CN101735885B - 一种从柏子仁中提取柏子仁油及胡萝卜苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从柏子仁中提取柏子仁油及胡萝卜苷的方法，采用以下步骤：取柏子仁，粉碎，用石油醚提取2次，得柏子仁油；提取柏子油后的柏子仁，挥尽石油醚，用乙醇提取2次，合并滤液；合并后的滤液回收乙醇至浸膏状，加入占浸膏1-4重量倍的柱层析硅胶，搅拌均匀，置干燥箱中，干燥，放冷，得柱层硅胶拌和物；取占浸膏4-8重量倍的柱层析硅胶，用石油醚湿法装柱，将柱层硅胶拌和物加入层析柱中，用体积比为1∶1的石油醚-醋酸乙酯洗脱，洗脱至流出液近无色，改用醋酸乙酯洗脱，合并醋酸乙酯洗脱液，回收醋酸乙酯，得胡萝卜苷粗分离物。本发明胡萝卜苷制备工艺方法简便，所用提取、洗脱溶剂毒性低，得到的胡萝卜苷纯度高，杂质少，易于精制，适于规模化制备或生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从柏子仁中提取柏子仁油及胡萝卜苷的方法。
背景技术
脂肪油中不饱和脂肪酸可分为单不饱和脂肪酸(MU-FA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)。不饱和脂肪酸可分为n-3族、n-6族、n-7族、n-9族，其中n-3族和n-6族在营养学和生物学上有相当重要的意义。它们主要以复合脂的形式存在于肌体组织成分中，部分作为人体内某些活性物质的前体物质，少量以脂蛋白形式存在于血液中，微量部分以自由脂肪酸形式与血浆清蛋白结合，成为脂肪酸在体内运输载体。我们实验鉴定了柏子仁油中的6种脂肪酸，饱和脂肪酸主要是十六烷酸(6.58％)、硬脂酸(2.62％)；不饱和脂肪酸主要为亚油酸(22.97％)、亚麻酸(54.17％)、花生四烯酸(7.75％)、二十碳三烯酸(2.62％)，占脂肪酸的87.51％。表明柏子仁油含有人体需要补充的重要不饱和脂肪酸，具有广阔的开发利用前景。
胡萝卜苷是一种重要的药用原料，研究表明胡萝卜苷能保护人微血管内皮细胞抑制氧化损伤，经对氧化损伤细胞的修复作用比较后发现，胡萝卜苷表现出了修复治疗作用，但保护优于修复作用，即预防优于治疗作用。胡萝卜苷对成骨样细胞UMR106的增殖具有显著的促进作用，是对成骨样细胞UMR106的增殖的活性成分。胡萝卜苷属于天然甾类化合物，研究制备胡萝卜苷，对于开发天然活性甾体化合物药物，具有重要作用和广阔的医药前景。自然界中多种植物含有胡萝卜苷成分，含量较低，一般是在植物成分系统分离时得到，大多采用乙醇或甲醇提取，石油醚、乙醚或醋酸乙酯脱脂，再用水分散，正丁醇萃取，硅胶柱层析分离，采用梯度洗脱，洗脱剂用不同比例氯仿-甲醇。洗脱剂有毒性，为混合溶媒，不易回收应用，制得的胡萝卜苷样品量很少，不适于大量制备。
发明内容
本发明为了克服以上技术的不足，提供了一种从柏子仁中提取脂肪油，再从柏子仁粕中提取胡萝卜苷的方法，该方法具有工艺简单，提取率高，适合于工业化生产。
本发明是通过以下措施来实现的：
本发明涉及一种从柏子仁中提取柏子仁油及胡萝卜苷的方法，其特征是采用以下步骤：
(1)取柏子仁，粉碎，用石油醚提取2次，每次用4倍量，每次提取1小时，过滤，合并石油醚液，回收石油醚至净，得柏子仁油；
(2)提取柏子油后的柏子仁，挥尽石油醚，用乙醇提取2次，每次用8倍量，每次提取2小时，滤过，合并滤液；
(3)合并后的滤液回收乙醇至浸膏状，加入占浸膏1-4重量倍的柱层析硅胶，搅拌均匀，置干燥箱中，干燥，放冷，得柱层硅胶拌和物；
(4)取占浸膏4-8重量倍的柱层析硅胶，用石油醚湿法装柱，将柱层硅胶拌和物加入层析柱中，用体积比为1∶1的石油醚-醋酸乙酯洗脱，洗脱至流出液近无色，改用醋酸乙酯洗脱，以薄层色谱检测，洗脱至流出液不在检出胡萝卜苷为止，合并醋酸乙酯洗脱液，回收醋酸乙酯，得胡萝卜苷粗分离物。
本发明采用以下方法进行精制：将胡萝卜苷粗分离物用100-300重量倍乙醇加热溶解，加入占乙醇重量2-4％的活性炭，加热至沸腾，保持微沸30分钟，趁热滤过，用乙醇洗涤活性炭，合并滤液及洗液，加热，浓缩至原体积的1/4时，室温放置12小时，让沉淀析出，滤过，得胡萝卜苷精品；滤液继续浓缩1/2体积，放置，过滤，仍得胡萝卜苷精品。
上述本发明的方法，优选的：所述步骤(1)中提取温度为30-60℃；所述步骤(3)中，干燥温度为60℃，时间为5小时；所述步骤(4)中，装柱和洗脱石油醚的沸程为60-90℃；所述步骤(3)和步骤(4)中的柱层析硅胶的粒度为100-200目。
目前，制备胡萝卜苷的专利只有“从亚麻根中制备脑苷脂类化合物的方法200510068282.X”，制备过程是选用水、醇、或两者的混合物提取，浓缩的粗浸膏；将粗浸膏用水溶解，用有机溶剂包括氯仿、苯、环己烷、石油醚、溶剂油、烷基醇、醋酸乙酯提取，保留水层；水层用正丁醇萃取，正丁醇液再选用NaHCO3水溶液提取，用水洗涤至中性，浓缩得总提取物；总提取物用硅胶柱分离，洗脱液为氯仿、醋酸乙酯或二氯甲烷-乙醇或甲醇混合溶剂，其体积可以从50∶1开始，逐步增大甲醇或乙醇含量，得三种苷类化合物，其一为胡萝卜苷(含量980mg/26kg)，含量极低，单一制备成本很高。
本发明制备胡萝卜苷方法采用石油醚或溶剂油提取分离柏子仁中脂肪油，残渣用乙醇提取，乙醇提取液浓缩得浸膏，直接将浸膏与硅胶混合上层析柱，用石油醚-醋酸乙酯(1∶1)洗脱，再用醋酸乙酯洗脱，即可得到胡萝卜苷。本发明胡萝卜苷制备工艺方法简便，所用提取、洗脱溶剂毒性低，得到的胡萝卜苷纯度高，杂质少，易于精制，适于规模化制备或生产。
附图说明
图1为自然光下的薄层色谱图
图2为荧光下的薄层色谱图
图3为液相色谱图
图中，1为胡萝卜苷样品2为胡萝卜苷样品和胡萝卜苷对照品3为胡萝卜苷对照品。
具体实施方式
实施例1：
取10Kg柏子仁，粉碎，用石油醚(40℃)提取2次，每次用4倍量，每次提取1小时，过滤，合并石油醚液，回收石油醚至净，得4.6Kg柏子仁油，精制后可食用。
提取柏子油后的柏子仁挥尽石油醚，用乙醇提取2次，每次用8倍量，每次提取2小时，滤过，合并滤液。回收乙醇至浸膏状，得浸膏1.1Kg。加入2.2Kg柱层析硅胶(100-200目)搅拌均匀，置干燥箱中，60℃干燥约5小时，放冷，得柱层硅胶拌和物。取8.8Kg柱层析硅胶(100-200目)，用石油醚(70℃)湿法装柱，将上述柱层硅胶拌和物加入层析柱中，用石油醚(70℃)-醋酸乙酯(1∶1)洗脱，洗脱至流出液近无色，改用醋酸乙酯洗脱，以薄层色谱检测，洗脱至流出液不在检出胡萝卜苷为止，合并醋酸乙酯洗脱液，回收醋酸乙酯，得胡萝卜苷粗分离物。
将胡萝卜苷粗分离物用200倍乙醇加热溶解，加入占乙醇重量2％活性炭，加热至沸腾，保持微沸30分钟，趁热滤过，用少量乙醇洗涤活性炭，合并滤液及洗液。将上述滤液浓缩至原体积的1/4时，室温放置12小时，让沉淀析出，滤过，得4.5g胡萝卜苷精品，含量达98％，见液相色谱图。滤液继续浓缩1/2体积，放置，过滤，得1.2g胡萝卜苷精品。
实施例2
取10Kg柏子仁，粉碎，用石油醚(50℃)提取2次，每次用4倍量，每次提取1小时，过滤，合并石油醚液，回收石油醚至净，得4.4Kg柏子仁油，精制后可食用。
提取柏子油后的柏子仁挥尽石油醚，用乙醇提取2次，每次用8倍量，每次提取2小时，滤过，合并滤液。回收乙醇至浸膏状，得浸膏1.0Kg。加入2.0Kg柱层析硅胶(100-200目)搅拌均匀，置干燥箱中，60℃干燥约5小时，放冷，得柱层硅胶拌和物。取10Kg柱层析硅胶(100-200目)，用石油醚(80℃)湿法装柱，将上述柱层硅胶拌和物加入层析柱中，用石油醚(80℃)-醋酸乙酯(1∶1)洗脱，洗脱至流出液近无色，改用醋酸乙酯洗脱，以薄层色谱检测，洗脱至流出液不在检出胡萝卜苷为止，合并醋酸乙酯洗脱液，回收醋酸乙酯，得胡萝卜苷粗分离物。
将胡萝卜苷粗分离物用200倍乙醇加热溶解，加入2％活性炭，加热至沸腾，保持微沸30分钟，趁热滤过，用少量乙醇洗涤活性炭，合并滤液及洗液。将上述滤液浓缩至原体积的1/4时，室温放置12小时，让沉淀析出，滤过，得4.7g胡萝卜苷精品，含量达98％，见液相色谱图。滤液继续浓缩1/2体积，放置，过滤，得1.1g胡萝卜苷精品。产品鉴定：取实施例1的胡萝卜苷精品进行以下鉴定
1颜色反应
1.1Liebermann-Burchard反应
取粉末样品约2mg，置试管中，加醋酐试剂1ml，振摇使溶解，沿试管壁缓缓加入浓硫酸试剂1ml。在醋酐与浓硫酸界面上呈现紫红色圆环，放置后呈污绿色，说明化合物具有甾体结构。
1.2Molish反应
取粉末样品约2mg，置试管中，加入1ml乙醇微热使溶解，然后加两滴Molish试剂(取α-萘酚5g，用95％乙醇溶解至100ml，临用前配制。)，摇匀。倾斜试管，沿管壁小心加入约1mL浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的呈现紫红颜色。说明化合物具有糖类结构。
2.1薄层鉴别
取样品2mg，加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取胡萝卜苷对照品(山东大学提供)2mg，加甲醇2ml使溶解，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005版一部附录IVB)试验，吸取上述两种溶液各5ul，分别点于同一羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，并将二者点一混合斑点，以氯仿-甲醇(10∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃加热至斑点显色清晰。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同紫红色斑点，混合点样斑点为一个斑点，颜色一致；荧光斑点。再将薄层板置紫外灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同橙红色荧光斑点，混合点样斑点为一个斑点，颜色一致。薄层色谱见图1、2。
2.2液相色谱
Waters 2695高效液相色谱仪，empower工作站；waters 2420蒸发光散射检测器；Scienhome inertex C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(80∶20)；流速：1.0mL·min-1；柱温：30℃；载气为氮气；气体压力为30.0psi；增益：100；漂移管温度：80℃。胡萝卜苷精品的液相色谱图如图3所示。
Claims (5)
1.一种从柏子仁中提取柏子仁油及胡萝卜苷的方法，其特征是采用以下步骤：
(1)取柏子仁，粉碎，用石油醚提取2次，每次用4倍量，每次提取1小时，过滤，合并石油醚液，回收石油醚至净，得柏子仁油；
(2)提取柏子油后的柏子仁，挥尽石油醚，用乙醇提取2次，每次用8倍量，每次提取2小时，滤过，合并滤液；
(3)合并后的滤液回收乙醇至浸膏状，加入占浸膏1-4重量倍的柱层析硅胶，搅拌均匀，置干燥箱中，干燥，放冷，得柱层硅胶拌和物；
(4)取占浸膏5-10重量倍的柱层析硅胶，用石油醚湿法装柱，将柱层硅胶拌和物加入层析柱中，用体积比为1∶1的石油醚-醋酸乙酯洗脱，洗脱至流出液近无色，改用醋酸乙酯洗脱，以薄层色谱检测，洗脱至流出液不再检出胡萝卜苷为止，合并醋酸乙酯洗脱液，回收醋酸乙酯，得胡萝卜苷粗分离物；
(5)将胡萝卜苷粗分离物用100-300重量倍乙醇加热溶解，加入占乙醇重量2-4％的活性炭，加热至沸腾，保持微沸30分钟，趁热滤过，用乙醇洗涤活性炭，合并滤液及洗液，加热，浓缩至原体积的1/4时，室温放置12小时，让沉淀析出，滤过，得胡萝卜苷精品；滤液继续浓缩1/2体积，放置，过滤，仍得胡萝卜苷精品。
2.根据权利要求1所述的从柏子仁中提取柏子仁油及胡萝卜苷的方法，其特征是：所述步骤(1)中提取温度为30-60℃。
3.根据权利要求1所述的从柏子仁中提取柏子仁油及胡萝卜苷的方法，其特征是：所述步骤(3)中，干燥温度为60℃，时间为5小时。
4.根据权利要求1所述的从柏子仁中提取柏子仁油及胡萝卜苷的方法，其特征是：所述步骤(4)中，装柱和洗脱石油醚的沸程为60-90℃。
5.根据权利要求1所述的从柏子仁中提取柏子仁油及胡萝卜苷的方法，其特征是：所述步骤(3)和步骤(4)中的柱层析硅胶的粒度为100-200目。
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