CN101744795A - 一种治疗鲜红斑痣的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗鲜红斑痣的药物组合物及其制备方法，其中金丝桃素的提取纯化通过步骤：a)粗提；b)大孔树脂精制；c)分离纯化得到，然后将得到的金丝桃素，以一定比例与药用载体混合制备所述药物组合物，本发明的药物组合物具有下述特点：轻度型、重度型病变均有效，疗效较高、暗毒性及毒副作用较低、安全度大，且与光动力的协同作用较强，无需做过敏实验，即可实现对鲜红斑痣的标本兼治。

Description

一种治疗鲜红斑痣的药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种药物及其制备方法，具体地讲涉及一种治疗皮肤病的药物组合物及其制备方法。

背景技术

鲜红斑痣(Port wine Stains，PWS)是一种不易自然消退的先天性真皮浅层毛细血管畸形，多发于儿童[林晓曦，王炜，祁佐良，等.葡萄酒色斑增生机制的研究[J].实用美容整形外科杂志，2000，11(3)：127-129.]。目前，鲜红斑痣的治疗手段主要有手术治疗、脉冲激光和光动力学疗法，其中手术治疗因其术后容易产生感染、瘢痕、损毁性皮肤改变及疱疹[周展超.鲜红斑痣的治疗进展[J].国际皮肤性病学杂志.2008，34(3)：149-151.]，而脉冲激光和光动力学疗法往往结合血卟啉、癌光啉等光敏剂治疗鲜红斑痣皮肤病。

但是，现阶段所使用的光敏剂，由于其对病变血管网的破坏作用存在限度，且仅对轻度型鲜红斑痣色素的消退有明显改善作用，对治疗重度型鲜红斑痣往往效果甚微，因此要取得一定效果则需要增加患者的治疗次数，给患者带来经济及身心上的多重负担；另外，现阶段在治疗鲜红斑痣皮肤病中往往会出现一定程度的光敏反应；使得治疗存在暗毒性较高，安全度低的缺陷。

发明内容

本申请人经过多年努力，发现了一种用于治疗鲜红斑痣的新型光敏剂；本发明的目的在于针对现有技术存在的上述缺陷，提供一种新型光敏剂药物组合物-该药物组合物对轻度型、重度型病变均有效，疗效较高、暗毒性及毒副作用较低、安全度大，且与光动力的协同作用较强，无需做过敏实验，即可实现对鲜红斑痣的标本兼治。

本发明的另一个目的在于提供该药物组合物的制备方法。

本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物，包括按重量份计的1～100份金丝桃素和药用载体。

本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物，包括按重量份计的1～100份金丝桃素和10～10000份药用载体。

本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物，包括按重量份计的50～99份金丝桃素和40～9000份药用载体。

本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物，包括按重量份计的20～80份金丝桃素和250～350份药用载体。

本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物，包括按重量份计的60～90份金丝桃素和200～300份药用载体。

其中，药用载体为从稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、乳化剂、防腐剂、增溶剂、溶剂和基质中选出的任意一种或几种化合物。

所述稀释剂为：淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、甘露醇和山梨醇；

所述润湿剂为：蒸馏水、乙醇、丙二醇和丙三醇；

所述黏合剂为：羧甲基纤维素、海藻酸钠、琼脂、阿拉伯胶、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、卡波姆、聚维酮、明胶和聚乙二醇；

所述崩解剂为：干淀粉、羧甲淀粉钠和交联聚维酮；

所述润滑剂为：硬脂酸钠、硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉和聚乙二醇；

所述乳化剂为：硬脂酸甘油酯、羊毛脂、甘油脂肪酸酯、卵磷脂、泊洛沙姆、聚山梨酯和脂肪酸山梨坦、硬脂酸、十二烷基硫酸钠和甘油；

所述防腐剂为：羟苯乙酯、硫柳汞、苯甲醇、三氯叔丁醇和尼泊金；

所述增溶剂为：吐温；

所述溶剂为：乙醇和蒸馏水；

所述基质为：甘油、凡士林、液体石蜡、聚乙二醇，硬脂酸、单硬脂酸甘油酯和氢化植物油。

本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)、金丝桃素的提取及纯化

a)、粗提

以(贯叶连翘粉)∶V(浓度为60％～100％的乙醇)为1∶20～40的比例将二者混合，超声处理15～25分钟，于70℃～90℃下回流1.5～2.5小时过滤，保留滤液；同样条件，用乙醇将其滤渣再提取2～4次，合并滤液，浓缩干燥，即得金丝桃素浸膏。

b)、大孔树脂提纯

将步骤a)所得浸膏与浓度为15％～35％的乙醇混合，超声处理15～30分钟溶解，过滤，调至浓度为5～7mg/mL，将大孔吸附树脂与此药液按质量比为1～2∶1的比例混合，用大孔吸附树脂分离提纯，控制吸附流速1.5～2.5床体积/小时，控制树脂柱径高比为1∶5～7，水洗3～5倍树脂体积，水洗速度为0.5～3床体积/小时；再换以流量为4～6床体积浓度为50％～70％的乙醇洗脱，洗脱速度为1～3床体积/小时，收集洗液，浓缩干燥得金丝桃素粗品；

c)、分离纯化

用200～300目细硅胶装柱，硅胶柱质量为金丝桃素粗品的10～50倍，干法上样按氯仿与甲醇的体积比为90～95∶1的比例洗脱，TLC跟踪流出液，收集金丝桃素为单点的流份；所得流份于60～75℃、0.08～0.10MPa真空度条件下，浓缩3～4.5h烘干，烘干后用150～250mL丙酮溶解过滤，滤液过硅胶柱，将收集的流出液浓缩干燥后得金丝桃素纯品；

(2)、药物组合物的制备

于金丝桃素中，加入至少一种所述药用载体制成医药上可接受的剂型。

本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物的制备方法，优选下述步骤：

a)、粗提

以M(贯叶连翘粉)∶V(浓度为60％的乙醇)为1∶30的比例将二者混合，超声处理20分钟，80℃回流2小时，过滤，保留滤液；同样条件下，用乙醇将所得滤渣再提取3次，合并滤液，浓缩干燥，即得金丝桃素浸膏。

b)、大孔树脂精制

将步骤a)所得浸膏与浓度为30％的乙醇混合，超声处理20分钟溶解，过滤，调至浓度为6mg/mL，以大孔吸附树脂与药液的体积比为2∶1的比例混合，通过S898型大孔吸附树脂分离提纯，控制吸附流速为2.0床体积/小时，控制树脂柱径高比为1∶5，用3倍树脂体积水洗，水洗速度为3床体积/小时；再换以流量为5床体积浓度为50％的乙醇洗脱，洗脱速度为2床体积/小时，收集洗液，浓缩干燥得金丝桃素粗品。

c)、分离纯化

用300目细硅胶装柱，硅胶柱质量为金丝桃素粗品的40倍，干法上样，以氯仿与甲醇的体积比为95∶1的比例洗脱，TLC跟踪流出液，收集金丝桃素为单点的流份；所得流份于60℃、0.08MPa真空度条件下，浓缩3.5h烘干，烘干后用200mL丙酮溶解过滤，滤液过硅胶柱，将收集的流出液浓缩干燥后得金丝桃素纯品。

2)、药物组合物的制备

于金丝桃素纯品中，加入至少一种所述药用载体制成医药上可接受的剂型。

除另有说明外，本申请所说份为重量份计。

另外，本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物，其中组合物中所添加的金丝桃素纯度要求在90％以上；药用载体除上述列举的外，也可选择医药上其他常规药用载体。

本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物，可以将药物组合物与任意选自同金丝桃素有相同活性的药物、光敏剂、血管损伤类药物和线粒体损伤药物混合使用。

上述组分及制备方法是通过大量实验确定的，而且采用上述组分及制备方法使得本发明制备的药物组合物疗效较高、暗毒性及毒副作用较低，与光动力疗法的协同作用较强，无需做过敏试验，即可实现对鲜红斑痣皮肤疾病标本兼治。

与现有技术相比，本发明的药物组合物具有以下有益效果：

1、本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物，对轻度型及重度型病变均有效，疗效显著且毒副作用低，可很好的与光动力疗法结合用于鲜红斑痣皮肤病的治疗，实现对鲜红斑痣标本兼治；

2、本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物制备方法简单，可以制成多种形式的药物产品，方便患者使用；

3、本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物可以减少患者治疗次数，从而在很大程度上减轻患者的身心负担及经济负担；

4、本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物，可以很好地结合电穿孔技术对患者给药，药物的透过率可提高20倍，而且无明显皮肤损伤；

5、本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物，光敏剂在体内代谢快，避光时间短，安全度大；

6、本发明的一种治疗鲜红斑痣的药物组合物，无过敏反应，不需要做过敏试验，且暗毒性低。

附图说明

图1是：正常及PDT后鸡冠的外观变化：

a、激光对照组；b、给药HY1mg/kg后立即光照；c、HY0.3mg/kg组光照后1d；

d、HY0.3mg/kg组光照后7d；e、HY0.3mg/kg组14d；f、HY1mg/kg组光照后1d；

g、HY1mg/kg组光照后7d；h、HY1mg/kg组光照后14d；i、HY3mg/kg组光照后1d；

j、HY3mg/kg组光照后7d；k、HY3mg/kg组光照后14d；l、血卟啉阳性对照组光照后1d；

m、血卟啉阳性对照组光照后7d；n、血卟啉阳性对照组光照后14d。

图2是：正常及PDT后鸡冠HE组织病理变化(HE×400)：

A、正常鸡冠(HE×400)；B、单纯激光照射鸡冠(HE×400)；C、HY(1mg/kg)-PDT组光照后7d后(HE×400)；D、HY(3mg/kg)-PDT组光照后7d后(HE×400)；E、血卟啉阳性对照组7d后(HE×400)；F、HY(1mg/kg)-PDT组光照后14d(HE×400)；G、HY(3mg/kg)-PDT组光照后14d(HE×400)；H、血卟啉阳性对照组14d后(HE×400)；

图3是：试验1中检测金丝桃素与提取物中其他成份分离的HPLC色谱图。

具体实施方式

以下通过试验例来进一步阐述本发明提供的药物的有益效果，这些试验例包括了本发明药物的药学试验和临床疗效观察试验。

[试验1]金丝桃素的提取及纯化

1.1、粗提

I、将贯叶连翘粉碎过筛，以以V(浓度为100％的乙醇)∶M(贯叶连翘粉)为20∶1将二者混合，超声处理20min，控制温度为70℃，回流2h后过滤，保留滤液；同样条件下，将滤渣用乙醇重复提取2次，合并滤液，浓缩、干燥，即得金丝桃素浸膏。

II、将贯叶连翘粉碎过筛，以浓度为80％的乙醇与贯叶连翘的质量比为30∶1的比例将二者混合，超声处理20min，控制温度为80℃，回流2h后过滤，保留滤液；同样条件，将滤渣用乙醇重复提取3次，合并滤液，浓缩、干燥，即得金丝桃素浸膏。

III、将贯叶连翘粉碎过筛，以V(浓度为100％的乙醇)∶m(贯叶连翘粉)＝40∶1的比例将二者混合，超声处理20min，90℃回流2h后过滤，保留滤液；同样条件，将滤渣用乙醇重复提取4次，合并滤液，浓缩、干燥，即得金丝桃素浸膏。

选择乙醇浓度、乙醇倍数、提取温度、提取次数四个因素进行考察，选用L₉(3⁴)表安排实验，考察指标为提取物浓缩后由HPLC检查，因素、水平表如表1

表1 因素水平表

因素	A乙醇浓度(％)	B乙醇倍数(倍)	C提取温度(℃)	D提取次数(次)
					1	A1(60)	B1(20)	C1(70)	D1(2)
2	A2(80)	B2(30)	C2(80)	D2(3)
					3	A3(100)	B3(40)	C3(90)	D3(4)

1.1.1提取金丝桃素的优选方法

1.1.2仪器与药品

LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本，SHIMADZU公司)，SPD-10A紫外可见光检测器；十万分之一电子天平(德国，Sartorius公司)，RE-201c恒温水油浴锅(巩义市予华仪器有限公司)，旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限公司)，KQ-500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器厂)。金丝桃素对照品(成都普瑞法科技开发公司，纯度99.1％，批号：081204)；甲醇(色谱纯，韩国SK Chemicals)，水为纯化水，无水乙醇、氨水均为分析纯。

1.1.3方法与结果

色谱条件：色谱柱：Boston pHlex ODS C₁₈(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇∶水(85∶15，氨水调PH至9.5)；流速：1mL·min^-1；检测波长：588nm；进样量20μL。此色谱条件下，金丝桃素与提取物中其他成分有较好的分离度，见图3。

对照品贮备液的制备：精密称取金丝桃素对照品9.01mg，加入20mL二甲基亚砜中，完全溶解后转入250mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，精密吸取1.00mL上述溶液到10.0mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为3.60μg·mL^-1的对照品贮备液。

线性关系考察：精密吸取上述对照品贮备液0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL，置于5.00mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，得不同浓度的对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件，每个浓度3次，每次进样20μL，测得峰面积积分值。以对照品的进样浓度(x)为横坐标，峰面积积分值(y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y＝59503x+1266，r＝0.9997。结果表明，金丝桃素进样浓度在0.14～3.60μg·mL^-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

精密度试验：精密量取对照品贮备液1.00mL，于5.0mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，按“2.1”项下方法项下色谱条件进样20μL，连续进样5次，测定峰面积。结果6次测定峰面积RSD为：1.82％，表明仪器精密度良好。

从贯叶连翘中提取金丝桃素优选方法的确定：取9个正交实验所得的金丝桃素提取液，按(2)项下方法制备供试品溶液，按(1)项下色谱条件进行测定，计算含量，结果详见表2。

表2 正交实验结果

结果计算：

A的K₁＝0.0233+0.0448+0.0308＝0.0989

A的K₂＝0.0269+0.0234+0.0239＝0.0742

A的K₃＝0.0097+0.0113+0.0143＝0.0353

B的K₁＝0.0233+0.0269+0.0097＝0.0599

B的K₂＝0.0448+0.0234+0.0113＝0.0816

B的K₃＝0.0308+0.0239+0.0143＝0.0690

C的K₁＝0.0233+0.0239+0.0113＝0.0585

C的K₂＝0.0448+0.0269+0.0143＝0.0860

C的K3＝0.0308+0.0234+0.0097＝0.0639

D的K₁＝0.0233+0.0234+0.0143＝0.0610

D的K₂＝0.0488+0.0239+0.0097＝0.0784

D的K₃＝0.0308+0.0269+0.0113＝0.0690

用K1’、K2’、K3’分别表示K₁、K₂、K₃的平均值，

A的K1’＝K₁/3＝0.0330

K2’＝K₂/3＝0.0247

K3’＝K₃/3＝0.0118

B的K1’＝K₁/3＝0.1970

K2’＝K₂/3＝0.0265

K3’＝K₃/3＝0.0230

C的K1’＝K₁/3＝0.0195

K2’＝K₂/3＝0.0287

K3’＝K₃/3＝0.0213

D的K1’＝K₁/3＝0.0203

K2’＝K₂/3＝0.0261

K3’＝K₃/3＝0.0230

R的值为K1’、K2’、K3’中的最大值减去最小值，表示各个因素对实验结果的影响程度大小，R值越大表明其对应的因素对结果的影响就越大。

A的R＝0.0212；B的R＝0.0068；C的R＝0.0092；D的R＝0.0058。从9个实验提取结果看出，最佳提取条件为：A₁B₂C₂D₂其提取率最高，根据正交表计算的结果得出，最佳条件也为A₁B₂C₂D₂，因此条件：乙醇浓度60％，乙醇倍数30倍，提取温度80℃，提取3次为提取率最高的优选提取条件。

1.2、大孔树脂精制

将步骤a)所得浸膏与浓度为30％的乙醇混合，超声处理20min溶解，过滤，调至浓度为6mg/mL，以大孔吸附树脂与药液的体积比为2∶1的比例将二者混合，通过S898型大孔吸附树脂分离提纯，控制吸附流速为2.0床体积/小时，控制树脂柱径高比为1∶5，水洗3倍树脂体积，水洗速度为3床体积/小时；再换以流量为5床体积浓度为50％的乙醇洗脱，洗脱速度为2床体积/小时，收集洗液，浓缩干燥得金丝桃素粗品，HPLC法检查纯度为0.5％～7％。

1.3、分离纯化

用300目细硅胶装柱，硅胶柱体积为金丝桃素粗品的40倍，干法上样，以氯仿与甲醇的体积比为95∶1的比例洗脱，TLC跟踪流出液，收集金丝桃素为单点的流份；所得流份于60℃、0.08MPa真空度条件下，浓缩3.5h烘干，烘干后用200mL丙酮溶解过滤，滤液过硅胶柱，将收集的流出液浓缩干燥后得金丝桃素纯品，HPLC法检查纯度为97.7％。

[试验2]给药并525nm激光照射鲜红斑痣模型罗曼鸡鸡冠的实验研究

2.1试验材料及仪器

选择金丝桃素纯度为95.1％(HPLC)，HY药物组合物为：[实施例1]-[实施例8]制备的不同剂型的药物组合物，血卟啉(购自上海红绿光敏剂研究所，批号20090225)；YK-LED-PDT绿光525nm光动力美容仪(江西新余顺兴科技开发有限公司)，BX51双筒光学显微镜(OLYMPUS)，BP101十万分之一电子分析天平(德国Sartorius)；罗曼鸡，雄性，6月龄，体重(2±0.2)kg，36只，由第三军医大学第三附属医院实验动物中心提供。实验过程中善待实验动物，严格遵守实验动物科学与管理的有关规定。

2.2实验分组

选取健康6月龄雄性罗曼鸡36只，根据随机数表法将动物随机分为6组，每组6只，对鸡冠单侧进行激光照射，未处理一侧作为自身对照。空白对照组，动物既不给药也不激光照射；激光对照组，动物只激光照射，不给药；血卟啉1mg/kg阳性对照组，动物给血卟啉并激光照射；HY0.3mg/kg组，动物给HY 0.3mg/kg后立即激光照射；HY1mg/kg组，动物给HY1mg/kg后立即激光照射；HY3mg/kg组，动物给HY3mg/kg后立即激光照射。

2.3PDT处理

罗曼鸡翼下静脉注射20mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，在鸡冠上划出直径2cm的圆形区域，用浓度为75％的乙醇清洁鸡冠表面，黑布遮盖其余部分并固定鸡冠。根据实验分组各组给药剂量，于翼下静脉注射给药后立即给予525nm的激光照射，照射时间为20min，激光剂量为功率密度100mW/cm²。机器每次运行激光照射前后检测输出功率，其波动范围＜±5％。

2.4观察和取材

PDT处理后，每天进行观察并照相记录，观察鸡冠色泽变化、表皮是否有白斑、是否水肿、表面是否组织坏死、是否有结痂、结痂是否脱落、脱落的时间分布等。在处理后第7d及14d各组各处死3只动物，切取鸡冠组织块，用浓度为10％的甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，进行组织病理检查及计算各组毛细血管减少率。

毛细血管减少率的计算方法为：选取HE染色切片，随机选取5个高倍(40×10倍)镜视野，计算出血管平均数，以未处理侧鸡冠的血管平均数减去处理侧鸡冠的血管平均数，为毛细血管减少数。计算公式：

毛细血管减少率＝(处理侧毛细血管减少的平均数/对照测毛细血管的平均数)×100％

2.5原位凋亡末端标记(Tunel)检测鸡冠内皮细胞凋亡的情况

鸡冠组织取材方法及切取组织块同“2.3”，常规石蜡包埋切片后，保存不脱蜡的白片，按照Tunel试剂盒说明书，常规脱蜡水化，蛋白酶消化，双氧水阻断，Tunel反应混合液(sigma公司)，用浓度为10％的正常羊血清封闭后，用结合有过氧化酶的抗体，进行信号转换，DAB显色后用苏木素复染，干燥封片后显微镜下观察，阳性细胞可见棕黄色深染细胞核，用Imageproplus5.0图像分析软件计算呈阳性细胞数占细胞总数的平均百分率作为凋亡细胞指数(AI)，再进行组间比较。

2.6给药并激光照射后鸡冠损伤效应分级

给药并照射激光后鸡冠外观大体变化和病理分级如表3。

表3 给药并照射激光后鸡冠损伤效应分级

2.7统计学分析

计数资料分析以均数加减标准差(

±s)表示，评价多组数据的差异采用单因素方差分析，以上数据资料分析均由统计软件包(SPSS11.5)完成。以P＜0.05及P＜0.01表示差异有统计学意义。

结果：(1)(肉眼)观察鸡冠外观的变化：

激光对照组鸡冠的外形及色泽均无明显变化；血卟啉组及HY给药组再光照后，鸡冠激光照射处均出现明显水肿、起泡现象。

实验后1d，HY0.3mg/kg组鸡冠呈中间皱缩水肿，为轻度损伤；HY1mg/kg组鸡冠表皮皱缩，呈浅黄褐色水肿，为中度损伤；HY3mg/kg组鸡冠呈紫红中间圈状白色变化，为重度损伤；血卟啉阳性对照组鸡冠表皮呈暗红及轻微泛白。实验后7d，HY0.3mg/kg组鸡冠光照处浅棕色结痂，为中度损伤；HY1mg/kg组鸡冠表皮白色包绕黑色结痂，为中度损伤；HY3mg/kg组鸡冠表皮外周表皮白色坏死，中间深黑色结痂，严重坏死，为重度损伤；血卟啉阳性对照组鸡冠表皮黄褐点状相间结痂，为中度损伤。实验14d，HY0.3mg/kg组鸡冠光照处深棕色结痂，为重度损伤；HY1mg/kg组鸡冠表皮深褐色结痂，为重度损伤；HY3mg/kg组鸡冠照射处外部表皮白色坏死及深黑色结痂、坏死为极重度损伤；血卟啉阳性对照组鸡冠整个光照处表皮黑色结痂，为极重度损伤。各给药组结痂颜色变为深黑色，结痂变硬，鸡冠无破溃，结痂无脱落；结果见图1。

(2)鸡冠的组织病理变化

空白对照组和激光对照组，病理检查可见表皮正常，真皮浅层血管清晰，有扩张的毛细血管，内皮细胞完整，内皮下有不连续的平滑肌层，管腔较大；HY1mg/kg组，在光照7d后处死动物检查，表皮正常，鸡冠真皮浅层细胞增生，浅溃疡、水肿，轻微凝固性坏死(缺血性坏死)；血卟啉阳性对照组及HY3mg/kg组，表皮细胞增生，真皮浅层毛细血管减少，血管中红细胞减少，溃疡、水肿，严重凝固性坏死(缺血性坏死)。光照14d后，HY1mg/kg组，表皮细胞不完整，真皮浅层毛细血管数目减少；血卟啉阳性对照组及HY3mg/kg组，鳞状上皮细胞明显增生，伴角化不全，真皮浅层毛细血管管壁水肿，伴血管内皮灶性缺失，偶见红细胞，大面积严重凝固性坏死(缺血性坏死)，结果见图2。

(3)毛细血管减少率

从鸡冠的毛细血管减少率可以看出，空白对照组7d与14d有一定差异，系因每次处死不同动物，动物个体差异造成的；激光对照组7d与14d也有明显差别，可能是由于单纯激光对鸡冠的损伤较小，鸡冠自身对轻微的损伤有修复作用；与空白对照组相比，单纯激光组在7d时毛细血管减少率有显著性差异，14d无显著性差异(P＜0.05)，说明单纯激光未给药对鸡冠皮肤影响不大。

在7d和14d时，HY各给药组及血卟啉组与空白对照组及激光对照组相比，毛细血管减少率均有显著性差异(P＜0.01)，表明HY在525nm激光激发下能明显破坏鸡冠毛细血管网，结果见表4。

表4 各组鸡冠处理后毛细血管减少率(

±s，n＝3)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与激光对照组相比△△P＜0.01。

(4)TUNEL染色法检查金丝桃素对鸡冠细胞凋亡的影响

以TUNEL染色法观察HY静脉给药后在525nm激光照射下对鸡冠皮肤内皮细胞凋亡的影响，对照组细胞排列整齐，细胞核蓝染，核质均匀。而光照后鸡冠细胞核黄染较多，且有的细胞核出现空泡或核固缩。从凋亡细胞指数可以看出，激光对照组与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，其为激光照射对鸡冠表皮产生了一定的损伤，但损伤不大；HY各给药组及血卟啉组分别与空白对照组相比，凋亡指数均有显著差异(P＜0.01)，且HY药物组合物1mg/kg及HY药物组合物3mg/kg引起鸡冠皮肤凋亡的能力较血卟啉组强，表明HY药物组合物在525nm激光激发下能明显导致鸡冠内皮细胞的凋亡，结果见表5。

表5 各组鸡冠处理后细胞凋亡指数(

±s，n＝3)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与激光对照组相比△△P＜0.01。

结果表明：在本实验中，HY静脉给药在525nm对鸡冠的作用，HY 0.3mg/kg对血管的损伤不够，HY3mg/kg在对真皮层毛细血管损伤的同时也严重损伤了表皮，均不是理想的给药剂量，HY1mg/kg在对鸡冠真皮层毛细血管损伤的同时对表皮的损伤较轻，为理想的鲜红斑痣鸡冠模型治疗剂量；与血卟啉相比，HY对鸡冠表皮的损伤较血卟啉轻，且同样能起到损伤真皮毛细血管的目的，这说明HY药物组合物在给药的副作用及减轻后期的光毒性等方面较传统光敏剂血卟啉更有优势。

[试验3]黄斑变性的动物药理实验

3.1试验材料

选择金丝桃素纯度为95.1％(HPLC)；健康新西兰大耳白兔，清洁级，体重2.5～3.5kg，雌雄不限，个体体重与平均差异不超过20％，由第三军医大学第三附属医院实验动物中心提供。实验过程中善待实验动物，严格遵守实验动物科学与管理的有关规定。

3.2药品制备

精密称取金丝桃素纯品6mg，以m(金丝桃素粉)∶V(无水乙醇)＝1∶2的比例将二者混合，完全溶解后，加5mg吐温-80增溶，搅拌溶解，用三乙胺调PH值至7.5，最后用注射用水定容到100.0mL，过滤除菌，分装即得棕红色澄清水溶液，冰箱4℃保存。

3.3操作方法

取健康新西兰大耳白兔25只，按随机数表法分为5组：HY0.3mg/kg组、HY1mg/kg组、HY3mg/kg组、单纯激光照射对照组，单纯药物对照组，每组5只。HY各给药组动物，用复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，使用浓度为3％的戊巴比妥耳缘静脉注射麻醉后，将兔固定在裂隙灯显微镜前，三面镜下选择照光部位。耳缘静脉注射HY注射液后立即给予525nm激光照射10min，功率密度50Mw/cm²，光斑直径1.5～1.6mm。治疗后进行间接检眼镜观察、荧光眼底造影和组织学检测。

单纯激光照射对照组，检眼镜下眼底观察、荧光眼底造影和组织学未见视网膜和脉络膜病变；HY0.3mg/kg组，检眼镜下眼底观察、荧光眼底造影和组织学检查可见轻微的脉络毛细血管光动力闭塞；HY1mg/kg组，检眼镜下眼底观察到，实验即刻视网膜无明显颜色改变，1天后视网膜白色样变，表明色素沉着偶有部分视网膜脱离及水肿，光学显微镜下见脉络膜毛细血管闭塞，视细胞膜外节排列紊乱，空泡化，部分RPE细胞层排列失去正常连接性，荧光眼底造影观察到，实验1天后在照射区域出现低荧光，低荧光范围和照光范围接近，在低荧光区周围包绕高荧光；HY3mg/kg组，视网膜呈强白色，荧光眼底造影渗漏明显，光照部位呈高荧光，组织学见RPE层排列紊乱，外颗粒层细胞固缩，血管中大量血栓。

结果表明：在525nm激光照射下能对新西兰大耳白兔眼睛造成明显的黄斑损伤，且随着HY剂量的增大而增大。

另外，将[实施例1]至[实施例8]制备的不同剂型的药物组合物，按上述试验方法在525nm激光照射下对新西兰大耳白兔进行试验，结果发现：在525nm激光照射下能对新西兰大耳白兔眼睛造成明显的黄斑损伤，且随着HY剂量的增大而增大。

[试验4]金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞的作用

4.1实验标本：新鲜人鲜红斑痣标本；实验药物：金丝桃素纯品，纯度要求大于90％，实测值：金丝桃素94.5％(HPLC)，将HY用0.5％二甲亚砜溶解后用于细胞实验。

4.2人鲜红斑痣内皮细胞的培养与鉴定

无菌条件下取新鲜鲜红斑痣标本，用PBS液漂洗干净后用眼科剪剪成1.5mm×1.5mm大小的组织块，放入预冷的生理盐水(含青霉素50u/ml)中。在超净台中用注射器吸取生理盐水反复冲洗，胶原酶37℃消化8～10min。将消化液一并注入离心管中，900r/min离心5min，收集细胞。将细胞悬浮于含50％FBS的DMEM中，以5×10⁴个/ml的细胞密度接种于纤维连接蛋白铺层的培养皿；用倒置显微镜进行细胞形态学观察：从鲜红斑痣组织分离纯化出CD31⁺细胞，在纤维连接蛋白铺层上6h开始贴壁，细胞呈梭形，7d生长融合呈铺路石状，CD31^-免疫磁珠黏附于细胞上，检测可发现CD31、vWF表达呈阳性，当细胞达到80％～90％融汇后才能用于本试验。

4.3在525nm激光照射下金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞的影响

采用四甲基偶氮唑蓝(methylthiazoletetrazol imumm，MTT)法检查在525nm下金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞抑制的影响：

取细胞融合达到80％～90％的内皮细胞，将待检测的细胞弃去培养液，加入适量的0.25％胰蛋白酶消化吹打分散细胞后，加入含MTT0.5mg/ml的无血清培养液100ul，继续培养4h后，吸出各孔液体，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL。按200ul/孔接种于96孔细胞培养板，6h后对各孔细胞进行随机分组：空白对照组；激光对照组，细胞只给激光照射，不给药；金丝桃素给药并激光照射组：10ng/ml、100ng/ml、1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、1mg/ml、3mg/ml、10mg/ml，在给药后立即用525nm激光照射10min，激光剂量为功率密度50mW/cm²每组设6个复孔，继续培养48h。在培养结束前加入含有0.1mol/L HCl的异丙醇100ul，振荡溶解15min，测定525nm波长下各孔吸光值(OD₅₂₅)，计算细胞的生长抑制率：

生长抑制率(％)＝(1-实验组平均OD₅₂₅值/对照组平均OD₅₂₅值)×100％

4.4在525nm激光照射下金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞毛细小血管形成的影响

取细胞融合达到80％～90％的内皮细胞，与Matrigel(Becton-Dickenson)在4℃融化2～3小时后以0.125ml/孔的量置于96孔细胞培养板内，在铺细胞前，将凝胶聚合至少1小时。在处理前将人鲜红斑痣内皮细胞铺在孔中，以粘着、分化和建立毛细血管网。将各孔随机分为：空白对照组；激光对照组，细胞只给激光照射，不给药；金丝桃素给药并激光照射组：10ng/ml、100ng/ml、1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、1mg/ml、3mg/ml、10mg/ml，在给药后立即用525nm激光照射10min，激光剂量为功率密度50mW/cm²每组设6个复孔，继续培养24h。用MTT法测定细胞存活力。

4.5、在525nm激光照射下金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞释放丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)、超(过)氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)和内皮素(endothelium，ET)的影响

选取金丝桃素3个浓度进行实验：1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml，另设空白对照组及激光对照组，每组设6个复孔，细胞处理方式同3.1，分别收集各孔细胞培养板细胞培养液，按照试剂盒说明书测定培养液中MDA、SOD、LDH、ET含量。

4.6在525nm激光照射下金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞线粒体的影响

4.6.1人鲜红斑痣内皮细胞线粒体的提取及其形态观察

取处理后的细胞悬液2ml，经预冷的0.25mol/L蔗糖液洗涤3次，在4℃下以每毫升加9ml冷的0.25mol/L蔗糖液的比例，将悬液与蔗糖液都放入离心管，沿管璧小心加入等量的浓度为0.34mol/L蔗糖液覆盖于上层，离心后，分离上清和沉淀，于沉淀中加入10ml 0.25mol/L蔗糖液，以1000g(3500rpm)离心10min(重复2次)，分别收集上清和沉淀(上清疏松部分为质膜，沉淀为细胞核)，合并各管上清液3300g(6600r/min)离心10min，分别收集上清和沉淀，沉淀中加入10ml 0.25mol/L蔗糖液悬浮，3300g离心10min(重复2次)，分别收集上清和沉淀(此为线粒体粗品)。合并各管上清液，16300g(1350r/min)离心20min，收集上清和沉淀，于沉淀中加入10min 0.25mol/L蔗糖液悬浮，16300g离心20min(重复2次)，分离上清和沉淀(此为溶酶体)，合并上清液再以100000g(33000r/min)离心30min，分离上清和沉淀，此沉淀为微粒体。取沉淀2滴于载玻片上，用0.2％詹纳绿B染色20min，用相差显微镜观察，线粒体呈绿色。

4.7在525nm激光照射下金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞线粒体琥珀酸脱氢酶、Na⁺-K⁺-ATP酶及Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶的测定

选取金丝桃素浓度：1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml进行实验，另设空白对照组及激光对照组，细胞处理方式同3.1。取相应细胞的线粒体悬液1ml，按试剂盒上说明进行。琥珀脱氢酶活力用酶的比活性U/mg protein表示，每毫克蛋白每分钟使反应体系的吸光度降低0.01为1个酶活性单位。酶的比活性＝(ΔOD值÷0.01)÷反应时间÷取样量中的蛋白毫克数。

Na⁺-K⁺-ATP酶及Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶的测定，按照试剂盒上的测定，ATP酶活力单位(μmol Pi/mgprotein·hour)：每小时每毫克蛋白分解ATP产生1μmol无机磷(Pi)的量定为1个ATP酶活力单位。ATP酶活力＝[(测定管OD-对照管OD)/标准管OD×标准管浓度]×反应体系中样本稀释倍数×6÷取样量中的蛋白含量。

4.8在525nm激光照射下金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞线粒体膜通透性的影响

用UV2401PC紫外分光光度计检测线粒体525nm处吸光度(optical density，OD)OD525值的变化来测定膜通透性转换孔开放。线粒体(1mg/ml)加入测定介质(200mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris-3吗啉基丙磺酸，5mmol/L Tris-琥珀酸盐，1mmol/L Tris-磷酸，10μmol/L乙二醇四乙酸酯-Tris，2μmol/L鱼藤酮，1mg/L寡霉素，pH 7.4)中，25℃孵育2min，测定OD540；用不同量HY：1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml在525nm激光诱导线粒体后测定OD525值变化。OD525值越小，表明膜通透性越大；OD525值越大，表明膜通透性越小。

4.9金丝桃素结合PDT对人鲜红斑痣内皮细胞线粒体膜膜电位(ΔΨm)的影响

人鲜红斑痣内皮细胞处理方法同“4.3”取单细胞悬液与阳离子染料JC-1混匀，使其终浓度为10μg/ml，37℃孵育20min，然后用Hank’s液洗两次，用流式细胞仪进行检测，激发波长为520nm，发射波长为595nm，用荧光强度比值F520/F595表示膜电位ΔΨm。

4.10统计学分析：计数资料分析以均数加减标准差(

±s)表示，评价多组数据的差异采用单因素方差分析，以上数据资料分析均由统计软件包(SPSS11.5)完成。以P＜0.05及P＜0.01表示差异有统计学意义。

4.11实验结果

a.在525nm下金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞抑制率

用MTT法检查HY在525nm激光下对人鲜红斑痣内皮细胞抑制率，激光对照组与空白对照组相比有显著差异(P＜0.01)，表明激光照射对人鲜红斑痣内皮细胞会产生一定的抑制作用；各HY给药组与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.01)在525nm激光照射下对鲜红斑痣内皮细胞能产生明显的抑制、致细胞凋亡作用，于空白对照组及激光对照组相比有显著差异，且在HY剂量10ng/ml～100ug/ml范围内对细胞的抑制呈剂量依赖，当HY浓度达到1mg/ml以上后，细胞抑制率无明显增加，剂量达到饱和。表明HY对人鲜红斑痣内皮细胞的抑制作用在100ug/ml以下呈剂量递增，当HY浓度大于1mg/ml，随着HY浓度增加抑制作用无明显提高，结果见表6。

表6 不同浓度金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞抑制率的影响(

±s，n＝6)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与激光对照组相比△△P＜0.01。

b.在525nm下金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞毛细管状血管形成的影响

用MTT法检查HY在525nm激光下对人鲜红斑痣内皮细胞抑制率，激光对照组与空白对照组相比有显著差异(P＜0.01)，表明激光照射对人鲜红斑痣内皮细胞会产生一定的抑制作用；各HY给药组与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.01)在525nm激光照射下对鲜红斑痣内皮细胞能产生明显的抑制、致细胞凋亡作用，与空白对照组及激光对照组相比有显著差异，且在HY剂量10ng/ml～100ug/ml范围内对细胞的抑制呈剂量依赖，当HY浓度达到1mg/ml以上后，细胞抑制率无明显增加，剂量达到饱和。表明，HY对人鲜红斑痣内皮细胞的抑制作用在100ug/ml以下呈剂量递增，当HY浓度大于1mg/ml时，随着HY浓度增加抑制作用无明显提高，结果见表7。

表7 不同浓度金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞毛细管状小管抑制率的影响(

±s，n＝6)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与激光对照组相比△△P＜0.01。

c.在525nm激光照射下金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞释放丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)、超(过)氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)和内皮素(endothelium，ET)的影响

细胞液中MDA、SOD、LDH、ET的值，激光对照组、空白对照组相比无明显差异。MDA与SOD的值各给药组与空白对照组、激光对照组相比均有显著差异(P＜0.01)，其中HY100ug/ml组对MDA与SOD的抑制作用尤其明显；LDH和ET的值，HY1ug/ml组，与空白对照组、激光对照组相比有显著差异(P＜0.05)，HY10ug/ml组与HY100ug/ml组与空白对照组、激光对照组相比有显著差异(P＜0.01)。可知，HY各给药组在525nm激光照射下对人鲜红斑痣内皮细胞MDA、SOD、LDH、ET有显著抑制作用。结果见表8。

表8 金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞MDA、SOD、LDH、ET的影响(±s，n＝6)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与激光对照组相比△△P＜0.01。

d.在525nm激光照射下金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞线粒体琥珀酸脱氢酶、Na⁺-K⁺-ATP酶及Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶的影响

525nm激光照射下金丝桃素对人红斑痣内皮细胞线粒体琥珀酸脱氢酶、Na⁺-K⁺-ATP酶及Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶的影响可以看出，激光对照组与空白对照组相比无明显差异，表明激光对以上3种酶的影响不大；HY各给药组对人鲜红斑痣线粒体中以上3种酶的表达均有明显抑制作用，其中HY1ug/ml组与空白对照组、激光对照组相比有显著差异(P＜0.05)，HY10ug/ml组和HY100ug/ml组与空白对照组、激光对照组相比有显著差异(P＜0.01)，HY100ug/ml组对3种酶的抑制作用最强。结果见表9。

表9 金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞线粒体琥珀酸脱氢酶、Na⁺-K⁺-ATP酶及Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶的影响(

±s，n＝6)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与激光对照组相比△△P＜0.01。

e.在525nm激光照射下金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞线粒体膜通透性及膜电位(ΔΨm)的影响

从实验结果可以看出，525nm激光照射下金丝桃素对人红斑痣内皮细胞线粒体膜通透性及膜电位(ΔΨm)均能产生明显的抑制作用，激光对照组与空白对照组相比无明显差异；HY各给药组，与空白对照组、激光对照组相比有显著差异(P＜0.01)，其中HY100ug/ml组对以上2个指标的抑制作用最强。结果见表10。

表10 金丝桃素对人鲜红斑痣内皮细胞线粒体膜通透性及膜电位(ΔΨm)的影响(

±s，n＝6)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与激光对照组相比△△P＜0.01。

结论：在525nm激光照射下HY剂量从10ng/ml到10mg/ml对人鲜红斑痣内皮细胞生长能产生明显的抑制作用，并能明显抑制鲜红斑痣内皮细胞毛细管状小管形成；对人鲜红斑痣内皮细胞释放MDA、SOD、LDH、ET；抑制人鲜红斑痣内皮细胞线粒体释放琥珀酸脱氢酶、Na⁺-K⁺-ATP酶及Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶；降低人鲜红斑痣内皮细胞线粒体膜通透性及膜电位(ΔΨm)。HY对人鲜红斑痣内皮细胞线粒体最佳作用浓度为：1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml。以上结果说明，在525nm激光照射下HY能对人鲜红斑痣内皮细胞产生明显的抑制作用，其作用机制与HY对内皮细胞的线粒体损损伤有关。

另外，将[实施例1]至[实施例8]制备的不同剂型的药物组合物，按上述试验方法进行试验验证，结果表明：在525nm激光照射下金丝桃素药物组合物能对人鲜红斑痣内皮细胞产生明显的抑制作用，其作用机制与HY对内皮细胞的线粒体损损伤有关。

[试验5]金丝桃素的急性毒性作用

5.1试验材料：实测值金丝桃素纯度95.1％(HPLC)；健康昆明小鼠，清洁级，7～8周龄，体重18～22g，个体体重与平均差异不超过20％，同批体重差异小于4g，由第三军医大学第三附属医院实验动物中心提供。小鼠适应性喂养5天后进入实验。实验过程中善待实验动物，严格遵守实验动物科学与管理的有关规定。

5.2药品制备：精密称取5mg金丝桃素与10mg无水乙醇，将二者混合完全溶解后，于其中加入5mL吐温-80增溶，搅拌溶解后，用三乙胺调PH值至7，最后用注射用水定容到100.0mL，过滤除菌，分装即得棕红色澄清水溶液，冰箱4℃保存。

5.3操作方法

5.3.1动物饲养给药方法

实验前动物先喂养5天，选健康的动物(去掉体重过轻、过重及行动迟缓，反应迟钝的动物)。动物尾静脉注射给药，按“不等浓度等溶”方法给药，在给药之前禁食12～16小时，不禁水。

5.3.2预实验

用2只动物(雌)在20mg/kg、200mg/kg、2000mg/kg剂量连续给药，若在2000mg/kg给药后死亡，则换2只新动物，从200mg/kg开始给药，连续剂量增加的系数是1.8，一直到出现动物死亡为止，得到Dmin。在Dmin的基础上递减剂量，得到D_0％，再取2只新动物(雌雄各半)在Dmin的基础上给药，连续剂量增加的系数是1.15，直到2只动物全部死亡。再对剂量进行细分，在有动物死亡到动物全部死亡的剂量间细分，每组取4只动物，直到得到4/4的动物死亡，求到Dmax即D_100％，金丝桃素静脉注射对小鼠的Dmin＝1680mg/kg，Dmax5650mg/kg。

5.3.3正式实验

用公式：1/k＝(N-1)×(Dmax/Dmin)^1/2

1/k＝组间比值N---分组数

在D_100％和D_0％之间取N(一般在6-10之间)组，本实验给药组取7组，组间距最好以等1g值为比值，具体的操作：把D_100％和D_0％的值换算成对数，再按等对数距离分组。80只小鼠，随机分为8个组，分为7个HY给药组及一个空白对照组，每组10只，雌雄各半，HY给药组分别为：5650mg/kg、4623.81mg/kg、3775.72mg/kg、3083.19mg/kg、2517.68mg/kg、2055.89mg/kg、1680mg/kg及对照组。给药组HY注射液尾静脉注射给药，对照组给予等量注射用水，给药当天详细观察给药后动物的反应情况，然后每天上午8点，下午14点各观察一次，持续观察14天动物的不良反应和死亡情况。记录各组动物死亡情况，数据用改良寇氏(Korbor)法进行计算LD₅₀。对死亡的动物立即进行尸检，取肉眼有异的脏器进行病理学检查，观察14天后，处死剩下存活动物进行尸检，取肉眼有异的脏器进行病理学检查。同时对实验动物于给药前、给药后第3、7、14天称量体重，观察存活动物体重变化的趋势并于对照组进行比较。

5.3.4实验结果

动物死亡多发生在给药后2h至6h内，表现为对刺激反应减弱或消失，呼吸困难，心跳减弱，直至死亡。对死亡动物立即解剖，肉眼观内脏器官未见明显异常。各组存活动物亦见类似症状，但较轻。存活动物当日或次日即可进食，观察14天，体重随周龄增长，未见其他毒性反应。HY静脉给药小鼠的半数致死量LD₅₀＝3177.45mg/kg，D_min＝1680mg/kg，Dmax＝5650mg/kg。动物死亡时间分布及死亡率见表11。分别与给药前，给药后3天、7天、14天称重小鼠体重见表2，发现各组存活的小鼠的体重没有显著性差异，体重随周龄增长，给药组较对照组体重增长缓慢，结果见表12。

表11 动物在死亡情况的时间点分布及死亡率(

±s)

表12 SLW对小鼠的体重影响(

±s)

剂量

1680.00mg/kg

2055.89mg/kg

2517.68mg/kg

3083.19mg/kg

3775.72mg/kg

4623.81mg/kg

5650.00mg/kg

正常对照组

结果表明：金丝桃素静脉给药对小鼠的急性毒性较小LD₅₀＝3177.45mg/kg，D_min＝1680mg/kg，D_max＝5650mg/kg，且对存活动物的体重影响不大。

另外，将[实施例1]至[实施例8]制备的不同剂型的药物组合物，按上述试验方法进行试验验证，结果表明：给药对小鼠的急性毒性较小：LD₅₀＝3165.45mg/kg，D_min＝1660mg/kg，D_max＝5630mg/kg；LD₅₀＝3155.45mg/kg，D_min1650mg/kg，D_max＝5530mg/kg；LD₅₀＝3145.45mg/kg，D_min＝1650mg/kg，D_max＝5620mg/kg；LD₅₀＝3155.45mg/kg，D_min＝1650mg/kg，D_max＝5620mg/kg；LD₅₀＝3145.45mg/kg，D_min＝1640mg/kg，D_max＝5530mg/kg；LD₅₀＝3065.45mg/kg，D_min＝1560mg/kg，D_max＝5530mg/kg；LD₅₀＝3045.45mg/kg，D_min＝1540mg/kg，D_max＝5420mg/kg；LD₅₀＝3235.45mg/kg，D_min＝1552mg/kg，D_max＝5543mg/kg且对存活动物的体重影响不大。

[试验6]皮肤光毒性实验

6.1试验材料：金丝桃素纯度要求大于90.0％，实测值金丝桃素纯度95.1％(HPLC)；健康昆明小鼠，清洁级，7～8周龄，体重18～22g，个体体重与平均差异不超过20％，同批体重差异小于4g，由第三军医大学第三附属医院实验动物中心提供。小鼠适应性喂养5天后进入实验。实验过程中善待实验动物，严格遵守实验动物科学与管理的有关规定。

6.2药品制备：精密称取金丝桃素纯品加入适量乙醇使其完全溶解，加5mL吐温-80增溶，搅拌溶解后，用三乙胺调PH值至7～8，最后用注射用水定容到100.0mL，过滤除菌，分装即得棕红色澄清水溶液，冰箱4℃保存。

6.3操作方法：实验前动物先喂养5天，选健康的动物(去掉体重过轻、过重及行动迟缓，反应迟钝的动物)。取小鼠42只随机分为7组，每组6只，对照组不给药，其余6组每组均尾静脉注射1mg/kg金丝桃素注射液，于给药后即刻、1、2、3、5、7天中午12点～14点给予自然阳光照射2小时，观察皮肤光毒反应。

6.4实验结果

①对照组：无明显躁动不安表现，耳朵、四肢和尾部无发红、肿胀等反应。

②即刻组：动物烦躁，频繁舔前足，耳朵、四肢和尾部发红、明显肿胀。

③1天组：不安，舔前足，耳朵、四肢和尾部有发红、明显肿胀。

④2天组：略有不安，耳朵、四肢和尾部有轻微发红、明显肿胀。

⑤3天组：无明显不安，耳朵、四肢和尾部有非常轻微发红、明显肿胀。

⑥5天组：无明显不安，耳朵、四肢和尾部无发红、明显肿胀。

⑦7天组：无明显不安，耳朵、四肢和尾部无发红、明显肿胀。

另外，将[实施例1]至[实施例8]制备的不同剂型的药物组合物，按上述试验方法进行试验验证，结果表明：本发明的药物组合物治疗鲜红斑痣疾病具有以下特点：①药物组合物与光动力的协同作用强，疗效高，大幅度提高临床治疗的效率和减轻患者在治疗期间的痛苦；②光敏剂在体内代谢快，避光时间短，一般仅为2～3天(对小鼠而言)，对人的避光时间会适当延长，安全度大；③无过敏反应，不需要做过敏试验；④暗毒性低。

[试验7]临床试验

(一)研究病例及判定方法：

1病例来源：本课题研究对象来自第三军医大学第三附属医院皮肤科在2009年2月至12月就诊鲜红斑痣患者32例。2患者一般情况：根据病变颜色及增生情况将皮损分为三种类型，见表13。不同病变位置的统计，见表14。

表13 鲜红斑痣患者病变类型分类(n＝32)

患者纳入标准：患者均无心、肝、肾等重要器官功能障碍；均为非瘫痕体质；皮损均未接受过任何方法的治疗。

患者排除标准：排除有心、肝、肾等重要功能障碍者；排除有瘫痕体质者；排除曾有治疗史者；排除处于急性病发作期或其他感染性疾病患者；排除处于妊娠期的妇女患者；排除合并有其他血管瘤或综合征患者。分组情况：将24例鲜红斑痣患者随机分为4个组，每组8人：HY 2.5mg/kg组，HY 5mg/kg组，HY 10mg/kg组和血卟啉5mg/kg组(阳性对照组)。

7.1金丝桃素溶液制备：精密称取纯度为95.2％(HPLC)的金丝桃素纯品7mg，以M(金丝桃素粉)∶V(无水乙醇)为1∶2的比例将二者混合，完全溶解，加6mg吐温-80增溶，搅拌溶解后，用三乙胺调pH值至7.8，最后用注射用水定容到100.0mL，过滤除菌，按照等比稀释分装即得2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的金丝桃素棕红色澄清水溶液，冰箱4℃保存。

7.2血卟啉溶液制备：血卟啉(上海红绿光敏剂研究所，批号20090225)，将浓度为10mg/mL的血卟啉注射液用注射用水稀释至浓度为1mg/mL的血卟啉溶液，冰箱4℃保存备用。

7.3仪器设备：YK-LED-PDT绿光525nm光动力美容仪(江西新余顺兴科技开发有限公司)，BP101万分之一电子分析天平(德国Sartorius)

7.4治疗方法：分别将金丝桃素及血卟啉稀释至浓度为10ug/ml，在患者前臂屈侧皮试，观察20min，阴性者方可给药。患者取卧位，用双层黑布遮盖非照光区域和眼睛。患者按照分组推注相应药物，推注前后用生理盐水冲洗管道，保证药物完全进入血管内，药物推入后立即给予525nm激光照射，照光前后检测输出功率，其波动范围＜±5％。光纤末端与病灶间的距离约为6～10cm，光斑直径为8～10cm，根据患者患部皮肤光照反应确定激光能量密度，以患部皮肤变色发白为依据，每个光斑的照射时间为20～30min，照光功密度为80～120mW/cm²。术后严格避光7天，1个月内避免阳光直接照射，每4周治疗1次。

7.5疗效判定：根据病变的消退程度将疗效分为四级，为方便统计分析，对各级疗效进行打分，如表15。同一患者取单一部位的治疗区进行疗效评估。

表15 疗效分级标准

7.6疗效评估方法：患者术后1个月复诊1次，达I级疗效者，连续随访3个月，无复发者判为治愈；达II级疗效或II级以下疗效者继续给予PDT治疗，总治疗次数不超过3次。在完成最后一次治疗的3个月后进行疗效评估。通过患者的随访、复查及治疗前后的照片对比，对其疗效及并发症的发生情况进行评估。

7.7疗效观察结果

7.7.1治疗率统计：不同治疗组治疗后按疗效评估方法评估疗效，不同疗效分级百分率结果见表16。

表16 各给药组不同疗效分级百分率(n＝8)

从结果可以看出，HY给药剂量为5mg/kg与HY10mg/kg治疗有效率相当，但HY10mg/kg治愈率最高，而金丝桃素与血卟啉在相同剂量下(5mg/kg)，金丝桃素治疗有效率比血卟啉好。表明作为静脉给药的光敏剂，在相同情况下HY的治疗效果优于血卟啉。

7.7.2术后反应

术后不良反应表现为：红肿、结痂、色素沉着与瘢痕，其中，红肿、结痴及瘫痕发生在光照后治疗的局部，色素沉肴，发生于全身可见光的部位。大多数患者在术后1周内红肿自行消退，2～4周脱痂，发生色素沉着，随访3个月仍未完全消退，HY10mg/kg组1例发生轻度增生性瘫痕。结果见表17。

表17 术后不良反应发生率(n＝8)

结论：金丝桃素作为光敏剂能有效治疗鲜红斑痣，且发生如红肿、结痂等可以恢复的不良反应，其不良反应发生率较血卟啉没有明显差异。

(二)、研究病例及判定方法：

同等条件，按(一)研究病例及判定方法，将[实施例1]至[实施例8]制备的药物组合物分别对粉红型，紫红型及增厚型病变进行治疗，治愈情况如表18

表18 不同比利金丝桃素与药用载体对不同程度鲜红斑痣的治愈

	金丝桃素用量	药物载体用量	粉红型	紫红型	增厚型
						实施例1	1mg	10mg	病变色消退70％，接近正常皮肤	病变色消退60％，增厚部变平同正常皮肤	病变色消退30％，增厚部明显变薄
实施例2	99mg	9000mg	病变色消退95％，接近正常皮肤	病变色消退60％-95％，增厚部变平同正常皮肤	病变色消退50％，增厚部明显变薄
						实施例3	100mg	10000mg	病变色消退87％，接近正常皮肤	病变色消退73％，增厚部变平同正常皮肤	病变色消退52％，增厚部明显变薄
实施例4	50mg	40mg	病变色消退88％，接近正常皮肤	病变色消退75％，增厚部变平同正常皮肤	病变色消退55％，增厚部明显变薄
						实施例5	20mg	250mg	病变色消退95％，接近正常皮肤	病变色消退85％，增厚部变平同正常皮肤	病变色消退56％，增厚部明显变薄
实施例6	80mg	350mg	病变色消退90％，接近正	病变色消退89％，增厚部	病变色消退57％，增厚部明显变薄
									常皮肤	变平同正常皮肤

	金丝桃素用量	药物载体用量	粉红型	紫红型	增厚型
						实施例7	60mg	200mg	病变色消退96.5％，接近正常皮肤	病变色消退95％，增厚部变平同正常皮肤	病变色消退59％，增厚部明显变薄
实施例8	90mg	300mg	病变色消退96％，接近正常皮肤	病变色消退94％，增厚部变平同正常皮肤	病变色消退60％，增厚部明显变薄
							1mg	——	病变色消退73％，接近正常皮肤	病变色消退62％，增厚部变平同正常皮肤	病变色消退35％，增厚部明显变薄
	100mg	——	病变色消退72％，接近正常皮肤	病变色消退64％，增厚部变平同正常皮肤	病变色消退31％，增厚部明显变薄

另外，不经过过敏实验，直接将上述组分与光动力疗法结合对上述鲜红斑痣病变患者治疗，治愈状况如表19所示：

表19 疗效分级标准

结果表明：上述药物组合物与光动力可以发生很好的协同作用，且轻度型、重度型病变均有效，另外随访患者没有发现类似暗毒性及毒副作用引起的异常反应。

注：以上试验所称HY均指本发明的金丝桃素药物组合物；另外，实施例所用无水乙醇均为分析纯级，乙醇含量为99.7％。

实施例1

(1)金丝桃素的提取：

a)、粗提

以M(贯叶连翘粉)∶V(浓度为60％的乙醇)为1∶20的比例将二者混合，超声处理15min，控制温度为70℃，回流1.5h后过滤，保留滤液；同样条件，用乙醇将所得滤渣再提取2次后，合并滤液，浓缩干燥，即得金丝桃素浸膏。

b)、大孔树脂精制

将步骤a)所得浸膏与浓度为15％的乙醇混合，超声处理15min溶解，过滤，调至浓度为5mg/mL，通过S898型大孔吸附树脂分离提纯：以大孔吸附树脂与药液的体积比为1∶1的比例将二者混合，控制吸附流速为1.5床体积/小时，控制树脂柱径高比为1∶5，水洗3倍树脂体积，水洗速度为0.5床体积/小时；再换以流量为4床体积浓度为50％的乙醇洗脱，洗脱速度为1床体积/小时，收集洗液，浓缩干燥得金丝桃素粗品。

c)、分离纯化

以60目粗硅胶与金丝桃素粗品的体积比为1∶1的比例拌样，用200目细硅胶装柱，硅胶柱体积为金丝桃素粗品的10倍，以氯仿-甲醇的体积比为90∶1的比例洗脱，TLC跟踪流出液，收集金丝桃素为单点的流份；所得流份于60℃、0.08MPa真空度条件下，浓缩3h烘干，烘干后用150mL丙酮溶解过滤，滤液过硅胶柱，将收集的流出液浓缩干燥后得金丝桃素纯品。

(2)、药物组合物的制备

金丝桃素1mg、无水乙醇1.9mg、硬脂酸0.1mg、羟苯乙酯0.5mg、甘油1.5mg、硬脂酸甘油酯1.5mg、卡波姆0.5mg、白凡士林0.2mg、液体石蜡0.8mg、羧甲基纤维素钠0.2mg、十二烷基硫酸钠0.8mg和蒸馏水2mg。

软膏剂的制备：

将1mg金丝桃素研细后通过60目筛，溶于二甲基亚砜中备用。取上述重量份的硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林和液状石蜡加热融化为油相。另将甘油和蒸馏水加热至90℃，于其中加入十二烷基硫酸钠及羟苯乙酯溶解作为水相。然后将水相慢慢倒入油相中，边加边搅拌，直至冷凝，即得乳膏型机制；将溶解于无水乙醇的金丝桃素溶液加如上述机制中，搅拌均匀即得本实施例的软膏剂。

实施例2

金丝桃素的提取同上实施例1；本实施例注射剂的制备：

99mg金丝桃素；于其中加入1000mg无水乙醇、2000mg甘油、800mg水；另加5200mg吐温-80增溶，搅拌溶解后，用三乙胺调PH值至7，最后用注射用水定容到7500.0mL，过滤除菌，分装即得棕红色澄清水溶液，冰箱4℃保存即得注射剂。

实施例3

金丝桃素的提取同上实施例1；

本实施例片剂的制备：

(2)、药物组合物的制备

将100mg金丝桃素粉碎成细粉，加入500mg乳糖、800mg淀粉、700mg糊精、3500mg羟丙基纤维素；500mg滑石粉；4000mg包衣预混剂欧巴代OY-C-7000A混合制成颗粒，并干燥，压制成片。

实施例4

金丝桃素的提取同上实施例1；

本实施例胶囊剂的制备：

胶囊剂的制备：50mg金丝桃素；10mg的乳糖、10mg羟丙基纤维素、3mg淀粉、7mg糊精、4mg滑石粉、6mg硬脂酸镁，将上述重量份的原料混合，粉碎成粉，装入明胶中制成胶囊。

实施例5

金丝桃素的提取同上实施例1；本实施例乳剂的制备：

20mg金丝桃素；10mg硬脂酸钠、20mg硬脂酸镁、30mg甘油脂肪酸酯、20mg甘油脂肪酸酯、40mg卵磷脂、50mg泊洛沙姆、10mg羊毛脂、5mg聚山梨酯、5mg脂肪酸山梨坦、10mg甲基纤维素、10mg羧甲基纤维素、20mg海藻酸钠和20mg琼脂，将上述重量份的原料混合乳化制成乳剂。

实施例6

金丝桃素的制备同上实施例1；

注射剂的制备：

80mg金丝桃素；于其中加入50mg无水乙醇、70mg甘油和140mg水，另加入90mg吐温-80增溶，搅拌溶解后，用三乙胺调pH值至8，最后用注射用水定容到600ml，过滤除菌，分装即得棕红色澄清水溶液，冰箱4℃保存。

实施例7

金丝桃素的提取同上实施例1；片剂的制备：

60mg金丝桃素粉碎成细粉，加入10mg乳糖、20mg淀粉、70mg糊精、5mg硬脂酸镁、35mg羟丙基纤维素；45mg滑石粉、15mg包衣预混剂欧巴代OY-C-7000A混合制成颗粒，并干燥，压制成片。

实施例8

金丝桃素的提取同上实施例1；

胶囊剂的制备：

90mg金丝桃素；10mg的乳糖、120mg淀粉、50mg糊精、60mg羟丙基纤维素、30mg滑石粉、30mg硬脂酸镁，将上述重量份的原料混合，粉碎成粉，装入明胶中制成胶囊。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管本领域的技术人员阅读本申请后，参照上述实施例对本发明进行种种修改或变更，但这些修改或变更，均在申请待批本发明的权利申请要求保护范围之内。

Claims (9)

1.一种治疗鲜红斑痣的药物组合物，其特征在于包括按重量份计的1～100份金丝桃素和药用载体。

2.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于包括按重量份计的1～100份金丝桃素和10～10000份药用载体。

3.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于包括按重量份计的50～99份金丝桃素和40～9000份药用载体。

4.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于包括按重量份计的20～80份金丝桃素和250～350份药用载体。

5.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于包括按重量份计的60～90份金丝桃素和200～300份药用载体。

6.根据权利要求1～5任一权利要求的药物组合物，其特征在于所述药用载体为从稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、乳化剂、防腐剂、增溶剂、溶剂和基质选出任意一种或几种助剂。

7.根据权利要求6的药物组合物，其特征在于：

所述稀释剂为：淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、甘露醇和山梨醇；

所述润湿剂为：蒸馏水、乙醇、丙二醇和丙三醇；

所述黏合剂为：羧甲基纤维素、海藻酸钠、琼脂、阿拉伯胶、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、卡波姆、聚维酮、明胶和聚乙二醇；

所述崩解剂为：干淀粉、羧甲淀粉钠和交联聚维酮；

所述润滑剂为：硬脂酸钠、硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉和聚乙二醇；

所述乳化剂为：硬脂酸甘油酯、羊毛脂、甘油脂肪酸酯、卵磷脂、泊洛沙姆、聚山梨酯和脂肪酸山梨坦、硬脂酸、十二烷基硫酸钠和甘油；

所述防腐剂为：羟苯乙酯、硫柳汞、苯甲醇、三氯叔丁醇和尼泊金；

所述增溶剂为：吐温；

所述溶剂为：乙醇和蒸馏水；

所述基质为：甘油、凡士林、液体石蜡、聚乙二醇，硬脂酸、单硬脂酸甘油酯和氢化植物油。

8.权利要求1～7的任一权利要求的药物组合物的制备方法，包括步骤：

(1)金丝桃素的提取及纯化

a)、粗提

将贯叶连翘粉的质量与浓度为60％～100％的乙醇的体积比为1∶20～40的比例混合，超声处理15～25分钟，70℃～90℃回流1.5～2.5小时，过滤，保留滤液；同样条件，用乙醇将其滤渣再提取2～4次，合并滤液，浓缩干燥，即得金丝桃素浸膏。

b)、大孔树脂提纯

将步骤a)所得浸膏与浓度为15％～35％的乙醇混合，超声处理15～30分钟溶解，过滤，调至浓度为5～7mg/mL，将大孔吸附树脂与此药液按体积比为1～2∶1的比例混合，用大孔吸附树脂分离提纯，控制吸附流速1.5～2.5床体积/小时，控制树脂柱径高比为1∶5～7，3～5倍树脂体积水洗，水洗速度为0.5～3床体积/小时；再换以流量为4～6床体积浓度为50％～70％的乙醇洗脱，洗脱速度为1～3床体积/小时，收集洗液，浓缩干燥得金丝桃素粗品；

c)、分离纯化

用200～300目细硅胶装柱，硅胶柱体积为金丝桃素粗品的10～50倍，干法上样按氯仿与甲醇的体积比为90～95∶1的比例洗脱，TLC跟踪流出液，收集金丝桃素为单点的流份；所得流份于60～75℃、0.08～0.10MPa真空度条件下，浓缩3～4.5h烘干，烘干后用150～250mL丙酮溶解过滤，滤液过硅胶柱，将收集的流出液浓缩干燥后得金丝桃素纯品；

(2)、药物组合物的制备

于金丝桃素纯品中，加入至少一种所述药用载体制成医药上可接受的剂型。

9.权利要求8的药物组合物的制备方法，包括步骤：

(1)金丝桃素的提取及纯化

a)、粗提

将贯叶连翘粉的质量与浓度为60％的乙醇的体积比为1∶30的比例混合，超声处理20分钟，80℃回流2小时后过滤，保留滤液；同样条件，用乙醇将所得滤渣再提取3次，合并滤液，浓缩干燥，即得金丝桃素浸膏；

b)、大孔树脂提纯

将步骤a)所得浸膏与浓度为30％的乙醇混合，超声处理20min溶解，过滤，调至浓度为6mg/mL，以大孔吸附树脂与药液的体积比为2∶1的比例将二者混合，通过S898型大孔吸附树脂分离提纯，控制吸附流速为2.0BV/h，控制树脂柱径高比为1∶5，水洗3倍树脂体积，水洗速度为3BV/h；再换以流量为5BY浓度为50％的乙醇洗脱，洗脱速度为2BV/h，收集洗液，浓缩干燥得金丝桃素粗品。

c)、分离纯化

用300目细硅胶装柱，硅胶柱体积为金丝桃素粗品的40倍，以氯仿与甲醇的体积比为95∶1的比例洗脱，干法上样TLC跟踪流出液，收集金丝桃素为单点的流份；所得流份于60℃、0.08MPa真空度条件下，浓缩3.5h烘干，烘干后用200mL丙酮溶解过滤，滤液过硅胶柱，将收集的流出液浓缩干燥后得金丝桃素纯品；

2)、药物组合物的制备

于金丝桃素纯品中，加入至少一种所述药用载体制成医药上可接受的剂型。

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