CN102325901A - 检测等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱 - Google Patents

检测等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱 Download PDF

Info

Publication number
CN102325901A
CN102325901A CN2009801573135A CN200980157313A CN102325901A CN 102325901 A CN102325901 A CN 102325901A CN 2009801573135 A CN2009801573135 A CN 2009801573135A CN 200980157313 A CN200980157313 A CN 200980157313A CN 102325901 A CN102325901 A CN 102325901A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
sub
equal portions
cell
gene type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801573135A
Other languages
English (en)
Inventor
阿诺德·R·奥利芬特
库尔特·A·克鲁梅尔
张海川
安德鲁·S·卡茨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Celula Inc
Original Assignee
Celula Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Celula Inc filed Critical Celula Inc
Publication of CN102325901A publication Critical patent/CN102325901A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Abstract

本发明公开了检测两种个体混合物中等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱。

Description

检测等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱
相关申请
本申请要求2008年12月22日提交的美国临时专利申请号61/140,063、2009年4月2日提交的美国临时专利申请号61/166,188和2009年8月4日提交的美国临时专利申请号61/231,232的优先权，它们全部内容通过参考的方式结合至本文。
技术领域
本发明属于检测两种个体混合物中等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱领域。
背景技术
产前诊断方法的主要目标是获得胎儿或胚胎的遗传信息。在临床实践中使用的产前遗传诊断方法主要涉及侵入性技术，如羊水诊断、绒毛膜绒毛取样和胎儿血液取样或活组织检查。那些技术涉及直接从胎儿或间接从雌性生殖结构中获取样品。由于那些方法的高度侵入性性质，它们易于对母体或胎儿引起并发症。可以在羊水诊断情况下引证的这样的并发症的例子是感染的风险、伴随可能的异源免疫的胎儿-母体出血、羊水损失和腹痛。不同的研究已经评估羊水诊断后流产风险是0.06％-2.1％，高于对照组的风险(Eddleman，Obstet Gynecol 2006 108(5)：1067-1072)。结果，羊水诊断仅被推荐给那些生产具有临床上显著的遗传变异的孩子的风险高于医源性流产的风险的女性，并且许多内科医生更喜欢引证与他们的经验相当的风险(代表性地1/300-1/500)。
为了限制引起上述并发症风险和通常是令人厌恶和/或成为母亲压力来源的侵入性产前诊断技术的使用，非侵入性方法的发展构成了现代产科学的主要目标。
特别是，在母亲血液中循环的胎儿细胞构成了作为产前遗传诊断潜在应用的遗传物质来源(Bianchi，Br J Haematol 1999 105：574-583；Fisk，Curr Opin Obstet Gynecol 1998 10：81-83)。在怀孕期间，胎儿来源的不同细胞类型穿过胎盘并在母亲血液中循环(Bianchi，Br J Haematol 1999 105：574-583)。这样的细胞类型包括淋巴样细胞和类红细胞、髓系前体和滋养层上皮细胞(细胞滋养层和合胞滋养层)。
已经描述了以产前诊断为目的的用于分析在母亲血液中循环的胎儿细胞的基因组的方法，但是它们仍然相对地限制了诊断的灵敏度和特异性(Di Naro等，Mol Hum Reprod 2000 6：571-574；Watanabe等，Hum Genet1998 102：611-615；Takabayashi等，Prenat Diagn 1995 15：74-77；Sekizawa等，Hum Genet 1998 102：393-396)。开发非侵入性的高度特异的产前诊断方法的优势来自于使用其以减少在最终该结果是阴性的孕妇中实施的侵入性诊断方法的比例的可能性。作为例子，在21三体情况下(涉及1/700女性)，在法国，通常仅当母亲是38岁时才提供产前诊断，而能够检测60％的21三体病例、价格是羊水诊断价格的5％的生化分析实验被推荐给较年轻的女性。但是，40％的21三体病例不能由目前可利用的实验检测出。已经描述了使用FISH技术在分离自母亲血浆的胎儿细胞中进行21三体的产前检测。这个方法是有趣的，但是由于胎儿细胞在血浆中很少(1/500-1/2000)并经常包括凋亡细胞，可靠的诊断将需要在非常大量的细胞上实施所述方法，导致其不能常规地完成。此外，整倍体胎儿细胞不能通过该方法鉴别。
该方法的一个局限性源自于在血液中循环的胎儿细胞以非常低的浓度存在。基于没有提前挑选的血液样品中Y染色体的PCR检测的研究已经确定要被检测的胎儿细胞的平均数是大约每毫升血液1个胎儿淋巴细胞(Bianchi，J Perinat Med 1998 26：175-85)。最近，由于改进的富集技术产生更多细胞，该胎儿细胞的平均数已经向上修订。一个新近的研究发现平均值是每毫升血液37个胎儿淋巴细胞(Huang，Prenatal Diagnosis 200828：892-899)。
因此，需要改进检测胎儿细胞等位基因和胎儿遗传变异的方法和手段。
发明内容
本发明的实施方式涉及检测胎儿等位基因和胎儿遗传变异的方法和基因型分析谱。本发明的一个实施方式是一种检测胎儿标识符的方法，包括：获得包含母本细胞和胎儿细胞混合物的样品；将所述样品分成子样品；筛选或基因型分析子样品中胎儿标识符的存在；及从至少一个子样品的胎儿细胞中鉴定至少一个胎儿标识符的存在。
本发明的实施方式可以和可能包括以下的一种或多种：一种方法，进一步包括在至少一个子样品上实行子样品扩增以提供扩增产物；一种方法，进一步包括将扩增产物分成等份，其中筛选或基因型分析子样品中至少一个胎儿标识符的存在包括筛选等份中胎儿标识符的存在；一种方法，其中子样品扩增包括一种选自以下方法的方法：全基因组扩增、全转录物组扩增、目标核酸扩增、非胎儿标识符的核酸序列的扩增、核酸序列代理(proxy)的产生和细胞分裂；一种方法，其中预扩增包括全基因组扩增或全转录物组扩增；一种方法，其中预扩增包括目标核酸扩增、非胎儿标识符的核酸序列的扩增、核酸序列代理的产生和细胞分裂；一种方法，进一步包括测定母本细胞的遗传物质在一系列目标基因座上是纯合的或杂合的，以测定母本基因型，其中筛选或基因型分析等份或子样品中胎儿标识符包括筛选或基因型分析等份或子样品中在至少一个目标基因座上不同于母本基因型的基因型，其中不同于母本基因型的基因型的存在显示了在扩增的产物中提供信息的父本等位基因的存在，和其中鉴定至少一个胎儿标识符的存在包括在至少一个等份或子样品中鉴定提供信息的父本等位基因；一种方法，进一步包括在测定母本细胞的遗传物质是纯合的或杂合的之前选择目标基因座；一种方法，进一步包括从目标基因座中选择实验基因座，其中筛选包括筛选等份中实验基因座上不同于母本基因型的基因型；一种方法，其中实验基因座的选择包括筛选混合的母本核酸和胎儿核酸的样品中在目标基因座上不同于母本基因型的基因型，并在混合的母本核酸和胎儿核酸的样品中选择具有非母本基因型的目标基因座作为实验基因座；一种方法，进一步包括分析被鉴定为含有提供信息的父本等位基因的等份或子样品以检测遗传变异；一种方法，进一步包括采集一部分被鉴定为含有提供信息的父本等位基因的等份或子样品，其中分析被鉴定为含有提供信息的父本等位基因的等份或子样品以检测遗传变异包括分析采集的部分等份或子样品；一种方法，其中采集的部分是等份或子样品的同质部分；一种方法，其中采集的部分是等份的非同质部分；一种方法，进一步包括在分析扩增的产物之前从至少两个子样品中采集被鉴定为含有提供信息的父本等位基因的等份并合并等份；一种方法，其中遗传变异是选自染色体重排、拷贝数变异和多态性的胎儿遗传变异；一种方法，其中分析包括测定包含提供信息的父本等位基因的等份中母系遗传的等位基因和父系遗传的等位基因的比例，分析所述比例以测定遗传变异的存在；一种方法，其中分析包括测定包含提供信息的父本等位基因的等份中等位基因的拷贝数，分析等位基因的拷贝数以测定遗传变异的存在；一种方法，进一步包括从至少两个子样品中分析被鉴定为含有提供信息的父本等位基因的扩增产物以检测嵌合性或异卵双胞胎的存在；一种方法，其中分析的等份或子样品不是筛选或基因型分析胎儿标识符的存在的等份或子样品，而是来自于与作为筛选或基因型分析胎儿标识符的存在的等份相同的子样品；一种方法，其中所述目标基因座对于母本基因型全部是纯合的，对于母本基因型全部是杂合的，或者包含对于母本基因型的纯合基因座和杂合基因座的混合物；一种方法，其中所述目标基因座对于母本基因型全部是纯合的；一种方法，其中扩增的产物包括基因组DNA或互补DNA；一种方法，其中测定母本基因型包括使用SNP谱以基因型分析母本遗传物质的样品，其中母本遗传物质来自作为母本细胞来源的同一个个体；一种方法，其中母本遗传物质的来源选自血液、血清、血浆、尿液、宫颈拭子、眼泪、唾液、口腔拭子或皮肤；一种方法，其中母本遗传物质的来源选自血液或口腔拭子；一种方法，其中母本核酸和胎儿核酸的混合物是无细胞核酸混合物；一种方法，其中母本和胎儿无细胞核酸样品的来源是孕妇的血液、血清、血浆、尿液、宫颈拭子、宫颈灌洗、子宫灌洗或后穹窿穿刺；一种方法，包括在单一等份或子样品中选择和筛选或基因型分析多于一个实验基因座，在多于一个等份或子样品中选择和筛选或基因型分析多于一个实验基因座，或在多于一个等份或子样品中选择和筛选或基因型分析一个实验基因座；一种方法，包括在第一等份或子样品中鉴定提供信息的父本等位基因之后，在至少第二子样品中选择和筛选或基因型分析第二目标基因座；一种方法，其中划分所述样品以产生具有细胞泊松分布或非泊松分布的子样品；一种方法，其中每一个子样品包含至多一种细胞；一种方法，进一步包括在筛选或基因型分析之前汇集来自两个或更多个子样品的等份；一种方法，其中汇集包括含有等份的排和列的孔的索引系统的应用；一种方法，进一步包括在分成子样品之前富集样品的胎儿细胞；一种方法，其中富集包括胎儿细胞超过母本细胞的差异扩增；一种方法，其中同质部分的扩增产物被分成等份；以及一种方法，其中非同质部分的扩增产物被分成等份。
本发明的另一种实施方式是用于检测胎儿等位基因的单核苷酸多态性(SNP)谱，包括至少一个包含大约5个至大约100个特异于单一染色体的独特SNP的染色体特异谱，其中在所有主要群组中测量的每一个SNP的频率范围在大约30％-大约50％；且其中SNP谱中SNP的总数是在大约5个至大约100个SNP之间。
具体实施方式
本发明的实施方式涉及检测胎儿等位基因(即，非母本等位基因/提供信息的父本等位基因)和胎儿遗传变异的方法和基因型分析谱。
本发明的实施方式涉及胎儿等位基因和胎儿遗传变异的检测，不管胎儿的性别且不需要父本核酸序列作为参考样品。通过区别母本细胞和胎儿细胞，优选地逐一细胞地，本发明的实施方式克服了由母本血液中胎儿细胞的低丰度施加的资源限制并保护了胎儿基因组或转录物组的完整性以用于比目前可利用的方法更广泛的分析。此外，通过逐一细胞地区分胎儿细胞，本发明的实施方式涉及嵌合性和异卵双胞胎的检测。
在本发明的一种优选实施方式中，对母本样品进行基因型分析以鉴定纯合的目标基因座，随后对这些纯合的目标基因座进行基因型分析以检测包含胎儿细胞的样品中胎儿杂合的基因座的存在。本领域技术人员将理解，在本文描述的任何一个实施方式中，可选择性地对母本样品进行基因型分析以鉴定杂合的目标基因座，随后对这些杂合的目标基因座进行基因型分析以检测包含胎儿细胞的样品中胎儿的纯合基因座的存在。在一些实施方式中，获得并富集母本细胞和胎儿细胞的混合物以产生相对于母本细胞的胎儿细胞浓缩的样品。然后将所述浓缩的样品分成子样品使得每一个子样品中优选地仅包含一个细胞。然后将这些子样品的每一个进行扩增以生产相应于每一个子样品的扩增产物，假设接近于基因组相对于细胞。然后将扩增产物分成等份。然后将这些等份单独地在至少一个基因座上筛选非母本等位基因，所述至少一个基因座之前在母本样品中被鉴定为纯合的；或者在至少一个基因座上进行基因型分析，所述至少一个基因座之前在母本样品中被鉴定为杂合的；分别伴随着杂合基因型或纯合基因型的检测，显示了在等份中非母本等位基因和因此的胎儿基因组或转录物组的存在。检测杂合基因型可以通过仅在选择的基因座上筛选非母本等位基因来完成。然后对相应的未筛选的等份进行进一步分析以检测胎儿遗传变异，其中至少一个等份包含完整的胎儿基因组或转录物组。
在本发明的另一种优选实施方式中，如上所述的对母本样品进行基因型分析，获得母本细胞和胎儿细胞的混合物，浓缩样品的胎儿细胞并将样品分成子样品。选择至少一个目标基因座的谱用于筛选或基因型分析子样品，在所述至少一个目标基因座处，所述母本样品是纯合的。在至少一个这些基因座上对每一个子样品单独地进行筛选或基因型分析，其中杂合基因型的检测再次显示子样品中非母本等位基因的存在。然后分析杂合的子样品中等位基因的比例以检测胎儿拷贝数变异。
如本文中所使用的，核酸指脱氧核糖核酸(如DNA、mtDNA、gDNA或cDNA)、核糖核酸(如RNA或mRNA)或本领域已知的任何其它的核酸变异体。
如本文中所使用的，目标基因座指基因组基因座或转录物组基因座，其中包含母本遗传物质的样品在此处具有可检测的基因型。在具有多于一个目标基因座的一些实施方式中，所述目标基因座由完全的纯合基因座、完全的杂合基因座或纯合基因座和杂合基因座的混合物组成。目标基因座谱也可以包含完全纯合的基因座、完全杂合的基因座或纯合基因座和杂合基因座的混合物。
如本文中所使用的，实验基因座指选择的用于在包含胎儿遗传物质的样品中进一步进行基因型分析的目标基因座。
如本文中所使用的，胎儿标识符指样品或部分样品是胎儿来源的任何指示物。胎儿标识符可以包括任何遗传变异或其它信息。胎儿标识符的一个例子是胎儿等位基因。如本文中所使用的，胎儿等位基因指提供鉴定如同胎儿的遗传来源性能的父本等位基因。父本等位基因是在父本样品中存在的任何等位基因。但是，如本文中所使用的，提供信息的父本等位基因是与非母本等位基因(如本文中所使用的)或胎儿等位基因(如本文中所使用的)等同的任何等位基因。
如本文中所使用的，遗传变异指核酸序列中的任何变异。遗传变异的范围从单碱基对变异到染色体变异，或者本领域已知的任何其它变异。遗传变异可以是简单序列重复、短串联重复、单核苷酸多态性、易位、倒位、缺失、重复或任何其它拷贝数变异。在一些实施方式中，染色体变异是染色体异常。例如，染色体变异可以是非整倍性、倒位、易位、缺失或重复。遗传变异可以是嵌合的。例如，遗传变异可以与遗传状况或遗传状况的风险因子(如囊肿性纤维化、泰-萨克斯病、亨廷顿病、阿尔茨海默病和多种癌症)关联。遗传变异还可以包括任何突变、染色体异常或在上述引用的优先权文件中公开的其它变异(如非整倍性、微缺失或微重复)。遗传变异在表型上可以具有正效果、负效果或中性效果。例如，染色体变异可以包括有利的、有害的或中性变异。在一些实施方式中，所述遗传变异是疾病或失调的风险因子。在一些实施方式中，所述遗传变异编码期望的表型形状。
获得样品(如，包含母本细胞和胎儿细胞的混合物)
在本发明的实施方式中所述的母本样品、混合母本细胞和胎儿细胞的样品和混合母本和胎儿无细胞核酸的样品可以从血液中获得。在一些实施方式中，抽取大约20-40mL的孕妇的血液。可以在怀孕期间的任何时间点采集血液样品。例如，在一些实施方式中，在第一个三个月期间采集母本样品。在其它实施方式中，在第二个三个月期间采集母本样品。在优选的实施方式中，在10-18周孕龄时采集血液。但是，可以在怀孕早期或18周孕龄后采集血液。可以根据寻求的信息或产前护理的标准改变采集的时间。也可以在一天间任何时间采集血液样品。在一些实施方式中，在早上采集血液。在其它实施方式中，在下午采集血液。
可以从身体的任何合适区域采集血液，包括胳膊、腿，或通过中心静脉导管易取得的血液。在一些实施方式中，在处理或活动后采集血液。例如，可以在盆骨检查后采集血液。也可以协调采集的时机以增加样品中存在的胎儿细胞数。例如，可以在锻炼或诱导血管扩张处理后采集血液。
在采集之后，血液可以与多种成分结合以保存或制备用于后续技术的样品。例如，在一些实施方式中，采集之后，血液用抗凝血剂、细胞固定剂、或DNA或RNA保护剂处理。在优选的实施方式中，使用包含抗凝血剂如EDTA或肝素的真空采集管通过静脉穿刺采集血液。同样可以使用涂覆有肝素的注射器和皮下注射器针头采集血液。血液还可以与将用于细胞培养的成分结合。例如，在一些实施方式中，血液与细胞培养基或补充的细胞培养基(如细胞因子)结合。
同样可以从本领域已知的其它来源获得母本样品，所述其它来源包括血清、血浆、尿液、宫颈拭子、眼泪、唾液、口腔拭子、皮肤或其它组织。混合的母本细胞和胎儿细胞的样品和混合的母本和胎儿无细胞核酸的样品同样可以从本领域已知的其它来源获得，所述其它来源包括血清、血浆、尿液、宫颈拭子、宫颈灌洗、子宫灌洗、后穹窿穿刺、淋巴结或骨髓。例如，在一些实施方式中，混合的母本和胎儿无细胞核酸样品的来源是宫颈拭子。在一种优选的实施方式中，胎儿无细胞核酸包含DNA。在另一种实施方式中，胎儿无细胞核酸包含RNA或cDNA。
富集胎儿细胞
为了解决母本细胞和胎儿细胞的混合样品中胎儿细胞的低丰度问题，可以富集这些样品的胎儿细胞。由于红血球在成熟时是无核的，而在未成熟时是有核的，这些性质可以被用于区分样品中母本红血球和胎儿红血球。可以通过正选择、负选择或正选择和负选择的结合富集样品中胎儿细胞。在一些实施方式中，直接捕获胎儿细胞。在其它实施方式中，捕获母本细胞并从剩余样品中采集胎儿细胞。
可以基于细胞物理性质的差异富集样品中的胎儿细胞。例如，可以基于密度、细胞膜结构或形态富集样品中的胎儿细胞。在一些基于密度的实施方式中，使用如FICOLLTM(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ)、PERCOLLTM(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ)、碘克沙醇(Axis Shield，Oslo，Norway)、NYCODENZ
Figure BPA00001423533900091
(Axis Shield，Oslo，Norway)或蔗糖的密度梯度。在一些基于细胞膜结构的实施方式中，使用裂解试剂(如氯化铵)。在一些基于形态的实施方式中，使用流式细胞术或过滤器。还可以基于本领域已知的其它物理性质富集样品中的胎儿细胞。例如，可以基于介电性能或磁性富集样品中的胎儿细胞。此外，可以通过采集骨髓富集样品中的胎儿细胞。
还可以基于细胞生化性质的差异富集样品中的胎儿细胞。例如，可以基于抗原、核酸、代谢作用、基因表达或表观遗传差异富集样品中的胎儿细胞。在一些基于抗原差异的实施方式中，使用磁场梯度中的偶联抗体的磁珠或顺磁珠或连同流式细胞术的荧光标记的抗体。在一些基于核酸差异的实施方式中，使用流式细胞术。在一些基于代谢作用差异的实施方式中，使用通过流式细胞术或另一种分类技术测量的染料吸收/排除。在一些基于基因表达的实施方式中，使用具有细胞因子的细胞培养。在一些基于表观遗传差异的实施方式中，使用细胞培养。还可以基于本领域已知的其它生化性质富集样品中的胎儿细胞。例如，可以基于pH或运动力富集样品中的胎儿细胞。此外，在一些实施方式中，使用多于一种方法富集胎儿细胞。
在本发明的一些实施方式中，通过使用如氯化铵的裂解试剂去除红血球或通过使用如FICOLLTM(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、PERCOLLTM(GE Healthcare Life Sciences Piscataway，NJ)或蔗糖的密度梯度分离而富集样品中的胎儿细胞。密度梯度还可以用于减少白细胞级分。得到的外周血单核细胞(“PBMC”)可以使用来自如Miltenyi Biotec(Gladbach，德国)、Stemcell Technologies(Vancouver，BC，加拿大)和DynalBiotech/Invitrogen(Carlsbad，CA)的生产商的磁珠分离技术被进一步富集胎儿细胞。正富集或负消耗或两者的结合可以用于富集PBMC中的胎儿级分。
尽管目前已知没有胎儿特异表面标记物，已经显示有多种标记物正富集胎儿细胞至1,000-100,000个母本细胞中1个胎儿细胞。在一些实施方式中，CD71、CD34、CD45或CD235a细胞表面标记物被用于富集胎儿细胞。在一些实施方式中，在胎儿细胞群体中没有发现的细胞表面标记物通过耗尽成人细胞群体被用于负富集胎儿细胞。在一些实施方式中，CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123和CD61的结合被用于耗尽成人细胞。使用细胞表面标记物或偶联荧光标记的细胞内标记物，流式细胞术分类同样可以用于进一步富集胎儿细胞。细胞内标记物可以包括核染色或抗优先在胎儿细胞中表达的细胞内蛋白(如胎儿血红蛋白)的抗体。
血红蛋白的氧化已经被鉴定为使用磁场梯度优先富集有核的红血球(NRBC)的一种途径(Zborowski，Biophys J 2003 84(4)：2638-2645)。此外，便于从白细胞中分离红细胞或从PBMC中富集胎儿细胞的微流体装置已经开发(Huang，Prenatal Diagnosis 2008 28：892-899)。
在本发明的一些实施方式中，通过在培养中差异扩增胎儿细胞超过母本细胞来富集样品中的胎儿细胞。差异扩增可以通过本领域已知的许多方法实施，包括在如WO2008/048931中描述的在含有干细胞因子(SCF)的无血清培养基中孵育来自含有母本和胎儿来源的CD34+细胞的母本血液样品的细胞，WO2008/048931通过参考的方式全部结合至本文。
在本发明的一些实施方式中，母本细胞和胎儿细胞的混合物中胎儿细胞被富集至胎儿细胞∶母本细胞为大约1∶2、大约1∶5、大约1∶10、大约1∶100、大约1∶1000、大约1∶10000或大约1∶100000，或任意两个前述值所限定的范围。
分成子样品
在子样品扩增(优选地使用全基因组扩增(WGA)或全转录物组扩增(WTA))、筛选或基因型分析纯合或杂合基因座之前，所述样品可以被分成几乎没有足够细胞的子样品使得甚至在子样品扩增(如WGA或WTA)之后所述样品的染色体拷贝数保持在子样品中。样品可以被分成与泊松分布或非泊松分布一致的子样品。在一些实施方式中，继续划分样品。例如，可以连续地划分样品。在其它实施方式中，平行地划分样品。
在一些实施方式中，样品被分成的子样品体积是小于或小于大约100μL、50μL、10μL、1000nL、500nL、400nL、300nL、200nL、100nL、50nL、30nL、10nL、3nL或1nL，或任意两个前述值限定的范围。优选地，每一个子样品包含的体积不多于100nL。在一些实施方式中，每一个子样品包含不多于大约500、400、300、200或100个细胞，或任意两个前述值所限定的范围。优选地，每一个子样品包含不多于大于50、40、30、20或10个细胞，或任意两个前述值所限定的范围。更优选地，每一个子样品包含不多于大约5、4、3或2个细胞。在一些实施方式中，每一个子样品包含不多于1个细胞。
在一些实施方式中，每一个子样品包含平均或大约500、400、300、200或100个细胞，或任意两个前述值所限定的范围。优选地，每一个子样品包含平均大约50、40、30、20或10个细胞，或任意两个前述值所限定的范围。更优选地，每一个子样品包含平均或大约5、4、3或2个细胞，或任意两个前述值所限定的范围。在一些实施方式中，每一个子样品包含平均小于大约1个细胞、大约1个细胞、或大约1至2个细胞、或任意两个前述值限定的范围。
样品的划分通过本领域已知的任何方法完成，包括使用油塞以造成微流体装置中单独细胞的油分离，沉淀至孔中，或由表面张力锚定至平的基底的单体滴状物。此外，子样品可以悬浮在将适于后续反应的缓冲液中。例如，子样品可以悬浮在包含裂解缓冲液和PCR缓冲液的溶液中，所述裂解缓冲液和PCR缓冲液将使得单步细胞裂解，然后在没有对子样品进一步处理下扩增。
扩增子样品
为抵补单一细胞或子样品中有效量的遗传物质，可以任选地实施子样品扩增。例如，可以实施核酸复制或细胞分裂。样品被分成几乎没有足够细胞的子样品，使得在子样品扩增之后所述样品的染色体拷贝数保持在子样品中。在一种优选的实施方式中，对包含单细胞的子样品实施子样品扩增，使得得到的扩增产物表现了母本细胞或胎儿细胞的基因组或转录物组。例如，子样品扩增可以在定位在微孔或通过如本文描述的油塞分离的滴状物中的单独细胞上实施。
可以使用用于产生额外拷贝的核酸、预示核酸的额外信号或本领域已知的其它核酸代理(如蛋白表达)的任何方法实施核酸复制。在一些实施方式中，使用WGA、WTA或目标核酸扩增技术实施核酸复制。在其它实施方式中，使用产生预示核酸序列的信号的方法实施核酸复制，如INVADER
Figure BPA00001423533900121
(Hologic，Inc.，Bedford，MA)。在一些实施方式中，仅一部分扩增的序列与核酸模板互补。例如，在一些实施方式中，连续扩增产物包含一部分核酸模板和一部分信号序列。用于核酸复制的常规技术可以包括等温复制或热循环(thermocycled)复制。在一些实施方式中，在SNP基因型分析之前实施核酸复制。但是，核酸复制也可以在SNP基因型分析之后实施。
同样可以使用本领域已知的任何方法实施细胞复制。在一些实施方式中，在培养基和添加物中培养细胞以产生在本文描述的方法中使用的额外的核酸拷贝。在其它实施方式中，培养细胞且一个或多个细胞完整保留以用于后续的分析。在一些实施方式中，在分成子样品之前实施细胞复制。优选地，在分成子样品之后实施细胞复制。
分成等份
子样品扩增之后，扩增的产物可以分成等份。这些等份可以用于多种实验。例如，在一个实施方式中，扩增产物的一个或多个等份用于检测胎儿等位基因的存在，而一个或多个其它等份用于检测包含胎儿基因组或转录物组的扩增产物中胎儿遗传变异的存在。在一些实施方式中，通过阵列检测被鉴定为包含胎儿基因组或转录物组的等份的遗传变异。例如，等份可以用于检测与遗传环境相关的遗传变异(如威廉斯综合征、沃尔夫-赫塞豪恩综合征、米-迪综合征、史密斯-马吉尼斯综合征、天使综合征、迪乔治综合征、普拉德-威利综合征、雅各布森综合征、猫叫综合征、夏科-马里-图思病、微小重复22q11.2综合征、囊肿性纤维化、泰-萨二氏病、亨廷顿病、阿尔茨海默病和多种癌症)。
可以挑选同质或非同质部分的扩增产物用于分成等份。在一些实施方式中，同质部分的扩增产物被顺序分开(如连续地)。在其它实施方式中，同质部分的扩增产物被平行地分开。可选地，可以选择非同质部分的扩增产物，使用正选择、负选择或正选择和负选择的组合来分成等份。例如，在一些实施方式中，珠结合(bead-bound)捕获寡聚物被用于靶定期望部分的用于分成等份的扩增产物。在其它实施方式中，表面结合寡聚物用于排除不期望部分的扩增产物。可基于本领域已知的任何物理或生化性质(包括本文描述的那些)选择非同质部分的扩增产物。例如，挑选具有特定电荷、大小或染色体特性的扩增产物部分用于分成等份。
在子样品扩增的可选步骤没有完成的一些实施方式中，可以移除子样品的一部分或等份用于后续分析。
在一些实施方式中，等份被汇集成两个或多个等份的组。这使得基于SNP或本文描述的其它反应的数量减少了多达因子N，其中N是每一个汇集中的等份的数量。来自阳性汇集(即具有至少一个与母本基因型不同的基因型的汇集)的等份然后可以逐一等份地重复实验以鉴定包含胎儿等位基因的等份。在一些实施方式中，在一种实验基因座处检测每一个汇集的非母本等位基因。在一些实施方式中，在两种或更多种实验基因座处检测每一个汇集的非母本等位基因。
在一些实施方式中，使用索引系统汇集等份，所述索引系统使得鉴定阳性汇集中的阳性等份的来源。例如，可以从每一扩增产物中取两个或更多个等份以形成N×M扩增等份的索引的汇集。包含至少一个胎儿等位基因的孔可以通过在正交坐标系中定位阳性N和M汇集的交叉点来鉴定。在一些实施方式中，N(即，在N×M索引中的列数)和M(即，在N×M索引中的行数)分别是在大约2和大约100之间。优选地，N和M分别在大约8和大约100之间。在一些实施方式中，N是、是大约、是至少、是至少大约、是不多于、是不多于大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、32、36、40、48、50、56、60、64、70、72、80、84、88、90、96、100、192、288、384、480、576、672、768、864、960、1000，或任意两个前述值所限定的范围。在一些实施方式中，M是、是大约、是至少、是至少大约、是不多于、是不多于大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、32、36、40、48、50、56、60、64、70、72、80、84、88、90、96、100、192、288、384、480、576、672、768、864、960、1000，或任意两个前述值所限定的范围。在优选的实施方式中，同质或非同质部分的扩增产物被索引以使得鉴定阳性等份的来源。
获得或推断亲本基因型
可以获得或推断亲本基因型以帮助非母本等位基因的鉴定。关于非母本等位基因的信息可以依次用于筛选或基因型分析等份或子样品、或直接分析胎儿基因组的遗传变异。例如，可以通过直接地基因型分析父本或母本样品获得父本或母本基因型，或通过基因型分析来自遗传相关的家庭成员的样品推断父本或母本基因型。但是，在一种优选的实施方式中，没有必要获得或推断父本基因型。例如，在一种优选的实施方式中，仅获得母本基因型。
在一些实施方式中，通过基因型分析遗传物质获得父本或母本基因型，所述遗传物质来自血液、血浆、血清、尿液、口腔拭子、唾液、眼泪、皮肤或父本核酸的任何其它来源(包括本文描述的那些)。在一些实施方式中，使用无细胞核酸或从源自这些来源之一的细胞中提取的核酸获得父本或母本基因型。同样优选地在DNA上实施父本或母本基因型分析，但是也可以在RNA、cDNA或本领域已知的任何其它核酸上实施。在一些实施方式中，扩增和检测(如，使用基于PCR的方法)父本或母本样品的模板。但是，在一些实施方式中，不扩增(如，使用本文描述的方法)父本或母本样品的模板。
还可以通过获得在在前的遗传实验中产生的信息来获得父本和母本基因型，所述信息如数据库中的信息、实验报告中的信息，或来自实施本文描述的方法的在前的怀孕的信息。通过可以使用血缘关系的亲属的基因型推断父本或母本基因型。例如，遗传相关的父母、兄弟姐妹、祖父母、姑妈姨妈(aunts)、伯父叔父(uncles)或孩子的基因型可以用于推断父本或母本基因型。
本领域已知的任何多态性可以用于基因型分析亲本样品。例如，可以基因型分析SNP、单体型、短串联重复(STR)或其它序列变异。其它遗传或表观遗传标记物同样可以用于基因型分析亲本样品。例如，可以评估拷贝数变异(CNV)或甲基化模式。
在母本核酸和胎儿核酸的混合物中可选地鉴定至少一个非母本等位基因
在纯合的目标基因座已经在母本样品中鉴定的实施方式中，母本核酸和胎儿核酸的混合物可选地被用于鉴定相同基因座处的杂合基因型，其表示胎儿的存在(即非母本等位基因/提供信息的父本等位基因)。该可选步骤优选地在筛选或基因型分析单独等份或子样品之前实施。通过在母本核酸和胎儿核酸的混合样品中筛选非母本等位基因并从而鉴定杂合的基因座(和因此胎儿等位基因)，可以更有效地筛选所述等份和子样品中已知的提供信息的SNP。在一种优选的实施方式中，胎儿无细胞DNA用于筛选非母本等位基因并鉴定杂合基因座。在另一种实施方式中，胎儿无细胞RNA或cDNA用于鉴定杂合基因座。
无细胞核酸可以从本领域已知的任何来源获得，所述来源包括孕妇的血液、血清、血浆、尿液、宫颈拭子、宫颈灌洗、子宫灌洗或后穹窿穿刺。同样可以从母本细胞和胎儿细胞的混合样品中提取核酸以鉴定杂合基因座。优选地，从母本细胞和胎儿细胞的混合样品中提取DNA。但是，RNA或cDNA可以从母本细胞或胎儿细胞的混合样品中提取。可以从本领域已知的任何来源，包括血液、宫颈拭子、宫颈灌洗、子宫灌洗、后穹窿穿刺、淋巴结或骨髓获得的细胞中提取核酸。在其它实施方式中，全血被用于鉴定杂合基因型而不必(或提前)将全血分成细胞部分、血浆部分或血清部分。
在一些实施方式中，扩增和检测来自母本核酸和胎儿核酸的混合样品的等份的核酸模板以鉴定杂合基因座(如使用基于PCR的方法)。但是，在一些实施方式中，不用扩增来自混合样品的等份的核酸模板以鉴定杂合的基因座。例如，可以使用在其中仅扩增与模板相关的信号的方法(如，在美国专利号7,226,798、7,473,775和7,468,261中描述的ABSCRIPTIONTM方法(Ribomed Biotechnologies，Inc.，Carlsbad，CA)或涉及INVADER
Figure BPA00001423533900161
化学(Hologic，Inc.)的方法)。同样可以使用在其中检测核酸模板而不需要扩增信号或模板的方法(如，涉及如在WO 2005/01122中描述的DNA结合的化学检测的方法(Adnavance Technologies，Inc.，SanDiego，CA))。此外，可以使用在其中测序核酸模板而不需要扩增的方法(如在Eid等，科学2009323(5910)：133-38中描述的测序方法)。本领域技术人员将理解，用于非母本等位基因鉴定的模板的来源可以包括血清、血浆、尿液、宫颈拭子或本领域已知的任何其它核酸的来源。
筛选或基因型分析至少一个等份或子样品中至少一个提供信息的父本等 位基因的存在
其次的步骤是筛选或基因型分析子样品或等份以鉴定非母本等位基因。一旦已经产生SNP谱(如本文中更详细描述的)及已经鉴定一系列对于母本遗传样品是纯合的(或可选地，杂合的)基因座，可以选择一个或多个实验基因座以筛选或基因型分析子样品或等份中胎儿等位基因的存在。为检测胎儿等位基因的存在，筛选或基因型分析实验基因座中非母本等位基因的存在(即，通过鉴定实验基因座处的杂合的或可选地纯合的基因型)。在一些实施方式中，逐个等份地筛选或基因型分析扩增产物的等份以检测杂合的(或可选地，纯合的)基因座。在一些实施方式中，等份包含来自单一细胞的扩增材料。
可以在在母本样品中在前鉴定为纯合的基因座处基因型分析子样品或等份。在一些实施方式中，在母本样品中在前鉴定为纯合的基因座处的基因型通过筛选非母本等位基因的存在而测定。优选地，如本文描述的，在筛选等份或子样品的非母本等位基因之前，混合母本和胎儿核酸(优选地，无细胞)的样品用于鉴定混合的核酸中非母本等位基因的存在，表示在胎儿材料中相同基因座处杂合基因型的存在。
在其它实施方式中，在在母本样品中在前鉴定为杂合的基因座处基因型分析子样品或等份。在等份或子样品中同样基因座处的纯合基因型的鉴定表示了非母本(即胎儿)等位基因的存在。
本领域技术人员将理解，在本文中描述的任何实施方式中的筛选或基因型分析方法可以使用等份或子样品实施。可以使用本领域已知的许多方法，包括本文提到的那些，筛选或基因型分析等份和子样品中的胎儿等位基因。例如，使用分子信标或其它基于核酸的SNP检测方法筛选或基因型分析等份。在一些实施方式中，扩增和检测等份中的核酸模板(如，使用基于PCR的方法)。但是，在一些实施方式中，不用扩增核酸模板(如，使用本文描述的方法)。此外，本领域已知的任何标记物可以用于筛选或基因型分析等份和子样品。在优选的实施方式中，使用SNP、单体型、短串联重复(STR)、其它序列变异、拷贝数变异(CNV)或在母本样品中基因型分析的表观遗传标记物。
由于在一些实施方式中，子样品包括不多于一个细胞，可以逐一细胞地筛选或基因型分析子样品或等份。同样可以使用本领域已知的多种方法，包括本文提到的那些，筛选或基因型分析子样品或等份。优选地，使用具有TAQMAN
Figure BPA00001423533900171
系统(Foster City，CA)的定量PCR(qPCR)筛选子样品的杂合等位基因。可以筛选预定数量的子样品或细胞以检测杂合等位基因。例如，如表1中所示，为检测富集至胎儿∶母本细胞为1∶10,000的样品中7个基因座，其中期待每个基因座大约5个胎儿细胞，所述样品或细胞的预定数量是350,000。在一些实施方式中，每个基因座的胎儿细胞数是、是大约、是至少、是至少大约、是不多于、是不多于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275或300，或任意两个前述值所限定的范围。
表1
Figure BPA00001423533900181
在至少一个等份或子样品中鉴定至少一个提供信息的父本等位基因
如本文中所描述的，在母本遗传物质中鉴定纯合的(或可选地杂合的)SNP之后，可以在子样品或等份中筛选或基因型分析这些SNP以检测非母本等位基因的存在。如果第一母本纯合的/杂合的SNP在等份或子样品中不产生杂合的/纯合的基因型，可以选择和基因型分析第二母本纯合的/杂合的SNP。可以重复这个过程直到检测到非母本等位基因或直到筛选到预定数量的SNP和/或细胞、子样品或等份。该过程还可以包括基因型分析多个等份或子样品、多元(multiplexing)SNP或它们任意的组合。
筛选或基因型分析实验基因座使得如果在样品中存在则将检测到至少一个胎儿等位基因。在一些实施方式中，筛选或基因型分析实验基因座直到检测到至少一个非母本等位基因。在一些实施方式中，在等份或子样品中筛选或基因型分析第一实验基因座，直到基因型分析足够的细胞以超过检测非母本等位基因的指定概率。如果没有检测到非母本等位基因，在等份或子样品中筛选或基因型分析第二实验基因座，直到运行足够的细胞以超过检测非母本等位基因的指定概率。如果没有检测到非母本等位基因，筛选或基因型分析额外的实验基因座，直到运行的实验基因座的数量超过从混合样品中检测非母本(和因此胎儿)等位基因的指定累积概率。
还可以筛选或基因型分析实验基因座直到检测到多于一个胎儿等位基因。如果筛选或基因型分析多于一个实验基因座，每一个对胎儿等位基因测试为阳性的额外基因座(即，具有与母本基因型不同的基因型)增加了在子样品或等份中检测胎儿基因组的置信度。此外，实验基因座的预定数量可以被指定为说明胎儿遗传物质可能不存在的事实。在一些实施方式中，实验基因座的预定数量通过计算检测胎儿等位基因的相关系列变量的累计概率测定。例如，如在表3中所示的，使用7个具有次要等位基因频率是大约0.5的SNP检测杂合的胎儿等位基因的存在的概率是1-(0.5)(0.5)(0.5)(0.5)(0.5)(0.5)(0.5)＝99.22％。如在表1中所示的，对于来自富集成胎儿细胞∶母体细胞为1∶10,000的样品的350,000个等份或子样品，实验基因座的预定数量因此可以是大约7个实验基因座。
可以单独地或多个地筛选或基因型分析实验基因座。在一些实施方式中，在单一等份或子样品中筛选或基因型分析一个实验基因座。也可以在多个等份或子样品中筛选或基因型分析单一实验基因座。此外，可以单独地或多个地筛选或基因型分析等份或子样品。在一些实施方式中，在单一等份或子样品中筛选或基因型分析多于一个实验基因座。此外，还可以在多个等份或子样品中筛选或基因型分析多于一个实验基因座。在一些实施方式中，谱中实验基因座的数量是、是大约、是至少、是至少大约、是不多于、是不多于大约2、3、4、5、6、7、8、9或10个实验基因座，或者是由任意两个前述值所限定的范围，所述实验基因座多元化(multiplexed)以筛选或基因型分析胎儿等位基因。
在一些实施方式中，用源自母本细胞和胎儿细胞的混合物的子样品逐一子样品地筛选在母本核酸和胎儿核酸(优选地，无细胞)的混合物中被鉴定为含有杂合的(和因此的非母本的)基因型的基因座。保存的等份和子样品然后可以用于实施额外的遗传分析。但是，尽管母本和胎儿无细胞核酸在检测胎儿等位基因的存在中有优势，这些样品并不适于需要完整保存胎儿基因组或转录物组、或需要捕获样品的分析。这突出了使用本文描述的基于细胞的方法的一个好处。
采集等份或子样品
可以采集被鉴定含有胎儿等位基因的等份或子样品用于后续分析。采集用于后续分析的等份可以是与用于筛选胎儿等位基因的等份相同的等份，或者来自相同子样品的不同等份可以用于提供没有经受用于胎儿等位基因筛选的任何反应的等份。在一些实施方式中，基于期望核酸的质量、数量或存在选择用于采集的等份或子样品。例如，使用信号相关性、信号强度、信号强度比、比作为背景测量的信号、相对于时间的实验动力学、相对于温度的实验动力学或本领域已知的其它性能指标选择用于采集的等份或子样品。在一些实施方式中，采集用于区分父本和母本等位基因的标记物或区域。但是，在其它实施方式中，采集分开的标记物或区域用于进一步分析。
在一些实施方式中，仅采集需要部分的等份或子样品用于后续分析。例如，在一些实施方式中，杂交探针用于采集仅来自目标染色体或区域的核酸序列。在其它实施方式中，采集完整等份、子样品或它们的同质部分。
分析至少一个胎儿基因组的遗传变异
被鉴定具有非母本等位基因的等份或子样品(可选地如本文描述地采集)可以被进一步分析，如，检验染色体变异或遗传变异的存在。所述用于分析的等份可以是与被筛选或基因型分析胎儿等位基因的等份相同的等份。或者所述用于分析的等份是来自同一子样品的不同等份，但是没有经受任何筛选或基因型分析胎儿等位基因。可以选择整个胎儿基因组或它们的部分用于进一步分析。在一些实施方式中，使用本领域已知的方法基因型分析多态性。例如，可以使用PCR和(如果适当的)如毛细管电泳的后续检测方法基因型分析SNP、单体型或STR。还可以使用测序方法基因型分析多态性。优选地使用高通量技术实施基因型分析。例如，在一些实施方式中，使用芯片以产生关于SNP和/或单体型的数据。还可以评估拷贝数变异用于进一步分析。例如，可以使用列阵比较基因组杂交(aCGH)检测拷贝数变异。同样可以评估染色体重排。例如，可以使用如测序、FISH或PCR的方法检测倒位或易位。
在一些实施方式中，测定母系遗传等位基因和父系遗传等位基因的比例以分析遗传变异的存在。可选地，同样的基因座用于测定胎儿等位基因的存在和遗传变异的存在。例如，可以测量在杂合的实验基因座处等位基因的强度，2∶1或1∶2的强度比例表示了拷贝数变异。但是，在一些实施方式中，用于测定胎儿等位基因存在的基因座不同于用于测定遗传变异的基因座。此外，本领域技术人员应当理解，在本文描述的任何实施方式中，其它强度比例(如3∶1、1∶3、3∶2、2∶3、4∶1和1∶4)可以用于检测拷贝数变异的存在。
在一些实施方式中，测定染色体序列的过表达或欠表达以分析拷贝数变异的存在。例如，可以测量特定染色体的独特序列读取的数量，并与母本染色体和/或其它参考染色体比较，比例小于或大于1∶1表示拷贝数变异。可以使用小规模(如，用为特定基因座设计的引物对测序)或大规模(如，整个基因组的测序)方法实施这些独特序列读取的检测。还可以测量特定染色体区的序列读取的数量并与母本染色体区和/或其它参考染色体区比较，比例小于或大于1∶1表示拷贝数变异的存在。
可以个别地分析等份或子样品或分析至少两个等份或子样品的组合样品。在一些实施方式中，基于本文描述的信号度量分级等份或子样品，挑选优选的系列用于分析或汇集后分析。在一些实施方式中，使用阵列比较基因组杂交(aCGH)、定量荧光PCR(QF-PCR)、短串联重复(STR)分析或测序检测分离的等份或子样品或汇集中遗传变异或染色体变异的存在。但是，本领域已知的任何技术，包括本文描述的那些，可以用于检测遗传变异或染色体变异的存在。
基于逐一细胞的筛选或基因型分析等份或子样品能够检测嵌合性(即，来自同一个个体的细胞具有不同的遗传性状的情况)。例如，可以筛选或基因型分析子样品以检测嵌合染色体变异。在一些实施方式中，被筛选或基因型分析嵌合性的子样品的数量是大约2至大约100个子样品。在一些实施方式中，被筛选或基因型分析的子样品的数量是、是大约、是至少、是至少大约、是不多于、是不多于大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100，或任意两个前述值所限定的范围。在优选的实施方式中，被筛选或基因型分析的子样品的数量是大约5至大约10个子样品。可选地，同样的基因座被用于测定胎儿等位基因的存在和嵌合性的存在。例如，可以测量杂合的实验基因座处等位基因的强度，在至少一个子样品中具有1∶1强度比例和在至少一个其它子样品中具有2∶1或1∶2强度比例表示嵌合遗传变异的存在。但是，不同基因座也可以用于测定胎儿等位基因的存在和嵌合性的存在。例如，纯合的实验基因座可以用于鉴定胎儿等位基因。然后可以检测杂合的基因座并测量杂合的基因座处等位基因的强度，在至少一个子样品中具有1∶1强度比例和在至少一个其它子样品中具有2∶1或1∶2强度比例再次表示嵌合遗传变异的存在。
在一些实施方式中，使用性染色体检测嵌合性。例如，可以检测在杂合的X染色体实验基因座处的等位基因，在至少一个子样品中存在一个等位基因和在至少一个其它子样品中存在两个等位基因表示嵌合非整倍体(如，嵌合型特纳氏综合征)的存在。在另一个实施例中，可以检测在纯合的X染色体实验基因座处等位基因的存在，在至少一个子样品中具有1∶1的X∶Y染色体强度比例和在至少一个其它子样品中具有2∶1的X∶Y染色体强度比例表示嵌合非整倍体(如，嵌合型克兰菲尔特综合征)的存在。
基于逐一细胞地筛选或基因型分析等份或子样品能够检测异卵双胞胎(即，非同卵双胞胎)。例如，可以在包含胎儿等位基因的子样品上实施SNP基因型分析，至少两个具有不同SNP基因型的子样品的存在表示异卵双胞胎的存在。在一些实施方式中，被筛选的或基因型分析的以检测异卵双胞胎的SNP的数量是大约1至大约20个SNP。在一些实施方式中，被筛选的或基因型分析的SNP的数量是、是大约、是至少、是至少大约、是不多于、是不多于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个SNP，或由任意两个前述值限定的范围。在优选的实施方式中，被筛选的或基因型分析的SNP的数量是大约3至大约4个SNP。使用3个SNP检测异卵双胞胎的存在的概率是大约1-(0.5)(0.5)(0.5)＝87.5％，而使用4个SNP检测异卵双胞胎的存在的概率是大约1-(0.5)(0.5)(0.5)(0.5)＝93.75％。
在一些实施方式中，汇集包含来自异卵双胞胎的胎儿等位基因的等份。例如，包含来自第一孪生子细胞的等份可以独立于包含来自第二孪生子细胞的等份汇集。在一些实施方式中，来自第一和第二孪生子的汇集的等份可以独立地置于一个或多个阵列中并如本文描述的评估遗传变异或染色体变异。
技术
即使胎儿DNA或RNA存在于较小部分的包含母本和胎儿遗传物质的样品中，仍可能使用标准的SNP检测模式(如TAQMAN
Figure BPA00001423533900231
PCR)检测胎儿SNP等位基因。但是，为了检测次要等位基因，优化荧光检测以阻止母本信号重叠遮蔽胎儿特异信号可能是必须的。在一些实施方式中，选择用于探针标记的最佳的荧光染料以将重叠减到最小。例如，可以选择在标准荧光光谱(400-700nm)上分离的、发射(emission)之间小于10％重叠的染料。这样，甚至来自胎儿等位基因的较小的信号(小于10％信号强度)也没有被母本信号(90％信号强度)遮蔽。在一些实施方式中，选择最佳的荧光过滤器以最小化发射检测中的重叠，并选择常规的荧光检测硬件和软件以最小化信号串话(crosstalk)。在一些实施方式中，使用数字PCR以最优化信号至背景比例。
用于测量等位基因强度的其它可能方法包括S曲线拟合和本领域已知的其它统计学分析。在一些实施方式中，测量Ct变化以检测遗传变异或染色体变异。例如，用于用TAQMAN化学检测胎儿SNP的单一细胞的封装能够同时检测被检测的SNP的异常拷贝数，以及因此的相关染色体的拷贝数。如果SNP位于21号染色体上，SNP丰度将与Ct值及因此的21号染色体的拷贝数相关。如果反应包含单一细胞，在该细胞中的染色体的拷贝数将通过Ct变化检测。在该实施例中，正常母本细胞Ct值的丰度的应用确定了对于每个细胞的两条染色体的正常拷贝数的Ct，且对于较早循环的Ct变化将显示拷贝数变异的存在。
如本文所描述的，测序方法可以用于筛选胎儿等位基因和/或测定遗传变异或染色体变异的存在。在一些实施方式中，鸟枪测序法可以用作CGH阵列的选择以检测拷贝数变异(如，由遗传变异产生)，例如，在Xie和Tammi，BMC Bioinformatics 2009，10(80)中所描述的。在一些实施方式中，可以实施全基因组测序。
可以使用本领域已知的任何方法实施SNP基因型分析，包括qPCR和TAQMAN
Figure BPA00001423533900241
方法。可以从生产商处购得多种SNP化学和平台，如LifeTechnologies(TAQMAN
Figure BPA00001423533900242
)(Carlsbad，CA)、Illumina(GOLDENGATE)(San Diego，CA)、Millipore(AMPLIFLUOR
Figure BPA00001423533900244
)(Billerica，MA)和DxS Ltd.(SCORPIONSTM)(Manchester UK)。同样可以从BioTrove(OPENARRAYTM)(Woburn，MA)和Fluidigm(BIOMARKTM)(South San Francisco，CA)获得小型化模式。
SNP谱
SNP谱可以用于鉴定母本遗传样品中目标基因座。一旦这些目标基因座被鉴定，它们被用于鉴定混合的样品中非母本等位基因的存在。由于基因型分析母本遗传样品以鉴定目标基因座昂贵且耗费时间，SNP谱被设计成包括尽可能少的SNP。但是，所述谱仍必须包括足够的SNP以鉴定大量足够系列的目标基因座使得能够检测混合样品中胎儿等位基因，这些SNP能够充分地提供信息以保存胎儿细胞和母本细胞的混合物中有限量的细胞。
SNP谱的大小与谱中SNP的次要等位基因频率成负相关。在本发明的一些实施方式中，目标是从母本细胞和胎儿细胞的混合样品中鉴定大约1至大约5个胎儿细胞。必须被评估以完成这个目标的SNP的数量依赖于被评估的SNP的次要等位基因频率和被基因型分析的细胞的数量。必须被评估的细胞的数量依次地依赖于混合样品中胎儿细胞的富集程度。
在一些实施方式中，因此设计SNP谱以将鉴定基因座必须的实验数量降至最小，所述基因座在母本样品中是纯合的(或，可选地，杂合的)且在母本遗传物质和胎儿遗传物质的混合样品中是杂合的(或，可选地，纯合的)。在一些实施方式中，SNP谱被设计成每个染色体特异SNP谱鉴定大约1至大约20个纯合的母本SNP。在一些实施方式中，所述SNP谱被设计成每个染色体特异谱检测纯合的母本SNP的数量是、是大约、是至少、是至少大约、是不多于、是不多于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个SNP，或任意两个前述值所限定的范围。在一种优选的实施方式中，SNP谱被设计成每个染色体特异的SNP谱鉴定大约5至大约10个纯合的母本SNP。更优选地，SNP谱被设计成每个染色体特异SNP谱鉴定大约7个纯合的母本SNP。例如，如表2中所示的，对于HWE中的SNP，其中p2＝0.25，需要20个SNP的谱以鉴定10个母本样品是纯合的SNP。
可以组合几个染色体特异SNP谱，优选地包含至少一个对照染色体特异谱，以产生用于基因型分析母本遗传物质的SNP谱。每一个染色体特异谱被设计成产生对于该染色体的目标系列的基因座。优选地，染色体特异SNP谱包含大约5至大约100个独特SNP。优选地，在染色体特异谱中的SNP总数是在大约5和大约30个独特SNP之间。更优选地，染色体特异谱中的SNP的总数是大约20个SNP。在一些实施方式中，染色体特异谱中SNP的总数是、是大约、是至少、是至少大约、是不多于、是不多于大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个SNP，或者由任意两个前述值所限定的范围。
SNP谱可以包含一个或多个染色体特异谱。染色体特异SNP谱可以包含定位在常染色体上的SNP，优选地，定位在临床相关综合征中对非整倍体敏感的染色体上的SNP。更优选地，染色体特异SNP谱包含定位在13、18、21号、X和Y染色体上的SNP。染色体特异谱同样可以是对照染色体特异谱。优选地，对照染色体特异谱包含定位在染色体上的SNP，所述染色体对非整倍体不敏感或其中非整倍体与生存能力不相容，其代表性地是由较低的指数指定的较大的染色体(如1、2或3号染色体)。最优选地，对照染色体特异SNP谱包含定位在1、2或3号染色体上的SNP。此外，染色体特异SNP谱还可以包含定位在性染色体上的SNP。在一些实施方式中，谱不特异于具体染色体。在一些实施方式中，所述对照不是染色体特异SNP谱。例如，引物可以被用于扩增将用作对照的染色体特异区。
在一些实施方式中，SNP谱包括多于一个染色体特异谱，其中染色体特异谱是用于染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22号、X或Y染色体上的SNP。在一些实施方式中，所述SNP谱包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个染色体特异谱，或由任意两个前述值所限定的范围。在一些实施方式中，谱中SNP的总数是N*染色体特异谱上SNP的数量，其中N是SNP谱中染色体特异谱的数量。
在选择用于基因型分析谱的基因座中可以考虑几个因素。例如，可以采用哈迪-温伯格平衡(“HWE”)以计算SNP等位基因频率的概率。在一些实施方式中，选择的SNP中等位基因的概率由以下等式给出：p2+2pq+q2＝1。例如，可以选择杂合性为0.5的SNP。HWE是优选的，由于不在HWE中的SNP不太可能是可遗传的SNP，限制了它们的应用，或者可能由不完善的基因型分析化学产生。
同样可以选择具有一个在主要已知的单体型的纯合性中有利的等位基因的SNP。在一些实施方式中，选择具有纯合的母本基因型(pp或qq)小于0.25及相对的纯合基因型大于0.25的SNP。
在一些实施方式中，SNP具有的频率范围对于在所有主要群组上测量的次要等位基因是大约30％至大约50％。在一种优选的实施方式中，SNP的频率范围对于次要等位基因是大约49％至大约50％。在一些实施方式中，SNP的频率对于次要等位基因是、是大约、是至少、是至少大约、是不多于、是不多于大约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％，或者由任意两个前述值所限定的范围。
本发明的实施方式
本发明的一个实施方式是一种检测胎儿等位基因的方法，包括：获得包含母本细胞和胎儿细胞的混合物的样品；富集样品中的胎儿细胞；将富集的样品分成子样品；对子样品实施全基因组扩增以提供扩增的基因组产物；将扩增的基因组产物分成等份；鉴定目标基因座，所述目标基因座在母本细胞的遗传物质中对于次要等位基因是纯合的；从目标基因座中选择实验基因座；筛选等份中在实验基因座处非母本等位基因(杂合的基因型)，其中非母本等位基因(杂合的基因型)的存在表示了在扩增的基因组产物中胎儿等位基因的存在；及鉴定至少一个胎儿等位基因。
本发明的另一种实施方式是一种检测胎儿遗传变异的方法，包括：一种鉴定母本细胞和胎儿细胞的混合样品中胎儿等位基因的方法，包括：获得包含母本细胞和胎儿细胞的混合物的样品；富集样品中的胎儿细胞；将富集的样品分成子样品，每一个子样品包含不多于一个细胞；鉴定至少一个基因座的谱，所述基因座在母本细胞的遗传物质中对于次要等位基因是纯合的；从目标基因座中选择实验基因座；在从谱中挑选的实验基因座处筛选子样品中的非母本等位基因(杂合的基因型)，其中非母本等位基因(杂合的基因型)的存在表示了在子样品中胎儿等位基因的存在；以及鉴定至少一个胎儿等位基因；和测定包含胎儿等位基因的子样品中母系遗传等位基因和父系遗传等位基因的比例，分析所述比例以测定遗传变异的存在。
本发明的另一种实施方式是一种检测胎儿等位基因的方法，包括：获得包含母本细胞和胎儿细胞的混合物的样品；将所述样品分成子样品；对子样品实施预扩增以提供扩增的产物；将扩增的产物分成等份；选择目标基因座并测定母本细胞的遗传物质在一系列目标基因座处是纯合的或杂合的以测定母本基因型；从目标基因座中选择实验基因座；筛选等份中在实验基因座处不同于母本基因型的基因型，其中不同于母本基因型的基因型的存在表示了在扩增的产物中胎儿等位基因的存在；和鉴定至少一个胎儿等位基因。
本发明的另一种实施方式是一种检测胎儿等位基因的方法，包括：获得包含母本细胞和胎儿细胞的混合物的样品；将样品分成子样品；鉴定至少一个目标基因座的谱并测定对于至少一个目标基因座所述母本细胞的遗传物质是纯合的或杂合的以测定母本基因型；从至少一个目标基因座中选择实验基因座；筛选子样品中在从谱中选择的实验基因座处不同于母本基因型的基因型，其中不同于母本基因型的基因型的存在表示了在子样品中胎儿等位基因的存在；以及鉴定至少一个胎儿等位基因。
本发明的实施方式可以和可能包括一个或多个以下内容：一种方法，进一步包括富集样品中胎儿细胞；一种方法，其中所述富集包括胎儿细胞超过母本细胞的差异扩增；一种方法，进一步包括分析被鉴定为包含胎儿等位基因的扩增产物以检测胎儿遗传变异；一种方法，其中所述胎儿遗传变异选自非整倍体、微缺失、微重复和突变或其它遗传变异；一种方法，进一步包括分析被鉴定为包含胎儿等位基因的扩增产物以检测嵌合性的存在；一种方法，进一步包括分析被鉴定为包含胎儿等位基因的扩增产物以检测异卵双胞胎的存在；一种方法，其中所述预扩增包括全基因组扩增或全转录物组扩增；一种方法，其中目标基因座对于母本基因型是纯合的；一种方法，其中目标基因座对于母本基因型是杂合的；一种方法，其中目标基因座包含对于母本基因型是纯合基因座和杂合基因座的混合物；一种方法，其中所述扩增产物包括基因组DNA；一种方法，其中所述扩增产物包括互补DNA；一种方法，其中测定母本基因型包括使用SNP谱以基因型分析来自同一个个体的母本遗传物质的样品，所述同一个个体是母本细胞的来源；一种方法，其中所述母本遗传物质的来源选自血液、血清、血浆、尿液、宫颈拭子或口腔拭子；一种方法，其中所述母本遗传物质的来源选自血液或口腔拭子；一种方法，其中所述实验基因座的选择包括筛选或基因型分析母本和胎儿无细胞核酸的样品中在目标基因座处不同于母本基因型的基因型，及选择在无细胞的核酸的样品中具有非母本基因型的目标基因座作为实验基因座；一种方法，其中非母本基因型是纯合的；一种方法，其中非母本基因型是杂合的；一种方法，其中母本和胎儿无细胞的核酸样品的来源是孕妇的血液、血清、血浆、尿液或宫颈拭子；一种方法，包括在单一等份中选择和筛选多于一个实验基因座；一种方法，包括在多于一个等份中选择和筛选多于一个实验基因座；一种方法，包括在单一等份中选择和筛选一个实验基因座；一种方法，包括在多于一个等份中选择和筛选一个实验基因座；一种方法，其中每一个子样品包含不多于一个细胞；一种方法，进一步包括在筛选之前汇集两个或更多个等份的组；一种方法，其中汇集包括包含等份的孔的行和列的索引系统的使用；一种方法，其中行和列的数量分别在大约2至大约1000之间；一种方法，其中行和列的数量分别在大约8和大约100之间；一种方法，其中行和列的数量分别在大约16和大约24之间；一种方法，其中至少一个目标基因座对于母本基因型是纯合的；一种方法，其中至少一个目标基因座对于母本基因型是杂合的；一种方法，其中所述谱包含纯合的目标基因座和杂合的目标基因座的混合物；一种方法，进一步包括测定包含胎儿等位基因中子样品中信号强度，其中分析所述信号强度以测定遗传变异的存在；一种方法，进一步包括测定与包含母本等位基因的子样品相比，包含胎儿等位基因的子样品中染色体序列的过表达或欠表达，其中所述过表达或欠表达用于测定染色体非整倍体、微缺失或微重复的存在；一种方法，进一步包括测定包含胎儿等位基因的子样品中的信号强度，其中分析所述信号强度以测定嵌合性的存在；一种方法，进一步包括测定包含胎儿等位基因的子样品中等位基因的拷贝数，其中分析等位基因的拷贝数以测定嵌合性的存在；一种方法，进一步包括测定包含胎儿等位基因的子样品中等位基因的拷贝数，其中分析等位基因的拷贝数以测定遗传变异的存在；一种方法，其中测定母本基因型包括使用SNP谱以基因型分析来自同一个个体的母本遗传物质的样品，所述同一个个体是母本细胞的来源；一种方法，其中目标基因座是纯合的，及实验基因座是杂合的；一种方法，其中目标基因座是杂合的，及实验基因座是纯合的；一种方法，其中所述谱包括纯合的目标基因座和杂合的目标基因座的混合物；一种方法，其中SNP谱是本文描述的SNP谱；及一种方法，其中所述谱是至少5个基因座的谱。
本发明的另一种实施方式是检测提供信息的父本等位基因的方法，包括：获得包含母本细胞和胎儿细胞的混合物的样品；可选地富集样品中的胎儿细胞；将所述样品或富集的样品分成子样品；可选地将扩增产物分成等份；可选地选择一系列目标基因座；测定母本细胞的遗传物质在一系列目标基因座处是纯合的或杂合的以测定母本基因型；可选地从所述系列的目标基因座中选择实验基因座，其中选择可选地包括筛选混合母本核酸和胎儿核酸的样品中目标基因座处不同于母本基因型的基因型，和选择混合母本核酸和胎儿核酸的样品中具有非母本基因型的目标基因座作为实验基因座；筛选或基因型分析等份或子样品中提供信息的父本等位基因的存在，其中筛选可选地包括筛选等份中在至少一个目标基因座或实验基因座处不同于母本基因型的基因型，其中不同与母本基因型的基因型的存在表示了等份中提供信息的父本等位基因的存在；和鉴定至少一个等份中至少一个提供信息的父本等位基因的存在。在一些实施方式中，所述方法进一步包括：可选地采集一部分被鉴定为包含提供信息的父本等位基因的等份；和分析被鉴定为包含提供信息的父本等位基因的等份或采集的部分扩增产物以测定遗传变异。
本发明的一些实施方式包括：一种SNP谱，其中所述的染色体特异谱针对经受非整倍体的染色体，选自13、18、和21号、X和Y染色体；以及一种SNP谱，进一步包括针对选自1、2和3号染色体的对照染色体的对照染色体特异谱。
在至少一份上面引用的优先权文件中使用的术语筛选包括本文描述的筛选方法和基因型分析方法。此外，在至少一份上面引用的优先权文件中所使用的术语纯合的等位基因和杂合的等位基因在本文中有时指杂合的基因座或纯合的基因座，或杂合的基因型或纯合的基因型。此外，在至少一份上面引用的优先权文件中所使用的术语预扩增在本文中指子样品预扩增。
本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的实质的情况下，可以做出多个和多种修改。本文中所涉及的所有参考文献对于所讨论的主题全部通过引用的方式结合。以下的实施例仅出于说明性的目地纳入，并不意味着限制本发明的范围。
实施例
实施例1
本发明的一种实施方式的以下实施例涉及基于PCR的胎儿样品的检测，后续WGA。细胞(可选地一种母本细胞和胎儿细胞的富集混合物)悬浮在如PBS的缓冲液中并分布在含有用于细胞裂解和PCR的合适的化学物质的第二缓冲液中。在PCR相容缓冲液中的细胞然后划分至个别的反应中，例如通过引入油塞以产生在裂解和PCR缓冲液中个别细胞的油分离。本方法优选地使用一种实现单步细胞裂解和不需要在封装后添加试剂的目标核酸扩增的化学物质。本方法同样优选地在DNA扩增之前不包括DNA纯化。然后对每一个名义上的单细胞反应进行加热和冷却热循环，在热循环期间或末循环终点时检测胎儿特异荧光探针和检测包含胎儿细胞(即，一个或多个)的所有室(compartment)。在优选的案例中，每个反应获得一个细胞，但是由一个胎儿细胞和几个至许多母本细胞组成的反应将仍然准确地鉴定胎儿细胞的存在或不存在。只要后续的基因组分析承受相当的污染物(即：一个胎儿细胞和两个母本细胞意味着33％纯度的胎儿DNA)，则每个反应多于一个细胞是可接受的。每个阳性室可选地汇集至单一共享的容器中。对该汇集的、胎儿特异反应进行DNA清理过程，如移除RNA和蛋白。可选的清除之后，使用任何相容的化学物质对核酸进行WGA。用于WGA的方法包括以下任何一项：简并寡核苷酸引物的聚合酶链式反应(“DOP-PCR”)、连接介导的PCR(“LM-PCR”)、用Φ-29聚合酶的链置换扩增技术(“SDA”)或其它结合方案(Rubicon Genomics或NuGen)。WGA之后，得到的扩增基因组DNA用于遗传分析，如，比较基因组杂交(“CGH”)或完全基因组测序。有许多用于CGH的方法，包括BAC阵列或寡聚物阵列。同样有多种用于测序的方法，包括基于标准毛细管的桑格测序和目前的“下一代”高通量测序平台，包括由Solexa/Illumina(San Diego，CA)、Complete Genomics(Mountain View，CA)、Roche/454(Branford，CT)和Life Technologies(SOLiDTM)(Carlsbad，CA)提供的那些。
实施例2
用于从细胞中检测胎儿DNA的本发明的一种实施方式的以下实施例包括将细胞分离至分离的反应室中，跟着进行WGA，然后每一个反应分开成多个等份用于PCR胎儿等位基因检测，然后可选地汇集胎儿阳性反应的结合的等份用于遗传分析，如CGH或测序。细胞(可选地一种胎儿细胞和母本细胞的富集的混合物)分布在含有用于细胞裂解和WGA的合适的缓冲液和试剂的孤立的反应室中。这可以是在允许添加多步试剂的毛细管或板模式中的交互的水相和油相中。在板模式中，首先将细胞悬浮成200μl大约100,000个细胞，并置于96孔板的孔中。然后使用标准的微量吸取技术，如由TECAN(
Figure BPA00001423533900321
瑞士)、LabCyte(Sunnyvale，CA)或其它提供的那些，10nL的包含平均1、2、3、4或5个细胞的细胞悬浮液转移至包含例如1,536或3,456个孔的高密度平板。使用标准的WGA化学物质。例如，对于每10nL的细胞体积，加入90nL的WGA试剂，所述平板用油封以防止挥发，并使得继续进行WGA化学反应。WGA之后、达到25nL、包含来自反应中全部细胞的许多拷贝的扩增的基因组DNA被转移至第二高密度平板。然后使用本文公开的SNP谱的目标基因座筛选达到100nL的包含引物和探针的PCR试剂以鉴定包含胎儿DNA的反应的等份。使用对于胎儿DNA是阳性的反应，可选地在汇集之后，对于下游基因组分析，包括CGH或测序。在CGH杂交或测序之前，对所述反应进行清理过程。
实施例3
在本发明的一种实施方式的以下实施例中，定位于21号染色体的SNP被选择用于谱。采用哈迪-温伯格平衡(“HWE”)以计算等位基因频率的概率。一个等位基因在主要已知的单体型的纯合性中是有利的。所述母本基因型是纯合的(pp或qq)小于0.25，相对的纯合的基因型大于0.25，所述等位基因的概率通过以下等式给出：p2+2pq+q2＝1。所述SNP以孟德尔模式遗传。
实施例4
在本发明的一种实施方式的以下实施例中，一种提议的谱包括在HWE下选择SNP，其中p2和q2的比例是0.25，杂合性是0.5。根据这些比例，得到纯合的母本SNP统计上仅需要20个SNP以寻找10个SNP，其中母本样品是纯合的(20*(0.25+0.25))。对于任何给出的纯合的SNP，包括胎儿的群体将有0.5的杂合性概率。对于第一个母本纯合的SNP，胎儿杂合性的概率是0.5，总概率是0.5。对于第一个和第二个母本纯合的SNP，结合的概率是1-(0.5*0.5)＝0.75。7个SNP的结合概率是0.992。
实施例5
以下实施例是本发明的一种实施方式。孕妇处于14周孕龄。为检测胎儿是否是21三体，医生分别通过静脉穿刺和口腔拭子从孕妇获得30mL血样和上皮细胞。
设计SNP谱。选择来自1号和21号染色体的各20个SNP(即40个目标基因座)用于谱，其中在所有主要群体中每一个SNP具有次要等位基因频率是49％。从口腔拭子中提取母本DNA并使用SNP谱进行基因型分析。来自谱的20个SNP产生纯合的基因型(即，目标基因座)并被选择用于在来自血样的母本细胞和胎儿细胞的混合物中进一步基因型分析。
通过对所述样品进行FICOLLTM([定位])，接着Miltenyi磁珠(Gladbach，德国)，所述血样被富集至胎儿细胞∶母本细胞为1∶10,000。所述富集的血样悬浮在包含裂解缓冲液和PCR试剂的溶液中。所述样品然后与油塞结合并引入至微流体装置，使得所述样品被分成子样品，每一个子样品包含不多于一个细胞。一旦处于微流体装置内部，所述子样品经历一步式细胞裂解，跟着进行如下面描述的PCR扩增。
进行计算以测定在胎儿细胞∶母本细胞是1∶10,000的浓度中，对于具有次要等位基因频率是49％的SNP，必须筛选50,000个细胞以测定大约5个杂合性的基因座。
使用具有TAQMAN
Figure BPA00001423533900331
系统的多元qPCR逐一子样品(和因此的逐一细胞)地筛选第一系列的50,000个子样品(和因此的50,000个细胞)中在第1和21号染色体每一个上的第一个SNP(即，一共2个基因座)。对于第1和21号染色体上的任一SNP，没有鉴定杂合的基因型。然后对第二系列的50,000个子样品逐一子样品地筛选第1和21号染色体每一个上的第二个SNP。在第1号染色体上的SNP是杂合的(表示胎儿等位基因的存在)，而在第21号染色体上的SNP是纯合的。然后对第三系列的50,000个子样品逐一子样品地筛选第1和21号染色体每一个上的第三个SNP。这次，在第21号染色体上的SNP是杂合的，没有进行进一步的基因型分析。
然后分析来自第21号染色体上的第三个SNP的等位基因的比例以检测非整倍体的存在。由于母本来源的等位基因(C)与父本来源的等位基因(G)的等位基因强度是2∶1(即，CCG)，检测到21三体。
实施例6
以下实施例是本发明的一种实施方式。胎儿细胞和母体细胞在不同因子存在下生长以评估它们对胎儿细胞差异扩增的效果。这些因子是干细胞因子为50ng/mL、IL-3是5ng/nL、IL-6是5ng/mL、EPO是1.5LVmL、TPO是100ng/mL及Flt-3是50ng/mL。这些细胞是从动员的成人捐献者外周血中纯化的CD34+阳性细胞和从Cambrex(Walkersville，MD)购买的胎儿肝组织纯化的CD34+阳性细胞。以每mL10,000个细胞将细胞铺在24孔组织培养板中。在潮湿的室中，在37℃和5％CO2的环境下，细胞在含有50单位/mL的青霉素、50μg/mL的硫酸链霉素和以上细胞因子组合物的HPGM培养基中孵育6天。6天之后，用血球计手动计数一等份的细胞，用标准公式计算总细胞数。另一等份用于使用VIALIGHT
Figure BPA00001423533900341
分析试剂盒(Cambrex，Walkersville，MD)分析总ATP水平(与总细胞数线性相关)。
在每一个测量的例子中，所述胎儿细胞扩增超过成人细胞(比较表4中的第4列与第7列)。表4的最后一列显示了对于一些生长条件胎儿细胞与成人细胞的比例。在每一个测量比例的例子中，扩增之后胎儿细胞更加多。
实施例7
用于从细胞中检测胎儿DNA的本发明的实施方式的以下实施例包括将细胞分离至离散反应室中，跟随着WGA，并直接检测遗传变异。细胞(可选地胎儿细胞和母本细胞的富集的混合物)分布在包含用于细胞裂解和WGA的合适的缓冲液和试剂的分离的反应室中。在平板模式中，首先将细胞重悬浮为每200μl大约100,000个细胞，并置于96孔板的孔中。然后使用标准的微量吸取技术，如由TECAN(瑞士)、LabCyte(Sunnyvale，CA)或其它提供的那些，10nL的包含平均1、2、3、4或5个细胞的细胞悬浮液转移至包含例如1,536或3,456个孔的高密度平板。使用标准的WGA化学试剂。例如，对于每10nL的细胞体积，加入90nL的WGA试剂，所述平板用油封以防止蒸发，并使得继续进行WGA化学反应。WGA之后，加入含有引物和探针以鉴定包含胎儿DNA反应的PCR试剂以从本文公开的SNP谱扩增目标基因座。对于胎儿DNA是阳性的反应在反应室中使用捕获探针直接检测。目标杂交之后，清洗孔以移除非目标DNA和未反应的试剂。然后使用标准化学试剂(如分子信标)测定特定杂交的产物。然后可以使用胎儿序列和母本序列的比例以测定遗传变异。
实施例8
以下实施例是本发明的一种实施方式。从孕妇采集40ml的血并与标准的抗凝血剂(如EDTA)结合，然后运送至处理场所。从血液中移除12ml的血浆并提取无细胞DNA。移除一等份的全血或PBMC用于母本基因型分析。
实施梯度富集以移除红血球，包括红血球裂解。磁性激活的细胞分类(MACS)被用于耗尽母本细胞以产生少于大约500,000个总细胞。细胞分类被用于富集胎儿部分以总计产生大约10,000个细胞。所述细胞被分成λ＝在合适体积中每个反应大约1个细胞。细胞被直接裂解并产生PCR适宜的溶液，可能地外加中和溶液。向每一个反应中加入WGA试剂使得总反应体积是100nL。对于总数是在大约10到10,000个DNA总基因组相等物继续进行WGA(其中反应初始地包含一个基因组相等物)。终止所述WGA反应，并且将所有反应分成至少一个位置索引的等份。对所有的等份实施PCR以检测非母本等位基因(如通过与使用全血或PBMC的等份获得的基因型比较)。鉴定包含非母本等位基因的WGA物质的初始位置，并回收这些位置的体积。然后将这些体积汇集形成最终的WGA以产生一些适于aCGH的DNA(如大约0.5-1ug)。然后实施aCGH以检测CNV。
表2
 SNP数量   p2   2pq   q2  累积测试的可能纯合的母本SNP的数量
 2   0.25   0.5   0.25  1
 4   0.25   0.5   0.25  2
 6   0.25   0.5   0.25  3
 8   0.25   0.5   0.25  4
 10   0.25   0.5   0.25  5
 12   0.25   0.5   0.25  6
 14   0.25   0.5   0.25  7
 16   0.25   0.5   0.25  8
 18   0.25   0.5   0.25  9
 20   0.25   0.5   0.25  10
表3
Figure BPA00001423533900361
Figure BPA00001423533900371
表4
  细胞因子组合物   总ATP/孔(AU)   每孔的胎儿细胞   倍扩增(胎儿)
  O   77.2   188500   18.85
  OA   272.8   577500   57.75
  OB   167.9   410400   41.04
  OC   657.9   1410000   141
  OD   267.0   652500   65.25
  OE   213.5   663300   66.33
  OAB   280.2
  OAC   668.3
  AOD   457.9
  OAE   517.1
  OBC   741.4
  OBD   335.9   850500   85.05
  OBE   341.2
  OCD   706.0
  OCE   638.6
  ODE   480.5
  OABC   691.0
  OABD   389.8
  OABE   281.3
  OACD   689.6
  OACE   609.6
  OADE   508.0
  OBCD   694.0
  OBCE   543.4
  OBDE   299.0
  OCDE   670.0
  OABCD   568.6
  OABCE   602.1
  OABDE   317.4
  OACDE   472.0
  OBCDE   441.0   1449000   144.9
  OABCDE   571.3   1577000   157.7
  OC   1000000   100
  OCD   1200000   120
  O   450000   45
  OA   75000   7.5
  OB   550000   55
  OAB   625000   62.5
  OE   900000   90
  ODE   1250000   125
续表4
Figure BPA00001423533900381
Figure BPA00001423533900391
Figure BPA00001423533900401
O：干细胞因子(50ng/mL)；A：IL-3(5ng/mL)；B：IL-6(5ng/mL)；C：EPO(1.5U/mL)；D：TPO(100ng/mL)；E：Flt-3(50ng/mL)

Claims (38)

1.一种检测胎儿标识符的方法，包括：
获得包含母本细胞和胎儿细胞混合物的样品；
将样品分成子样品；
筛选或基因型分析子样品中胎儿标识符的存在；和
从至少一个子样品的胎儿细胞中鉴定至少一个所述胎儿标识符的存在。
2.根据权利要求1的方法，进一步包括：
对至少一个所述子样品实施子样品扩增以提供扩增产物。
3.根据权利要求2的方法，进一步包括：
将所述扩增产物分成等份，其中所述筛选或基因型分析子样品中至少一个胎儿标识符的存在包括筛选或基因型分析等份中胎儿标识符的存在。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述子样品扩增包括选自以下的一种方法：全基因组扩增、全转录物组扩增、目标核酸扩增、非胎儿标识符的核酸序列的扩增、产生核酸序列的代理和细胞分裂。
5.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述子样品扩增包括目标核酸扩增、非胎儿标识符的核酸序列的扩增、产生核酸序列的代理和细胞分裂。
6.根据权利要求1或4的方法，进一步包括：在一系列目标基因座处测定所述母本细胞的遗传物质是纯合的或杂合的以测定母本基因型，其中所述筛选或基因型分析等份或子样品的胎儿标识符包括在至少一个目标基因座处筛选或基因型分析所述等份或子样品中不同于所述母本基因型的基因型，其中所述不同于所述母本基因型的基因型的存在表示了在所述扩增产物中提供信息的父本等位基因的存在，和其中所述鉴定至少一个所述胎儿标识符的存在包括在至少一个等份或子样品中鉴定提供信息的父本等位基因。
7.根据权利要求6的方法，进一步包括在测定所述母本细胞的遗传物质是纯合的或杂合的之前选择所述的目标基因座。
8.根据权利要求7的方法，进一步包括从所述目标基因座中选择实验基因座，其中所述筛选或基因型分析包括在所述实验基因座处筛选或基因型分析等份或子样品中不同于所述母本基因型的基因型。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述实验基因座的所述选择包括在目标基因座处筛选混合的母本核酸和胎儿核酸的样品中不同于所述母本基因型的基因型，和在所述混合的母本核酸和胎儿核酸的样品中选择具有非母本基因型的目标基因座作为所述实验基因座。
10.根据权利要求6或9的方法，进一步包括分析被鉴定为含有所述提供信息的父本等位基因的等份或子样品以检测遗传变异。
11.根据权利要求10的方法，进一步包括：
采集被鉴定为含有所述提供信息的父本等位基因的部分所述等份或子样品，其中所述分析被鉴定为含有所述提供信息的父本等位基因的等份或子样品以检测遗传变异包括分析所述等份或子样品的采集部分。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于，所述采集部分是所述等份或子样品的同质部分。
13.根据权利要求11的方法，其特征在于，所述采集部分是所述等份或子样品的非同质部分。
14.根据权利要求10的方法，进一步包括从至少两个子样品中采集被鉴定为含有所述提供信息的父本等位基因的等份并在分析所述扩增产物之前结合所述等份。
15.根据权利要求10的方法，其特征在于，所述遗传变异是选自染色体重排、拷贝数变异和多态性的胎儿遗传变异。
16.根据权利要求10的方法，其特征在于，所述分析包括测定包含所述提供信息的父本等位基因的等份中母系遗传等位基因和父系遗传等位基因的比例，其中分析所述比例以测定遗传变异的存在。
17.根据权利要求10的方法，其特征在于，所述分析包括测定包含所述提供信息的父本等位基因的等份中等位基因的拷贝数，其中分析所述等位基因的拷贝数以测定遗传变异的存在。
18.根据权利要求6或9的方法，进一步包括分析来自至少两个所述子样品的被鉴定为包含所述提供信息的父本等位基因的扩增产物以检测嵌合性或异卵双胞胎的存在。
19.根据权利要求10-18任一项的方法，其特征在于，所述被分析的等份不是被筛选或基因型分析所述胎儿标识符的存在的等份，而是来自与被筛选或基因型分析所述胎儿标识符的存在的等份相同的子样品。
20.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述目标基因座对于所述母本基因型全部是纯合的，对于所述母本基因型全部是杂合的，或包括对于所述母本基因型是纯合基因座和杂合基因座的混合物。
21.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述目标基因座对于所述母本基因型全部是纯合的。
22.根据权利要求6或9的方法，其特征在于，所述扩增产物包括基因座DNA或互补DNA。
23.根据权利要求6或9的方法，其特征在于，所述测定母本基因型包括使用SNP谱以基因型分析母本遗传物质的样品，所述母本遗传物质来自与所述母本细胞的来源相同的个体。
24.根据权利要求23的方法，其特征在于，所述母本遗传物质的来源选自血液、血清、血浆、尿液、宫颈拭子、眼泪、唾液、口腔拭子或皮肤。
25.根据权利要求23的方法，其特征在于，所述母本遗传物质的来源选自血液或口腔拭子。
26.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述母本核酸和胎儿核酸的混合物是无细胞核酸的混合物。
27.根据权利要求26的方法，其特征在于，所述母本和胎儿无细胞核酸样品的来源是孕妇的血液、血清、血浆、尿液、宫颈拭子、宫颈灌洗、子宫灌洗或后穹窿穿刺。
28.根据权利要求8或9的方法，包括在单一等份或子样品中选择和筛选或基因型分析多于一个实验基因座，在多于一个等份或子样品中选择和筛选或基因型分析多于一个实验基因座，或在多于一个等份或子样品中选择和筛选或基因型分析一个实验基因座。
29.根据权利要求6或9的方法，包括在第一等份或子样品中鉴定提供信息的父本等位基因之后，在至少第二子样品中选择和筛选或基因型分析第二目标基因座。
30.根据权利要求6或9的方法，其特征在于，划分所述样品以产生具有细胞泊松分布或非泊松分布的子样品。
31.根据权利要求6或9的方法，其特征在于，每一个所述子样品包括不多于1个细胞。
32.根据权利要求6或9的方法，进一步包括在所述筛选或基因型分析之前汇集来自两个或更多个子样品的等份。
33.根据权利要求32的方法，其特征在于，所述汇集包括包含所述等份的行和列的孔的索引系统的应用。
34.根据权利要求6或9的方法，进一步包括在所述分成子样品之前富集所述样品中的所述胎儿细胞。
35.根据权利要求34的方法，其特征在于，所述富集包括所述胎儿细胞超过母本细胞的差异扩增。
36.根据权利要求6或9的方法，其特征在于，所述扩增产物的均质部分被分成所述等份。
37.根据权利要求6或9的方法，其特征在于，所述扩增产物的非均质部分被分成所述等份。
38.一种用于检测胎儿等位基因的单核苷酸多态性(SNP)谱，包括至少一个包含大约20个至大约100个特异于单一染色体的独特SNP的染色体特异谱，其中在所有主要群组中测量的每一个所述SNP的频率范围是大约30％至大约50％；其中每一个所述SNP是处于哈迪-温伯格平衡；及其中SNP谱中SNP的总数是在大约5个SNP和大约100个SNP之间。
CN2009801573135A 2008-12-22 2009-12-22 检测等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱 Pending CN102325901A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14006308P 2008-12-22 2008-12-22
US61/140,063 2008-12-22
US16618809P 2009-04-02 2009-04-02
US61/166,188 2009-04-02
US23123209P 2009-08-04 2009-08-04
US61/231,232 2009-08-04
PCT/US2009/069317 WO2010075459A1 (en) 2008-12-22 2009-12-22 Methods and genotyping panels for detecting alleles, genomes, and transcriptomes

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410504084.2A Division CN104531837A (zh) 2008-12-22 2009-12-22 检测等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102325901A true CN102325901A (zh) 2012-01-18

Family

ID=41785800

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801573135A Pending CN102325901A (zh) 2008-12-22 2009-12-22 检测等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱
CN201410504084.2A Pending CN104531837A (zh) 2008-12-22 2009-12-22 检测等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410504084.2A Pending CN104531837A (zh) 2008-12-22 2009-12-22 检测等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱

Country Status (10)

Country Link
US (2) US9051602B2 (zh)
EP (1) EP2379746B1 (zh)
JP (1) JP2012513217A (zh)
KR (1) KR101781147B1 (zh)
CN (2) CN102325901A (zh)
AU (2) AU2009329946B2 (zh)
CA (1) CA2748030A1 (zh)
MY (1) MY161966A (zh)
SG (2) SG10201501804WA (zh)
WO (1) WO2010075459A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013173993A1 (zh) * 2012-05-23 2013-11-28 深圳华大基因健康科技有限公司 鉴定双胞胎类型的方法和系统
CN105531707A (zh) * 2013-08-28 2016-04-27 勒芬天主教大学 使用多态性变体等位基因频率进行单体型分型和拷贝数分型
WO2016112539A1 (zh) * 2015-01-16 2016-07-21 深圳华大基因股份有限公司 确定胎儿核酸含量的方法和装置
CN111534605A (zh) * 2020-06-05 2020-08-14 复旦大学附属妇产科医院 一种基于snp基因型的单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定方法
CN116855617A (zh) * 2023-08-31 2023-10-10 安诺优达基因科技(北京)有限公司 基于核心家系的串联重复变异分型检测方法及其应用

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10081839B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US10083273B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
ES2620431T3 (es) 2008-08-04 2017-06-28 Natera, Inc. Métodos para la determinación de alelos y de ploidía
US9134221B2 (en) 2009-03-10 2015-09-15 The Regents Of The University Of California Fluidic flow cytometry devices and particle sensing based on signal-encoding
US9645010B2 (en) 2009-03-10 2017-05-09 The Regents Of The University Of California Fluidic flow cytometry devices and methods
US10017812B2 (en) 2010-05-18 2018-07-10 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20120185176A1 (en) 2009-09-30 2012-07-19 Natera, Inc. Methods for Non-Invasive Prenatal Ploidy Calling
AU2010315037B9 (en) 2009-11-05 2015-04-23 Sequenom, Inc. Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
CA2798758C (en) 2010-05-18 2019-05-07 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
EP2603607B1 (en) 2010-08-11 2016-04-06 Celula, Inc. Genotyping dna
US20120053062A1 (en) * 2010-08-24 2012-03-01 Bio Dx, Inc. Defining diagnostic and therapeutic targets of conserved free floating fetal dna in maternal circulating blood
KR101885936B1 (ko) 2010-10-21 2018-09-10 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 무선 전력이 공급되는 전자 회로를 포함하는 미세 유체
MX349568B (es) * 2010-11-30 2017-08-03 Univ Hong Kong Chinese Deteccion de aberraciones geneticas o moleculares asociadas con el cancer.
WO2012088456A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
EP3202921B1 (en) * 2011-02-24 2019-02-13 The Chinese University of Hong Kong Molecular testing of multiple pregnancies
EP2705166A4 (en) * 2011-05-06 2014-12-17 Celula Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR COMPLETE ISOTHERMIC GENOMAMPLIFICATION
WO2012177792A2 (en) 2011-06-24 2012-12-27 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of a genetic variation
US20140371083A1 (en) 2011-07-14 2014-12-18 Celula, Inc. Systems, apparatus and methods for biochemical analysis
US9984198B2 (en) 2011-10-06 2018-05-29 Sequenom, Inc. Reducing sequence read count error in assessment of complex genetic variations
US9367663B2 (en) 2011-10-06 2016-06-14 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10196681B2 (en) 2011-10-06 2019-02-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10424394B2 (en) 2011-10-06 2019-09-24 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2013052907A2 (en) 2011-10-06 2013-04-11 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US8688388B2 (en) 2011-10-11 2014-04-01 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2792751B1 (en) * 2011-12-17 2018-09-05 BGI Genomics Co., Ltd. Method and system for determining whether genome is abnormal
WO2013097062A1 (zh) * 2011-12-31 2013-07-04 深圳华大基因健康科技有限公司 一种遗传变异检测方法
JP6431769B2 (ja) 2012-01-20 2018-11-28 セクエノム， インコーポレイテッド 実験条件を要因として含める診断プロセス
US10504613B2 (en) 2012-12-20 2019-12-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
EP2864472A4 (en) * 2012-06-20 2015-12-30 Celula Inc MATERIALS AND METHODS FOR TREATING CELLULAR POPULATIONS
US10497461B2 (en) 2012-06-22 2019-12-03 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US20140065621A1 (en) * 2012-09-04 2014-03-06 Natera, Inc. Methods for increasing fetal fraction in maternal blood
US10482994B2 (en) 2012-10-04 2019-11-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
JP6396911B2 (ja) 2012-10-15 2018-09-26 ナノセレクト バイオメディカル， インコーポレイテッド 粒子を選別するためのシステム、装置、および、方法
US20130309666A1 (en) 2013-01-25 2013-11-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2971126B1 (en) * 2013-03-15 2018-11-07 The Chinese University Of Hong Kong Determining fetal genomes for multiple fetus pregnancies
EP4187543A1 (en) 2013-04-03 2023-05-31 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA2910205C (en) 2013-05-24 2023-04-04 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10622094B2 (en) 2013-06-21 2020-04-14 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
GB2534067B (en) 2013-08-30 2021-07-21 Personalis Inc Methods and systems for genomic analysis
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
US9499870B2 (en) 2013-09-27 2016-11-22 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
CA2925528C (en) 2013-10-04 2023-09-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA2925111C (en) 2013-10-07 2024-01-16 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of chromosome alterations
RU2717641C2 (ru) 2014-04-21 2020-03-24 Натера, Инк. Обнаружение мутаций и плоидности в хромосомных сегментах
WO2016010401A1 (ko) * 2014-07-18 2016-01-21 에스케이텔레콘 주식회사 산모의 혈청 dna를 이용한 태아의 단일유전자 유전변이의 예측방법
US20160034640A1 (en) 2014-07-30 2016-02-04 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
AU2016262545B2 (en) * 2015-05-12 2022-06-16 Gen-Probe Incorporated Method of pooling blood samples
US11299783B2 (en) 2016-05-27 2022-04-12 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
EP3491560A1 (en) 2016-07-27 2019-06-05 Sequenom, Inc. Genetic copy number alteration classifications
WO2018067517A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
CN106480221B (zh) * 2016-12-19 2019-07-23 北京林业大学 基于基因拷贝数变异位点对林木群体基因型分型的方法
CN106874712B (zh) * 2017-01-13 2019-01-29 天津大学 一种基于池化时间序列特征表示的细胞分裂事件识别方法
JP7237003B2 (ja) 2017-01-24 2023-03-10 セクエノム， インコーポレイテッド 遺伝子片の評価のための方法およびプロセス
AU2018225348A1 (en) 2017-02-21 2019-07-18 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
KR102031841B1 (ko) * 2017-12-22 2019-10-15 테라젠지놈케어 주식회사 모체 시료 중 태아 분획을 결정하는 방법
EP3527659A1 (en) * 2018-02-14 2019-08-21 Universidad del Pais Vasco Method for obtaining a spermatozoid cell population with improved fitness
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
JP2022519159A (ja) * 2018-12-17 2022-03-22 ナテラ， インコーポレイテッド 循環細胞の分析方法
CN114728256A (zh) * 2019-11-14 2022-07-08 生物辐射实验室股份有限公司 通过非终点扩增进行的单细胞的靶标拷贝数的分区型确定
JP2023524048A (ja) * 2020-04-29 2023-06-08 パーソナリス，インコーポレイティド 癌の免疫療法のための複合バイオマーカー

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7226798B2 (en) 1999-07-19 2007-06-05 United Microelectronics Corp. Fabrication method for a multi-layered thin film protective layer
US7045319B2 (en) 2001-10-30 2006-05-16 Ribomed Biotechnologies, Inc. Molecular detection systems utilizing reiterative oligonucleotide synthesis
US20070178478A1 (en) * 2002-05-08 2007-08-02 Dhallan Ravinder S Methods for detection of genetic disorders
WO2005001122A2 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Adnavance Technologies, Inc. Electrochemical detection of dna binding
WO2005022147A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-10 Celula, Inc. Methods and apparatus for sorting cells using an optical switch in a microfluidic channel network
EP1664077B1 (en) * 2003-09-05 2016-04-13 Trustees of Boston University Method for non-invasive prenatal diagnosis
WO2005056790A1 (ja) * 2003-12-10 2005-06-23 Takara Bio Inc. 核酸の増幅方法
US20070122823A1 (en) 2005-09-01 2007-05-31 Bianchi Diana W Amniotic fluid cell-free fetal DNA fragment size pattern for prenatal diagnosis
DE102005059227A1 (de) * 2005-12-12 2007-06-14 Advalytix Ag Verfahren zur Bestimmung des Genotyps aus einer biologischen Probe enthaltend Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen
PT2385143T (pt) * 2006-02-02 2016-10-18 Univ Leland Stanford Junior Rastreio genético fetal não-invasivo por análise digital
CA2645045A1 (en) 2006-03-06 2007-09-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Specific amplification of fetal dna sequences from a mixed, fetal-maternal source
EP4108780A1 (en) 2006-06-14 2022-12-28 Verinata Health, Inc. Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
EP2589668A1 (en) * 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
WO2007147018A1 (en) 2006-06-14 2007-12-21 Cellpoint Diagnostics, Inc. Analysis of rare cell-enriched samples
AU2007311126A1 (en) 2006-10-16 2008-04-24 Celula Inc. Methods and compositions for differential expansion of fetal cells in maternal blood and their use
AU2008213634B2 (en) * 2007-02-08 2013-09-05 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for RhD typing, gender determination and nucleic acid quantification
ITTO20070307A1 (it) * 2007-05-04 2008-11-05 Silicon Biosystems Spa Metodo e dispositivo per la diagnosi prenatale non-invasiva
WO2009105531A1 (en) * 2008-02-19 2009-08-27 Gene Security Network, Inc. Methods for cell genotyping
DE102008019132A1 (de) * 2008-04-16 2009-10-22 Olympus Life Science Research Europa Gmbh Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer Probe

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013173993A1 (zh) * 2012-05-23 2013-11-28 深圳华大基因健康科技有限公司 鉴定双胞胎类型的方法和系统
CN104053787A (zh) * 2012-05-23 2014-09-17 深圳华大基因医学有限公司 鉴定双胞胎类型的方法和系统
CN105531707A (zh) * 2013-08-28 2016-04-27 勒芬天主教大学 使用多态性变体等位基因频率进行单体型分型和拷贝数分型
CN105531707B (zh) * 2013-08-28 2018-12-04 勒芬天主教大学 使用多态性变体等位基因频率分析遗传物质的方法和介质
WO2016112539A1 (zh) * 2015-01-16 2016-07-21 深圳华大基因股份有限公司 确定胎儿核酸含量的方法和装置
CN107109324A (zh) * 2015-01-16 2017-08-29 深圳华大基因股份有限公司 确定胎儿核酸含量的方法和装置
CN107109324B (zh) * 2015-01-16 2019-11-08 深圳华大基因股份有限公司 确定胎儿核酸含量的方法和装置
CN111534605A (zh) * 2020-06-05 2020-08-14 复旦大学附属妇产科医院 一种基于snp基因型的单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定方法
CN116855617A (zh) * 2023-08-31 2023-10-10 安诺优达基因科技(北京)有限公司 基于核心家系的串联重复变异分型检测方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010075459A1 (en) 2010-07-01
AU2009329946B2 (en) 2016-01-07
CN104531837A (zh) 2015-04-22
US9994902B2 (en) 2018-06-12
SG172345A1 (en) 2011-07-28
KR101781147B1 (ko) 2017-10-10
KR20110137286A (ko) 2011-12-22
JP2012513217A (ja) 2012-06-14
SG10201501804WA (en) 2015-05-28
EP2379746A1 (en) 2011-10-26
EP2379746B1 (en) 2017-03-08
AU2016202178A1 (en) 2016-04-28
US20110086769A1 (en) 2011-04-14
US9051602B2 (en) 2015-06-09
AU2009329946A1 (en) 2011-08-11
US20150232937A1 (en) 2015-08-20
CA2748030A1 (en) 2010-07-01
MY161966A (en) 2017-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102325901A (zh) 检测等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱
US11053543B2 (en) System and methods for massively parallel analysis of nucleic acids in single cells
US20150154352A1 (en) System and Methods for Genetic Analysis of Mixed Cell Populations
CN103608818A (zh) 非侵入性产前倍性识别方法
CN103608466A (zh) 非侵入性产前亲子鉴定方法
TR201807917T4 (tr) Maternal numunelerde fetal nükleik asitlerin fraksiyonunu belirleme yöntemleri.
CN103620055A (zh) 在全基因组规模非侵入性确定亲本单倍型的胎儿遗传
CN108424834A (zh) 用于高通量分析的微流控细胞捕获和分析设备
US20230212656A1 (en) Methods of spatially resolved single cell sequencing
CN109971846A (zh) 使用双等位基因snp靶向下一代测序的非侵入性产前测定非整倍体的方法
Litjens et al. Combined Analysis of Transcriptome and T-Cell Receptor Alpha and Beta (TRA/TRB) Repertoire in Paucicellular Samples at the Single-Cell Level
Ainciburu-Fernández Application of single cell transcriptomics to characterize the progression of hematopoietic cells to myeloid malignancies
Felice-Alessio et al. Ultra-high throughput single-cell analysis of proteins and RNAs by split-pool synthesis
WO2020226528A1 (ru) Способ определения кариотипа плода беременной женщины

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20120118