CN103948925A - 一种视网膜黄斑变性的动物模型 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体涉及一种用于筛选光动力治疗视网膜黄斑变性药物的动物模型。该动物模型是雄性鸡的鸡冠，由于鸡冠的组织病理结构特点与视网膜黄斑变性组织病理结构特点十分相似，故可用于光动力治疗视网膜黄斑变性药物的筛选，具有重要的实用价值和理论研究价值。
Description
技术领域
本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体涉及一种用于筛选光动力治疗视网膜黄斑变性药物的动物模型。
背景技术
视网膜黄斑变性(Retinal Macular Degeneration)是视网膜色素上皮细胞变性造成的一种不可逆性视力下降或丧失的疾病(Pradeep S.Prasad at al.，Maturitas，66(1)：46-50，2010)。主要表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外界盘膜吞噬消化功能下降，使未被消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原桨中，并向细胞外排出，形成玻璃膜疣，因此继发病理改变后，导致黄斑变性发生。本病大多发生于45岁以上，其患病率随年龄增长而增高，是一种严重威胁老年人视功能的眼底病变(Bressler NM at al.，Surv Ophthalmol32(6)：375-413，1988)。
视网膜黄斑变性是国际眼科界公认的最难治疗的眼病之一。分为年龄相关性黄斑变性和少年黄斑变性两种，尤其以渗出性年龄相关性黄斑变性最为严重，是当前老年人致盲的重要疾病，发生原因主要是异常的新生血管在黄斑部的视网膜下生长，称为脉络膜新生血管(Choroidal Neovascularization，CNV)，引起视网膜出血、水肿及视网膜组织的破坏，最终导致疤痕形成，从而视力丧失(Ursula Schmidt-Erfurth at al.，Progress in Retinal and EyeResearch.28(2)：145-154，2009)。其治疗方法主要包括激光光凝术治疗、光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)、经瞳孔温热疗法、药物治疗、基因治疗和手术治疗等。目前为止各种治疗手段都存在一定的局限性，但其中PDT被认为是较安全、有效的方法(UrsulaSchmidt-Erfurth and Tayyaba Hasan，Current Research，45(3)：195-214，2000)。
目前，CNV动物模型的建立方法主要有激光诱导CNV模型、血管生长因子诱导CNV模型及利用基因方法诱导CNV模型等(Mark E.Pennesi at al.，Molecular Aspects of Medicine33：487-509，2012)。由于这些方法存在对操作技术要求高、CNV生成率低及生长周期长、成本高等缺点，严重制约了光动力抗视网膜黄斑变性新药的研究开发，急需一种操作简便、周期短、成本低、重现性好的视网膜黄斑变性动物模型，来弥补这些方法的不足。
CNV又称视网膜下新生血管(Subretinal Neovaseularization，SRNV)，起源于脉络膜血管，位于视网膜色素上皮间隙或神经上皮下间隙。CNV呈一膜样结构，光镜下新生血管主要由单层色素上皮、上面覆盖的纤维基质(主要是纤维组织和胶原)和散在的一些血管组成。CNV膜上的细胞成分主要有色素上皮细胞、类成纤维细胞及一些血管内皮细胞(Green WR at al.，The1992Lorenz E.Zimmerman Lecture.Ophthalmology，100(10)：1519-1535)。鸡冠在60年代末已被国外学者用作毛细血管瘤动物模型(A Orenstein ai al.，Lasers Surg Med，10(4)：334-343，1990)。鸡冠皮肤由表皮层、真皮乳头层、乳头下真皮浅层和真皮深层组成。表皮层含有角质层和5～6层细胞，包括基底细胞层；真皮乳头层含有大量扩张的毛细管网，管壁由单层血管内皮细胞构成，血运丰富；乳头下真皮浅层呈网状，较疏松，有粘液，间有少量微血管；真皮深层含有较粗大的胶原纤维、小动脉和小静脉血管，及少量脂肪细胞。这些特点与CNV的组织病理结构特点十分相似，因此，在理论上具有将鸡冠作为光动力治疗视网膜黄斑变性药物筛选模型的基础。
发明内容
针对上述现有建立视网膜黄斑变性动物模型方法的不足，本发明提供了一种视网膜黄斑变性的动物模型，弥补了目前常用模型存在的对操作技术要求高、CNV生成率低及生长周期长、成本高等不足，可用于光动力治疗视网膜黄斑变性药物的筛选。
所述的一种视网膜黄斑变性的动物模型是：雄性鸡的鸡冠。
所述的雄性鸡为：莱亨鸡、罗曼鸡。
所述的视网膜黄斑变性为：年龄相关性视网膜黄斑变性。
所述的一种视网膜黄斑变性的动物模型，可用于光动力治疗视网膜黄斑变性药物的筛选。
本发明的一种视网膜黄斑变性的动物模型，在使用维替泊芬(Verteporfin)(迄今为止国际上用于年龄相关性视网膜黄斑变性治疗的唯一光敏剂新药)后，其对鸡冠的PDT效应与对传统方法诱导的CNV模型的疗效是相一致的。表明该模型可较好地用于筛选光动力治疗视网膜黄斑变性的药物，且具有天然形成、周期短、重现性好、成本低、对操作技术要求低等优点。
附图说明
图1Verteporfin、ZWL3对鸡冠的PDT效应对比图
图2Verteporfin-PDT、ZWL3-PDT治疗CNV前后疗效对比图
具体实施方式
[实施例1]
Verteporfin对鸡冠的PDT效应与Verteporfin对氪激光诱导的CNV模型疗效的对比
1.Verteporfin对鸡冠的PDT效应的观察
受试动物：莱亨鸡，雄性，24只，随机分为4组(空白对照组、单纯Verteporfin组，单纯激光组，Verteporfin-PDT组)，每组6只。
受试药物：Verteporfin
实验方法：
空白对照组不作任何处理；
单纯Verteporfin组，Verteporfin以剂量0.585mg/kg(相当于人0.25mg/kg)翅根静脉推注，不照光。
单纯激光组，以速眠新(0.2ml/kg)麻醉，标记照光区，固定鸡冠，直接照光。
Verteporfin-PDT组，以速眠新(0.2ml/kg)麻醉，标记照光区，固定鸡冠，避光条件下以0.585mg/kg(相当于人0.25mg/kg)翅根静脉推注Verteporfin，注射完毕即刻照光。
单纯激光组和Verteporfin-PDT组均用630nm激光治疗仪进行照射，能量密度为90J/cm2，光斑直径为1.5cm，不照光处双层红黑布适当遮盖。
效应观察和评价：
所有实验组于第1d、第3d、第7d、第14d，第28d进行肉眼观察并照相，Verteporfin-PDT组根据肉眼观察结果评定PDT效应等级。
所有实验组于第3d在鸡冠照射区域中心取材，做病理切片行HE染色。P组根据病理切片光镜下评定PDT效应等级。
PDT效应分级标准：
大体PDT效应分级标准见表1，组织病理PDT效应分级标准见表2.
表1PDT效应分级(大体)
表2PDT效应分级(组织病理)
实验结果：
I.肉眼观察鸡冠反应强度结果
肉眼观察鸡冠反应结果显示空白对照组、单纯Verteporfin组，单纯激光组鸡冠处理前后无明显改变。
Verteporfin-PDT组5例为重度改变，l例为中度改变。褪色反应持续时间较长，14d时PDT褪色效果达到最好并一直稳定持续，到28d观察结束时仍可见鸡冠明显褪色。
II.光镜下观察PDT反应强度结果
病理切片结果显示空白对照组、单纯Verteporfin组，单纯激光组鸡冠处理前后无明显改变，可见表皮正常，真皮浅层血管清晰，血管分支多，弯曲度大，迂曲明显，呈网状、均匀、密集分布，毛细血管管腔明显扩张，管径在100pm，甚至更大，内有红细胞，内皮细胞完整。
Verteporfin-PDT组4例为重度改变，2例为中度改变。部分表皮细胞灶性空泡变性和坏死；乳头层大量毛细血管闭塞，腔内有很多凝集、碎裂的红细胞和微血栓，部分血管破裂，漏出形态改变的红细胞管周胶原纤维变性等；网状层血管内皮细胞肿胀，红细胞凝集、碎裂和微血栓，炎细胞浸润。
结论：本研究表明Verteporfin对于鸡冠的PDT效应为重度，所以我们推测Verteporfin对CNV的治疗具有显著效果。
因此，下面实验对我们的推测进行了验证。
2.Verteporfin对氪激光诱导的CNV模型疗效的观察
受试动物：氪激光诱导CNV形成的BN大鼠，24只，随机分为4组(空白对照组、单纯Verteporfin组，单纯激光组，Verteporfin-PDT组)，每组6只。
受试药物：Verteporfin
实验方法：
空白对照组不作任何处理；
单纯Verteporfin组，Verteporfin以剂量1.35mmg/kg(相当于人0.25mg/kg)尾静脉注射，不照光。
单纯激光组，腹腔内注射10％水合氯醛溶液3.5ml/kg麻醉，复方托品酰胺滴眼液散瞳，固定，直接照射CNV处。
Verteporfin-PDT组，腹腔内注射10％水合氯醛溶液3.5ml/kg麻醉，复方托品酰胺滴眼液散瞳，固定，避光条件下以1.35mg/kg(相当于人0.25mg/kg)尾静脉注射Verteporfin，注射完毕即刻照射CNV处。
单纯激光组和Verteporfin-PDT组均用630nm激光治疗仪进行照射，能量密度为90J/cm2，光斑直径为800μm。
疗效观察和评价：
眼底荧光素钠造影(FFA)
分别于PDT后24h、7d各组大鼠麻醉，将10％荧光素钠lml/kg自腹腔注入，实验组和对照组眼分别行FFA检察，观察治疗区域CNV闭合情况。
组织病理学光镜观察
分别于PDT后24h、7d取材，做病理切片行HE染色。光镜下观察治疗区域CNV的闭合情况。
实验结果：
I.FFA检查
FFA检查结果显示空白对照组、单纯Verteporfin组，单纯激光组CNV区域处理前后无明显改变，为晚期圆盘状强荧光渗漏。
Verteporfin-PDT组，FFA显示无荧光素渗漏。
II.光镜下观察疗效
病理切片结果显示空白对照组、单纯Verteporfin组，单纯激光组鸡冠处理前后无明显改变。
Verteporfin-PDT组PDT后24h，CNV病变中的微血管闭合，RPE层和光感受器层轻微伤偶见外核层固缩，未见脉络膜毛细管和视网膜血管闭合。
结论：Verteporfin-PDT对于CNV的疗效显著，能有效的闭合CNV。
3.结论
由以上1，2实验，可知Verteporfin对于鸡冠的PDT效应与Verteporfin对CNV的PDT疗效是相一致的。表明本发明提供的一种动物模型，即雄性鸡的鸡冠，可用于视网膜黄斑变性光动力药物的筛选，且具有天然形成，周期短，重现性好，成本低，对操作技术要求低等优点。
[实施例2]
ZWL3对鸡冠的PDT效应与ZWL3对氪激光诱导的CNV模型疗效的对比
1.ZWL3对鸡冠的PDT效应的观察
受试动物：莱亨鸡，雄性，24只，随机分为4组(空白对照组、单纯ZWL3组，单纯激光组，ZWL3-PDT组)，每组6只。
受试药物：ZWL3(本实验室自主合成的新光敏化合物：中介-四[3-(1-吡咯烷基)-4-甲氧基苯基]二氢卟吩)
实验方法：
空白对照组不作任何处理；
单纯ZWL3组，ZWL3以剂量10mg/kg翅根静脉推注，不照光。
单纯激光组，以速眠新(0.2ml/kg)麻醉，标记照光区，固定鸡冠，直接照光。
ZWL3-PDT组，以速眠新(0.2ml/kg)麻醉，标记照光区，固定鸡冠，避光条件下以10mg/kg翅根静脉推注ZWL3，注射完毕即刻照光。
单纯激光组和ZWL3-PDT组均用630nm激光治疗仪进行照射，能量密度为90J/cm2，光斑直径为1.5cm，不照光处双层红黑布适当遮盖。
效应观察和评价：
所有实验组于第1d、第3d、第7d、第14d，第28d进行肉眼观察并照相，ZWL3-PDT组根据肉眼观察结果评定PDT效应等级。
所有实验组于第3d在鸡冠照射区域中心取材，做病理切片行HE染色。P组根据病理切片光镜下评定PDT效应等级。
PDT效应分级标准：
大体PDT效应分级标准见表1，组织病理PDT效应分级标准见表2.
实验结果：
I.肉眼观察鸡冠反应强度结果
肉眼观察鸡冠反应结果显示空白对照组、单纯ZWL3组，单纯激光组鸡冠处理前后无明显改变。
ZWL3-PDT组3例为重度改变，3例为中度改变。褪色反应持续时间较短，7d时PDT褪色效果达到最好之后部分个体开始恢复正常红色，28d后50％的鸡冠完全恢复正常鲜红色。
II.光镜下观察PDT反应强度结果
病理切片结果显示空白对照组、单纯ZWL3组，单纯激光组鸡冠处理前后无明显改变，可见表皮正常，真皮浅层血管清晰，血管分支多，弯曲度大，迂曲明显，呈网状、均匀、密集分布，毛细血管管腔明显扩张，管径在100μm，甚至更大，内有红细胞，内皮细胞完整。
ZWL3-PDT组3例为重度改变，3例为中度改变。小部分表皮细胞灶性空泡变性和坏死；部分乳头层毛细血管闭塞，腔内凝集、碎裂的红细胞和微血栓，网状层部分血管扩张，内皮细胞肿胀。
结论：本实验中光敏剂ZWL3对于鸡冠的PDT效应为中度偏重，我们推测ZWL3-PDT对于CNV的治疗具有一定的效果。
因此，下面实验对我们的推测进行了验证。
2.ZWL3对氪激光诱导的CNV模型疗效的观察
受试动物：氪激光诱导CNV形成的BN大鼠，24只，随机分为4组(空白对照组、单纯ZWL3组，单纯激光组，ZWL3-PDT组)，每组6只。
受试药物：ZWL3(本实验室自主合成的光敏新化合物：中介-四[3-(1-吡咯烷基)-4-甲氧基苯基]二氢卟吩)
实验方法：
空白对照组不作任何处理；
单纯ZWL3组，ZWL3以剂量10mg/kg尾静脉注射，不照光。
单纯激光组，腹腔内注射10％水合氯醛溶液3.5ml/kg麻醉，复方托品酰胺滴眼液散瞳，固定，直接照射CNV处。
ZWL3-PDT组，腹腔内注射10％水合氯醛溶液3.5ml/kg麻醉，复方托品酰胺滴眼液散瞳，固定，避光条件下以10mg/kg尾静脉注射ZWL3，注射完毕即刻照射CNV处。
单纯激光组和ZWL3-PDT组均用630nm激光治疗仪进行照射，能量密度为90J/cm，光斑直径为800μm。
疗效观察和评价：
眼底荧光素钠造影(FFA)
分别于PDT后24h、7d各组大鼠麻醉，将10％荧光素钠lml/kg自腹腔注入，实验组和对照组眼分别行FFA检察，观察治疗区域CNV闭合情况。
组织病理学光镜观察
分别于PDT后24h、7d取材，做病理切片行HE染色。光镜下观察治疗区域CNV的闭合情况。
实验结果：
I.FFA检查
FFA检查结果显示空白对照组、单纯ZWL3组，单纯激光组CNV区域处理前后无明显改变，为晚期圆盘状强荧光渗漏。
ZWL3-PDT组，FFA显示部分CNV治疗区出现低荧光素渗漏。
II.光镜下观察疗效
病理切片结果显示空白对照组、单纯ZWL3组，单纯激光组鸡冠处理前后无明显改变。
ZWL3-PDT组PDT后24h，可见不同程度的CNV和脉络膜毛细管闭合，RPE层和光感受器层轻微伤偶见外核层固缩，未见脉络膜毛细管和视网膜血管闭合。
结论：ZWL3-PDT对于CNV治疗有一定的效果，可以不同程度的闭合CNV。
3.结论
由以上1，2实验，可知ZWL3对于鸡冠的PDT效应与ZWL3对CNV的PDT疗效是相一致的。表明本发明提供的一种动物模型，即雄性鸡的鸡冠，可用于视网膜黄斑变性光动力药物的筛选，且具有天然形成，周期短，重现性好，成本低，对操作技术要求低等优点。
Claims (5)
1.一种视网膜黄斑变性的动物模型，其特征在于：动物模型为雄性鸡的鸡冠。
2.根据权利要求1所述的一种视网膜黄斑变性的动物模型，其特征在于：所述的雄性鸡是莱亨鸡。
3.根据权利要求1所述的一种视网膜黄斑变性的动物模型，其特征在于：所述的雄性鸡是罗曼鸡。
4.根据权利要求1所述的一种视网膜黄斑变性的动物模型，其特征在于：所述的视网膜黄斑变性是年龄相关性视网膜黄斑变性。
5.根据权利要求1所述的一种视网膜黄斑变性的动物模型，其特征在于：可用于筛选光动力治疗视网膜黄斑变性的药物。
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| CN201410192630.3A CN103948925A (zh) | 2014-05-08 | 2014-05-08 | 一种视网膜黄斑变性的动物模型 |
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| CN107787912A (zh) * | 2017-10-20 | 2018-03-13 | 广东省生物资源应用研究所 | 一种干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型的诱导方法 |
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2014
- 2014-05-08 CN CN201410192630.3A patent/CN103948925A/zh active Pending
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