素前体，修饰的猪胰岛素前体，修饰的绵羊胰岛素前体，修饰的公山羊胰岛素前体或修饰的啮齿动物胰岛素前体，并且最优选，修饰的人胰岛素前体。非人转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的其他物种可以是，但不限于，猪物种，绵羊物种，公山羊物种或啮齿动物物种。启动子可以是β酪蛋白启动子。合适的β酪蛋白启动子如上所述。质粒还可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，表达质粒可以是pβmhuIP。质粒还可以包含一个或多个其他遗传元件，这些遗传元件将增强质粒稳定性，增强从质粒转录的mRNA的稳定性，降低修饰的胰岛素前体的降解和/或提高修饰的胰岛素前体的表达。合适的遗传元件包括，但不限于，调控元件(例如，启动子、增强子、绝缘子或转录终止位点)、不是目标蛋白基因编码序列的片段或不是目标蛋白基因的编码序列。表达质粒可以是pNJK IP或pβKLE IP。
在实施方案中，使用编码含有修饰C肽的修饰胰岛素前体的核酸序列来克隆表达失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物。在修饰的胰岛素前体中，编码在天然存在的胰岛素原中发现的连接C肽的氨基酸由未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸替代。在实施方案中，修饰的C肽含有以下三个氨基酸：Ala-Ala-Lys。此外，修饰的胰岛素前体可以含有修饰的B链。在实施方案中，修饰的B链含有天然存在B链的几乎所有的C-端氨基酸。
在进一步的实施方案中，通过其中体细胞是成纤维细胞的方法制得表达失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物。此外，转基因体细胞可以分离自在其奶中表达失活形式目标蛋白的雌性转基因动物。转基因体细胞可以是成纤维细胞。
在进一步的实施方案中，表达失活形式目标蛋白的核酸序列在表达失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物的体细胞和生殖细胞中都有发现。
本发明进一步涉及在其奶中产生重组修饰人胰岛素前体的非人转基因哺乳动物中生产失活形式人胰岛素的方法，其基因组包含整合的质粒，该质粒包含编码修饰的人胰岛素前体的核酸序列和指导该序列在哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。合适的β酪蛋白启动子如上所述。整合的质粒可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，整合质粒可以是pβmhuIP。整合质粒还可以包含一个或多个其他遗传元件，这些遗传元件将增强质粒稳定性，增强从质粒转录的mRNA的稳定性，降低修饰的胰岛素前体的降解和/或提高修饰的胰岛素前体的表达。合适的遗传元件包括，但不限于，调控元件(例如，启动子、增强子、绝缘子或转录终止位点)、不是胰岛素基因编码序列的片段或不是胰岛素基因的编码序列。整合质粒可以是pNJK IP或pβKLE IP。
此外，本发明涉及从在其奶中产生失活蛋白的转基因哺乳动物的奶中纯化失活形式目标蛋白的方法。纯化方法可以包括色谱和过
Figure G2008800228561D00121
骤。可以使用不同类型的色谱，并包括离子交换色谱或反相色谱。离子交换色谱可以是阳离子交换色谱。此外，可以进行多个色谱步骤。
本发明进一步涉及从在其奶中产生失活蛋白的非人转基因哺乳动物的奶中纯化失活形式目标蛋白的方法，包括从非人转基因哺乳动物获得奶，将非人转基因哺乳动物的奶澄清，获得澄清的奶，并使澄清的奶接受色谱，获得纯失活蛋白。色谱步骤可以包括离子交换色谱或反相色谱。反相色谱可以使用反相基质，如C4或C18反相基质。此外，可以进行多个色谱步骤。
本发明进一步涉及从在其奶中产生失活蛋白的非人转基因哺乳动物的奶中纯化失活形式目标蛋白的方法，包括从非人转基因哺乳动物获得奶，将非人转基因哺乳动物的奶澄清，获得澄清的奶，并使澄清的奶接受阳离子交换色谱，获得阳离子交换色谱处理过的材料，使阳离子交换色谱处理过的材料接受反相色谱，获得纯失活蛋白。
本发明的失活蛋白可以是重组的修饰胰岛素前体，优选，重组修饰的哺乳动物胰岛素前体，更优选，重组修饰的人胰岛素前体，重组修饰的牛胰岛素前体，重组修饰的猪胰岛素前体，重组修饰的绵羊胰岛素前体，重组修饰的公山羊胰岛素前体或重组修饰的啮齿动物胰岛素前体，并最优选，重组修饰的人胰岛素前体。此外，修饰的胰岛素前体没有在表达修饰胰岛素前体的非人转基因哺乳动物中引起低血糖。在修饰的胰岛素前体中，编码在天然存在的胰岛素原中发现的连接C肽的氨基酸由未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸替代。在实施方案中，修饰的C肽含有以下三个氨基酸：Ala-Ala-Lys。此外，修饰的胰岛素前体可以含有修饰的B链。在实施方案中，修饰的B链含有天然存在B链的几乎所有的C-端氨基酸。非人哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的其他物种可以是，但不限于，猪物种、绵羊物种、公山羊物种或啮齿动物物种。
本发明进一步涉及将失活形式的目标蛋白转化成成熟(即，活性)形式目标蛋白的方法，然后纯化目标蛋白。转化可以包括目标蛋白前体的酶切割。酶切割可以涉及胰蛋白酶水解(trypsinolysis)。目标蛋白的纯化可以包括色谱步骤。这些色谱步骤可以包括反相色谱。反相色谱可以使用反相基质，C4或C18反相基质。此外，可以进行多个色谱步骤。
本发明进一步涉及将重组修饰的胰岛素前体转化成重组胰岛素的方法，然后纯化重组胰岛素。转化可以包括重组修饰的胰岛素前体的酶切割和转肽作用。酶切割可以涉及胰蛋白酶水解。重组胰岛素的纯化可以包括色谱步骤。这些色谱步骤可以包括反相色谱或离子交换色谱。此外，可以进行多个色谱步骤。
本发明还涉及将重组修饰的胰岛素前体转化成重组胰岛素的方法，然后纯化重组胰岛素。该方法包括使重组修饰的胰岛素前体接受胰蛋白酶水解和转肽作用，形成胰蛋白酶水解和转肽的材料，使胰蛋白酶水解和转肽的材料接受第一个反相色谱，形成第一个反相色谱处理过的材料，使第一个反相色谱处理过的材料接受第二个反相色谱，形成第二个反相色谱处理过的材料，并使第二个反相色谱处理过的材料接受第三个反相色谱，形成纯的重组胰岛素。反相色谱的步骤包括使用反相基质，优选C4或C18反相基质。
重组胰岛素和重组修饰的胰岛素前体可以分别是，重组哺乳动物胰岛素和重组修饰的哺乳动物胰岛素前体，更优选，各自为重组人胰岛素和重组修饰的人胰岛素前体，重组牛胰岛素和重组修饰的牛胰岛素前体，重组猪胰岛素和重组修饰的猪胰岛素前体，重组绵羊胰岛素和重组修饰的绵羊胰岛素，重组公山羊胰岛素和重组修饰的公山羊胰岛素，或重组啮齿动物胰岛素和重组修饰的啮齿动物胰岛素前体，最优选，重组人胰岛素和重组修饰的人胰岛素前体。此外，修饰的胰岛素前体不会在表达修饰胰岛素前体的非人转基因哺乳动物中引起低血糖。在修饰的胰岛素前体中，编码在天然存在的胰岛素原中发现的连接C肽的氨基酸由未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸替代。在实施方案中，修饰的C肽含有以下三个氨基酸：Ala-Ala-Lys。此外，修饰的胰岛素前体可以含有修饰的B链。在实施方案中，修饰的B链含有天然存在B链的几乎所有的C-端氨基酸。
本发明进一步涉及生产目标蛋白的方法，包括制备在其奶中产生失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物，从非人转基因哺乳动物获得奶，从奶纯化失活蛋白，通过将纯化的失活蛋白接受酶切割在体外转化失活蛋白，并最终纯化目标蛋白。
本发明进一步涉及生产重组胰岛素的方法，包括制备在其奶中产生重组修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物，从非人转基因哺乳动物获得奶，从奶纯化重组修饰的胰岛素前体，通过使纯化的前体接受酶切割和转肽作用在体外将前体转化成重组胰岛素，并最终纯化重组胰岛素。
此外，本发明还涉及生产重组胰岛素的方法，包括制备在其奶中产生重组修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物，从非人转基因哺乳动物获得奶，将奶澄清，获得澄清的奶，使澄清的奶接受阳离子交换色谱，获得阳离子交换色谱处理过的材料，使阳离子交换色谱处理过的材料接受反相色谱，形成纯的重组修饰的胰岛素前体，使纯的重组修饰的胰岛素前体接受胰蛋白酶水解和转肽作用，获得胰蛋白酶水解和转肽的材料，使胰蛋白酶水解和转肽的材料接受第一个反相色谱，形成第一个反相色谱处理过的材料，使第一个反相色谱处理过的材料接受第二个反相色谱，形成第二个反相色谱处理过的材料，并使第二个反相色谱处理过的材料接受第三个反相色谱，形成纯的重组胰岛素。
重组胰岛素和重组修饰的胰岛素前体各自可以是，重组哺乳动物胰岛素和重组修饰的哺乳动物胰岛素前体，更优选，各自为重组人胰岛素和重组修饰的人胰岛素前体，重组牛胰岛素和重组修饰的牛胰岛素前体，重组猪胰岛素和重组修饰的猪胰岛素前体，重组绵羊胰岛素和重组修饰的绵羊胰岛素，重组公山羊胰岛素和重组修饰的公山羊胰岛素，或重组啮齿动物胰岛素和重组修饰的啮齿动物胰岛素前体，最优选，重组人胰岛素和重组修饰的人胰岛素前体。非人哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的其他物种可以是，但不限于，猪物种、绵羊物种、公山羊物种或啮齿动物物种。反相色谱的步骤包括使用反相基质，优选C4或C18反相基质。
以下实施例是本发明的各个方面和特征的说明，而非限制。
实施例1
表达质粒的构建
产生了构建体，其含有大部分的牛β酪蛋白基因启动子，包括5’非-编码β酪蛋白基因区的短片段，与修饰的人胰岛素前体的编码序列融合。短的非翻译片段是β酪蛋白基因的第一个外显子的片段。所用的β酪蛋白基因为约3.8kb。
通过将修饰的人胰岛素前体(mhuIP)的编码序列和大部分的牛β酪蛋白基因启动子基因(对应于来自β酪蛋白基因5’区的3,800bp)插入合适的载体中来进行表达质粒pβmhuIP的构建(参见图1)。该启动子确保基因在其控制下组织特异性地和发育调控地表达，在这种情况下为异源修饰的人胰岛素前体。
为了转基因细胞的正确选择，在质粒中包括编码新霉素磷酸转移酶的基因。该基因使得可以用抗生素遗传霉素来选择转基因细胞，并且其在SV40启动子的控制下。
其他构建体可以源自用来提高转染细胞选择或DNA整合至牛细胞基因组中的效率的原始构建体。
通过限制酶分析和DNA测序来分析构建体。之前通过荧光抗体识别在乳腺细胞系中测试了构建体表达mhuIP的能力。
以下详细地描述了质粒pβmhuIP的制备。
pβmhuIP的制备
形成起始构建，其包括编码mhuIP(含有修饰C肽的人胰岛素原)的序列。mhuIP与人胰岛素原相似，除了mhuIP中的C肽比天然存在的胰岛素原中发现的C肽短。
图2描绘了起始构建的略图。开始时，可以找到编码牛信号肽的区域，接着是编码胰岛素B链(缺乏C-端氨基酸)的序列。然后，可以找到编码三个氨基酸的间隔区的区域，Ala-Ala-Lys，其后是编码
Figure G2008800228561D00161
岛素全部A链的序列，最后是编码mRNA polyA的区域。三个氨基酸间隔区，Ala-Ala-Lys，替代天然存在的胰岛素原中发现的C肽。
通过从6个重叠重建mhuIP序列产生了起始构建，6个重叠是含有限制酶Bam HI和Not I的识别位点的化学合成的寡核苷酸。引物序列如下所示：
Ins1：
5′-ACTGGGATCCATGGCCCTGTGGACACGCCTGCGGCCCCTGCTGGCCCTGCTGGCGCTCTGGCCCCCCCCCCCGGCCCG-3′
Ins2：
5′-CTCCGCACACCAGGTACAGCGCCTCCACCAGGTGGGAGCCACACAGATGCTGGTTGACGAAGGCGCGGGCCGGGGGGGGG-3′
Ins3：
5′-ACCTGGTGTGCGGAGAGCGCGGCTTCTTCTACACGCCCAAGGCTGCTAAGGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAG-3′
Ins4：
5′-GTGTGGGGCTGCCTGCAGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTAGAGGGAGCAGATGCTGGTACAGCA-3′
Ins5：
5′-CAGGCAGCCCCACACCCGCCGCCTCCTGCACCGAGAGAGATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGCCCTGCTGTGCCGTCTGT-3′
Ins6：
5′-TGACGCGGCCGCAGCGTGGAGAGAGCTGGGAGGGGCTCACAACAGTGCCGGGAAG
TGGGGCTTGGCCCAGGGCCCCCAAGACACACAGCAGGCACAGCA-3′
通过PCR进行重建过程。从引物Ins1和Ins2(产物f12)、Ins3和Ins4(产物f34)以及Ins5和Ins6(产物f56)的混合物产生PCR产物。然后在单个混合物中使用f12和f34重叠片段来进行相同的过程，其获得了产物f14。最终，在含有f56的混合物中在PCR中使用f14产物，以扩增大约410bp的片段，其含有全长mhuIP(f16)。
一旦获得了片段f16，将其克隆至合适的载体中，并转化至感受态大肠杆菌细菌细胞中，用于进一步扩增带有其相应插入片段的克隆载体。载体源自pBKCMV。pBKCMV是获自Invitrogen Co.(Carlsbad，CA)的表达载体，其编码CMV启动子，新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。用3.8kb牛β酪蛋白启动子替代CMV启动子，并使用Bam HI和Not I限制位点将片段f16克隆至所得到的载体中。
扩增后，进行限制测试，以检查克隆的插入片段的同一性。通过测序获得最终的证实。
此后，在4kb的牛β酪蛋白启动子下游的质粒载体中定向插入起始构建体(Bam HI/Not I)。质粒载体还含有新霉素抗性基因。所得到的载体pβmhuIP，其是最终的构建体，含有β酪蛋白启动子，编码mhuIP的序列和新霉素抗性基因。
人胰岛素原由三个结构域组成：氨基末端B链(30个氨基酸)，羧基末端A链(21个氨基酸)和中间称为C肽的连接肽(31个氨基酸)。mhuIP不同于天然存在形式的人胰岛素原，因为B链的C-端氨基酸已经除去，并且编码C肽的氨基酸已经由通常未在C肽中发现的三个氨基酸Ala-Ala-Lys替代。在C肽切割后，形成了成熟的人胰岛素，其仅由A链和B链组成。表达人胰岛素原的转基因哺乳动物是无法生存的，因为宿主肽酶可以切割并除去C肽，形成成熟的胰岛素。如上所述，非人转基因哺乳动物中成熟人胰岛素的表达可能杀死哺乳动物，因为成熟的人胰岛素可能渗漏至哺乳动物的血流中。相反，使用pβmhuIP制得的非人转基因哺乳动物表达修饰的人胰岛素前体，其不会引起转基因哺乳动物产生任何明显的低血糖并且对转基因哺乳动物是无毒的。不希望受到以下的限制，因为编码修饰的人胰岛素前体的三个氨基酸间隔区的区域不同于天然存在的人胰岛素原中发现的C肽，宿主肽酶没有识别和切割三个氨基酸间隔区。因此，修饰的人胰岛素前体保持失活并且没有在转基因动物中引起低血糖，这是所要求保护的本发明的重要优点。
选择克隆，其含有β酪蛋白启动子和正确融合的mhuIP，以在该启动子控制下仅表达mhuIP。
该表达质粒的大小为约8.4kbp。
体细胞的转染
然后将质粒pβmhuIP用于转染体细胞的初级培养物，使用磷酸钙或脂质体方法。通常将胎牛成纤维细胞用于转染。
通过将遗传霉素加入培养物中来选择转染的细胞。2至8周的时间段后，对遗传霉素有抗性的细胞适于用作供体细胞来获得转基因克隆。通过PCR来分析转染的选择细胞，以证实细胞含有表达盒。
实施例2
卵母细胞去核和成熟去核卵母细胞中的中期核移植
牛卵母细胞的收集和体外成熟
从屠宰场卵巢中吸出牛卵母细胞并使之在TCM-199+5％FCS+3mMHEPES+杀真菌药中成熟。然后将选定的卵母细胞置于TCM-199+细胞周期蛋白依赖激酶中，在5％CO2的气氛和39℃下20小时。此后，将卵母细胞置于TCM-199+5％FCS+FSH(促卵泡激素)+抗生素中，在5％CO2的气氛和39℃下24小时。通过在含有1mg/ml牛睾丸透明质酸酶的PBS中涡旋2分钟来将成熟卵母细胞去核。
实施例3
使用卵丘细胞的核移植
去核
使用Narishige水压显微操作器和Nikon Diaphot显微镜将卵母细胞机械去核。用20μm斜角和尖锐的移液管进行去核。之前用5μg/ml Bisbenzimidine(Hoechst 333421)染料将卵母细胞染色20分钟。通过在紫外线下观察染色的染色体来将中期去核。在吸入移液管后，测定中期染色体。将转基因体细胞转染至卵周隙中，并与去核卵母细胞紧密相对。
融合、激活和胚胎培养
将转基因体细胞和去核的卵母细胞人工地排列在融合室中，使得待融合的膜与电极平行。使用玻璃胚胎操作移液管来进行。
使用持续15μs的180伏特/cm的一个电脉冲进行融合(BTXElectro细胞操作仪200)2并用BTX Optimizer-Graphic脉冲分析仪。用于脉冲胚胎的室由安放在玻璃显微镜载玻片上的相隔0.5mm的两个0.5mm不锈钢金属丝电极构成。融合后三小时，通过在TL-HEPES中与5μM离子要素一起培养4分钟和在TCM-199中用2mM 6-DMAP培养3小时来诱导激活。
然后在5％CO2+5％O2+90％N2的气氛下，在SOF培养基中将激活的卵母细胞培养6.5天，直到产生胚细胞。
此后，将胚胎移植至代孕母牛中。通常，每只受体奶牛非外科手术地移植两个胚细胞，并且在30-35天时通过超声波检查来确定妊娠。
使植入的奶牛正常地经过妊娠直到自然分娩。最后，外科方法(Caesarea)可以用于分娩。在头48小时期间给新生儿喂养富含Ig的初乳，然后使用合成的食物，之后使用天然的食物(所有这些食物都不含动物来源的化合物)。
                      
1Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA
2BTX Inc.，San Diego，Ca，USA
实施例4
对转基因小牛进行的测试
该实施例中，我们呈现了对特定的转基因小牛所进行测试的完整描述，该转基因小牛是作为实施例1至3中所述方法的结果而获得的。尽管如此，应当保持清楚的是对作为其它获得转基因小牛方法的
Figure G2008800228561D00201
而出生的牛可以进行同一套的测定，这些其他方法如转基因雌性的亚克隆、转基因雌性的超排卵，接着人工授精，或用来自对所需蛋白为转基因的公牛的精子将转基因或非转基因雌性人工授精。
通过对从小牛白细胞中纯化得到的DNA进行PCR反应，使用来自非转基因jersey小牛的DNA作为负对照，证明了在转基因小牛细胞的基因组中包括牛β酪蛋白启动子和编码修饰的人胰岛素前体的序列。可以作为不同于小牛的同源β酪蛋白基因的独特DNA片段一起发现它们。
使用Pharmacia自动测序仪，证实了插入的序列对应于克隆质粒中所含的编码修饰的人胰岛素前体的序列。插入的序列包括分泌信号和终止子。将控制修饰的人胰岛素前体序列在我们的小牛中表达的牛β酪蛋白启动子也进行了测序。所有那些元件与其预期的理论序列精确地一致，该理论序列来自用于转化产生了克隆的细胞的遗传构建体。
实施例5
从奶中纯化重组的mhuIP，将mhuIP转化成人胰岛素和人胰岛素的纯化
从转化的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的发酵获得为研发从奶中纯化前体的程序所需量的重组mhuIP蛋白。为此，在通过甲醇可诱导的启动子的控制下，将编码mhuIP的序列亚克隆至酵母分泌信号序列下游的表达载体中，并在酵母细胞中转化。
此后，进行合适克隆的选择并从选定的克隆制得液体培养物。
在含有作为碳源的甘油、少量元素的培养基中进行转化的酵母克隆的发酵。将甲醇用于诱导。该发酵获得0.5克mhuIP/升培养物。
一旦发酵结束，进行纯化步骤来获得纯产物。
最初的目标是从酵母培养物获得纯的重组mhuIP。因此，用纯水将转化的巴斯德毕赤酵母培养物的上清液稀释十倍，并使用冰醋酸将其pH调节至3.0。证实该溶液的传导率，使得其没有呈现高于7mS/cm的值。此后进行纯化过程，以获得用于研发从转基因哺乳动物的奶中纯化重组mhuIP的方法的起始材料，并进一步将其转化成重组人胰岛素。
首先，使上述溶液接受阳离子交换色谱步骤，使用SP SepharoseFF树脂(Amersham)，以100cm/h的流速。使用5％醋酸进行柱的装载(每mL树脂装载10mL上清液)和平衡。为了蛋白质的洗脱，使用pH 3的5％醋酸∶1M NaCl的梯度，在25个柱体积的总体积中，从100∶0的溶液比例开始，直到达到0∶100的溶液比例。
在第二个纯化步骤中，使来自阳离子交换色谱的洗出液接受反相色谱。用纯水将之前的洗出液稀释五倍，并用三氟醋酸(TFA)将pH调节至3。
将所得到的溶液装载至含有C4 Baker Wide Pore树脂的柱中。将流动设定为100cm/h的速率。为了装载和平衡，使用了0.1％的TFA/水。为了洗脱，使用0.1％TFA/水-乙腈梯度，在50个柱体积的总体积中，从100∶0的溶液比例开始，直到达到0∶100的溶液比例。
之前纯化步骤的总产率大约为42％，并获得了纯度高于95％的mhuIP。
研发了以下的方法，其包括从奶中纯化重组mhuIP(因为转基因哺乳动物将在其奶中分泌前体)，将重组mhuIP转化成重组人胰岛素和重组人胰岛素的最终纯化。通过将纯的重组mhuIP(获自巴斯德毕赤酵母，如上所述)与常规牛奶混合来获得用于该研发的起始材料。
研发了彻底的纯化方法。该方法包括以下步骤：通过切向过滤获得奶泡，稀释所获得的洗出液来获得最终保留在酪蛋白胶束中的重组mhuIP更好的溶解度(澄清)；并将该溶液通过阳离子交换色谱柱。使所得到的溶液接受反相色谱(C4)步骤，此后使富含重组mhuIP的级分接受胰蛋白酶水解和转肽作用。最后，进行重组人胰岛素的纯化，因为在制造生物药品时，将目标蛋白纯化至同质性以避免产品中可能污染物的存在是强制性的。
用于从奶中纯化重组mhuIP，之后转化成重组人胰岛素和重组人胰岛素最终纯化的程序包括以下次序的步骤：(a)切向流过
Figure G2008800228561D00221
清)，(b)阳离子交换色谱，(c)反相色谱(C4)，(d)胰蛋白酶分解和转肽作用，(e)反相色谱(C4)，(f)反相色谱(C4)和(g)反相色谱(C18)。
澄清
将鲜奶与足量的纯重组mhuIP混合，重组mhuIP如之前所述在巴斯德毕赤酵母中产生。此后，将产物接受切向流过滤步骤。滤器孔径大小为0.1μm，并且该方法产率为80％。
阳离子交换色谱
对从之前步骤得到的材料进行色谱处理，使用阳离子交换基质。用冰醋酸将待色谱的溶液的pH调节至3.0。检查传导率，使其不高于7mS/cm。
使用流速为100cm/h的SP Sepharose FF树脂(Amersham)进行色谱步骤。使用5％醋酸进行柱的装载和平衡。为了蛋白质的洗脱，使用pH 3的5％醋酸∶1M NaCl的梯度，在25个柱体积的总体积中，从100∶0的溶液比例开始，直到达到0∶100的溶液比例。
色谱步骤具有90％的产率。测定选定的含有重组mhuIP的级分的总蛋白(通过Bradford方法)和目标蛋白(通过Western印迹)，并贮存于2-8℃。
反相色谱(1)
然后使从之前步骤得到的材料接受反相色谱，使用C4 Baker WidePore树脂。将流动设定为100cm/h的速率。为了装载和平衡，使用了0.1％的TFA/水。为了洗脱，使用0.1％TFA/水-乙腈梯度，在50个柱体积的总体积中，从100∶0的溶液比例开始，直到达到0∶100的溶液比例。
该步骤具有68％的产率。
胰蛋白酶水解和转肽作用
用胰蛋白酶处理从之前步骤得到的材料。
为了胰蛋白酶水解，用胰蛋白酶(以200μM的浓度)在12℃下将10mM mhuIP溶液培养24小时。
一旦结束培养，进行转肽反应，以在人胰岛素B链的位置30添加苏氨酸。为此，制备含有0.8M Thr-Obu，50％DMF/EtOH(1∶1)，26％H2O，醋酸，10mM mhuIP和200μM胰蛋白酶的溶液，并使转肽反应进行直到完全。
一旦转肽步骤已经结束，使所得到的溶液接受三次连续的反相色谱步骤，以产生纯的重组人胰岛素。
反相色谱(2)
使从之前步骤得到的材料接受反相色谱。
首先，使用50mM NaH2PO4，pH 5.0将之前消化的材料稀释至0.125mg/mL。此后，加入50μL醋酸/100mL溶液。然后样品是清澈的，pH大约为4.5，并且样品是即可装载的。
缓冲液组成如下所述：
移动相A(MPA)：210mL硫酸盐缓冲液+790mL纯水(大约48mS的传导率)。
移动相B(MPB)：105mL硫酸盐缓冲液+40％乙腈，纯水q.s.p.至1L。
1L硫酸盐缓冲液含有132.1gr.NH4SO4，14mL H2SO4，并且将其pH调节至2.00。
装载后，如下以100cm/h的流速进行洗脱：首先，使用MPA-MPB梯度，在135mL的总体积中，从100∶0的溶液比例开始，直到达到55∶45的溶液比例；此后，使用另一个MPA-MPB梯度，在360mL的总体积中，从55∶45的溶液比例开始，直到达到25∶75的溶液比例；并且最后，使用最终的MPA-MPB梯度，在50mL的总体积中，从25∶75的溶液比例开始，直到达到0∶100的溶液比例。
所获得的级分含有纯度超过98％的重组人胰岛素，并且该步骤的产率大约为85％。
反相色谱(3)
对于该步骤，通过将其pH调节至7.4，对从之前步骤获得的材料进行调节。
然后使用C4Baker Wide Pore基质对所得到的溶液进行色谱。将流动设定为100cm/h的速率。为了装载和平衡，使用了0.1％的TFA/水。为了洗脱，使用0.1％TFA/水-乙腈梯度，在50个柱体积的总体积中，从100∶0的溶液比例开始，直到达到0∶100的溶液比例。
该步骤具有大约65％的产率。
反相色谱(4)
对于最终的反相色谱步骤，通过将其pH调节至3.0，对从之前步骤获得的材料进行调节。
然后使用C18反相基质对调节过的材料进行色谱。将流动设定为100cm/h的速率。为了装载和平衡，使用了0.1％的TFA/水。为了洗脱，使用0.1％TFA/水-乙腈梯度，在50个柱体积的总体积中，从100∶0的溶液比例开始，直到达到0∶100的溶液比例。
该步骤具有大约61％的产率。
实施例6
表达质粒pNJK IP的构建
产生了在转基因牛乳腺中中表达mhuIP的备选构建体，其含有大部分的公山羊β酪蛋白基因启动子，其与鸡β球蛋白绝缘子的编码序列的片段融合。绝缘子是保护启动子不受邻近调控元件影响的DNA序列元件，邻近的调控序列包括邻近的抑制基因表达的沉默序列。产生了这种含有鸡β球蛋白绝缘子的备选构建体，以阻断β酪蛋白启动子受任何邻近沉默序列的抑制。
进行了这种备选质粒的构建，首先，通过从pBC1(其是可从Invitrogen Co.(Carlsbad，CA)获得的商业载体)切除15kb片段，其含有：鸡β球蛋白绝缘子的2.4kb片段，3.1kb的公山羊β酪蛋白启动子序列，包括来自公山羊β酪蛋白基因的内含子和非翻译外显子，内含子和非翻译外显子之间的来自公山羊β酪蛋白基因的Xho I克隆位点，以及来自3’β酪蛋白基因组序列的poly A信号和侧翼区。
将该15kb片段克隆至pβmhuIP的主链中。首先，从pβmhuIP切除3.8kb牛β酪蛋白启动子和mhuIP片段。使用Sal I和Not I限制位点将15kb片段插入该载体中。然后，将410bp mhuIP f16片段克隆至位于15kb片段中的Xho I克隆位点(在来自公山羊β酪蛋白基因的内含子和非翻译外显子之间，如上所述)。
将所得到的载体(pNJK IP，图3)转化至感受态的大肠杆菌细菌细胞中，用于进一步扩增含有其对应插入片段的克隆载体。
扩增后，进行限制位点分析来检查mhuIP f16片段插入片段的方向。通过测序获得最终的证实。
实施例7
表达质粒pβKLEIP的构建
产生了在转基因牛乳腺中中表达mhuIP的备选构建体，其含有大部分的牛β酪蛋白基因启动子，包括β酪蛋白基因的第一个外显子的短的非翻译片段，其与大部分的牛α乳清蛋白基因的编码序列融合，接着为肠激酶切割位点，其接着为修饰的人胰岛素前体(mhuIP)的编码序列。该备选构建体表达α乳清蛋白-mhuIP融合蛋白。由于其较大的序列，该备选构建体应当产生具有较高稳定性的mRNA。此外，因为α乳清蛋白是在牛乳腺中天然表达的蛋白，该备选构建体应当最小化mhuIP降解和提高mhuIP表达。
为了产生该构建体，首先，使用来自牛外周血的白细胞的DNA作为模板来进行PCR反应，以克隆大部分的α乳清蛋白基因。PCR产物包含约700bp的α乳清蛋白直到第二个外显子结束，并包括α乳清蛋白信号序列。
第一个PCR反应使用了以下寡核苷酸：
NES：GGA GGT GAG CAG TGT GGT GAC
ALB：GAA GTT ACT CAC TGT CAC AGG AGA
然后，进行了第二个PCR反应，使用以下寡核苷酸
SIG：TCA CCA AAA TGA TGT CCT TTG TC
LAC：TGT CAC AGG AGA TGT TAC AGA
通过该程序，获得了620bp片段并使用Sma I限制位点克隆至pUC中(pUCα乳清蛋白)。
通过PCR从内部的IP克隆质粒获得带有mhuIP基因的片段，使用以下的寡核苷酸：
EKB：tag gct agc gat gat gat gat aaa ttc gtt aac cag cac ctg
CadAr：tca gcg gcc gc tta gtt gca gta gtt
所得到的260bp片段包括编码肠激酶识别位点的短序列，该肠激酶识别位点在mhuIP的编码序列的上游。肠激酶切割位点使得IP可以与剩余的肽分离。然后用NheI消化260bp片段并插入pUC α乳清蛋白中相当的Xba I限制位点。选择所得到的构建体，其中260bp片段位于构建体方向中的α乳清蛋白基因的下游。该构建体具有大部分的牛α乳清蛋白基因的编码序列，包括α乳清蛋白信号序列，接着是肠激酶识别位点，其进一步接着修饰的人胰岛素前体(mhuIP)的编码序列。
首先用EcoRI消化pUC α乳清蛋白质粒，并用Klenow处理所得到的粘性末端。此外，进行了NotI消化并分离所得到的基因片段。在位于所述启动子区域3′端的唯一BamH I位点中消化带有β酪蛋白启动子的pBK质粒，用于待连接的α乳清蛋白基因融合体。因此，还将BamHI位点钝化来连接来自该片段的EcoR I钝化端，在给插入片段的NotI端提供同源末端之前，还进行了pBK质粒的NotI消化。
然后将pβKLE IP转化至感受态大肠杆菌细菌细胞中，用于带有其对应插入片段的克隆载体的进一步扩增。
扩增后，通过测序获得最终的证实。
现在已经充分地描述了本发明，本领域普通技术人员将会理解可以在宽泛而等价范围的条件、制剂和其他参数内进行本发明，而不影响本发明或其任何实施方案的范围。在此引用的所有专利和出版物在此以其整体全部引入作为参考。

Claims (91)

1.生产胰岛素的方法，包括：
a)制备在其奶中产生修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物；
b)从非人转基因哺乳动物获得奶；
c)从奶中纯化修饰的胰岛素前体，得到纯的修饰的胰岛素前体；
d)将纯的修饰的胰岛素前体转化成胰岛素；和
e)纯化胰岛素。
2.权利要求1的方法，其中非人转基因哺乳动物通过包括以下步骤的方法制得：
a)将编码修饰的胰岛素前体的核酸序列克隆至质粒中，由此将该序列可操作地连接到将指导该序列在乳房细胞中表达的启动子上，得到表达质粒；
b)用表达质粒转染体细胞，使得质粒掺入到体细胞的基因组中，得到转基因体细胞；
c)将成熟的卵母细胞去核，得到去核的卵母细胞；
d)将一个转基因体细胞与去核的卵母细胞融合，得到单细胞胚胎；
e)将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中；和
f)监控怀孕直到转基因哺乳动物的出生。
3.权利要求2的方法，其中启动子是β酪蛋白启动子，并且其中修饰的胰岛素前体是修饰的哺乳动物胰岛素前体。
4.权利要求3的方法，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人胰岛素前体、修饰的牛胰岛素前体、修饰的猪胰岛素前体、修饰的绵羊胰岛素前体、修饰的公山羊胰岛素前体或修饰的啮齿动物胰岛素前体。
5.权利要求4的方法，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人胰岛素前体。
6.权利要求5的方法，其中表达质粒进一步包含新霉素抗性基因。
7.权利要求6的方法，其中表达质粒是p βmhuIP。
8.权利要求6的方法，其中表达质粒是pNJK IP。
9.权利要求6的方法，其中表达质粒是pβKLE IP。
10.权利要求2的方法，其中哺乳动物是在其奶中产生修饰的人胰岛素前体的牛，其基因组包含整合的质粒，其中该质粒包含编码修饰的人胰岛素前体的序列和指导该序列在哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。
11.权利要求10的方法，其中质粒进一步包含新霉素抗性基因。
12.权利要求11的方法，其中质粒是pβmhu IP。
13.权利要求11的方法，其中质粒是pNJK IP。
14.权利要求2的方法，其中哺乳动物是在其奶中产生融合蛋白的牛，该融合蛋白包含α乳清蛋白的片段、肠激酶切割位点和修饰的人胰岛素前体，该牛的基因组包含整合的质粒，其中该质粒包含编码融合蛋白的序列和指导该序列在哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。
15.权利要求14的方法，其中质粒进一步包含新霉素抗性基因。
16.权利要求15的方法，其中质粒是pβKLE IP。
17.权利要求2的方法，其中体细胞是成纤维细胞。
18.权利要求2的方法，其中通过从用于在其奶中生产修饰的胰岛素前体的雌性转基因动物分离来获得转基因体细胞。
19.权利要求18的方法，其中转基因体细胞是成纤维细胞。
20.权利要求1、2或18的方法，其中哺乳动物属于牛物种、猪物种、绵羊物种、公山羊物种或啮齿动物物种。
21.权利要求20的方法，其中哺乳动物属于牛物种。
22.权利要求1、2或18的方法，其中胰岛素和修饰的胰岛素前体分别为哺乳动物胰岛素和修饰的哺乳动物胰岛素前体。
23.权利要求22的方法，其中哺乳动物胰岛素和修饰的哺乳动物胰岛素前体各自为人胰岛素和修饰的人胰岛素前体、牛胰岛素和修饰的牛胰岛素前体、猪胰岛素和修饰的猪胰岛素前体、绵羊胰岛素和修饰的绵羊胰岛素前体、公山羊胰岛素和修饰的公山羊胰岛素前体、或啮齿动物胰岛素和修饰的啮齿动物胰岛素前体。
24.权利要求23的方法，其中哺乳动物胰岛素和修饰的哺乳动物胰岛素前体各自为人胰岛素和修饰的人胰岛素前体。
25.权利要求1、2或18的方法，其中修饰的胰岛素前体不会在非人转基因动物中引起低血糖。
26.权利要求25的方法，其中修饰的胰岛素前体包含修饰的C肽。
27.权利要求26的方法，其中修饰的C肽包含通常未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸。
28.权利要求27的方法，其中修饰的C肽包含以下三个氨基酸：Ala-Ala-Lys。
29.权利要求26的方法，其中修饰的胰岛素前体进一步包含修饰的B链。
30.权利要求29的方法，其中修饰的B链包含天然存在B链的几乎所有C-末端氨基酸。
31.权利要求1、2或18的方法，其中在哺乳动物的体细胞和生殖细胞中都发现了编码修饰的胰岛素前体的序列，其可操作地指导该核酸序列在乳房细胞中表达的启动子上。
32.从在其奶中产生修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物的奶中纯化修饰的胰岛素前体的方法，包括：
a)将非人转基因哺乳动物的奶澄清，得到澄清的奶；和
b)将澄清的奶进行色谱处理，得到纯的修饰的胰岛素前体。
33.权利要求32的方法，其中色谱是离子交换色谱或反相色谱。
34.权利要求33的方法，其中进行多个色谱步骤。
35.权利要求33的方法，其中离子交换色谱是阳离子交换色谱。
36.从在其奶中产生修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物的奶中纯化修饰的胰岛素前体的方法，包括：
a)将非人转基因哺乳动物的奶澄清，得到澄清的奶；
b)使澄清的奶接受阳离子交换色谱，得到阳离子交换色谱处理过的材料；和
c)使阳离子交换色谱处理过的材料接受反相色谱，得到纯的修饰的胰岛素前体。
37.权利要求32或36的方法，其中修饰的胰岛素前体是修饰的哺乳动物胰岛素前体。
38.权利要求37的方法，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人胰岛素前体、修饰的牛胰岛素前体、修饰的猪胰岛素前体、修饰的绵羊胰岛素前体，修饰的公山羊胰岛素前体或修饰的啮齿动物胰岛素前体。
39.权利要求38的方法，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人胰岛素前体。
40.权利要求32或36的方法，其中非人转基因哺乳动物属于牛物种。
41.权利要求32或36的方法，其中非人转基因哺乳动物是猪、绵羊、山羊或啮齿动物。
42.权利要求32或36的方法，其中修饰的胰岛素前体不会在非人转基因动物中引起低血糖。
43.权利要求42的方法，其中修饰的胰岛素前体包括修饰的C肽。
44.权利要求43的方法，其中修饰的C肽包含通常未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸。
45.权利要求44的方法，其中修饰的C肽包含以下三个氨基酸：Ala-Ala-Lys。
46.权利要求43的方法，其中修饰的胰岛素前体进一步包含修饰的B链。
47.权利要求46的方法，其中修饰的B链包含天然存在B链的几乎所有C-末端氨基酸。
48.将修饰的胰岛素前体转化成胰岛素，并纯化胰岛素的方法，包括：
a)对修饰的胰岛素前体进行酶切割和转肽作用，得到切割的和转肽的材料，
b)使切割的和转肽的材料接受色谱处理，得到纯的胰岛素。
49.权利要求48的方法，其中酶切割是胰蛋白酶水解。
50.权利要求48的方法，其中色谱是反相色谱。
51.权利要求50的方法，其中进行多个色谱步骤。
52.权利要求51的方法，其中进行三个色谱步骤。
53.权利要求52的方法，其中色谱步骤包括使用反相基质。
54.权利要求53的方法，其中反相基质是C4或C18反相基质。
55.将修饰的胰岛素前体转化成胰岛素，并纯化胰岛素的方法，包括：
a)对修饰的胰岛素前体进行胰蛋白酶水解和转肽作用，得到胰蛋白酶水解和转肽的材料；
b)使胰蛋白酶水解和转肽的材料接受第一个反相色谱，得到第一个反相色谱处理过的材料；
c)使第一个反相色谱处理过的材料接受第二个反相色谱，得到第二个反相色谱处理过的材料；和
d)使第二个反相色谱处理过的材料接受第三个反相色谱，得到纯的胰岛素。
56.权利要求55的方法，其中反相色谱步骤包括使用反相基质。
57.权利要求56的方法，其中反相色谱基质是C4或C18反相基质。
58.权利要求48或55的方法，其中胰岛素和修饰的胰岛素前体分别为哺乳动物胰岛素和修饰的哺乳动物胰岛素前体。
59.权利要求58的方法，其中哺乳动物胰岛素和修饰的哺乳动物胰岛素前体各自为人胰岛素和修饰的人胰岛素前体、牛胰岛素和修饰的牛胰岛素前体、猪胰岛素和修饰的猪胰岛素前体、绵羊胰岛素和修饰的绵羊胰岛素前体、公山羊胰岛素和修饰的公山羊胰岛素前体、或啮齿动物胰岛素和修饰的啮齿动物胰岛素前体。
60.权利要求59的方法，其中哺乳动物胰岛素和修饰的哺乳动物胰岛素前体分别为人胰岛素和修饰的人胰岛素前体。
61.权利要求48或55的方法，其中修饰的胰岛素前体不会在非人转基因动物中引起低血糖。
62.权利要求61的方法，其中修饰的胰岛素前体包括修饰的C肽。
63.权利要求62的方法，其中修饰的C肽包含通常未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸。
64.权利要求63的方法，其中修饰的C肽包含以下三个氨基酸：Ala-Ala-Lys。
65.权利要求62的方法，其中修饰的胰岛素前体进一步包含修饰的B链。
66.权利要求65的方法，其中修饰的B链包含天然存在B链的几乎所有C-末端氨基酸。
67.权利要求1的方法，其中从奶中纯化修饰的胰岛素前体包括：
a)将非人转基因哺乳动物的奶澄清，得到澄清的奶；和
b)使澄清的奶接受色谱处理，得到纯的修饰的胰岛素前体。
68.权利要求67的方法，其中色谱是离子交换色谱或反相色谱。
69.权利要求68的方法，其中进行多个色谱步骤。
70.权利要求68的方法，其中离子交换色谱是阳离子交换色谱。
71.权利要求1的方法，其中修饰的胰岛素前体转化成胰岛素，包括：
a)使修饰的胰岛素前体接受酶切割和转肽作用，得到切割和转肽的材料；
b)使切割和转肽的材料接受色谱处理，得到纯的胰岛素。
72.权利要求71的方法，其中酶切割是胰蛋白酶水解。
73.权利要求71的方法，其中色谱是反相色谱。
74.权利要求73的方法，其中进行多个色谱步骤。
75.权利要求74的方法，其中进行三个色谱步骤。
76.权利要求75的方法，其中色谱步骤包括使用反相基质。
77.权利要求76的方法，其中反相基质是C4或C18反相基质。
78.生产胰岛素的方法，包括：
a)制备在其奶中产生修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物；
b)从非人转基因哺乳动物获得奶；
c)将奶澄清，得到澄清的奶；
d)使澄清的奶接受阳离子交换色谱，得到阳离子交换色谱处理过的材料；
e)使阳离子交换色谱处理过的材料接受反相色谱，得到纯的修饰的胰岛素前体；
f)使纯的修饰的胰岛素前体接受胰蛋白酶水解和转肽作用，得到胰蛋白酶水解和转肽的材料；
g)使胰蛋白酶水解和转肽的材料接受第一个反相色谱，得到第一个反相色谱处理过的材料；
h)使第一个反相色谱处理过的材料接受第二个反相色谱，得到第二个反相色谱处理过的材料；和
i)使第二个反相色谱处理过的材料接受第三个反相色谱，得到纯的胰岛素。
79.权利要求78的方法，其中反相色谱步骤包括使用反相基质。
80.权利要求79的方法，其中反相基质是C4或C18反相基质。
81.权利要求78的方法，其中胰岛素和修饰的胰岛素前体分别为哺乳动物胰岛素和修饰的哺乳动物胰岛素前体。
82.权利要求81的方法，其中哺乳动物胰岛素和修饰的哺乳动物胰岛素前体各自为人胰岛素和修饰的人胰岛素前体、牛胰岛素和修饰的牛胰岛素前体、猪胰岛素和修饰的猪胰岛素前体、绵羊胰岛素和修饰的绵羊胰岛素前体、公山羊胰岛素和修饰的公山羊胰岛素节体或啮齿动物胰岛素和修饰的啮齿动物胰岛素前体。
83.权利要求82的方法，其中哺乳动物胰岛素和修饰的哺乳动物胰岛素前体各自为人胰岛素和修饰的人胰岛素前体。
84.权利要求78的方法，其中非人转基因哺乳动物属于牛物种。
85.权利要求78的方法，其中非人转基因哺乳动物是猪、绵羊、山羊或啮齿动物。
86.权利要求78的方法，其中修饰的胰岛素前体不会在非人转基因动物中引起低血糖。
87.权利要求86的方法，其中修饰的胰岛素前体包含修饰的C肽。
88.权利要求87的方法，其中修饰的C肽包含通常未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸。
89.权利要求88的方法，其中修饰的C肽包含以下三个氨基酸：Ala-Ala-Lys。
90.权利要求87的方法，其中修饰的胰岛素前体进一步包含修饰的B链。
91.权利要求90的方法，其中修饰的B链包含天然存在B链的几乎所有C-末端氨基酸。
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