CN101717769A - 一种提高l-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，将本室构建的L-苯丙氨酸基因工程菌的重组表达质粒作为一个整体进行定向突变；采用烷基化试剂EMS对表达质粒进行突变的过程中，通过EMS与质粒反应时间的长短来控制突变率以获得在相同突变条件下的最佳突变时间，然后将经EMS突变处理最佳突变时间后的表达质粒电转化宿主菌构建菌株突变库；筛选获得4株L-苯丙氨酸产量不同程度提高的优良突变菌株。本发明在实现改造利于大规模发酵、易于实现产业化的L-苯丙氨酸基因工程菌产酸菌株的同时使改造操作更为容易简单。

Description

一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法

【技术领域】

本发明涉及氨基酸制备技术领域，尤其涉及一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法。

【背景技术】

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是人体和动物生命活动中必须的八大氨基酸之一，对人体和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，广泛应用于医药、食品、饲料和营养保健等领域。近年来，随着对L-苯丙氨酸生理功能了解和科学研究的不断深入，L-苯丙氨酸的应用越来越广泛，已成为一种国际市场上发展前景好，市场需求大的产品。

国内外L-苯丙氨酸的生产方法主要有水解抽提法、化学合成法、酶法和发酵法这4种。由于天然蛋白中L-苯丙氨酸含量较低，水解抽提法很少使用；化学合成法的工艺复杂，成本较高，在国外基本上被酶法和发酵法取代。但由于底物和酶的价格较高且来源有限，酶法应用也受到限制；微生物直接发酵法可利用廉价且易得的原料又可在常温常压下进行，是目前生产L-苯丙氨酸的主流方法，具有较大的竞争优势。但是由于野生菌株体内L-苯丙氨酸等终产物对芳香氨基酸合成代谢途径上的关键酶有着强烈的反馈抑制作用，使其细胞不能大量蓄积苯丙氨酸，因此若要进行实际发酵生产，就必须改造野生菌株，解除其代谢调控，使得代谢终产物能过量蓄积。

80年代中期，随着载体和受体系统的构建及基因重组等基因工程技术的发展，用基因工程的方法通过对L-苯丙氨酸代谢途径进行调控来构建L-苯丙氨酸生产菌株的研究在国外开展广泛，并取得不少成绩，而国内起步较晚。

基本原则为：选择不再受到反馈抑制的关键酶突变子，并破坏苯丙氨酸的酶系。主要的方法有：通过选育结构抗类似物突变株以解除自身的反馈抑制；切断由分支酸到预苯酸、VK、CoQ等的支路代谢；通过减少支路代谢，解除Trp和Tyr对DS的反馈调节，增加分支酸浓度的方法增加前体物；增加苯丙氨酸代谢流上aroF、pheA等关键酶基因的表达量以及切断苯丙氨酸进一步代谢途径等。

1985年，Ozaki等把一株抗苯丙氨酸结构类似物的生产菌株棒状杆菌K38染色体上的CM和PD基因克隆到质粒pcE53中，再将重组质粒转回亲株，苯丙氨酸的产量达到19g/L，比亲株提高50％；1987年Robinson等从E.coliB菌株克隆了高效的转氨基基因，将重组质粒转回亲株，其芳香族氨基酸转移酶活性为亲株的10倍；1992年，Ikeda等从苯丙氨酸生产菌株中克隆了脱敏的DS、CM及PD酶基因，并将其串联起来，克隆到同一个多拷贝的载体上，转移到苯丙氨酸生产菌株中，使之代谢流向产苯丙氨酸方向转移，产酸达28g/L.

1986年陈琦等采用原生质体融合的技术选育苯丙氨酸产生菌，以北京棒杆菌AS1.299为出发菌株，经过突变筛选，得到具有不同抗性的两个亲株，进行原生质体融合后，苯丙氨酸产量为0.6％，高于亲株50％。但这种细胞内基因重组技术的缺点：是只有同种或近缘关系的微生物之间才能进行且成功率低。

1994年中国医科大学生物技术中心的史燕东等将tyrB基因克隆质粒导入不同的宿主菌，得到产酸量提高的菌株；1999年复旦大学范长胜等通过将关键酶基因aroG、pheA进行串联表达来构建苯丙氨酸生产菌株，较大幅度提高了工程菌苯丙氨酸的发酵产酸量，但是都未能达到工业化生产水平。

从以上国内外对L-苯丙氨酸基因工程菌育种情况看出，国内外从分子水平对L-苯丙氨酸菌株育种大部分停留在构建基因工程菌的水平，且产酸水平不够理想，尚未看到在构建基因工程菌的基础上进一步对构建的表达载体采用定向改造技术进行菌种改良。

高产L-苯丙氨酸基因工程菌的构建，除改变代谢流外还可通过关键酶基因的克隆表达增加酶的表达量和提高菌株对产物的反馈抑制双重手段来提高产酸率。

此外，构建的重组表达载体质粒是否具有遗传稳定性也是限制苯丙氨酸基因工程菌产酸的重要因素。重组质粒的不稳定性主要是指重组菌在培养过程中发生突变或者缺失，使重组菌失去原有的表型特征。如果细胞含有的质粒拷贝数过高，或带有对宿主细胞有毒副作用的基因，以及以高密度培养或者连续培养的方式培养工程菌时，质粒的丢失率会大大增加等。

质粒载体含有的启动子类型、par功能区、分离机制、复制起始点和启动子的距离、启动子的强度等序列信息都会影响质粒的稳定性。

体外定向改造是一种新的分子改造策略，通过人工模拟自然进化机制来实现“在试管中的进化”。其具体方法是：首先在体外改造基因来模拟自然进化的随机突变和同源重组，并在人为创造的选择压力下，筛选出所需性质的进化分子。它不需事先了解酶分子的空间结构和催化机制，简而言之，定向进化＝随机突变+正向重组+选择(或筛选)。这样就能在较短时间内完成漫长的自然进化过程，甚至可以在几周或几个月的时间内创造出优化的酶，而在天然的进化过程中，得到这个结果需要几千万年之久。

但是定向改造作为模拟自然界分子进化的一种方式，并不能总是确切的反映进化的真实过程。定向改造操作一般针对某一个酶进行的。而我们知道在自然界中，某一表型的决定往往是多个基因共同作用的结果。而这些基因产物间往往互相影响，互相制衡，某个基因的改变往往难以造成表型的变化。

针对上述缺点，本申请人在中国发明申请第200910111381.X号，名称为一种体外定向协同共进化改造L-苯丙氨酸基因工程菌的方法的专利中提供了将一株L-苯丙氨酸基因工程菌上的aroG和pheA基因串联表达后当做一个整体，采用易错PCR和DNA改组这两种技术相结合的方法进行体外定向协同共进化改造，筛选获得一株L-苯丙氨酸产量提高114％的突变菌株，虽然有在构建基因工程菌的基础上进一步对构建的表达载体采用定向改造技术进行菌种改良而大幅度提高了L-苯丙氨酸工程菌的产酸量，但由于其需从表达质粒载体中提取出aroG和pheA基因再进行改造，操作起来复杂麻烦。因此，需要一种更为简便的提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，采用络氨酸营养缺陷型菌为宿主菌，通过突变改造基因工程菌的表达质粒，提高L-苯丙氨酸基因工程菌重组表达质粒的遗传稳定性，实现改造利于大规模发酵、易于实现产业化的L-苯丙氨酸基因工程菌产酸菌株的同时，使改造操作更为容易简单。

一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，主要是将构建的L-苯丙氨酸基因工程菌的重组表达质粒作为一个整体进行定向突变；采用烷基化试剂EMS对表达质粒进行突变的过程中，通过EMS与质粒反应时间的长短来控制突变率以获得在相同突变条件下的最佳突变时间，然后将经EMS突变处理最佳突变时间后的表达质粒电转化宿主菌构建菌株突变库；最后进行稳定高产突变菌株的筛选。

本发明具体包括以下几个步骤：

一、构建L-苯丙氨酸基因工程菌突变库

(1)EMS体外改造重组表达载体致死率的选择：以L-苯丙氨酸基因工程菌的表达质粒pbv-aroG-pheA作为突变对象，用烷基化试剂EMS对质粒DNA进行直接突变，取四支1.5ml EP管，分别加入1.5μg纯化表达质粒，分别溶于400μl高纯水，加入4μl EMS混匀后，于36℃温浴0min、30min、60min、75min、90min，对突变条件进行选择，确定最佳突变时间为60min；

(2)突变重组表达质粒电转化宿主菌构建菌株突变库：将经EMS突变处理60min后的表达质粒电转化酪氨酸营养缺陷型宿主菌构建突变菌株库；

二、从突变库中筛选获取高产稳定的L-苯丙氨酸基因工程菌株

(1)抗高浓度对氟苯丙氨酸突变菌株的初步筛选：将电转复苏的菌液，按照4％的接种量分别接到含3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml对氟苯丙氨酸的LB/Amp培养基中，37℃过夜振荡培养；

(2)高产稳定突变菌株的高通量筛选：复苏的突变菌株在对氟苯丙氨酸浓度为3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml的LB/Amp培养基中生长，含8mg/ml对氟苯丙氨酸的LB/Amp培养基菌未生长，而未突变质粒的基因工程菌H9-26在对氟苯丙氨酸浓度为4mg/ml的培养基就未见生长了，将7mg/ml对氟苯丙氨酸LB/Amp培养基中的突变菌株分离成单菌落，分别挑取突变菌株至含150μl LB/Amp培养基的96孔板中于37℃、150rpm条件下培养48h，取突变菌株发酵上清液用盐酸稀释后，采用三波段测量法测定上清液中L-苯丙氨酸的浓度，从近万株突变株中筛选获得4株L-苯丙氨酸产量不同程度提高的优良突变菌株；

(3)优良突变株质粒稳定性实验：将从平板中挑取获得的4株优良突变菌株单菌落接入2ml LB/Amp培养基中，30℃培养过夜，将种子20μl接入LB培养基中，37℃培养使菌株在LB培养基中连续生长48h，繁殖70代以上，取样涂于LB平板上，次日，随机挑取菌落100个点在LB/Amp平板上，在平板上生长菌落的百分数均超过未改造L-苯丙氨酸基因工程菌质粒稳定性的百分数。

本发明主要将本室构建的L-苯丙氨酸基因工程菌的表达质粒作为整体，采用烷基化试剂EMS对其进行突变，通过EMS与质粒反应时间的长短得到不同的突变率，对突变条件进行选择，确定最佳突变时间为60min，然后将经EMS突变处理60min的表达质粒电转化宿主菌构建菌株突变库，筛选获得4株L-苯丙氨酸产量不同程度提高的优良突变菌株。

在对L-苯丙氨酸基因工程菌进行突变改造操作以提高L-苯丙氨酸产量时，大肠杆菌体内L-苯丙氨酸的代谢复杂多样，将参与代谢的酶进行部分改造，不仅影响代谢效果，且还需对酶进行提取，操作复杂麻烦，因此，本发明在了解大肠杆菌苯丙氨酸代谢途径的基础上，将构建的L-苯丙氨酸工程菌的重组表达质粒做为一个整体进行体外定向改造。即是将L-苯丙氨酸基因工程菌的重组表达质粒进行随机突变，突变库中存在L-苯丙氨酸代谢途径相关的关键酶基因和不同程度突变的表达载体结构基因相互搭配，从而筛选获得具有更高遗传稳定性且能抵抗更高浓度的L-苯丙氨酸反馈抑制的基因工程菌。

通过质粒体外定向突变手段，筛选获取的优良菌株MD-8654质粒基因序列有8个位点发生碱基突变，并引起6个氨基酸发生改变。其L-苯丙氨酸产率由0.23g/100ml提高到0.75g/100ml，且质粒稳定性由60％提高到95％，对氟苯丙氨酸浓度由3mg/ml提高到7mg/ml。从而找到稳定高产的新苯丙氨酸基因工程菌。该技术的应用加速了关键酶基因的进化速度，提高工程菌质粒的遗传稳定性，加快了筛选的时间，降低筛选成本。

【具体实施方式】

本发明一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，主要包括以下几个步骤：

步骤一：L-苯丙氨酸基因工程菌的构建，具体包括以下构建步骤：

1、酪氨酸营养缺陷型菌株的构建

将野生型E.coil K12经UV和NTG复合突变处理，用抗生素淘汰野生型菌株，富集营养缺陷型菌株；用点植对照法获取营养缺陷型菌株，最后进行营养缺陷型菌株的鉴定，筛选获取酪氨酸营养缺陷型宿主菌。

2、碱裂解法提取E.coil K12基因组DNA

3、关键酶aroG和pheA基因的获得

以基因组DNA为模板，分别采用设计的aroG和pheA基因上下游引物，进行目的基因的PCR扩增。循环参数为：95℃预变性4min，94℃变性1min，56.5℃退火1min，72℃延伸1min，反应35个循环，最后72℃延伸10min。混匀后取5μl产物1％琼脂糖凝胶电泳检验，其余-20℃保存备用。切下特异性扩增条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按说明回收扩增的基因片断。经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用凝胶成像系统的分析软件估算核酸浓度。

4、重组质粒pMD-aroG和pMD-pheA的构建

将扩增的关键酶基因aroG和pMD-18T、pheA和pMD-18T质粒分别用EcoR I/Kpn I、Kpn I/BamH I进行双酶切，待酶切完全后取50μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖电泳PCR产物回收试剂盒回收所需要aroG/pMD-18T、pheA/pMD-18T基因片段，用T₄DNA连接酶连接，构建克隆质粒pMD-aroG和pMD-pheA。

5、关键酶基因的连接产物pMD-aroG和pMD-pheA转化感受态细胞

分别取新鲜制备的100μl感受态细胞和10μl连接产物于1.5mlEP管中，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2-10min。加入890μl 37℃预热的LB培养基，37℃200rpm振荡1h，将转化菌涂布于含7μl IPIG(20％)和40μlx-gal(2mg/μl)的LB/Amp平板上，于37℃培养16h，经蓝白斑筛选，分别挑取数个白斑单菌落于2ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，于37℃震荡培养过夜。

6、阳性克隆子的鉴定及基因的测序分析

(1)重组质粒pMD-aroG和pMD-pheA的快速制备

用碱裂解法提取保存于E.coli JM109中的含关键酶基因的pMD-aroG和pMD-pheA。

(2)重组质粒pMD-aroG和pMD-pheA的酶切验证

将提取出来的重组质粒pMD-aroG和pMD-pheA分别进行EcoR I/Kpn I及Kpn I/BamH I的双酶切验证，酶切完全后，取10μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，出现目的基因条带即可判定所挑的菌落为阳性克隆子。

(3)关键酶aroG和pheA基因序列的测定

将筛选出来的阳性克隆子pMD-aroG和pMD-pheA送生工，进行序列分析。

7、关键酶基因串联重组子pMD-aroG-pheA的构建

(1)目的基因的酶切、连接

将鉴定的阳性克隆质粒pMD-aroG和pMD-pheA分别用Kpn I和BamH I进行双酶切，酶切完全后将分别将50μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖电泳PCR产物回收试剂盒回收所需要pMD-aroG和pheA目的基因片段，用T₄DNA连接酶连接，构建表达质粒pMD-aroG-pheA。

(2)重组质粒pMD-aroG-pheA的转化

取新鲜制备的100μl感受态细胞和10μl连接产物于1.5mlEP管中，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2-10min。加入890μl 37℃预热的LB培养基，37℃200rpm振荡1h，将转化菌涂布于含7μl IPIG(20％)和40μl x-gal(2mg/μl)的LB/Amp平板上，于37℃培养16h，分别挑取数个白斑单菌落于2ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，于37℃震荡培养过夜。

(3)重组菌阳性克隆子的快速筛选及酶切验证

随机挑取20个单菌落，37℃摇床培养过夜；分别取1ml菌液到EP管中，12000rpm，离心去上清，收集菌体；加入20μl ddH₂O、20μl酚∶氯仿∶异戊醇(24∶25∶1)和4μl 6×lddding buffer，还有少量的Rnase酶，混匀后，剧烈震荡2min；震荡后，12000rpm，离心2min，取上清进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。出现目的条带即可初步判定所挑的菌落为阳性克隆子，再提取阳性重组菌的质粒进行EcoR I和BamH I双酶切验证。

8、关键酶基因串联表达重组子pBV-aroG-pheA的构建

(1)大肠杆菌培养及质粒DNA的提取。

分别取含质粒pMD-aroG-pheA和质粒pBV220的大肠杆菌单菌落，于含100μg/ml Amp的LB培养基中，37℃220rpm过夜培养，利用碱裂解法提取其质粒DNA。

(2)目的基因的酶切、连接

将鉴定的阳性克隆质粒pMD-aroG-pheA和质粒pBV220分别用EcoR I和BamH I进行双酶切，酶切完全后将50μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖电泳PCR产物回收试剂盒回收所需要-aroG-pheA-和pBV220目的基因片段，用T₄DNA连接酶连接，构建重组表达质粒pBV-aroG-pheA。

(3)重组质粒pBV-aroG-pheA的转化

将连接产物转化酪氨酸缺陷型E.coil K12感受态细胞后，涂布于含Amp的LB平板上，于37℃过夜培养。

(4)重组菌阳性克隆子的快速筛选及酶切验证

随机挑取平板上20个阳性克隆子，37℃摇床培养过夜后，利用质粒快速抽提法提取质粒DNA，电泳检测后，出现目的条带即可初步判定所挑的菌落为阳性克隆子，再提取阳性重组菌的质粒进行EcoR I和BamH I双酶切验证。

(5)质粒稳定性实验

从平板中挑取一单菌落，接入2ml含Amp抗生素的LB培养基中，30℃培养过夜，将种子20μl接入不含Amp抗生素的LB培养基中，35℃培养使菌株在热诱导前在无Amp的培养基中连续生长48h，繁殖50代以上，最后一次，细菌在生长到OD₆₀₀＝0.3时，转入37℃诱导，取样涂于不含Amp的LB平板上，次日，随机挑取菌落100个点含Amp的平板上，在含Amp平板上生长菌落的百分数为60％，证明基因工程菌稳定性有待提高。

9、重组质粒pBV-aroG-pheA的表达研究

挑取构建的L-苯丙氨酸基因工程菌单克隆，至1ml LB/Amp培养基中，37℃、220rpm振荡培养48h，3000rpm/min离心，取发酵液上清用盐酸稀释后，采用酶标仪三波段测量法测定上清液中L-苯丙氨酸的产酸水平。

以上完成了酪氨酸营养缺陷型L-苯丙氨酸基因工程菌的构建，将该工程菌作为以下定向改造的出发菌株。

步骤二：构建L-苯丙氨酸基因工程菌突变库，具体包括以下构建步骤：

1、L-苯丙氨酸基因工程菌的培养

在平板上挑取L-苯丙氨酸基因工程菌单菌落至含有Amp的3ml LB的试管中，37℃过夜培养。

2、碱裂解法提取重组质粒

(3)EMS体外改造重组表达载体致死率的选择

EMS是常用的烷基化化学突变剂，它是亲电子的化合物，很容易与生物中大分子的亲核位点起反应。烷基化试剂可使DNA发生各种类型的损伤：硷基烷基化、硷基脱落、断链等。在构成DNA的四种碱基中，鸟嘌呤和腺嘌呤最容易受到其攻击，烷基化的嘌呤碱基配对会发生变化，造成序列的改变。

在试验中，以L-苯丙氨酸基因工程菌的表达质粒pBV-aroG-pheA作为突变对象，用烷基化试剂EMS对质粒DNA进行直接突变。

该质粒上存在氨苄霉素抗性基因及复制起始点，如果突变位点发生在这两段基因的关键位点，会引起致死突变。突发发生在质粒结构的其他区域会引起质粒遗传稳定性的改变。当含有致死突变的质粒转化入宿主细胞时，在抗生素选择压力下就相应地表现为致死率。EMS与质粒反应的时间越长，突变率越高，相应的致死率越高、存活率就越低。因此，在试验中我们将存活率作为判断突变频率的指标(当存活率为1％左右时，相应的突变率大约为5个突变/kb)，取四支1.5ml EP管，分别加入1.5μg纯化表达质粒，分别溶于400μl高纯水，加入4μl EMS混匀后，于36℃温浴0min、30min、60min、75min、90min。对突变条件进行选择，确定最佳突变时间为60min。

(4)突变重组表达质粒电转化宿主菌构建菌株突变库

将EMS突变处理60min的表达载体质粒电转化酪氨酸营养缺陷型宿主菌构建突变菌株库。

步骤三：从突变库中筛选获取高产稳定的L-苯丙氨酸基因工程菌株

1、抗高浓度对氟苯丙氨酸突变株的初步筛选

将电转复苏的菌液，按照4％的接种量分别接到含3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml对氟苯丙氨酸的LB/Amp培养基中，37℃过夜振荡培养。

2、稳定高产突变株的高通量筛选

复苏的突变株在对氟苯丙氨酸浓度为3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml的LB/Amp培养基中生长，含8mg/ml对氟苯丙氨酸的LB/Amp培养基菌未生长。而未突变质粒得宿主菌，在对氟苯丙氨酸浓度为4mg/ml的培养基就未见生长了。将7mg/ml对氟苯丙氨酸的LB/Amp培养基中的突变株均匀分离单菌落。分别挑取突变菌株至含150μl LB/Amp培养基的96孔板中37℃、150rpm培养48h。取突变菌株发酵液上清用盐酸稀释后，采用三波段测量法，测定上清液中L-苯丙氨酸的浓度，从1万多株突变株中筛选获取4株L-苯丙氨酸产量不同程度提高的优良突变株：MD-3482、MD-4675、MD-8654、MD-9865。产酸分别为：0.65mg/100ml、0.70mg/100ml、0.75mg/100ml、0.68mg/100ml，未改造L-苯丙氨酸基因工程菌H9-26产酸为0.23mg/100ml。

(3)优良突变株质粒稳定性实验

从平板中挑取优良突变株单菌落MD-3482、MD-4675、MD-8654、MD-9865，接入2ml含Amp抗生素的LB培养基中，30℃培养过夜，将种子20μl接入不合LB培养基中，37℃培养使菌株在Amp的培养基中连续生长48h，繁殖70代以上，取样涂于LB平板上，次日，随机挑取菌落100个点含氨苄霉素的平板上，在Amp平板上生长菌落的百分数为70％、55％、95％、47％，证明基因工程菌有较高的质粒稳定性，未改造L-苯丙氨酸基因工程菌质粒稳定性为60％。

(4)优良突变株MD-8654基因序列的分析

碱裂解法提取优良突变株MD-8654的质粒DNA，测定基因序列。

测序结果表明通过定向改造L-苯丙氨酸基因工程菌重组表达载体筛选获得的优良L-苯丙氨酸基因工程菌的质粒基因共8个碱基位点产生突变，其中在表达载体结构基因发生3个碱基的突变，引起了2个氨基酸的突变，L-苯丙氨酸代谢途径相关的关键酶基因aroG、pheA操纵子上发生共发生5个碱基的突变引起了4个氨基酸的突变。

将上述经过改造后的基因工程菌突变株MD-9865应用于扩大生产，在50M³发酵罐中平均产L-苯丙氨酸水平达7.1g/100ml，且生产性能稳定。

本发明主要将本室构建苯丙氨酸基因工程菌的表达载体采用化学药品EMS进行体外定向改造，提高L-苯丙氨酸基因工程菌重组表达质粒的遗传稳定性，同时使之表达的酶既有高效的催化活性又能抵抗L-苯丙氨酸反馈抑制，从而筛选获得一株稳定高产的L-苯丙氨酸基因工程菌MD-8654，发酵罐产酸水平比未改造的基因工程菌H9-26提高226％。

对重组表达质粒的定向改造，通过改变某些氨基酸残基的性质，得到比原始序列具有优化性质的蛋白或者更加稳定的基因结构，这种方法在制药和工业生产领域有广阔的应用前景。如改变重组载体的遗传稳定性、酶的Km值，改变酶与底物结合的能力；改变酶的最适pH值、耐热性、溶解性等；增加酶的特异性，减少副反应；解除别构效应引起底物对酶的反馈抑制等以增加产量。

为了构建稳定高产的L-苯丙氨酸基因工程菌，解除产物L-苯丙氨酸对其代谢途径关键酶的反馈抑制，使代谢流充分流向L-苯丙氨酸产生的方向，我们将L-苯丙氨酸工程菌的重组表达质粒做为一个整体进行体外定向改造。在对L-苯丙氨酸基因工程菌进行定向改造操作以提高L-苯丙氨酸产量时，大肠杆菌体内L-苯丙氨酸的代谢有多种酶共同参与，如果单独的对某一个酶进行改造，都很难破坏已经稳固建立的代谢平衡和酶分子间的协调。唯一的方法是将参与这一代谢途径的所有酶或者是代谢途径上的关键酶都进行改造，从而实现提高L-苯丙氨酸产量的目标。

本发明将L-苯丙氨酸基因工程菌的重组表达质粒进行随机突变，突变库中存在L-苯丙氨酸代谢途径相关的关键酶基因和表达载体结构基因不同程度改变的不同搭配，从而找到新的具有抗反馈调节机制的代谢平衡，筛选获得具有更高遗传稳定性的重组质粒，且L-苯丙氨酸关键酶基因取得更高的催化活性同时又能抵抗L-苯丙氨酸反馈抑制的基因工程菌，且整个突变改造操作较从表达质粒载体中提取关键酶基因aroG、pheA后再将其改造要容易简单。

Claims (2)

1.一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其特征在于：将构建的L-苯丙氨酸基因工程菌的重组表达质粒作为一个整体进行定向突变；采用烷基化试剂EMS对表达质粒进行突变的过程中，通过EMS与质粒反应时间的长短来控制突变率以获得在相同突变条件下的最佳突变时间，然后将经EMS突变处理最佳突变时间后的表达质粒电转化宿主菌构建菌株突变库；最后进行稳定高产突变菌株的筛选。

2.根据权利要求1所述的一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其特征在于具体包括以下几个步骤：

一、构建L-苯丙氨酸基因工程菌突变库

(1)EMS体外改造重组表达载体致死率的选择：以L-苯丙氨酸基因工程菌的表达质粒pbv-aroG-pheA作为突变对象，用烷基化试剂EMS对质粒DNA进行直接突变，取四支1.5ml EP管，分别加入1.5μg纯化表达质粒，分别溶于400μl高纯水，加入4μl EMS混匀后，于36℃温浴0min、30min、60min、75min、90min，对突变条件进行选择，确定最佳突变时间为60min；

(2)突变重组表达质粒电转化宿主菌构建菌株突变库：将经EMS突变处理60min后的表达质粒电转化酪氨酸营养缺陷型宿主菌构建突变菌株库；

二、从突变库中筛选获取高产稳定的L-苯丙氨酸基因工程菌株

(1)抗高浓度对氟苯丙氨酸突变菌株的初步筛选：将电转复苏的菌液，按照4％的接种量分别接到含3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml对氟苯丙氨酸的LB/Amp培养基中，37℃过夜振荡培养；

(2)高产稳定突变菌株的高通量筛选：复苏的突变菌株在对氟苯丙氨酸浓度为3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml的LB/Amp培养基中生长，含8mg/ml对氟苯丙氨酸的LB/Amp培养基菌未生长，而未突变质粒的基因工程菌H9-26在对氟苯丙氨酸浓度为4mg/ml的培养基就未见生长了，将7mg/ml对氟苯丙氨酸LB/Amp培养基中的突变菌株分离成单菌落，分别挑取突变菌株至含150μl LB/Amp培养基的96孔板中于37℃、150rpm条件下培养48h，取突变菌株发酵上清液用盐酸稀释后，采用三波段测量法测定上清液中L-苯丙氨酸的浓度，从近万株突变株中筛选获得4株L-苯丙氨酸产量不同程度提高的优良突变菌株；

(3)优良突变株质粒稳定性实验：将从平板中挑取获得的4株优良突变菌株单菌落接入2ml LB/Amp培养基中，30℃培养过夜，将种子20μl接入LB培养基中，37℃培养使菌株在LB培养基中连续生长48h，繁殖70代以上，取样涂于LB平板上，次日，随机挑取菌落100个点在LB/Amp平板上，在平板上生长菌落的百分数均超过未改造L-苯丙氨酸基因工程菌质粒稳定性的百分数。