CN101680024A - 重组人类第九因子及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明致力于将第九因子转变成更具有活性的分子，以供B型血友病的基因疗法或蛋白质疗法之用。比起重组的野生型第九因子，利用重组技术在氨基酸位置86、276、277和338作氨基酸替换的第九因子显示出更佳的凝血活性。

Description

重组人类第九因子及其用途

技术领域

本发明涉及一种重组人类第九因子蛋白，以及编码该蛋白质的核苷酸序列。本发明还涉及一种治疗血友病的方法。

背景技术

目前在发达国家中，治疗血友病病人的方式包含预防性及按需性(on-demand)替代疗法(Lofqvist T.et al.，J.Intern.Med.1997；241：395-400)，注射来自血浆或重组的浓缩凝血因子(Lippert B.et al.，Blood Coagul.Fibrinolysis.2005；16：477-485)。血友病的标准疗法是注入浓缩蛋白质以取代有缺陷的凝血因子。注入的量是依据出血的严重程度、出血的位置及病人的体型大小来决定。病况严重的病人则可能以定期预防性的输液来治疗。若能有适当的治疗，大多数患有血友病的人均能拥有相对正常的生活。然而高成本及数量有限的重组蛋白，使得凝血因子的剂量成为治疗血友病时的重要问题。除此之外，来自血浆的产品容易有传染人类免疫缺陷病毒(HIV)及B、C型肝炎的风险，注入到病人体内的蛋白其半衰期也很短，导致需要相当频繁的输液(White G.C.et al.，Transfus.Sci.1998；19：177-189)。

其它像是基因疗法及组织植入技术，亦被研究是否可作为可能的疗法(Hough C.et al.，J.Thromb.Haemost.，2005；3：1195-1205)。其中一个血友病病患的基因疗法临床试验显示因为抗递送载体(delivering vehicle)的抗体产生之故，所以凝血因子的表现量只有短暂的增加(Manno C.S.et al.，Nat.Med.2006；12：342-347)。因此，基因疗法仍然是一个研究中的方法，在能广泛用于治疗血友病之前仍有许多障碍需要克服。

B型血友病是因缺乏一种名叫第九因子的凝血蛋白所引起。该基因位于X染色体上因此这是一种性联遗传疾病。此疾病主要发生于男性。约每3万名男性中就有1人患有B型血友病。

人类第九因子是一种维生素K依赖性酶原，在血液凝固上扮演了很重要的角色。第九因子在体内循环时为一个具有415氨基酸的单链酶原，分子量为55000道尔顿(dalton)，在正常血浆中的含量约为5μg/ml。

重组第九因子产品大大地减少了传染HIV及B、C型肝炎的风险。如果拥有加强凝血活性的重组第九因子能通过第九因子DNA的基因工程生产，不但可以降低凝血因子的成本，亦可在管理血友病病患时减少使用的剂量。此外，这种方法也提供了一个更有效的血友病患基因疗法试验工具。

附图说明

图1显示纯化的重组第九因子的SDS-PAGE分析。将来自野生型(IX-7)及突变体(IX-1、IX-2、IX-8、IX-3、IX-4、IX-5及IX-6)的纯化蛋白质(每栏4μg)进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺胶体电泳(SDS-PAGE)。样本在不加入还原剂也不破坏蛋白质结构的条件下(non-reducing condition)跑电泳。通过考马斯蓝染色以显现第九因子的蛋白条带。使用BCA^TM蛋白试验套组(Pierce，Rockford，IL，USA)测定亲和纯化(affinity-purified)后重组野生型第九因子及丙氨酸替换过的第九因子的浓度，其中牛丙种球蛋白(bovine γ-globulin)(cat.#23212，Pierce)被使用来产生标准曲线以供计算蛋白浓度之用。

图2显示通过pBS-HCRHP1-A-FIX高压注射处理(如之前方法所述)后24小时，B型血友病小鼠中的人类第九因子浓度。通过6到8秒内的高压，自尾静脉注射2ml的50μg DNA至体重20μg的B型血友病公鼠中。之后让小鼠慢慢复原，至注射后24小时处死小鼠，收集血浆以测定凝血活性，及以酶联免疫吸附分析法(ELISA)蛋白浓度(IX：Ag)。每笔数据各表示一只小鼠的数据。利用在平行实验中收集自20个健康个体的正常血浆进行连续稀释，以作出可用于ELISA及凝血活性测定的标准曲线。这些收集血浆中的第九因子蛋白浓度及凝血活性被假定为5μg/ml。

图3显示利用腺相关病毒(AAV)移转基因至B型血友病小鼠中以表现第九因子的结果。建构各自带有IX-6及IX-7之rAAV2/8载体的方法如之前方法中所述。分别静脉注射4×10¹²vg/kg(a)4×10¹¹及8×10¹⁰vg/kg(b)如上所述带有IX-6及IX-7之rAAV2/8载体至同型接合的(Homozygous)B型血友病小鼠(n＝6，年龄8到14周，重16到18g)中。注射后2周收集血液以测量第九因子蛋白浓度及凝血活性。根据年龄为每组小鼠编号。专一活性以百分比表示，定义为每个样本所测得的凝血活性除以其ELISA测出的质量(IX：Ag)。利用在平行实验中收集自20个健康个体的正常血浆进行连续稀释，以作出可用于ELISA及凝血活性测定的标准曲线。这些收集血浆中的第九因子蛋白浓度及凝血活性被假定为5μg/ml。

图4为活化态第九因子的彩带图(ribbon drawing)，其由2个EGF区及1RFN.PDB催化区所组成。残基86、277及338以支链显示。在活性部位上结合的抑制物也以支链显示。推测出的活化态第八因子结合部位及活化胜肽区亦被标出。

发明内容

本发明提供了一种比野生型第九因子拥有更高活性的重组第九因子，能用较少的剂量便达到血友病的治疗效果。

本发明提供了一种新的第九因子DNA序列，在藉由各种不同工具(如病毒载体)运送到动物体内后，与表达野生型第九因子的DNA序列相比，能表现出具有较高凝血活性的第九因子蛋白。

使用重组技术，在氨基酸位置86、276、277和338同时作双重或三重丙氨酸替换的第九因子显示出高于野生型第九因子(IX-7)2到14倍的凝血活性。为了了解这些变异型第九因子增加凝血活性的原因，一些功能参数被测定。表2证实了增加的凝血活性与活化态第八因子有关，且被认为是第九因子与活化态第八因子间的亲和力增加，以及第十因子k_cat增加及K_M减少的结果。

从0.5到1公升的稳定转殖HEK 293细胞培养上清液中纯化出重组第九因子。使用双缩脲法(Biuret method)(BCA蛋白质定量分析组，购自Pierce公司)测定纯化的第九因子(如图1所示)并将其稀释到5μg/ml。使用部份凝血活酶时间分析(aPTT assay)以测定其凝血活性。人类正常血浆经连续稀释后用于产生标准曲线。正常血浆中的第九因子浓度被测定为5μg/ml。样本的专一活性(specific activity)定义为凝血活性除以其质量浓度，并以百分比表示。实验进行两次重复。

因此，本发明提供了一种重组人类第九因子蛋白，其在编码如SEQ IDNo：7所示的氨基酸序列的氨基酸残基上作氨基酸的替换，氨基酸替换位置选自由86、276、277和338所组成的群组，但不包含氨基酸位置338的单一替换。在一较佳实施例中，该替换上之氨基酸为丙氨酸。

此处使用的术语“氨基酸”指一个包含氨及羧官能基的分子。在生物化学中，该术语指通式为H₂NCHRCOOH的α-氨基酸，其中R是一个有机取代基。α-氨基酸中的氨基及羧基连接在同一个碳原子上，即所谓的α-碳。各种不同的α-氨基酸其连接在α-碳上的支链(R基)也不同。一般来说，标准氨基酸如丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、精氨酸或赖氨酸都可用作为替换的氨基酸。

在一更佳实施例中，本发明的蛋白质具有编码如SEQ ID No：1、2、3、4、5或6所示的氨基酸序列。在一最佳实施例中，本发明的蛋白质具有编码如SEQ ID No：6所示的氨基酸序列。

替换氨基酸残基所创造出的非自然发生的人类第九因子，展现出了高于野生型第九因子蛋白2到14倍的凝血活性(表1)，且与辅因子：活化态第八因子有较强的亲和力。在一较佳实施例中，重组人类第九因子蛋白其K_d值为0.1到0.5nM，K_M值为32到128nM。更佳之K_M值为32到56nM(表2)。

本发明也提供一种编码重组人类第九因子蛋白的分离核酸，其具有如SEQ ID NO：9、10、11、12、13或14所示的核苷酸序列。在一较佳实施例中，该核酸具有如SEQ ID NO：11、12、13或14所示的核苷酸序列。在一更佳实施例中，该核酸具有如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。

表1纯化第九因子的凝血活性

表2活化态第八因子存在或不存在时，产生活化态第十因子的动力学参数

a.活化态第九因子-活化态第八因子复合物的浓度可从实验条件及K_d的观察值得知。

b.K_cat＝V_max/[酶]，单位为M FXa，M^-1 FIXa(或FIXa-FVIIIa)，S^-1。

c.反应物培养在0.4nM第八因子及0.25nM第九因子中，以活化0到200nM的第十因子，同时存在有0.5mM活化态第十因子专一小受质(spectrozyme FXa)、40μM PCPS及5mM Ca²⁺。

#.ND：未测定。

本发明进一步提供一种医药组合物，其包含本发明中的人类第九因子蛋白，及其医药上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

除了在体外表现及分析丙氨酸变异体的生物特性，本发明亦使用小鼠模型以评估其潜在作用。B型血友病小鼠提供了一个模型，可研究各种不同第九因子在生理上所扮演的作用角色。为了估计第九因子的降解途径，有几种人类第九因子蛋白被注射至血友病小鼠的尾静脉中，以观察这些突变蛋白质的特性。

以流体动力学为基础将裸露的质体DNA递送至肝脏，可使小鼠体内的血浆含有转殖基因产物并达到具有疗效的浓度。该技术被使用于将可制造野生型及变异型第九因子蛋白质的基因DNA递送至B型血友病小鼠体内。

通过病毒载体进行全身性递送治疗的转殖基因，可能导致长期的转殖基因表现效果(Miao C.H.et al.，Mol.Ther.2001；3：947-957)。但基因转移到肝细胞的效率不高。

当重组腺相关病毒(AAV)递送系统证实其在B型血友病动物模型的初步临床前研究中具有良好效率后，便获得热烈的支持(Davidoff A.M.et al.，Mol.Ther.2005；11：875-888)。两个临床研究使用AAV血清2型载体，将第九因子由直接肌内注射递送至肌肉(Manno C.S.et al.，Blood.2003；101：2963-2972)或通过肝动脉灌注(Manno C.S.et al.，Nat.Med.2006；12：342-347)递送至肝脏。在肌肉注射试验中，血浆中的第九因子浓度通常不会上升到超过1％，但在接受肝动脉递送AAV载体的单一病患血浆中可测得高达12％的浓度。然而该浓度上升后随后便是血清转胺酶浓度的暂时上升及第九因子表现的减少，可能是因为预先存在的宿主免疫机制会辨识AAV衣壳蛋白并攻击转导细胞。由于重组IX-6在本发明之小鼠模型中比起野生型(IX-7)有较高的活性，所以可能可以减少病毒颗粒的注射数量，但又能达到相同的第九因子活性。

因此，本发明又提供一种在体内产生人类第九因子蛋白的方法，其包含(a)建构载体，其携带有编码人类第九因子蛋白之核酸；及(b)将该载体施予至哺乳动物体内。在一较佳实施例中，该哺乳动物为人类。

此处使用的术语“施予”不限于但包含通过载体、质体、脂质体、DNA注射、电穿孔、基因枪、静脉注射或肝动脉灌注等方式。

本发明进一步提供一种治疗血友病的方法，其包含施予需要该治疗之病人一达有效剂量之本发明蛋白质。

具体实施方式

本发明可能以不同的形式来实施，并不仅限于下列文中所提及的实例。下列实施例仅作为本发明不同面向及特点中的代表。

材料

由美国酶研究实验室公司(Enzyme Research Laboratory，South Bend，IN，USA)购得纯化的人类活化态第七因子、活化态第十因子、活化态第十一因子、第十因子、及多株山羊抗人类第九因子抗体(cat.#GAFIX-AP)。磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)及胰岛素-运铁蛋白-钠亚硒酸盐(Insulin-Transferrin-Sodium selenite，ITS)等使用于无血清培养基的培养基添加物则取自于西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)。制备组织因子及PCPS磷脂的方法则如前案所述(Chang YJ，et al.，Biochemistry，1999：10940-10948)。第九因子缺乏血浆、活化态第十因子专一小受质及活化态第九因子专一小受质(Spectrozyme FIXa)购自美国公司(American Diagnostica Inc.，Greenwich，CT，USA)。所有的限制性内切酶和聚合酶均为新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs Inc.，Beverly，MA，USA)的产品。G418(Geneticin)则取自德国默克公司(CalBiochem，Merck KGaA，Darmstadt，Germany)。所有的分光光度分析法(spectrophotometric assays)均使用安装有温度控制器的微盘分析仪(Vmax microtiter plate reader)(MolecularDevices Corp.，Menlo Park，CA，USA)。强盐基性阴离子交换剂(QAE-Sephadex A50)及阴离子交换层析管柱(Resource Q)则取自英国的安玛西亚生技医药公司(Amersham Pharmacia BioTech，UK，Bucks，England)。

方法

第九因子的体外突变、表现及纯化

以使用引物对的PCR方法(QuickChange，Stratagene，Boston，USA)在人类第九因子的cDNA上进行定点突变，将位于残基第86、277或338的密码子替换成可转译出丙氨酸的密码子。替换残基86的引物对序列为IX86(SEQ ID NO：17)及IX86T7(SEQ ID NO：18)；替换残基277的引物对序列为IX277(SEQ ID NO：19)及IX277-2(SEQ ID NO：20)；替换残基338的引物对序列为IX338(SEQ ID NO：21)及IX338D(SEQ ID NO：22)。利用这些引物对，7种不同的第九因子cDNA被制造出并被完全定序，同时将野生型第九因子(IX-7)亚克隆(subclone)至pCR3^TM-Uni(Invitrogen，CA，USA)中并使其在巨细胞病毒(cytomegalovirus)promoter的控制下于人类293细胞中表现。7个重组第九因子突变体中，有3个是单一替换变异体，分别在残基86、277或338处被替换成丙氨酸(序列分别如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8所示)；另外3个则是双重替换变异体，分别在残基86与277(SEQ ID NO：3)、残基86与338(SEQ ID NO：4)或残基277与338(SEQ ID NO：5)处被替换成丙氨酸；最后1个则是三重替换变异体，其在残基86、277与338处都被替换成丙氨酸(SEQ ID NO：6)。用ELISA(方法如后所述)鉴定能表现重组蛋白的细胞克隆(clone)，并使用市面上可购得的专一抗第九因子的抗体。依照已有的方法，在无血清培养基中大量培养正确细胞株及纯化重组蛋白。简单来说，将1公升的培养上清液以5mM苯甲脒(benzamidine)及4mMEDTA微调并以4,350rpm在4℃下离心(HA6000，Sorvall RC-3C Plus，DuPont)30分钟。移除细胞残渣后，将上清液通过以TBS/EDTA(20mMTris-Cl，pH 7.5，及150mM NaCl/4mM EDTA)平衡过的QAE-Sephadex A50管柱(30ml，5×2.5cm)。以含5mM苯甲脒的1公升TBS冲洗管柱后，可用含0到30mM CaCl₂梯度于含TBS/1mM苯甲脒条件下冲提出第九因子。含第九因子的部分以ELISA(如下所述)鉴定、收集、并使用超过原体积100倍的50mM Tris-Cl(pH 7.5)透析，然后通过0.22-μm的针筒过滤器(syringe filter，Millipore，Cork，Ireland)过滤。约100毫升的QAE冲提液被装入Resource Q管柱(1ml，Akta FPLC purifier，AmershamBiosciences)。以含50mM Tris-Cl(pH 7.5)的缓冲液清洗过管柱后，用含NaCl梯度(0～1M)的50mM Tris-Cl(pH 7.5)冲提管柱。冲提出的第九因子在约250mM NaCl的部分。进行SDS-PAGE电泳及考马斯蓝(Coomassie blue)染色以验证纯化的重组第九因子蛋白。

酶联免疫吸附试验(ELISA)及凝血活性试验

使用人类第九因子的多株抗体，以ELISA测定培养上清液及小鼠血浆中的野生型及被丙氨酸替换过的人类第九因子(hFIX)之蛋白质量。该抗体为种特异性多株抗hFIX抗体，并不会与小鼠的第九因子交叉反应。收集平行实验中至少20个健康个体的血浆并进行连续稀释，以描绘出可用于计算第九因子浓度的标准曲线。来自收集血浆的标准曲线与那些来自纯化血浆第九因子(IMMUNINE(产品名)，Baxter AG，Vienna，Austria)的标准曲线相似。

重组第九因子蛋白的功能是用部分凝血活酶时间(one-stage aPTTassay)测定凝血活性。使用连续稀释中的收集血浆作为试验标准。凝血试验中的标准曲线与那些来自纯化血浆第九因子(IMMUNINE)及重组第九因子(BeneFIX(产品名)，Genetics Institute，Inc.Cambridge MA，USA)的标准曲线均很相似。一个样本的专一活性(specific activity)定义为凝血活性除以其质量。在收集的一般人类血浆中，第九因子蛋白的质量及凝血活性假设为5μg/ml。

通过活化态第十一因子及活化态第七因子-组织因子(VIIa·TF)复合物以活化第九因子

通过活化态第十一因子并加入TBS/5mM CaCl₂以活化第九因子，其中酶与基质的比率为1比200。在一定时间的间隔抽出反应混合物的等分试样(aliquot)，并放置于含1％SDS及2mM EDTA的溶液中以终止反应，以电泳试样缓冲液(gel loading buffer)(最终浓度为50mM Tris-Cl(pH6.8)、2mM EDTA、1％SDS、8％甘油及0.025％溴酚蓝)调整，然后用SDS-PAGE分析。通过活化态第七因子-组织因子复合物活化第九因子，并以1比80的酶与基质比率在TBS/5mM CaCl₂中进行。在一定时间的间隔抽出反应混合物的等分试样，然后以SDS-PAGE分析。

活化态第九因子及第十因子的交互作用

如上所述，通过活化态第十一因子制备出活化态第九因子。使用先前所述(Chang YJ，et al.，Journal of Biological Chemistry.2002；277：25393)的抗凝血酶III(ATIII)滴定并测得活化态第九因子分子浓度。当存有或不存有活化态第八因子时，通过动力学监测活化态第十因子(由活化态第九因子所产生)所造成的活化态第十因子专一小受质的水解，以分析活化态第九因子与第十因子的交互作用。简单地说，当活化态第八因子不存在时，活化态第十因子(10nM)与PCPS一同在室温下培养5分钟，然后加入不同浓度的第十因子(0到1μM)及0.5mM活化态第十因子专一小受质。将反应纪录为根据培养时间下混合物的吸光度变化。反应的最终体积为100μl，且在37℃含0.01％BSA及TBS/5mM CaCl₂中40μM PCPS的缓冲液(TBS/CaCl₂/BSA/PCPS)中进行。当活化态第八因子存在时，25μl的活化态第八因子(新鲜制备)与同体积、在TBS/CaCl₂/BSA/PCPS中先经过稀释及预培养的活化态第九因子先一起培养，以进行活化态第九因子与第十因子的交互作用，接着加入50μl含PCPS、活化态第十因子专一小受质及第十因子之反应混合物。在微盘分析仪上动力学侦测混合物中活化态第九因子-活化态第八因子复合体(具有内源性十酶(tenase)复合体活性)所产生的活化态第十因子。最终浓度分别为：野生型或突变型活化态第九因子0.25nM；活化态第八因子0.4nM；PCPS 40μM；第十因子0到200nM；及活化态第十因子专一小受质0.5mM。如之前所述，以下列方程式计算活化态第九因子活性：吸光度(A₄₀₅)＝at²+bt+c。

活化态第九因子与活化态第八因子间的交互作用

在有限浓度的活化态第八因子下，监测内源性十酶活性以进行结合实验。将25个微孔新鲜制备的活化态第八因子(0.4nM)与25μl不同浓度野生型或突变型活化态第九因子(0到20nM)一起培养，以形成内源性十酶复合体。接着加入50μl由含TBS/Ca/PCPS/BSA的反应缓冲液与第十因子及活化态第十因子专一小受质所组成的混合物，以测量活化态第八因子与活化态第九因子结合而形成的内源性十酶复合体活性。最终浓度分别为：活化态第八因子0.1nM；PCPS 40μM；第十因子100nM；活化态第十因子专一小受质0.5mM；及活化态第九因子0到15nM。三个独立反应均进行实验二重复，并使用所有的数据点绘制曲线。根据如下方程

$[\mathrm{IXa}-\mathrm{VIIIa}]=\frac{{\left[\mathrm{IXa}\right]}_t+{\left[\mathrm{VIIIa}\right]}_t+K_d}{2}-\frac{\sqrt{{({\left[\mathrm{IXa}\right]}_t+{\left[\mathrm{VIIIa}\right]}_t+K_d)}^2-4{\left[\mathrm{IXa}\right]}_t{\left[\mathrm{VIIIa}\right]}_t}}{2}$

计算并推导出K_d值(Chang YJ，et al.，Journal of Biological Chemistry.2002；277：25393)。

第十因子与活化的抗凝血酶III(ATIII)间的交互作用

以酶-抑制剂复合体的凝胶分析进行抗凝血酶III对活化态第九因子的抑制。0.53μM的活化态第九因子与0.53μM抗凝血酶III一同被培养在37℃下100μl的TBS/5mM CaCl₂中(含有或不含有0.01单位/毫升的肝素)。在不同时间间隔(0、5、10、20及30分钟)抽出反应混合物的等分试样(20μl)，将之与电泳试样缓冲液(最终浓度为50mM Tris-Cl(pH6.8)、2mM EDTA、1％SDS、8％甘油及0.025％溴酚蓝)混合后，进行SDS-PAGE及银染。

动物实验

所有下面提及的动物实验均遵守标准程序，遵照台湾的国立台湾大学准则、美国国家卫生院动物保护准则及美国西雅图儿童医院及地区医学中心的准则。来自C57BL/6品系的B型血友病小鼠取自戴尔·史塔福特教授(Dr.Darrel Stafford，Biology Department，University of North Carolina atChapel Hill，NC，USA)及凯瑟琳·海教授(Dr.Katherine High，TheChildren’s Hospital of Philadelphia，PA，USA)。

蛋白质灌注B型血友病小鼠

以2.5％阿佛丁(Avertin)麻醉小鼠并静脉注射0.25μg/每克体重的重组蛋白IX-6(SEQ ID NO.6)、IX-7(SEQ ID NO.7)及IX-8(SEQ ID NO.8)以达到假定的循环浓度5μg/ml，其中小鼠的总血浆体积估计为体重的十分之一。注射后5分钟、15分钟及2小时，将小鼠处死并从下腔静脉收集血液至3.8％柠檬酸钠(9∶1v/v)中。在室温下以8,000rpm(Eppendorf，5415R)离心10分钟以制备出血浆，并以ELISA分析蛋白质量，及以aPTT分析凝结活性。

高压注射(Hydrodynamic injection)及测量B型血友病小鼠中人类第九因子的表现

将编码重组第九因子(SEQ ID Nos：9-16)的cDNA亚克隆至pBS-HCRHP1-A(Miao C.H.et al.，Mol.Ther.2001；3：947-957)中，在人类脂蛋白元E/C-I基因座控制区(locus control region)及人类α-1抗胰蛋白酶启动子的控制之下，利用可增进蛋白质表现的人类第九因子内含子1(已切除前后端)及牛生长激素多聚腺苷酸化信号序列，使该cDNA能在B型血友病小鼠的肝中被最佳表现。以2.5％阿佛丁麻醉小鼠。将这些表现质体(pBS-HCRHP1-A-FIX)的等分试样(50到100μg)溶解在2ml PBS(磷酸盐缓冲液)中并将其注射至17到24g小鼠的尾静脉，期间约6到8秒。每个使用不同质体的实验都重复数次，且至少有两批以上在不同时间所准备的质体DNA。自下腔静脉采取血液样本，并用1/10(v/v)3.8％的柠檬酸钠稀释以制成血浆。分别以ELISA和aPTT测量在小鼠血浆中表现的人类第九因子浓度及呈现的凝血活性。同时亦制备肝组织，以进行ELISA测量第九因子的表现。使用含5μl/ml多种蛋白酶抑制剂(Sigma)的2ml T-PER组织蛋白质萃取试剂(cat.#78510，Pierce)将全部的肝(1到1.7克)均质化。离心后，上清液中提取出的所有蛋白质约31.8±3.5mg/ml，使用这些蛋白质进行ELISA以测量人类第九因子的浓度。

使用假型ssAAV2/8载体进行基因转移实验

将编码IX-6(SEQ ID NO：14)及IX-7(SEQ ID NO：15)之cDNA序列(长1.4kb，没有3端非转译区)分别亚克隆至pBS-HCRHP1-A中，随后被切除成为4.3kb、含有全部表现卡匣(加强子、启动子、第九因子编码区及内含子1、以及牛生长激素多聚腺苷酸化信号)的SpeI片段，再将其亚克隆至pAAV-MCS(Stratagene，La Jolla，CA)的NotI位点，其与连接子(linker)接合后会转变为XbaI。最后产生的质体包含两侧带有AAV2的反转末端重复序列(ITRs)的全部表现卡匣(4.3-kb SpeI片段)。根据三重基因转染法(Triple transfection method)(Xiao X，et al.J Virol.1998；72：2224-2232)，使用携带有个别IX-6及IX-7表现卡匣的ssAAV2/8载体以产生AAV病毒颗粒。使用第九因子专一性引物(SEQ ID NOs：28及29)，由定量PCR(LightCycler 480，Roche Applied Science，Mannheim，Germany)测定载体剂量，并以每毫升载体基因组(vg/ml)为单位表示。从尾静脉将病毒颗粒施打至B型血友病小鼠内，载体剂量为4×10¹²、4×10¹¹或8×10¹⁰vg/公斤体重。尾静脉注射入AAV颗粒的两周之后将小鼠处死。自下腔静脉收集血液样本以用作血浆制备。分别以ELISA及aPTT测量人类第九因子蛋白的表现浓度及在小鼠血浆中的凝血活性。

结果

工程重组第九因子蛋白比野生型第九因子(IX-7)显示较高的凝血活性

为了寻找有较高凝血功效的第九因子，本发明选择213、228、240、247、276及277等6个氨基酸位置并分别将其取代为丙氨酸(序列分别如SEQ ID NOs：23、24、25、26、27及2所示)。重组蛋白的凝血活性与野生型第九因子几乎相同，或者具有更高之活性(表3)。

表3

^*这些蛋白质均为QAE-纯化的部分

本发明更进一步选择人类第九因子上的86、277及338等3个氨基酸位置，并将他们单一或一并替换成丙氨酸。本发明在人类293肾脏细胞中总共表现7种丙氨酸替换过的第九因子变异体。这些突变的第九因子表现浓度与野生型第九因子(IX-7)十分相似，约为0.08到0.5微克/24小时/10⁶细胞。纯化之后，所有的重组第九因子蛋白在SDS-PAGE中均显示为单一条带，其移动性与来自血浆中的第九因子相似(图1)。进行氨基酸序列分析，定出每个重组蛋白前5个残基，以验证并确认重组蛋白的特性(数据未展示)。通过活化态第十一因子及活化态第七因子-组织因子复合物，更进一步测试IX-7及丙氨酸突变体是否健全以活化重组第九因子蛋白，及是否在存在或不存在肝素的情况下会被抗凝血酶III抑制。这些实验均显示IX-7及其它7个丙氨酸重组体之间并无显著差异(数据未展示)。由此可作出结论，即在位置86、277及338上的丙氨酸替换并不会改变第九因子整体的结构。

纯化的重组第九因子之凝血活性显示于表1。重组IX-7具有充分活性，专一活性为94％。所有的第九因子突变体均有功效，并比IX-7多出1.1到13倍的凝血活性。其中，IX-6的活性最高，比IX-7的凝血活性高出13倍。

IX-6增加的凝血活性和其与活化态第八因子之间的亲和力相关

测量重组活化态第九因子的酶动力学参数，以研究丙氨酸替换对活化态第九因子之凝血活性的影响。假定活化态第九因子-活化态第八因子复合物的十酶活性与该复合体的浓度成比例关系，便可由活化态第九因子-活化态第八因子复合物之间的结合亲和力作为指标，监测活化态第十因子的产生并计算表观(apparent)解离常数(K_d)。如表2所示，具有单一丙氨酸突变的3个变异体(IX-1、IX-2及IX-8)及具有双重丙氨酸突变的其中一个变异体(IX-3)的K_d(1.20nM到1.95nM)均与IX-7的K_d(2.44nM)相当接近。令人惊讶的是，具有双重丙氨酸突变的2个变异体(IX-4及IX-5)以及具有三重丙氨酸突变的变异体(IX-6)之K_d(分别为0.4nM、0.34nM及0.19nM)，与IX-7或那3个单一丙氨酸突变的变异体之K_d相比显著下降。IX-6与IX-7的K_d戏剧性地相差10倍。不仅如此，IX-6与活化态第八因子还可形成酶复合物(0.144nM)，比IX-7与活化态第八因子的复合物(0.033nM)效率更佳。根据这些结果，再加上比起IX-7，IX-6与活化态第八因子间有较佳的亲和力，解释了为何IX-6可以有较高的凝血活性。

当活化态第八因子不存在时，所有重组突变体与IX-7的动力学参数(即K_M和k_cat)都非常相似(表2)，k_cat/K_M约在240.59到726.81M^-1 sec^-1间。该结果显示出当活化态第八因子不存在时，活化态第九因子裂解第十因子的效率相当低，这个情况在IX-7已被证实其它的活化态第九因子的突变体也是有相同特性。

重组的IX-6在体内比IX-7更有活性

为了评估重组第九因子在体内的效能，IX-6、IX-7及IX-8蛋白被灌注到B型血友病小鼠体内，并在一定的时间间隔分析血浆样本，追踪这些蛋白质的浓度及凝血功能。如表4所示，尾静脉注射10μg重组蛋白至20克小鼠中的5分钟后，自B型血友病小鼠的血浆中可检测出大约1μg/ml的IX-7蛋白，但第15分钟后浓度会下降到初始浓度的76％，而第2小时后则会下降到初始浓度的18％。在每个时间点，循环中的IX-7因子凝血活性约在121到483％蛋白质量之间。IX-6及IX-8的平行实验，使每个检测IX-7蛋白浓度的时间点上都能同时比较被灌注IX-6及IX-8小鼠的情形。与被灌注IX-7的小鼠相比，被灌注重组IX-8的小鼠分别显示出2.4(5分钟后的样本)到3.67倍(2小时后的样本)更高的凝血活性。IX-6则与体外实验的发现一致，与被灌注IX-7的小鼠相比，灌注IX-6的B型血友病小鼠显示出高的更多的活性，在每个时间点上约为IX-7专一活性的2.6到7.5倍，例如在第5分钟时的数据，IX-7(凝血活性2.91/蛋白1.15)比上IX-6为(12.05/0.72)。

表4连续时间纪录被灌注重组第九因子蛋白的小鼠血浆中的第九因子浓度^＊

^*约10μg的第九因子被注射至每只小鼠中，以达到假定的蛋白浓度(每毫升血浆中5μg)。在注射后不同时间点取出血液样本并进行ELISA及凝血试验分析。连续稀释平行实验的正常血浆以得出标准曲线。ELISA系统使用来自ERL(Gafix-AP160)的pAb作为涂布抗体，ERL pAb-HRP(Gafix-HRP)作为检测抗体。正常血浆中的第九因子浓度假定为5μg/ml。

通过高压注射法将基因递送至B型血友病小鼠中

高压注射带有各自cDNA的表达质体至B型血友病小鼠中，由肝脏主要表达第九因子突变体，以评估第九因子突变体治疗B型血友病的效果。DNA注射后的第24小时测量表达浓度，如图2及表5所示。重组IX-7及所有经过丙氨酸替换的突变体(除了IX-6)均被表达并被分泌至血浆中，蛋白质浓度为0.7到1.17μg/ml，凝血活性则为0.46到2.26μg/ml。与IX-7及其它丙氨酸突变体相比，IX-6具有可再现的较高蛋白浓度(3.22±0.58μg/ml，n＝4)及凝血活性(12.34±2.87μg/ml，n＝4)。有趣的是，与IX-8相比，IX-6也有高出6倍(凝血活性)及2倍(专一活性，即凝血活性/蛋白抗原)的较高活性。比起被注射IX-7及其它突变体的小鼠，在被注射IX-6DNA的小鼠中所发现的较高第九因子蛋白浓度，并未出现在细胞培养表达系统中，该系统中显示X-7及IX-6会被合成至相似浓度。为了进一步探究被注射IX-6DNA的小鼠中，血浆第九因子蛋白比起被注射IX-7DNA的小鼠会有较高浓度的解释，肝细胞内及血浆循环中的第九因子分别被取出并量化。如表5所示，近乎相同数量的第九因子自被注射IX-6及IX-7DNA的小鼠的肝中被取出(分别为每克肝中1.18及1.36μg，p＝0.43)。这些数据显示被注射IX-6DNA及IX-7DNA的小鼠在肝细胞中第九因子的表达相当接近。有趣的是，比起被注射IX-7DNA的小鼠，被注射IX-6DNA的小鼠具有统计上较多的血浆中循环第九因子(1.5倍的差异，p＜0.01，n＝7～10)。更重要地是，IX-6DNA小鼠的血浆凝血活性比IX-7DNA处理小鼠高出了15倍(4.88±2.12μg/ml比上0.31±0.15μg/ml，表5)。

表5被高压注射质体的小鼠中的第九因子浓度

^*高压传递第九因子表达质体至B型血友病小鼠中。通过6到8秒内以高压方式，自尾静脉注射2ml的100μgDNA至20μg的B型血友病公鼠中。之后让小鼠慢慢复原，至注射后24小时处死小鼠，收集血浆以进行aPTT凝血分析，及进行ELISA测定蛋白浓度(IX：Ag)。ELISA系统使用来自ERL(Gafix-AP160)的pAb作为涂布抗体，ERL pAb-HRP(Gafix-HRP)作为检测抗体。连续稀释正常血浆以得出标准曲线。正常血浆中的第九因子浓度假定为5μg/ml。

使用假型ssAAV2/8载体的基因转移实验

使用病毒载体进一步研究IX-6用于基因疗法的功效。静脉注射带有个别IX-6及IX-7的重组腺相关病毒载体(rAAV2/8)至B型血友病小鼠中，剂量为4×10¹²vg/kg。注射后2周，由带有IX-7的rAAV2/8所表达的血浆第九因子蛋白浓度约为2.3到7.8μg/ml(n＝5)(图3a)。与之相比，由带有IX-6的rAAV2/8所表达的第九因子浓度约为1.58到4.23μg/ml(n＝6)。该结果显示，带有IX-6的rAAV2/8比起带有IX-7的rAAV2/8，在小鼠血浆中有较低的第九因子蛋白浓度。相反地，IX-6的专一活性(495±109％)比IX-7的专一活性(94±34％)高上5倍。本发明也评估当递送较低剂量的病毒载体(分别为4×10¹¹vg/kg及8×10¹⁰vg/kg)时，IX-6的效能。如图3b所示，注射带有IX-6之rAAV2/8的小鼠，其在两个剂量之下的专一活性分别达到1236±418％(4×10¹¹vg/kg)及1129±479％(8×10¹⁰vg/kg)；至于注射带有IX-7之rAAV2/8的小鼠，其专一活性分别约为192±24％(4×10¹¹vg/kg)及246±116％(8×10¹⁰vg/kg)。在最低的剂量，其中一只注射IX-6的小鼠具有38％的正常凝血活性，其它4只则都在10％治疗浓度以上(或接近)。相反地，注射IX-7的小鼠只有5.6％及7.4％的正常凝血活性。当倾向以注射低剂量的病毒载体治疗以减少抗病毒抗体之形成时，该结果进一步证实了IX-6能作为有效的试剂。

从图4可得知，残基277位于活化态第九因子催化区表面的对面。根据浜口等人的研究(Hamaguchi N，et al.，blood 1994；84：1837-1842)，E277位于第九因子的表面，具有

的水无障碍区(water-accessible area)(使用DSSP计算)，并紧邻另一个表面分子D276(具有

的水无障碍区)。使用单株抗体基因线状排列作图实验(mapping experiment)研究位置D276，结果显示D276会被一种抑制活化态第九因子与活化态第八因子结合的抗第九因子抗体“FXC008”识别，因此成为强烈的抗原表位(Frazier D，et al.，Blood.1989；74：971-977)。再者，E277主链的氧被发现与支链的Arg248间会形成氢键，Arg248也是一个与FXC008结合有关的重要残基。已知第九因子在结合至活化态第八因子之前，需要先进行构象转变(conformational change)并活化成为活化态第九因子(Hamaguchi N，etal.，Biochemistry.1993；32：6324-6329)。因此，因为活化胜肽的释放而变为溶剂可接触的催化区部分，可能在与活化态第八因子的结合上扮演了重要的角色。D276及E277位于在第九因子活化时会产生构象转变的区域是有可能的，他们也可能位于在第九因子活化后，对重链的其它部分的正常构象转变具关键性的区域。因此，FXC008与D276(或E277)的结合可能会扰乱在附近或在其它重链表面部分所发生的正常构象转变(HamaguchiN，et al.，Biochemistry.1993；32：6324-6329)。扩展设想情境，假定在位置E277进行丙氨酸替换可能直接或间接地支持R338位置附近的构象。位于D276及/或E277的突变其中任一者可能支持活化态第九因子在与活化态第八因子结合后的构象转变。此外，已推测出在与活化态第八因子结合后活化态第九因子会进行构象转变，因此，活性部位到脂质表面的距离会变得比到第九因子酶原的距离短。已有研究指出，膜结合酶活性部位中施体染料(donor dyes)与位于膜表面的受体染料(acceptor dyes)之间的距离，在活化之前与之后会相差

以上(Mutucumarana VP，et al.，J Biol Chem.1992；267：17012-17021)。要发生此情形，可以想见构象转变可能涵盖了活化态第九因子的枢纽区域(hinge region)。既然推测出的活化态第八因子结合区(包含R388)位于E277的对面，则可以合理地想象整体的转变可能包含潜在的枢纽运动，将E277推向另一个方向。去除该位置的电荷可能可以增进该运动，使其更易与活化态第八因子结合。

所属技术领域的技术人员能很快体会到本发明可很容易达成目标，并获得所提到的结果及优点，以及那些存在于其中的东西。本发明中的胚胎、动物及其制造程序与方法乃较佳实施例的代表，其为示范性且不仅局限于本发明领域。所属技术领域的技术人员将会想到其中可修改之处及其它用途。这些修改都蕴含在本发明的精神中，并在权利要求范围中界定。

本发明的内容叙述与实施例均揭示详细，得使任何所属技术领域的技术人员能够制造及使用本发明，即使其中有各种不同的改变、修饰、及进步之处，仍应视为不脱离本发明的精神及范围。

说明书中提及的所有专利及出版品，都以和发明有关领域的公知技术为准。所有专利和出版品都在此被纳入相同的参考程度，就如同每一个个别出版品都被具体且个别地指出纳入参考。

在此所适当地举例说明的发明，可能得以在缺乏任何要件，或许多要件、限制条件或并非特定为本文中所揭示的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书的描述而非限制，同时并无意图使用这类排除任何等同于所示及说明之特点或其部分之名词及表达，但需认清的是，在本发明的权利要求内有可能出现各种不同的改变。因此，应了解到虽然已根据较佳实施例及任意的特点来具体揭示本发明，但是所属技术领域的技术人员仍会修改和改变其中所揭示的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明的申请专利范围内。

序列表

<110>林淑华  吴凯文

<120>重组人类第九因子及其用途

<130>9P04038-US-PCT

<160>29

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>IX-1

<400>1

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                  70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Ala Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

                165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

            180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>2

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>IX-2

<400>2

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                  70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

                165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

            180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Asp Ala Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>3

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>IX-3

<400>3

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                  70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Ala Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

                165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

            180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Asp Ala Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>4

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>IX-4

<400>4

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                  70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Ala Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

                165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

        180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Ala Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>5

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>IX-5

<400>5

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                  70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu ThrIle Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

               165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

            180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Asp Ala Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Ala Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>6

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>IX-6

<400>6

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                  70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Ala Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

                165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

            180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Asp Ala Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Ala Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>7

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>IX-7

<400>7

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                  70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

                165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

            180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>8

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>IX-8

<400>8

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                  70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

                165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

            180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Ala Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>9

<211>2775

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>DNA

<222>(1)..(2775)

<223>IX-1

<400>9

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta    60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt   120

ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt   180

gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac   240

actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat   300

ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc   360

tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgcaacat gtaacattaa gaatggcaga   420

tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga   480

tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga   540

gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac   600

tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca   660

tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg   720

caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa   780

tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt   840

gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt   900

cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa   960

ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa  1020

tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc  1080

cacaaaggga garcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc  1140

acatgtcttc gatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat  1200

gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa  1260

gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa  1320

tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc    1380

acttaatgaa agatggattt ccaaggttaa ttcattggaa ttgaaaatta acagggcctc    1440

tcactaacta atcactttcc catcttttgt tagatttgaa tatatacatt ctatgatcat    1500

tgctttttct ctttacaggg gagaatttca tattttacct gagcaaattg attagaaaat    1560

ggaaccacta gaggaatata atgtgttagg aaattacagt catttctaag ggcccagccc    1620

ttgacaaaat tgtgaagtta aattctccac tctgtccatc agatactatg gttctccact    1680

atggcaacta actcactcaa ttttccctcc ttagcagcat tccatcttcc cgatcttctt    1740

tgcttctcca accaaaacat caatgtttat tagttctgta tacagtacag gatctttggt    1800

ctactctatc acaaggccag taccacactc atgaagaaag aacacaggag tagctgagag    1860

gctaaaactc atcaaaaaca ctactccttt tcctctaccc tattcctcaa tcttttacct    1920

tttccaaatc ccaatcccca aatcagtttt tctctttctt actccctctc tcccttttac    1980

cctccatggt cgttaaagga gagatgggga gcatcattct gttatacttc tgtacacagt    2040

tatacatgtc tatcaaaccc agacttgctt ccatagtgga gacttgcttt tcagaacata    2100

gggatgaagt aaggtgcctg aaaagtttgg gggaaaagtt tctttcagag agttaagtta    2160

ttttatatat ataatatata tataaaatat ataatataca atataaatat atagtgtgtg    2220

tgtgtatgcg tgtgtgtaga cacacacgca tacacacata taatggaagc aataagccat    2280

tctaagagct tgtatggtta tggaggtctg actaggcatg atttcacgaa ggcaagattg    2340

gcatatcatt gtaactaaaa aagctgacat tgacccagac atattgtact ctttctaaaa    2400

ataataataa taatgctaac agaaagaaga gaaccgttcg tttgcaatct acagctagta    2460

gagactttga ggaagaattc aacagtgtgt cttcagcagt gttcagagcc aagcaagaag    2520

ttgaagttgc ctagaccaga ggacataagt atcatgtctc ctttaactag cataccccga    2580

agtggagaag ggtgcagcag gctcaaaggc ataagtcatt ccaatcagcc aactaagttg    2640

tccttttctg gtttcgtgtt caccatggaa cattttgatt atagttaatc cttctatctt    2700

gaatcttcta gagagttgct gaccaactga cgtatgtttc cctttgtgaa ttaataaact    2760

ggtgttctgg ttcat                                                     2775

<210>10

<211>2775

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>DNA

<222>(1)..(2775)

<223>IX-2

<400>10

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta   60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt  120

ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt  180

gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac  240

actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat  300

ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc  360

tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga  420

tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga  480

tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga  540

gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac  600

tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca  660

tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg  720

caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa  780

tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt  840

gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt  900

cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa  960

ctggacgcac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020

tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080

cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc 1140

acatgtcttc gatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200

gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa 1260

gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa    1320

tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc    1380

acttaatgaa agatggattt ccaaggttaa ttcattggaa ttgaaaatta acagggcctc    1440

tcactaacta atcactttcc catcttttgt tagatttgaa tatatacatt ctatgatcat    1500

tgctttttct ctttacaggg gagaatttca tattttacct gagcaaattg attagaaaat    1560

ggaaccacta gaggaatata atgtgttagg aaattacagt catttctaag ggcccagccc    1620

ttgacaaaat tgtgaagtta aattctccac tctgtccatc agatactatg gttctccact    1680

atggcaacta actcactcaa ttttccctcc ttagcagcat tccatcttcc cgatcttctt    1740

tgcttctcca accaaaacat caatgtttat tagttctgta tacagtacag gatctttggt    1800

ctactctatc acaaggccag taccacactc atgaagaaag aacacaggag tagctgagag    1860

gctaaaactc atcaaaaaca ctactccttt tcctctaccc tattcctcaa tcttttacct    1920

tttccaaatc ccaatcccca aatcagtttt tctctttctt actccctctc tcccttttac    1980

cctccatggt cgttaaagga gagatgggga gcatcattct gttatacttc tgtacacagt    2040

tatacatgtc tatcaaaccc agacttgctt ccatagtgga gacttgcttt tcagaacata    2100

gggatgaagt aaggtgcctg aaaagtttgg gggaaaagtt tctttcagag agttaagtta    2160

ttttatatat ataatatata tataaaatat ataatataca atataaatat atagtgtgtg    2220

tgtgtatgcg tgtgtgtaga cacacacgca tacacacata taatggaagc aataagccat    2280

tctaagagct tgtatggtta tggaggtctg actaggcatg atttcacgaa ggcaagattg    2340

gcatatcatt gtaactaaaa aagctgacat tgacccagac atattgtact ctttctaaaa    2400

ataataataa taatgctaac agaaagaaga gaaccgttcg tttgcaatct acagctagta    2460

gagactttga ggaagaattc aacagtgtgt cttcagcagt gttcagagcc aagcaagaag    2520

ttgaagttgc ctagaccaga ggacataagt atcatgtctc ctttaactag cataccccga    2580

agtggagaag ggtgcagcag gctcaaaggc ataagtcatt ccaatcagcc aactaagttg    2640

tccttttctg gtttcgtgtt caccatggaa cattttgatt atagttaatc cttctatctt    2700

gaatcttcta gagagttgct gaccaactga cgtatgtttc cctttgtgaa ttaataaact    2760

ggtgttctgg ttcat                                                     2775

<210>11

<211>2775

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>DNA

<222>(1)..(2775)

<223>IX-3

<400>11

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta   60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt  120

ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt  180

gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac  240

actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat  300

ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc  360

tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgcaacat gtaacattaa gaatggcaga  420

tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga  480

tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga  540

gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac  600

tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca  660

tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg  720

caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa  780

tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt  840

gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt  900

cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa  960

ctggacgcac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020

tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080

cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc 1140

acatgtcttc gatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200

gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa    1260

gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa    1320

tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc    1380

acttaatgaa agatggattt ccaaggttaa ttcattggaa ttgaaaatta acagggcctc    1440

tcactaacta atcactttcc catcttttgt tagatttgaa tatatacatt ctatgatcat    1500

tgctttttct ctttacaggg gagaatttca tattttacct gagcaaattg attagaaaat    1560

ggaaccacta gaggaatata atgtgttagg aaattacagt catttctaag ggcccagccc    1620

ttgacaaaat tgtgaagtta aattctccac tctgtccatc agatactatg gttctccact    1680

atggcaacta actcactcaa ttttccctcc ttagcagcat tccatcttcc cgatcttctt    1740

tgcttctcca accaaaacat caatgtttat tagttctgta tacagtacag gatctttggt    1800

ctactctatc acaaggccag taccacactc atgaagaaag aacacaggag tagctgagag    1860

gctaaaactc atcaaaaaca ctactccttt tcctctaccc tattcctcaa tcttttacct    1920

tttccaaatc ccaatcccca aatcagtttt tctctttctt actccctctc tcccttttac    1980

cctccatggt cgttaaagga gagatgggga gcatcattct gttatacttc tgtacacagt    2040

tatacatgtc tatcaaaccc agacttgctt ccatagtgga gacttgcttt tcagaacata    2100

gggatgaagt aaggtgcctg aaaagtttgg gggaaaagtt tctttcagag agttaagtta    2160

ttttatatat ataatatata tataaaatat ataatataca atataaatat atagtgtgtg    2220

tgtgtatgcg tgtgtgtaga cacacacgca tacacacata taatggaagc aataagccat    2280

tctaagagct tgtatggtta tggaggtctg actaggcatg atttcacgaa ggcaagattg    2340

gcatatcatt gtaactaaaa aagctgacat tgacccagac atattgtact ctttctaaaa    2400

ataataataa taatgctaac agaaagaaga gaaccgttcg tttgcaatct acagctagta    2460

gagactttga ggaagaattc aacagtgtgt cttcagcagt gttcagagcc aagcaagaag    2520

ttgaagttgc ctagaccaga ggacataagt atcatgtctc ctttaactag cataccccga    2580

agtggagaag ggtgcagcag gctcaaaggc ataagtcatt ccaatcagcc aactaagttg    2640

tccttttctg gtttcgtgtt caccatggaa cattttgatt atagttaatc cttctatctt    2700

gaatcttcta gagagttgct gaccaactga cgtatgtttc cctttgtgaa ttaataaact    2760

ggtgttctgg ttcat                                                    2775

<210>12

<211>2775

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>DNA

<222>(1)..(2775)

<223>IX-4

<400>12

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta   60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt  120

ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt  180

gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac  240

actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat  300

ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc  360

tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgcaacat gtaacattaa gaatggcaga  420

tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga  480

tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga  540

gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac  600

tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca  660

tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg  720

caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa  780

tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt  840

gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt  900

cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa  960

ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020

tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080

cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc 1140

acatgtcttg catctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat    1200

gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa    1260

gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa    1320

tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc    1380

acttaatgaa agatggattt ccaaggttaa ttcattggaa ttgaaaatta acagggcctc    1440

tcactaacta atcactttcc catcttttgt tagatttgaa tatatacatt ctatgatcat    1500

tgctttttct ctttacaggg gagaatttca tattttacct gagcaaattg attagaaaat    1560

ggaaccacta gaggaatata atgtgttagg aaattacagt catttctaag ggcccagccc    1620

ttgacaaaat tgtgaagtta aattctccac tctgtccatc agatactatg gttctccact    1680

atggcaacta actcactcaa ttttccctcc ttagcagcat tccatcttcc cgatcttctt    1740

tgcttctcca accaaaacat caatgtttat tagttctgta tacagtacag gatctttggt    1800

ctactctatc acaaggccag taccacactc atgaagaaag aacacaggag tagctgagag    1860

gctaaaactc atcaaaaaca ctactccttt tcctctaccc tattcctcaa tcttttacct    1920

tttccaaatc ccaatcccca aatcagtttt tctctttctt actccctctc tcccttttac    1980

cctccatggt cgttaaagga gagatgggga gcatcattct gttatacttc tgtacacagt    2040

tatacatgtc tatcaaaccc agacttgctt ccatagtgga gacttgcttt tcagaacata    2100

gggatgaagt aaggtgcctg aaaagtttgg gggaaaagtt tctttcagag agttaagtta    2160

ttttatatat ataatatata tataaaatat ataatataca atataaatat atagtgtgtg    2220

tgtgtatgcg tgtgtgtaga cacacacgca tacacacata taatggaagc aataagccat    2280

tctaagagct tgtatggtta tggaggtctg actaggcatg atttcacgaa ggcaagattg    2340

gcatatcatt gtaactaaaa aagctgacat tgacccagac atattgtact ctttctaaaa    2400

ataataataa taatgctaac agaaagaaga gaaccgttcg tttgcaatct acagctagta    2460

gagactttga ggaagaattc aacagtgtgt cttcagcagt gttcagagcc aagcaagaag    2520

ttgaagttgc ctagaccaga ggacataagt atcatgtctc ctttaactag cataccccga    2580

agtggagaag ggtgcagcag gctcaaaggc ataagtcatt ccaatcagcc aactaagttg    2640

tccttttctg gtttcgtgtt caccatggaa cattttgatt atagttaatc cttctatctt    2700

gaatcttcta gagagttgct gaccaactga cgtatgtttc cctttgtgaa ttaataaact  2760

ggtgttctgg ttcat                                                   2775

<210>13

<211>2775

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>DNA

<222>(1)..(2775)

<223>IX-5

<400>13

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta   60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt  120

ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt  180

gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac  240

actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat  300

ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc  360

tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga  420

tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga  480

tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga  540

gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac  600

tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca  660

tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg  720

caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa  780

tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt  840

gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt  900

cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa  960

ctggacgcac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020

tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080

cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc    1140

acatgtcttg catctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat    1200

gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa    1260

gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa    1320

tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc    1380

acttaatgaa agatggattt ccaaggttaa ttcattggaa ttgaaaatta acagggcctc    1440

tcactaacta atcactttcc catcttttgt tagatttgaa tatatacatt ctatgatcat    1500

tgctttttct ctttacaggg gagaatttca tattttacct gagcaaattg attagaaaat    1560

ggaaccacta gaggaatata atgtgttagg aaattacagt catttctaag ggcccagccc    1620

ttgacaaaat tgtgaagtta aattctccac tctgtccatc agatactatg gttctccact    1680

atggcaacta actcactcaa ttttccctcc ttagcagcat tccatcttcc cgatcttctt    1740

tgcttctcca accaaaacat caatgtttat tagttctgta tacagtacag gatctttggt    1800

ctactctatc acaaggccag taccacactc atgaagaaag aacacaggag tagctgagag    1860

gctaaaactc atcaaaaaca ctactccttt tcctctaccc tattcctcaa tcttttacct    1920

tttccaaatc ccaatcccca aatcagtttt tctctttctt actccctctc tcccttttac    1980

cctccatggt cgttaaagga gagatgggga gcatcattct gttatacttc tgtacacagt    2040

tatacatgtc tatcaaaccc agacttgctt ccatagtgga gacttgcttt tcagaacata    2100

gggatgaagt aaggtgcctg aaaagtttgg gggaaaagtt tctttcagag agttaagtta    2160

ttttatatat ataatatata tataaaatat ataatataca atataaatat atagtgtgtg    2220

tgtgtatgcg tgtgtgtaga cacacacgca tacacacata taatggaagc aataagccat    2280

tctaagagct tgtatggtta tggaggtctg actaggcatg atttcacgaa ggcaagattg    2340

gcatatcatt gtaactaaaa aagctgacat tgacccagac atattgtact ctttctaaaa    2400

ataataataa taatgctaac agaaagaaga gaaccgttcg tttgcaatct acagctagta    2460

gagactttga ggaagaattc aacagtgtgt cttcagcagt gttcagagcc aagcaagaag    2520

ttgaagttgc ctagaccaga ggacataagt atcatgtctc ctttaactag cataccccga    2580

agtggagaag ggtgcagcag gctcaaaggc ataagtcatt ccaatcagcc aactaagttg    2640

tccttttctg gtttcgtgtt caccatggaa cattttgatt atagttaatc cttctatctt  2700

gaatcttcta gagagttgct gaccaactga cgtatgtttc cctttgtgaa ttaataaact  2760

ggtgttctgg ttcat                                                   2775

<210>14

<211>2775

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>DNA

<222>(1)..(2775)

<223>IX-6

<400>14

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta   60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt  120

ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt  180

gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac  240

actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat  300

ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc  360

tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgcaacat gtaacattaa gaatggcaga  420

tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga  480

tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga  540

gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac  600

tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca  660

tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg  720

caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa  780

tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt  840

gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt  900

cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa  960

ctggacgcac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020

tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080

cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc    1140

acatgtcttg catctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat    1200

gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa    1260

gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa    1320

tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc    1380

acttaatgaa agatggattt ccaaggttaa ttcattggaa ttgaaaatta acagggcctc    1440

tcactaacta atcactttcc catcttttgt tagatttgaa tatatacatt ctatgatcat    1500

tgctttttct ctttacaggg gagaatttca tattttacct gagcaaattg attagaaaat    1560

ggaaccacta gaggaatata atgtgttagg aaattacagt catttctaag ggcccagccc    1620

ttgacaaaat tgtgaagtta aattctccac tctgtccatc agatactatg gttctccact    1680

atggcaacta actcactcaa ttttccctcc ttagcagcat tccatcttcc cgatcttctt    1740

tgcttctcca accaaaacat caatgtttat tagttctgta tacagtacag gatctttggt    1800

ctactctatc acaaggccag taccacactc atgaagaaag aacacaggag tagctgagag    1860

gctaaaactc atcaaaaaca ctactccttt tcctctaccc tattcctcaa tcttttacct    1920

tttccaaatc ccaatcccca aatcagtttt tctctttctt actccctctc tcccttttac    1980

cctccatggt cgttaaagga gagatgggga gcatcattct gttatacttc tgtacacagt    2040

tatacatgtc tatcaaaccc agacttgctt ccatagtgga gacttgcttt tcagaacata    2100

gggatgaagt aaggtgcctg aaaagtttgg gggaaaagtt tctttcagag agttaagtta    2160

ttttatatat ataatatata tataaaatat ataatataca atataaatat atagtgtgtg    2220

tgtgtatgcg tgtgtgtaga cacacacgca tacacacata taatggaagc aataagccat    2280

tctaagagct tgtatggtta tggaggtctg actaggcatg atttcacgaa ggcaagattg    2340

gcatatcatt gtaactaaaa aagctgacat tgacccagac atattgtact ctttctaaaa    2400

ataataataa taatgctaac agaaagaaga gaaccgttcg tttgcaatct acagctagta    2460

gagactttga ggaagaattc aacagtgtgt cttcagcagt gttcagagcc aagcaagaag    2520

ttgaagttgc ctagaccaga ggacataagt atcatgtctc ctttaactag cataccccga    2580

agtggagaag ggtgcagcag gctcaaaggc ataagtcatt ccaatcagcc aactaagttg    2640

tccttttctg gtttcgtgtt caccatggaa cattttgatt atagttaatc cttctatctt  2700

gaatcttcta gagagttgct gaccaactga cgtatgtttc cctttgtgaa ttaataaact  2760

ggtgttctgg ttcat                                                   2775

<210>15

<211>2775

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>DNA

<222>(1)..(2775)

<223>IX-7

<400>15

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta   60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt  120

ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt  180

gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac  240

actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat  300

ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc  360

tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga  420

tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga  480

tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga  540

gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac  600

tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca  660

tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg  720

caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa  780

tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt  840

gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt  900

cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa  960

ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020

tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc    1080

cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc    1140

acatgtcttc gatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat    1200

gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa    1260

gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa    1320

tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc    1380

acttaatgaa agatggattt ccaaggttaa ttcattggaa ttgaaaatta acagggcctc    1440

tcactaacta atcactttcc catcttttgt tagatttgaa tatatacatt ctatgatcat    1500

tgctttttct ctttacaggg gagaatttca tattttacct gagcaaattg attagaaaat    1560

ggaaccacta gaggaatata atgtgttagg aaattacagt catttctaag ggcccagccc    1620

ttgacaaaat tgtgaagtta aattctccac tctgtccatc agatactatg gttctccact    1680

atggcaacta actcactcaa ttttccctcc ttagcagcat tccatcttcc cgatcttctt    1740

tgcttctcca accaaaacat caatgtttat tagttctgta tacagtacag gatctttggt    1800

ctactctatc acaaggccag taccacactc atgaagaaag aacacaggag tagctgagag    1860

gctaaaactc atcaaaaaca ctactccttt tcctctaccc tattcctcaa tcttttacct    1920

tttccaaatc ccaatcccca aatcagtttt tctctttctt actccctctc tcccttttac    1980

cctccatggt cgttaaagga gagatgggga gcatcattct gttatacttc tgtacacagt    2040

tatacatgtc tatcaaaccc agacttgctt ccatagtgga gacttgcttt tcagaacata    2100

gggatgaagt aaggtgcctg aaaagtttgg gggaaaagtt tctttcagag agttaagtta    2160

ttttatatat ataatatata tataaaatat ataatataca atataaatat atagtgtgtg    2220

tgtgtatgcg tgtgtgtaga cacacacgca tacacacata taatggaagc aataagccat    2280

tctaagagct tgtatggtta tggaggtctg actaggcatg atttcacgaa ggcaagattg    2340

gcatatcatt gtaactaaaa aagctgacat tgacccagac atattgtact ctttctaaaa    2400

ataataataa taatgctaac agaaagaaga gaaccgttcg tttgcaatct acagctagta    2460

gagactttga ggaagaattc aacagtgtgt cttcagcagt gttcagagcc aagcaagaag    2520

ttgaagttgc ctagaccaga ggacataagt atcatgtctc ctttaactag cataccccga    2580

agtggagaag ggtgcagcag gctcaaaggc ataagtcatt ccaatcagcc aactaagttg  2640

tccttttctg gtttcgtgtt caccatggaa cattttgatt atagttaatc cttctatctt  2700

gaatcttcta gagagttgct gaccaactga cgtatgtttc cctttgtgaa ttaataaact  2760

ggtgttctgg ttcat                                                   2775

<210>16

<211>2775

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>DNA

<222>(1)..(2775)

<223>IX-8

<400>16

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta   60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt  120

ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt  180

gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac  240

actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat  300

ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc  360

tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga  420

tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga  480

tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga  540

gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac  600

tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca  660

tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg  720

caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa  780

tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt  840

gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt  900

cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa  960

ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa    1020

tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc    1080

cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc    1140

acatgtcttg catctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat    1200

gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa    1260

gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa    1320

tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc    1380

acttaatgaa agatggattt ccaaggttaa ttcattggaa ttgaaaatta acagggcctc    1440

tcactaacta atcactttcc catcttttgt tagatttgaa tatatacatt ctatgatcat    1500

tgctttttct ctttacaggg gagaatttca tattttacct gagcaaattg attagaaaat    1560

ggaaccacta gaggaatata atgtgttagg aaattacagt catttctaag ggcccagccc    1620

ttgacaaaat tgtgaagtta aattctccac tctgtccatc agatactatg gttctccact    1680

atggcaacta actcactcaa ttttccctcc ttagcagcat tccatcttcc cgatcttctt    1740

tgcttctcca accaaaacat caatgtttat tagttctgta tacagtacag gatctttggt    1800

ctactctatc acaaggccag taccacactc atgaagaaag aacacaggag tagctgagag    1860

gctaaaactc atcaaaaaca ctactccttt tcctctaccc tattcctcaa tcttttacct    1920

tttccaaatc ccaatcccca aatcagtttt tctctttctt actccctctc tcccttttac    1980

cctccatggt cgttaaagga gagatgggga gcatcattct gttatacttc tgtacacagt    2040

tatacatgtc tatcaaaccc agacttgctt ccatagtgga gacttgcttt tcagaacata    2100

gggatgaagt aaggtgcctg aaaagtttgg gggaaaagtt tctttcagag agttaagtta    2160

ttttatatat ataatatata tataaaatat ataatataca atataaatat atagtgtgtg    2220

tgtgtatgcg tgtgtgtaga cacacacgca tacacacata taatggaagc aataagccat    2280

tctaagagct tgtatggtta tggaggtctg actaggcatg atttcacgaa ggcaagattg    2340

gcatatcatt gtaactaaaa aagctgacat tgacccagac atattgtact ctttctaaaa    2400

ataataataa taatgctaac agaaagaaga gaaccgttcg tttgcaatct acagctagta    2460

gagactttga ggaagaattc aacagtgtgt cttcagcagt gttcagagcc aagcaagaag    2520

ttgaagttgc ctagaccaga ggacataagt atcatgtctc ctttaactag cataccccga  2580

agtggagaag ggtgcagcag gctcaaaggc ataagtcatt ccaatcagcc aactaagttg  2640

tccttttctg gtttcgtgtt caccatggaa cattttgatt atagttaatc cttctatctt  2700

gaatcttcta gagagttgct gaccaactga cgtatgtttc cctttgtgaa ttaataaact  2760

ggtgttctgg ttcat                                                   2775

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游PCR引物IX86

<220>

<221>引物

<222>(1)..(21)

<400>17

gtgaattaga tgcaacatgt a                                            21

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游PCR引物IX86T7

<220>

<221>引物

<222>(1)..(24)

<400>18

tgttacatgt tgcatctaat tcac                                         24

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游PCR引物IX277

<220>

<221>引物

<222>(1)..(22)

<400>19

gaactggacg cacccttagt gc                                      22

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游PCR引物IX277-2

<220>

<221>引物

<222>(1)..(22)

<400>20

ctaagggtgc gtccagttcc ag                                      22

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游PCR引物IX338

<220>

<221>引物

<222>(1)..(20)

<400>21

catgtcttgc atctacaaag                                         20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游PCR引物IX338D

<220>

<221>引物

<222>(1)..(20)

<400>22

ctttgtagat gcaagacatg                                      20

<210>23

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>E213A

<400>23

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                  70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

                165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

            180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Ala Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>24

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>K228A

<400>24

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                  70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

                165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

            180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr AlaAla His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Ala Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>25

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>E240A

<400>25

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile AsnSer Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                 70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

                165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

            180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Ala

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>26

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>K247A

<400>26

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                  70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

                165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

            180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Ala Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>27

<211>415

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(415)

<223>D276A

<400>27

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

            20                  25                  30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

        35                  40                  45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

    50                  55                  60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65                  70                  75                  80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

        115                 120                 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

                165                 170                 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

            180                 185                 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

    210                 215                 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225                 230                 235                 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

                245                 250                 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

            260                 265                 270

Leu Glu Leu Ala Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305                 310                 315                 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

                325                 330                 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

            340                 345                 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

        355                 360                 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

    370                 375                 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

                405                 410                 415

<210>28

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游第九因子专一性引物

<220>

<221>引物

<222>(1)..(19)

<400>28

ggaagcagtatgttgatgg                                        19

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游第九因子专一性引物

<220>

<221>引物

<222>(1)..(20)

<400>29

tggttcacaggacttctggt                                        20

Claims (19)

1.一种重组人类第九因子蛋白，其在编码如SEQ ID No：7所示之氨基酸序列的氨基酸残基上作氨基酸的替换，氨基酸替换位置选自由86、276、277和338所组成的群组，但不包含氨基酸位置338的单一替换。

2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于其中替换的氨基酸选自丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、精氨酸或赖氨酸。

3.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于其中替换的氨基酸是丙氨酸。

4.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDNo：1、2、3、4、5或6所示。

5.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDNo：6所示。

6.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于其具有高出野生型第九因子蛋白2到14倍的凝血活性。

7.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于其与辅因子：活化态第八因子间有较强的亲和力。

8.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于其K_d值为0.1到0.5nM。

9.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于其K_M值为32到128nM。

10.一种编码重组人类第九因子蛋白的分离核酸，其具有如SEQ IDNO：9、10、11、12、13或14所示的核苷酸序列。

11.根据权利要求10所述的核酸，其特征在于核苷酸序列如SEQ IDNo：14所示。

12.一种医药组合物，其包含

a.一种如权利要求1所述的人类第九因子蛋白；及

b.其医药上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

13.一种在体内产生如权利要求1所述的人类第九因子蛋白的方法，其包含

a.建构载体，其携带有编码人类第九因子蛋白的核酸；及

b.将该载体施予至哺乳动物体内。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于该哺乳动物是人类。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于该核酸具有如SEQ IDNO：9、10、11、12、13或14所示的核苷酸序列。

16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于通过载体、质体、脂质体、DNA注射、电穿孔或基因枪施予。

17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于施予的方法是静脉注射或肝动脉灌注。

18.一种治疗血友病的方法，其包含施予需要该治疗的病人一达有效剂量如权利要求1所述的蛋白。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于施予的方法是注射。

Images