CN101715486A - 用于非侵入性产前诊断的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

用于非侵入的产前诊断的方法，所述方法包括以下步骤：a.获得有机流体样品，所述有机流体具有含有来自怀孕妇女的胎儿细胞的高概率；b.使所述有机流体样品富含至少一个包括至少一种类型的胎儿具核细胞的细胞群；c.从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离至少一个细胞；d.在从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离的所述至少一个细胞上进行遗传分析，以便突出所述至少一个胎儿具核细胞的至少一种遗传特征，适于容许所述诊断；其中从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离至少一个细胞的步骤是通过在设计用于所述用途的微型流体装置中单独选择单个细胞而进行的。

Description

用于非侵入性产前诊断的方法和装置
技术领域
本发明涉及用于非侵入性产前诊断，特别是用于识别胎儿中的基因和染色体病症的方法。
现有技术
对于染色体病症的产前诊断是为了突出胎儿中的染色体异常的目的而引入的。
迄今，胎儿受染色体病症影响的诊断确定仅能通过侵入性诊断测试而获得，通过羊水穿刺、绒膜绒毛的采样或脐穿刺的方法检查胚胎细胞以确定核型。
全部这些测试是侵入性的并且涉及增加的流产风险。因此，它们通常被推荐用于超过35岁的女性，或在以前的怀孕中曾经怀有受染色体病症影响的胎儿的妇女或当超声扫描确定具有畸形的胎儿时。
在母体循环中发现胎儿细胞的存在，虽然很少，但是已经引起许多小组研究并且开发用于分离和回收所述细胞的方法，这容许非侵入性产前诊断。具体地，存在三种能通过胎盘屏障的主要胎儿细胞类型：淋巴细胞，营养细胞和成红血细胞。在这些中，研究已经首先针对研究用于分离来自外周母体血液的胎儿成红血细胞和营养细胞，源自胎盘的上皮细胞的方法。从外周血分离营养细胞受它们的多核形态的限制，然而已经证明[8-13]，在妊娠的第6周和15周之间，经宫颈样品中存在这些细胞。应当注意，从胎盘迁移的营养细胞经常粘合其它营养细胞或母体细胞，形成凝块。
最近通过直接应用到非培养的胎儿细胞的分子生物学方法已经使得胎儿细胞的鉴定成为可能。所述方法例如是产前FISH(荧光原位杂交)和定量荧光-聚合酶链式反应(QF-PCR)。QF-PCR是能识别和同时量化染色体特异性的DNA序列的方法，其可适用于单独的细胞，允许了基于非常低数量胎儿细胞的遗传分析。在文献中，存在许多出版物，包括一些综述[1-6，见说明书结尾的参考文献]，将其内容结合在这里，用于作为涉及QF-PCR在产前分析中应用的所需部分的简单参考。
D.W.Bianchi和同事基于多参数评分开发了[14-27]从母体血液分离胎儿具核红细胞(NRBCs)的系统；所述参数包括两种形态学特征(核的圆度和形态)和胎儿血红蛋白标记的两种性质(细胞质的荧光强度和周围发光度)。该流程提供根据密度梯度分离单核细胞和通过消除白细胞的富集(具有关于CD15和CD45的抗体的MACS)和使用利用γ抗-血红蛋白抗体的FACS方法在细胞荧光计上分离。在显微镜观察下，使用显微操作器回收通过多参数评分鉴定的细胞。
评分系统是非常费力的，并且使用显微操作器引起部分细胞的损失。通常，该方法已经在回收胎儿细胞方面显示74％的灵敏性，兼有5％的假阳性频率。
由其它工作还已知[7]，根据密度梯度分离单核细胞和通过缺少CD71+细胞的MACS富集样品，其进一步由关于γ和ε胎儿血红蛋白链的特异性抗体标记。然而，所述标记可以产生非特异性，因为在成人细胞中存在产生胎儿血红蛋白的情况，或归因于胎儿血红蛋白和成人血红蛋白的抗体之间的交联，这是由这些血红蛋白链的类似性所引起的。
MonaLiza医疗公司(美国专利2005/0181429A1)开发了使用经宫颈细胞的产前遗传分析方法。所述方法基于Pap涂片细胞刷用于回收经宫颈样品的用途，所述样品通过细胞离心处理以用于制备载玻片。标记经宫颈细胞并且在显微镜下进行分析并且记录它们在载玻片上的位置和坐标。在FISH中分析载玻片并且使用先前获得的坐标鉴定营养细胞。所述方法的缺点是，在用于制备载玻片的处理期间，损失部分经宫颈细胞，其由于营养细胞的缺乏而无响应(no-call)。
AVIVA-Biosciences公司(见，例如EP-A-1439897)开发了基于生物芯片的富集系统，以用于从母体血液分离胎儿细胞。该方法使用容许除去大部分红细胞的试剂，借助于高度特异性的磁珠和胎儿抗原的特异性抗体的混合物(cocktail)的分类，和借助于具有根据待分离细胞类型的可变直径孔的高分辨率过滤室的富集。
然而，所述方法被局限于通过样品富集选择胎儿细胞，这不限制具有污染的母体细胞的可能性，和因此后续发生不可靠遗传分析的风险。
简言之，迄今没有一种以上提到的非侵入性方法证明其可以被用作诊断胎儿非整倍性和/或其它染色体缺陷的常规实践。
因此本发明的目的是提供用于非侵入性产前诊断的方法，其基于采样高概率含有循环胎儿具核细胞的有机母体流体和它们的后续分离物，具体地，子宫、宫颈内或经宫颈流体、或外周母体血。本发明的另一个目的是提供用于产前诊断的方法，其可以是自动的，没有假阴性，并且具有低数量的假阳性和无响应。
发明概述
本发明涉及用于非侵入性产前诊断，特别是用于确定胎儿中的遗传异常的方法和装置。
因此，根据本发明，该诊断基于高概率含有胎儿具核细胞的有机母体流体及其后继分离物，具体地，来自子宫，宫颈内或经宫颈的流体或外周母体血而进行，识别和分析其中存在的胎儿细胞，其根据权利要求1的方法进行。
根据本发明，首先通过胎儿具核细胞的一个或多个富集阶段处理子宫、宫颈内或经宫颈的流体或外周母体血。所述方法的特征在于，使用能以容易可自动化和可重复的方式，由富集样品单独选择单个细胞的微型流体系统。通过分离单个细胞的微型流体系统，有可能获得一组具有足以进行遗传诊断的纯度的胎儿细胞。
通过微型流体装置，本发明人意指适于使用层流控制液体体积的装置。
通过微型流体装置，本发明人进一步意指具有至少一个小于1mm的维度的装置。
通过能单独选择单个细胞的装置，本发明人意指能基于对每个细胞单独评价的参数，每次一个或同时地进行一个或多个单个细胞选择的装置。
然后可以通过下列技术，诸如定量荧光PCR(QF-PCR)进行遗传分析，如果必要，使用母体细胞的分析用于比较，FISH，核型或比较基因组杂交(CGH)。
微型流体系统的使用提供多种优点，包括具有一次性(disposable)系统的可能性，在不同的分析之间没有污染风险，或不需要彻底清洗设备。而且，微型流体系统的使用提供具有自动或半自动系统的可能性，其特征在于高可靠性水平。
从一些非限制性实施例的下列描述，参考附图的图，本发明另外的特征和优点将呈现清楚。
附图简述
图1显示根据本发明的非侵入性产前诊断方法的概图。
图2显示具有10X放大倍数的芯片图像，其使用DAPI的荧光滤波器。可以观察到三个细胞核，对应三个单个细胞。
图3显示具有10X放大倍数的芯片图像，其使用FITC的荧光滤波器。拍照区域与图2相同，并且可以观察到两个Hb-ε阳性细胞和一个Hb-ε阴性细胞。
图4显示关于染色体标记物AMXY、D21S11和HPRT分析的电泳图谱。上图指关于从母体血液回收的胎儿细胞进行的分析，下图指关于母体细胞进行的分析。该图显示胎儿中存在性染色体X和Y，并且在D21S11处，胎儿细胞具有从母亲(M)继承的第一等位基因和不同的第二等位基因(属于父系来源(P))。
图5显示关于染色体标记物D18S391、D13S631和D21S1411分析的电泳图谱。上图指关于从母体血液回收的胎儿细胞进行的分析，下图指关于母体细胞进行的分析。该图显示关于标记物D13S631和D21S1411，存在两种等位基因(正常杂合子)，且母体细胞的污染可以被排除。
图6显示关于标记物D21S1437和D21S1446分析的电泳图谱。上图指关于从母体血液回收的胎儿细胞进行的分析，下图指关于母体细胞进行的分析。该图显示存在两种等位基因(正常杂合子)，并且母体细胞的污染可以被排除。
图7显示关于标记物D18S535分析的电泳图谱。上图指关于从母体血液回收的胎儿细胞进行的分析，下图指关于母体细胞进行的分析。该图显示存在两个无响应的等位基因(正常杂合子)。
图8显示根据本发明方法的优选实施方案的流程图。
图9显示单一栏(cage)中胎儿细胞数目(NCISCC)根据每栏细胞平均密度(ACPC)的趋势。
图10示意性显示用于实施根据本发明的方法(或者属于其实质和特征部分)的装置的实例。
发明详述
本发明的主题是用于执行非侵入性产前诊断的方法。
经宫颈样品的收集
经宫颈的样品(TCC)可以通过以下多种技术取自子宫的不同水平(外部骨，宫颈管的下部，下部子宫极，子宫内腔)：子宫颈粘液的抽吸，细胞刷或拭子，宫颈内灌洗和子宫内灌洗(IUL)。
从外周血开始的富集
可以使用多种方法富集胎儿细胞的比例，例如根据密度梯度离心，其由溶液诸如Ficoll或Percoll组成；机械富集，其基于选择nRBC和排空RBC样品的微制造的(microfabricated)过滤器；通过介电电泳分离的富集，其借助于特定装置，介电电泳活化细胞分类器(DACS)；选择性溶胞，例如选择性溶解非目的红细胞；免疫磁性分离，其借助于具有阳性选择(使用与关于待回收的胎儿群的特异性抗体连接的珠)或阴性选择(消除非目的细胞群)的免疫磁珠，并且其中这两种类型的选择可以偶联以增强所述方法的特异性(如，例如，在US2006/0051775-Bianchi中)；FACS，其关于用胎儿抗原的特异性荧光抗体标记的细胞。
这些方法的大部分还是自动的，并且所有分离方法均可以借助于根据密度梯度的离心分离全部单核细胞之后，或备选地它们可以全部应用于血液。
通常，所述过程从稀释开始，但是它不是所有技术严格必需的。
其它富集技术
另一种本领域技术人员众所周知的技术被Miltenyi Biotech(Miltenyi生物技术)称作MACS，或被Stem-cell technologies(干细胞技术)称作Easy-sep。
总之，考虑由外周母体血组成有机流体的情况，使所述血液样品富含包括至少一种类型的胎儿细胞的细胞群可以通过采用连续阶段的过程获得，所述连续阶段具有，例如，第一阶段，其中通过Ficoll密度梯度离心将全部单核细胞与预先稀释在PBS/EDTA中的母体样品分开。显然，作为备选方案，可以使用图1中总结的其它方法中的任一种，例如通过基于选自由下列组成的组中的至少一个参数进行细胞选择而富集母体样品：
a.密度；
b.形态；
c.电性质；
d.化学性质；
e.机械性质；
f.表面抗原的表达；
g.细胞质内抗原的表达；
h.介电性质；
i.磁性质；
或它们的组合。
随后，胎儿细胞的富集还通过第二阶段获得，其中由在第一步骤中回收的单核细胞进行阳性或阴性选择，例如表达CD71。显然，第二富集步骤可以包括基于包括至少一种类型的胎儿具核细胞的细胞群的至少一个下列特征进行的选择：
a.表达CD71表面抗原(如已经描述的并且其代表本发明的优选形式)；
b.表达CD34表面抗原；
c.表达GPA表面抗原；
d.不表达CD14表面抗原；
e.不表达CD15表面抗原；
f.不表达CD45表面抗原。
而且，所述使样品富含包括至少一种类型的细胞的细胞群的第二阶段可以通过下列技术之一进行：
a.MACS或磁性活化细胞分类器；
b.DACS或介电电泳活化细胞分类器；
c.FACS或荧光活化细胞分类器。
胎儿细胞的标记
营养细胞的免疫染色
如果样品是TCC样品，在标记以前，将样品用乙酰基-半胱氨酸温育并且剧烈搅拌以溶解凝块并获得单个细胞悬浮液。
为了鉴别胎儿细胞，使用利用关于胎儿细胞的特异性抗体的标记(能从母体细胞辩别它们)，其如已知技术进行。营养细胞可以使用多种针对特异性抗原的抗体来标记，所述特异性抗原：
HLA-G，NDOG-5，BC1，因子XIII，FDO202N，JunD，Fra2，HASH2和PP5(胎盘蛋白质)，其特异于绒毛外营养细胞；
FT1.41.1，I03，NDOG-1和AB-154，其特异于合胞体营养细胞；
CK-7(细胞角蛋白-7)，CHL1(CD146)，CHL2，H315，HLA-C，αHCG，IGF-II，PAI-1和p57，其在营养细胞上表达；
PLAP(胎盘碱性磷酸酶)，AB-340和D6，其在合胞体营养细胞和细胞滋养层上表达；
Tapasin和CAR，其特异于侵入性或绒毛外但非绒毛营养细胞；
PLAC1，PLAC4，PLAC8和PLAC9，胎盘特异的，具体是营养细胞谱系细胞；
PAR-1(蛋白酶活化受体)，其在来自妊娠第7至第10周的胎盘细胞上表达；
GLUT-12(葡萄糖转运蛋白)，其在来自妊娠的第10至第12周的合胞体营养细胞和绒毛外营养细胞上表达；
NDPK-A(二磷酸核苷激酶A)，其在怀孕最初的三个月期间内表达在绒毛外营养细胞上。
来自外周母体血样品的成红血细胞的免疫染色
为了鉴别胎儿细胞，使用利用关于胎儿细胞的二级特异性抗体的标记(能从母体细胞辩别它们)，不同于用于富集的抗体，其如上所述，不必须特异于胎儿细胞。
在这种情况下可以使用下列：
·识别表面抗原(如i-抗原)的抗体
·细胞内抗原(例如，球蛋白链γ或ε。在这些情况下，细胞优选是固定的和渗透化的，如在已知技术中，以容许良好标记。
应当注意，虽然从以前研究已知抗-i-抗原抗体标记胎儿细胞的用途，但是所述抗体直接使用在基于密度梯度的装置中。在富集CD71+细胞之后借助于i-抗原抗体标记胎儿细胞具有进行预选择胎儿细胞(富含胎儿成红血细胞的样品)和促进识别目的细胞的优点，从而进一步获得非常灵敏和特异性的标记。
已经标记的细胞
胎儿细胞可以是已经标记的，条件是在富集中使用了特异于胎儿细胞(能从母体细胞辩别它们)并且是荧光的或与荧光珠缀合的或与荧光二级或三级抗体缀合的抗体。在这种情况下，可以将富集的样品直接注射到能选择单个细胞的微型流体装置中，因为其已经可能用于识别胎儿细胞。
单个胎儿细胞的分离
随后，将含有所述细胞的样品放置在能单独选择任何已知类型的单个细胞的微型流体装置中。为了所述目的，可以使用介电电泳分离(DEPArray，使用例如PCT/IB2007/000963中或PCT/IB2007/000751，或[31]和[32]中描述的技术)，或光电子阱或光原子间致导电性(optophoretic)分离或激光镊[28-30]。所述文件[28-30]和[31-32]的内容结合在这里，用于简单参考所需的部分。
目的细胞的识别可以例如通过以下传感器进行：
-外部的
-光学的，诸如荧光显微镜，
或者还有
-内部的
-光学的，如专利PCT/IB2006/000636和WO2007010367中举例说明地，其描述识别荧光细胞的综合方法
-impedentiomeric，如专利PCT/IB2006/000636和WO2007010367中举例说明地，以识别与细胞有关的介电珠。
遗传分析
可以在回收的胎儿细胞上进行多种类型的分析，容许以不同水平的分辨率和灵敏性并且根据研究的诊断目的，进行基因或染色体的表征。
在假定的染色体病症的事件中，可以进行使用典型或分子方法(FISH)的核型分析或通过QF-PCR的染色体标记物研究。还可以通过比较基因组杂交研究遗传材料的获得或损失。
本发明优选实施方案的实施例
经由本发明目的的非限制性实施例，给出了根据本发明方法的优选实施方案，遵循图8中所示的流程图。
样品收集
从怀孕女性获取10ml外周血。
富集
本发明的优选实施方案包括采用连续阶段方式的过程，其具有第一阶段，其中将全部单核细胞与母体样品分开。
所述阶段包括用PBS pH7.2的1∶1稀释母体血液。然后使稀释的样品根据单一Ficoll梯度1.077g/ml分层，并且在22℃以300g的速度离心30分钟。将已经积累在Ficoll以上的细胞环收集并转移到无菌试管。
根据本发明的特征，一部分血液或单核细胞不进行进一步处理并用于母体DNA的分析。
然后通过第二阶段进一步获得胎儿具核细胞的富集，其中从在第一步骤中回收的单核细胞中阳性选择表达CD71的细胞。该阳性选择通过使用与磁珠缀合的抗-CD71抗体的免疫磁性分离(MACS-Miltenyi生物技术(Miltenyi Biotec))进行。
为了免疫磁性分离，将细胞再悬浮在80μl的PBS/107细胞中，然后添加20μl的抗-CD71微珠(Miltenyi Biotec)/107细胞。在4℃温育15分钟以后，使细胞通过与磁场相连接、保留阳性CD71细胞的柱。然后将保留的细胞从柱中洗脱出来并用于后继阶段。
分离
将由此获得的CD71+细胞(对于CD71是阳性的)用3.7％甲醛在22℃固定15分钟。然后用处于PBS中的0.1％NP-40溶液(Sigma Aldrich(西格玛奥德里奇))渗透化固定的细胞。将识别与荧光染料FITC缀合的胎儿血红蛋白的γ链的抗体(1μg/ml)加入到渗透化的细胞。
根据本发明的重要方面，将样品进一步以组合方式用DAPI(或其它适合的标记物)反标记(countermark)，以显示所有细胞的核。
在加载在芯片中从而进行介电电泳操作和胎儿细胞分离以前，样品经历质量控制以验证标记的荧光强度和总细胞含量。将一部分标记的样品再悬浮在有效用于介电电泳操作的最小特定缓冲液体积中，并加载到用于样品质量控制的装置中并在荧光显微镜下检验：在多种通道中观察细胞的荧光强度，并且进行在DAPI中标记的细胞(总具核细胞)的计数。如果细胞浓度高于正确操作用于分离单个细胞的装置的最佳浓度，则将样品稀释以获得所需浓度；如果细胞的总数太低以致于不容许回收最小数量的胎儿细胞，则不回收胎儿细胞(无响应结果)。
为了计算最佳细胞浓度，本发明人参考特定的商业装置(DEPArrayTM，Silicon Biosystems SpA(硅生物系统SpA))，WO0069565，基于移动的介电电泳栏，特别是包括100,000栏的型号CONV 600k。
使用所述装置的优选方法提供下列步骤：
1.选择含有胎儿细胞(对标记是阳性的)的栏。
2.如果所述细胞是团块的一部分，即，它与其它非胎儿细胞共用所述栏，则将团块的细胞分到单独的栏中，直到将胎儿细胞分离到不与其它非胎儿细胞共用的栏中。如果胎儿细胞不与其它非胎儿细胞分开，则将其丢弃。
3.回收一个单一栏中的全部胎儿细胞。
使用所述装置的另一个备选优选方法提供下列步骤：
1.选择含有胎儿细胞(对标记是阳性的)的栏。
2.如果所述细胞是团块的一部分，则将其从待回收的细胞列表中丢弃。
3.回收单一栏中的全部胎儿细胞。
在所述第二情况下，考虑存在于样品中的总细胞数目(NCELLSTOT)和预期的胎儿细胞的百分比(PCI)，进行待注射到芯片中的平均细胞密度/栏(ACPC)的选择。
事实上，当ACPC增加时，存在于芯片操作室中的胎儿细胞数目增加。然而，每个细胞属于具有单个细胞的栏的概率降低，并且单一栏中的胎儿细胞数目(NCISCC)因此达到最大值ACPC～＝1。所述数值与PCI无关，并且可以根据理论最大值ACPC＝1将其限定为NCISCC的标准化数值，其趋势显示在附图9的图中。所述浓度最大化每次将样品冲洗到操作微室中时可以回收到的细胞数目。这是好的选择，条件是可以回收的胎儿细胞的总数足以用于下游的遗传分析。
随着ACPC增加，存在要丢弃的细胞百分比的增长的单调增加，则归因于这样的事实，即它们与其它非胎儿细胞共用栏，如图9中所示，参考关于存在于操作微室中的胎儿细胞数目的标准数值(标准化细胞废物)。
如果可回收的细胞数目低于下游分析所需的最小值，则可以稀释样品，并且进行更多次数的冲洗以回收更大数量的胎儿细胞。
用较少次数的冲洗回收足够数量的胎儿细胞的最佳ACPC值可以基于以上确定的统计学分析，例如，使用基于预期的胎儿细胞数量和用于遗传分析的最小细胞数量的计算法来计算，由此确定样品中存在的胎儿细胞的最小回收效率(在单一栏中的细胞/在具有其它细胞的栏中的细胞之间的比例)。从所述效率，可以推出ACPC的最大值，由此推出在所述回收效率条件下处理全部样品的最小冲洗次数。
然后将样品加载到芯片中，从而通过移动的介电电泳栏(DEPArrayTMWO 0069525，Silicon Biosystems SpA(硅生物系统SpA)，例如作为包装(package)或总装置的一部分，如图10中示意性说明)分离细胞，并且进行胎儿细胞的扫描，识别和选择，分类和回收。在具有三种不同荧光通道(或采用三种不同的波长)的显微镜下自动地或人工地观察(扫描)分栏的细胞：在此处所述的非限制性实例中，蓝色通道容许验证核的存在，以及如果必要，它的形态(例如用DAPI标记)，且绿色通道突出已经用特异性胎儿抗体标记的细胞，所述特异性胎儿抗体与在绿色波长中发射的荧光团(例如FITC)缀合。根据本发明的一个方面，还使用不同于前两种的第三种通道(例如在红色波长中发射的通道，如关于用于检测TRITC荧光的滤波器)，并且对其没有使用荧光标记物；这允许识别自发荧光细胞，对其在DAPI和绿色通道中检出的任何信号应该不是特异性的。
备选地，第三种通道可用于突出与连接荧光团，如例如CD45的抗体缀合的细胞，以识别待丢弃的细胞。
因此通过选择含有一个单个具核细胞(对于DAPI是阳性的，图2)的栏进行细胞选择，其具有强特异性胎儿抗体信号(对于FITC/Alexa是阳性的，图3)，并且其在其它通道上(例如红色通道)检测，具有低或无自发荧光。
为了进一步提高该方法的选择性，荧光标记物特别是胎儿标记物，可以由与能识别目的细胞，在该情况下是胎儿细胞的抗体缀合的荧光珠组成，而不是由简单荧光分子组成。
将细胞以数微升(＜40微升)回收在0.2毫升PCR管中。
遗传分析
从由此获得的所述细胞提取DNA，将其扩增并且分析染色体非整倍性的存在，优选地在与用于选择，且如果必要，先前已经用于富集过程的至少一部分相同的微型流体装置中操作(例如在使用DACS技术情况下)；在该情况下，所述装置可以类似于图10中所示的装置。
所述设备含有现有技术中的电极阵列，但是其特征在于主要微室(CHM)和多个次要微室(CHJ)，全部在至少一个面上由一个单一芯片或多个分开的芯片分界(delimited)，含有可以被激活的电极阵列。可以通过相对的进口(IM1)和出口(OM1)向主要微室填充包括至少一个细胞的样品。每个次要微室(CHJ)优选具有基本上更大的尺寸，但是与细胞尺寸相当。优选地，每个次要微室通过构型通道(长度和/或形式)与主要微室相连，所述构型通道足以分析所需的时间内，阻止(防止或至少限制)样品通过扩散和污染分散到其它微室中。根据说明的实施例，存在多个用于溶胞的次要微室，其例如用十字形接头与芯片上用于毛细管电泳的通道相连。备选地，根据现有技术，可以为具有双T接头的毛细管电泳提供一系列通道。任选地，在用于毛细管电泳的通道的末端，存在属于impedentiometric和/或光学类型的集成传感器，其能基于从交叉点(十字形或双T)到传感器本身分析的化合物迁移时间产生电泳图谱。根据图10，具体地，多个微室中的每个微室通过每个次要微室的流体出口(OJ)与用于电泳的毛细管(CAPJ)连接。
提取回收的胎儿细胞的DNA是通过碱性热分解进行的。
染色体变化的确定是通过借助于QF-PCR分析STR(短串联重复)或微卫星进行的。荧光毛细管电泳技术容许通过适当选择用不同的荧光分子标记的DNA片段而同时分析若干STR。
在多重-PCR中扩增属于染色体13、18和21的每一条的至少三个不同STR和性染色体的三个标记物，所述STR在种群中具有高杂合频率。在无响应的情形中，例如由于纯合性中STR的存在，扩增相同染色体的另一个STR。分析的STR是：用于分析染色体21的D21S11，D21S1410，D21S1411，D21S1412，D21S1435和D21S1446；关于染色体13的D13S631，D13S634，D13S258，D13S305和D13S742；关于染色体18的D18S535，D18S386，D18S391，D18S858和D18S51；为了分析性染色体的，分析了标记物AMXY和SRY，以及STR X22，DXYS218，DXS6803，DXS6809，DXS8377，HPRT和SBMA。
与胎儿细胞DNA的扩增平行，分析母体DNA，从而根据本发明的一个方面，识别胎儿细胞可能的母体污染或QF-PCR的可能的外部污染的存在(图4-7)。
在从使用自动测序仪(例如用ABI prism 310)进行的PCR产物的毛细管电泳获得的电泳图谱中，分析了对应于扩增的微卫星的多种等位基因的峰的面积和尺寸。同时分析母体DNA可以作为对照帮助解释遗传分析的结果，从而帮助确定实验室污染和回收的胎儿细胞被母体细胞污染的可能情况。
根据本发明的可能变化，遗传分析阶段还可以通过核型的方法进行，在所述情况中，富集至少一个包括至少一种类型的胎儿具核细胞的细胞群的阶段还包括下列阶段：
I.在中期阻断细胞。
在中期停止细胞以后，进行固定和渗透化，从而借助于细胞质内抗体识别胎儿细胞。
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Claims (21)

1.用于非侵入性产前诊断的方法，所述方法包括下列步骤：
a.由怀孕女性获得有机流体样品，所述有机流体高概率地含有胎儿具核细胞；
b.使所述有机流体样品富含至少一个包括至少一种类型的胎儿具核细胞的细胞群；
c.从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离至少一个细胞；
d.对从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离的所述至少一个细胞进行遗传分析，以便突出所述至少一个胎儿具核细胞的至少一种遗传特征，适于容许所述诊断；
其特征在于，所述从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离至少一个细胞的步骤是通过在设计用于所述目的的微型流体装置中单独选择单个细胞而进行的。
2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于所述从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离至少一个细胞的步骤通过以下步骤进行：捕获单个细胞，其优选地分别位于根据阵列定位于微型流体装置中的所述微型流体装置的多个位点的特定位点中，和随后基于至少一种参数从捕获的细胞中选择单个细胞，所述参数可以借助于微型流体装置内部或外部的传感器检测。
3.如权利要求1或2中所述的方法，其特征在于所述富集所述有机流体的所述样品的步骤包括基于选自由下列组成的组中的至少一个参数进行细胞的选择：
a.密度；
b.形态；
c.电性质；
d.化学性质；
e.机械性质；
f.表面抗原的表达；
g.细胞质内抗原的表达；
h.介电性质；
i.磁性性质；
或它们的组合。
4.如权利要求3中所述的方法，其特征在于所述使所述有机流体的所述样品富含至少一个包括至少一种类型的胎儿具核细胞的细胞群的步骤包括，处理所述有机流体的所述样品，从而分离具核细胞并且由此使其富含具核细胞的步骤。
5.如权利要求4中所述的方法，其特征在于所述处理所述有机流体的样品，从而分离具核细胞并且由此使其富含具核细胞的步骤包括，在密度梯度中离心所述有机流体的所述样品的步骤。
6.如上述权利要求的任何一项中所述的方法，其特征在于所述富集步骤包括基于所述包括至少一种类型的胎儿具核细胞的细胞群的下列特征中的至少一种进行的选择：
a.表达表面抗原CD71；
b.表达表面抗原CD34；
c.表达表面抗原GPA；
d.不表达表面抗原CD14；
e.不表达表面抗原CD15；
f.不表达表面抗原CD45
7.如上述权利要求中的一项中所述的方法，其特征在于，所述方法包括在所述富集步骤以后和在所述从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离至少一个细胞的步骤以前稀释所述有机流体的所述样品的步骤；所述稀释是基于在所述样品的具有预先确定体积的一部分中存在的具核细胞数目的计数而进行的，所述具有预先确定体积的一部分在所述富集步骤以后立即与所述有机流体的样品分开。
8.如上述权利要求的任一项中所述的方法，其特征在于，所述富集和执行遗传分析步骤中的至少一种或两种均与所述在用于执行分离步骤的所述微型流体装置内的分离步骤组合进行。
9.如权利要求8中所述的方法，其特征在于，使用装配有多个不同室的微型流体装置，所述室是相互分开并且液压连接的，其在至少一面上由一个单一芯片或通过多个分开的芯片分界。
10.如上述权利要求的任何一项中所述的方法，其特征在于，所述阶段包括用所述胎儿细胞的特异性抗体标记所述胎儿细胞的阶段，所述胎儿细胞的特异性抗体可以适于将所述胎儿细胞与母体细胞区分开，所述方法优选地通过使用多种针对选自由下列组成的组中的特异性抗原的抗体进行：
●识别胎儿营养细胞抗原诸如HLA-G的抗体
●识别胎儿表面抗原诸如i抗原的抗体
●识别胎儿细胞内抗原诸如血红蛋白链γ和ε的抗体
11.如权利要求10中所述的方法，其特征在于，所述分离至少一个胎儿细胞的步骤是通过单独选择所述微型流体装置中存在的预先用所述至少一种标记物标记的单个细胞而进行的。
12.如权利要求10或11中的一项中所述的方法，其特征在于，所述至少一种标记物是荧光标记物。
13.如权利要求10或11中的一项中所述的方法，其特征在于，所述至少一种标记物是与胎儿细胞的所述至少一种特异性抗体缀合的荧光珠。
14.如权利要求11至13中的一项中所述的方法，其特征在于，它包括用特异于细胞核的第一标记物标记所述血样的具核细胞，和用不同于第一标记物的第二标记物标记至少所述包括至少一种类型的胎儿具核细胞的细胞群的阶段，从而在所述分离至少一个胎儿细胞的步骤中仅选择突出所述第一和第二标记物存在的单个细胞。
15.如权利要求14中所述的方法，其特征在于，所述第一和第二标记物都是荧光标记物，其具有分别处于彼此不同的第一和第二波长中，优选分别处于蓝色和绿色波长中的发射。
16.如权利要求15中所述的方法，其特征在于，所述在所述分离至少一个胎儿细胞的步骤中单独选择单个细胞的阶段是通过也检测第三波长的优选在红色波长的发射而进行的，其可以通过由所述有机流体的所述样品中的所述细胞自身荧光而产生，从而仅选择以第一和第二所述波长发射但是同时不以所述第三波长发射的细胞。
17.如权利要求10至16中的一项中所述的方法，其特征在于它包括，在标记细胞以后，固定和渗透化的阶段，从而通过细胞质内的抗体用于识别胎儿细胞。
18.如上述权利要求中的一项中所述的方法，其特征在于，所述遗传分析阶段是通过QF-PCR进行的，并且包括在由所述至少一个胎儿具核细胞和至少一个母体具核细胞携带的遗传信息之间进行比较的阶段。
19.如上述权利要求的任何一项中所述的方法，其特征在于，所述使所述有机流体的所述样品富含至少一个包括至少一种类型的胎儿具核细胞的细胞群的步骤包括，将所述富含至少一个包括至少一种类型的胎儿具核细胞的细胞群的有机流体的所述样品置于培养物中，并且随后对所述样品重复富集阶段。
20.如上述权利要求的任何一项中所述的方法，其特征在于，所述有机流体的所述样品含有选自由下列组成的组中的细胞：子宫，经宫颈或宫颈内细胞或外周母体血。
21.如上述权利要求的任何一项中所述的方法，其特征在于，所述用于选择单个细胞的微型流体装置是一次性装置。
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