CN101668775B - Il-23拮抗剂治疗感染的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含IL-23拮抗剂的方法及组合物，所述方法和组合物用于治疗感染，诸如慢性细菌感染、病毒感染以及真菌感染。

Description

IL-23拮抗剂治疗感染的用途

技术领域

本发明总体涉及感染的治疗。具体而言，本发明涉及将IL-23拮抗剂(例如，抗体)给予表现出感染(诸如，慢性细菌感染、真菌感染或病毒感染)的个体。

背景技术

许多病原体引起慢性感染。例如各种病毒、真菌和细菌可以引起无法消退的持久性感染。

随着严重真菌感染的数目继续上升，对用于其治疗的方法和组合物的需要更为紧迫。主要真菌病原体包括白色念珠菌(Candida albicans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)以及新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，其中在美国，涉及此类病原体的侵袭性霉菌病的每年发病率经估算为每一百万人口中72-228例(念珠菌物种)、12-34例(曲霉菌物种)及30-66例(新型隐球菌)感染。Pfaller等人(2006)Clin.Infect.Dis.43：S3-14。真菌感染的上升主要归因于免疫受损患者数目增加，这是医学发展(移植和化疗)的结果以及AIDS患者人口渐增的结果。免疫受损患者中80％以上的真菌感染由念珠菌物种引起。隐球菌病(cryptoccosis)为继念珠菌病(candidiasis)之后在AIDS患者中第二位流行的真菌感染。曲菌病(aspergillosis)引起癌症及器官移植患者中至少30％的感染并且具有高死亡率。

虽然多年来氟康唑(fluconazole)已成为抵抗真菌病原体的有效药物，但抗性也在日益增加。诸如两性霉素B(amphotericin B)的替代药物具有严重缺点，包括诸如发热、肾损坏、贫血、低血压、头痛、恶心、呕吐及静脉炎的副作用。

由于免疫受损个体的人口增加以及抗生素抗性菌株广泛发展，尽管抗生素很普遍，但细菌感染仍为重要问题。免疫受损个体包括老年人、移植接受者、化疗患者以及患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的个体。在美国每年在医院中有近两百万患者受到感染，且引起这些感染的细菌的70％对至少一种抗生素具有抗性。NIAID Fact Sheet，″The Problem of Antimicrobial Resistance，″2006年4月。近年来，在美国有约90,000人死于感染，远高于1992的13,300人。虽然大部分细菌感染仍对至少一种抗生素的延长治疗时程(例如，连续静脉内给予万古霉素(vancomycin))敏感，但无法保证这对将来的病原菌仍然成立。甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant Stapholococcus aureus，MRSA)为代表重大公众健康挑战的多重抗生素抗性微生物的主要实例。2002年，疾病控制中心(Centers for Disease Control，CDC)报导了密歇根州(Michigan)的第一例在患者中完全耐受万古霉素的金黄色葡萄球菌感染(称为VRSA)。持久性细菌病原体还包括沙门氏菌属(Salmonella spp.)、布鲁氏杆菌属(Brucella spp.)及衣原体属(Chlamydia spp.)。

分枝杆菌(Mycobacteria)为一组多样且广泛分布的不形成芽孢的需氧不动杆菌(bacilli)，其具有高细胞壁脂质含量及缓慢的生长速率。分枝杆菌属(genusMycobacterium)的成员的毒性不同，例如自无害至具有重大病原性的物种，例如结核病(TB)中的病原体结核分枝杆菌(M.tuberculosis)。TB为世界上第二主要感染死因。据估算约二十亿人或全世界人口的三分之一感染有结核分枝杆菌。每年发生八百万新病例且近三百万人死亡。TB直接引起全世界所有死亡的7％，由于抗药生物体的传播(spread)以及HIV的持续流行，TB这一全球流行病可能恶化。参见例如Dale及Federman(编辑)(2002)WebMD Scientific AmericanMedicine，WebMD Professional Publishing，New York，NY。

目前治疗TB的大部分方法包括使用广谱抗感染剂，诸如异烟肼(isoniazid)、利福平(rifampin)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、乙胺丁醇(ethambutol)、链霉素(streptomycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)及氧氟沙星(ofloxacin)。然而，这些药剂可在多种器官中引起毒性，且随着若干抗生素抗性TB菌株生长而失去功效。通过使用多种非抗生素药剂降低结核患者肺中的分枝杆菌负荷可以防止疾病形成、传播及死亡。

慢性病毒感染也代表了对公众健康的重大威胁。无法完全根除诸如丙型肝炎病毒(HCV)或人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒感染可能导致随后再活化和并发症，分别如肝癌或获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。Robertson及Hasenkrug(2006)Springer Semin.Immun.28：51。此外，人乳头瘤病毒(HPV)基因型16、18、31、33、45及56为95％以上的宫颈癌病例的原因。Berzofsky等人(2004)J.Clin.Invest.114：450。据估算实际上在100％的HIV感染病例、55-85％的HCV感染病例及30％以上的HPV病例中会出现慢性感染。Berzofsky等人(2004)。

对用于治疗和/或预防细菌感染、病毒感染以及真菌感染的改良方法和组合物存在需要。与现有治疗方法和组合物相比，这些方法和组合物优选具有较低毒性和/或较高功效。

发明概述

本发明通过提供使用IL-23拮抗剂对抗细菌感染、病毒感染和真菌感染的组合物、药物以及方法来满足这些需要及更多需要。

一方面，本发明涉及治疗患有感染、怀疑患有感染、或有获得感染风险的个体的方法，该方法包括给予IL-23拮抗剂。在一个实施方式中，拮抗剂为与IL-23或其p19亚基结合的结合化合物，诸如抗体或其结合片段。在一些实施方式中，抗体的结合阻断IL-23或其p19亚基与IL-23受体或其IL-23R亚基的结合。在另一个实施方式中，IL-23拮抗剂与IL-23受体或其IL-23R亚基结合。在一些实施方式中，拮抗剂与IL-23受体或其IL-23R亚基结合，阻断与IL-23或其p19亚基的结合。在另一方面中，本发明涉及用于所述治疗方法中的组合物。

在一些实施方式中，感染病症包括感染疾病，诸如细菌感染、分枝杆菌感染、病毒感染或真菌感染。在一个实施方式中，感染病症为由牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)或结核分枝杆菌引起的分枝杆菌感染。在一个实施方式中，感染病症为TB。在另一个实施方式中，感染病症为选自甲真菌病(onychomycosis)、念珠菌病(candidiasisa)、曲菌病、隐球菌病的真菌感染。在另一个实施方式中，感染病症为由白色念珠菌(例如，慢性皮肤粘膜念珠菌病(chronic mucouctaneous candidiasis)，鹅口疮(thrush))、新型隐球菌或烟曲霉引起的真菌感染。在另一个实施方式中，感染病症为病毒感染，例如由人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)或人乳头瘤病毒(HPV)引起的病毒感染。

在其它实施方式中，感染病症为慢性感染。在各种实施方式中，尽管先前曾进行至少一次消退感染的尝试，但慢性感染已持续1、2、4、6、9、12、18、24、36或48个月或更久。在各种实施方式中，消退慢性感染的先前尝试包括用抗微生物剂、抗生素、抗病毒剂或抗真菌剂治疗。

在一个实施方式中，本发明涉及组合给予IL-23拮抗剂与至少一种其它治疗形式(诸如，另一治疗剂)的组合疗法。在各种实施方式中，另一治疗剂为IL-17A拮抗剂、IL-17F拮抗剂、IL-12激动剂(包括IL-12)、TGF-β拮抗剂或IL-6拮抗剂。在另一个实施方式中，另一治疗剂为一种或多种选自下列物质的抗真菌剂：泊沙康唑(posaconazole)、氟康唑、伏立康唑(voriconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、利阿唑(liarozole)、伊替马唑(irtemazol)、克霉唑(clotrimazole)、咪康唑(miconazole)、益康唑(econazole)、布康唑(butoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、硫康唑(sulconazole)、噻康唑(tioconazole)及特康唑(terconazole)、经取代的噻唑、噻二唑、噁二唑、卡泊芬净(caspofungin)、两性霉素B、制霉菌素(nystatin)、匹马菌素(pimaricin)、氟胞嘧啶(flucytosine)(5-氟胞嘧啶，5-fluorocytosine)、萘替芬(naftifine)、特比萘芬(terbinafine)、布替萘芬(butenafine)、硫代碳酸酯托萘酯(thiocarbonate tolnaftate)、灰黄霉素(griseofulvin)、胺碘酮(amiodarone)、环吡司(ciclopirox)、舒苯汀(sulbentine)、阿莫罗芬(amorolfine)、氯碘羟喹(clioquinol)、龙胆紫(gentian violet)、碘化钾、硫代硫酸钠、石炭酸-品红溶液及棘白菌素(echinocandins)(例如，乙酸卡泊芬净(caspofungin acetate)、米卡芬净(micafungin)及阿尼芬净(anidulafungin))。

在另一个实施方式中，另一治疗剂为一种或多种选自由下列的抗微生物剂：异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、环丙沙星、万古霉素或氧氟沙星。

在另一个实施方式中，另一治疗剂为一种或多种选自下列的抗病毒剂：阿巴卡韦(abacavir)、阿昔洛韦(acyclovir)、金刚烷胺(amantadine)、安普那韦(amprenavir)、地拉韦啶(delavirdine)、去羟肌苷(didanosine)、依发韦仑(efavirenz)、泛昔洛韦(famciclovir)、茚地那韦(indinavir)、干扰素α(interferon alfa，IFN-α)、利巴韦林(ribavirin)、拉米夫定(lamivudine)、奈非那韦(nelfinavir)、奈韦拉平(nevirapine)、奥司他韦(oseltamivir)、喷昔洛韦(penciclovir)、利巴韦林、利托那韦(ritonavir)、沙奎那韦(saquinavir)、司他夫定(stavudine)、万乃洛韦(valacyclovir)、扎西他滨(zalcitabine)、扎那米韦(zanamivir)、齐多夫定(zidovudine)(叠氮脱氧胸苷(azidodeoxythymidine)，AZT)。

一方面，本发明涉及增强患有感染或怀疑患有感染的个体中1型(Th1)免疫反应的方法。在各种实施方式中，Th1反应的增强反映在与经IL-23拮抗剂治疗之前的T细胞的百分比相比，表达IFN-γ的CD4⁺T细胞百分比增加、表达IL-17A的CD4⁺T细胞百分比减少或两者。在各种实施方式中，增加或减少1.5倍、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更多。在另一方面中，本发明涉及用于所述增强Th1反应的方法中的组合物。

在各种实施方式中，另一治疗剂在给药IL-23拮抗剂之前和/或同时和/或之后给药。在一个实施方式中，IL-17A拮抗剂在给药IL-23拮抗剂之前和/或同时给药。在另一个实施方式中，抗菌剂、抗真菌剂或抗病毒剂与IL-23拮抗剂同时给药。

在另一方面中，本发明涉及治疗患有感染、怀疑患有感染或处于获得感染的风险中的个体的方法，其包括给予IL-17A和/或IL-17F的拮抗剂，诸如针对细胞因子自身或其各受体或受体亚基的拮抗型抗体。

在其它实施方式中，IL-23拮抗剂包括多核苷酸。在各种实施方式中，多核苷酸为反义多核苷酸(例如，反义RNA)或小干扰RNA(siRNA)。在一个实施方式中，IL-23的多核苷酸拮抗剂以诸如腺病毒、慢病毒(lentivirus)、逆转录病毒或腺相关病毒载体的基因疗法载体递送。在另一个实施方式中，IL-23的多核苷酸拮抗剂以治疗剂形式递送。

在另一个实施方式中，IL-23拮抗剂包括可溶性受体多肽。在一实施方式中，IL-23拮抗剂为来源于IL-23R的胞外结构域的可溶性片段。

在各种实施方式中，IL-23拮抗剂为抗体或其抗原结合片段。在各种实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、完全人抗体；抗体片段(例如，Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)₂及双功能抗体(diabody))。在其它实施方式中，拮抗剂包括抗体的肽模拟物。在其它实施方式中，抗体或其抗原结合片段经可检测标记。在一个实施方式中，IL-23拮抗剂为展现降低的补体活化、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或两者的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，具有降低的效应功能的IL-23拮抗剂抗体或其片段为抗IL-23受体(例如，抗IL-23R)抗体或片段。在各种实施方式中，具有降低的效应功能的抗体为抗体片段(例如，Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)₂)、IgG4或具有改变的糖基化作用。

在一个实施方式中，本发明涉及通过给予有效量的特异性结合选自IL-23p19、IL-23R、IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC、IL-6及TGF-β的任两种蛋白的双特异性抗体来治疗感染，例如，慢性真菌感染、细菌感染或病毒感染。在一实施方式中，蛋白为人蛋白。

在一个实施方式中，IL-23拮抗剂对IL-23(或其受体)具有特异性且不拮抗IL-12(或其受体)。在各种实施方式中，通过体外结合检测(例如，ELISA)或通过生物检测(例如，BaF3细胞增殖或Th17细胞产生的促进)来检测拮抗作用。在各种实施方式中，抑制IL-12与其受体结合的IC50与抑制IL-23与其受体结合的IC50的比率(IC50_IL-12/IC50_IL-23)为1.5、2、3、4、5、7、10、15、20、50、100或更大。

在一个实施方式中，使用本发明的方法和组合物来治疗TB且治疗的成功通过细菌负荷减少来检测。在各种实施方式中，分枝杆菌负荷通过结核菌素(tuberculin)测试、曼托测试(Mantoux test)或临床样品中分枝杆菌DNA或RNA的存在来检测。

在本发明的一些实施方式中，患有感染的个体先前已使用其它方法或组合物治疗过。在一个实施方式中，先前治疗没有有效消除感染。在另一个实施方式中，患有感染、怀疑患有感染或处于获得感染的风险中的个体由于(例如)AIDS、移植或化疗而免疫受损。

本发明进一步涵盖IL-23拮抗剂在制备用于治疗一种或多种选自下列感染疾病的药物中的用途：真菌感染、持久性真菌感染、念珠菌病、慢性皮肤粘膜念珠菌病(CMC)、曲菌病、隐球菌病、病毒感染、持久性病毒感染、HIV感染、HBV感染、HCV感染、持久性细菌感染、分枝杆菌感染、结核分枝杆菌感染、牛分枝杆菌感染及麻风分枝杆菌感染。在一些实施方式中，药物可以包含一种或多种其它治疗剂。在其它实施方式中，本发明的药物可与一种或多种其它治疗剂结合使用。

附图简述

图1A-1E显示关于IL-23/IL-17依赖性途径对念珠菌病易感性的作用的实验结果。经胃内给小鼠注射10⁸毒性念珠菌。自三次实验汇集结果(每次实验每组6只小鼠)。

图1A显示p19^-/-、p35^-/-、p40^-/-及C57BL/6(WT)小鼠随时间的存活百分比(％)。

图1B显示在感染后第3天及第10天胃中的真菌生长(CFU)。在第3天及第10天的时间点p19^-/-、p35^-/-或p40^-/-小鼠与C57BL/6小鼠相比，结果在统计学上具有差异(p＜0.05，由^*指示)。

图1C显示MLN中的p35和p19mRNA表达(感染1天后)以及IL-12β2R和IL-23R mRNA表达(感染3天后)。通过实时RT-PCR检测mRNA表达。

图1D显示感染一周后产IFN-γ、IL-17或IL-4的MLN CD4⁺细胞的频率。产生细胞因子的细胞的频率通过ELISPOT检测测定，值为每10⁵个细胞中产生细胞因子的细胞的平均数(±SE)。

图1E显示感染3天后胃匀浆中炎性细胞因子(IL-17、IL-23、IFN-γ、IL-12)的含量。细胞因子通过ELISA检测(pg/ml)。

在图1C-lE中，如图中所示，比较感染小鼠(+)与未经感染小鼠(-)(^*)时，以及比较p19^-/-或p35^-/-/小鼠与C57BL/6小鼠(^**)时，差异在统计学上显著(p＜0.05)。

图2A和2B显示关于IL-23/IL-17依赖性途径对曲菌病易感性的作用的实验结果。小鼠经鼻内感染2×10⁷个曲霉菌休眠分生孢子。图2A和2B中所示的结果自四次实验汇集(6只动物/组)。

图2A显示感染3天后肺中的真菌生长(几丁质含量，表示为葡糖胺微克数/器官)。当比较p19^-/-、p35^-/-或p40^-/-小鼠与C57BL/6小鼠(^*)时差异在统计学上显著(p＜0.05)。

图2B显示TLN中的p35/p19mRNA表达(感染1天后)和IL-12β2R/IL-23RmRNA表达(感染3天后)。通过RT-PCR检测信使RNA(Messenger RNA)表达。如图中所示，当比较感染小鼠(+)与未经感染小鼠(-)(^*)时，以及比较p19^-/-或p35^-/-小鼠与C57BL/6小鼠(^**)时，差异在统计学上显著(p＜0.05)。

图3A-3C显示关于IL-23/IL-17依赖性途径对真菌感染的易感性中的重要性的实验结果。如图1及2中感染小鼠，在感染5h后用200μgp19或IL-17中和抗体或在感染5h和24h后用1mg TGF-β中和抗体治疗。

图3A显示在感染3天后患有念珠菌病(白色念珠菌)或曲菌病(烟曲霉)的小鼠的胃或肺中的真菌生长。如图中所示，当比较经治疗小鼠(+)与未经治疗(-)小鼠(^*)时，差异在统计学上显著(p＜0.05)。

图3B分别显示如通过ELISPOT检测所测定，来自患有念珠菌病或曲菌病的小鼠的MLN或TLN的产生IFN-γ或IL-17的CD4+细胞频率。值为每10⁵个细胞中产生细胞因子的细胞的平均数(±SE)。图3B进一步展示在经抗原刺激的未分级分离的MLN或TLN的培养物上清液中的实际IL-17产生(感染一周后)。如图中所示，当比较经感染与未经感染(Ct)小鼠(^*)时，以及比较经治疗(+)与未经治疗(-)小鼠(^**)时，差异在统计学上显著(p＜0.05)。

图3C显示在感染3天后经上述p19中和抗体治疗的患有念珠菌病的小鼠胃中的真菌生长。如图中所示，当比较经治疗小鼠(+)与未经治疗小鼠(-)(^*)时，以及比较IL-4^-/-、IFN-γ^-/-、p35^-/-或IFN-γ^-/-/p35^-/-小鼠与BALB/c小鼠(^**)时，差异在统计学上显著(p＜0.05)。

图4A-4D显示关于DC亚群中响应真菌的IL-23和IL-12产生的实验结果。将在GM-CSF+IL-4(GM-DC)或FLT3-L(FL-DC)的存在下获得的骨髓DC用真菌刺激，评估其细胞因子表达。

图4A显示细胞因子mRNA表达的实时RT-PCR分析，图4B展示如通过ELISA检测的细胞因子表达(pg/ml)。使用酵母聚糖(Zymosan)、LPS(10μg/ml)或CpG-ODN 2006(0.06μM)作为阳性对照。将DC以10∶1的比率暴露于酵母。如图中所示，当比较暴露的DC与未暴露(″未″)的DC(^*)时，差异在统计学上显著(p＜0.05)。

图4C显示来自p19^-/-小鼠或p35^-/-小鼠的脾CD11c+DC中的IL-12及IL-23产生。在检测培养物上清液中的细胞因子前用真菌刺激小鼠。

图4D显示如图中所示，在IL-12或IL-23(10ng/ml)存在(+)或不存在(-)下或在中和抗IL-12或抗IL-23抗体(10μg/ml)存在下，来自暴露于真菌12h的C57BL/6小鼠的脾CD11c+DC中的IL-12及IL-23产生。

图5A-5C显示关于对真菌反应的炎性DC响应真菌产生IL-23的实验结果，具体而言该产生是否具有TLR及T细胞依赖性的实验结果。

图5A显示来自先暴露于真菌12h的不同类型小鼠的脾CD11c+DC中的IL-23产生(pg/ml)。显示了自四次实验汇集的结果。如图中所示，当比较暴露的DC与未暴露(″未″)的DC(^*)时，差异在统计学上显著(p＜0.05)。

图5B显示各种细胞培养物及共培养物中细胞因子的表达。将来自C57BL/6(WT)或p35^-/-小鼠的脾CD4+T细胞在未经脉冲(组2及5)或经念珠菌酵母(Ag)脉冲(组3及6)的相应脾DC存在下培养。脉冲后5天，通过ELISA检测细胞因子(IL-12、IL-23、IFN-γ、IL-17)。组1及4为经真菌刺激且无T细胞的C57BL/6或p35^-/-DC。组7及8为在真菌存在下分别用C57BL/6或p35^-/-DC培养的p35^-/-或C57BL/6CD4+T细胞。如图中所示，当比较组3和7与组1的IFN-γ产生，以及当比较组6和8与组4的IL-23和IL-17产生时，差异在统计学上显著(p＜0.05，由^*指示)。

图5C显示类似于图5B中所示数据的数据，不同的是一些样品包括抗IL-23或抗TGF-β抗体。在相应脾DC存在下培养来自C57BL/6(WT)(组1-3)或p35^-/-(组4-6)小鼠的脾CD4+T细胞。在10μg/ml IL-23或TGF-β中和抗体存在下将培养物用念珠菌酵母(Ag)脉冲，通过ELISA定量培养物上清液中的细胞因子(IFN-γ、IL-17)。如图中所示，当针对IFN-γ及IL-17产生将组2及3与组1比较时且当针对IL-17产生将组5与组4比较时，差异在统计学上显著(p＜0.05，由^*指示)。

图6A-6E显示关于IL-23和IL-17削弱抗真菌效应功能及破坏PMN的抗炎程序的能力的实验结果。

图6A显示在37℃下在5∶1的效应物与真菌细胞比率下用未经调理的酵母(30min)或分生孢子(60min)孵育后来自C57BL/6(WT)、p19^-/-或p35^-/-小鼠的PMN中的杀真菌活性。结果绘制为菌落形成单位抑制百分比(平均值±SE)的图。结果反映来自三次实验的汇集数据。如图中所示，当比较p19^-/-或p35^-/-PMN与C57BL/6(WT)PMN(^*)时，差异在统计学上显著(p＜0.05)。

图6B显示来自暴露于指定浓度下的IL-23或IL-17的C57BL/6(WT)小鼠的PMN杀真菌活性。当比较暴露于细胞因子的PMN与未暴露的PMN(^*)时，差异在统计学上显著(p＜0.05)。

图6C和6D显示来自暴露于IFN-γ(50ng/ml)、IL-23(100ng/ml)及IL-17(100ng/ml)的各种组合60min的C57BL/6(WT)小鼠的PMN杀真菌活性。检测抵抗念珠菌酵母或曲霉菌分生孢子的杀真菌活性(图6C)。还检测了MMP9/MPO产生(图6D)。通过明胶酶谱法(zymography)评估明胶酶及髓过氧化物酶的产生，对培养物上清液进行Western印迹分析。凝胶展示对应于活性92kDa MMP9及60kDaMPO的条带。如图中所示，当比较暴露于细胞因子的PMN与未暴露的PMN时(^*)以及当比较暴露于(IFN-γ+IL-23)或(IFN-γ+IL-17)的PMN与暴露于IFN-γ的PMN时(^**)，差异在统计学上显著(p＜0.05)。

图6E显示Western印迹上的条带。将PMN在体外暴露于IFN-γ、IL-23及IL-17的各种组合12h。接着通过Western印迹法测定IDO蛋白表达。表达IDO的MC₂₄转染子及经模拟转染的MC₂₂细胞分别充当阳性对照和阴性对照。β-微管蛋白充当加样对照。

发明详述

除非上下文另外清楚规定，否则如本文(包括随附权利要求书)所用的单数形式的词(诸如，“一个”、“一种”和“所述”)包括其相应复数指示物。除非另外指示，否则认为本文所提供的例示性实施方式不限制本发明的范围。这些例示性实施方式之前可放置诸如“例如”、“在一实施方式中”或其它此类非限制性语言的短语，或其例示性质可自上下文显而易见(例如，“实施例”)。除非另外指示，否则诸如“不抑制”的术语意欲为相对的而非绝对的。举例而言，抑制IL-23但“不”抑制IL-12的药剂指当该药剂以给定浓度存在于这两种细胞因子的比较检测中时，抑制IL-12不如抑制IL-23有效的药剂。

本文所引用的所有文献以全文引用的方式并入，其并入程度如同各单独出版物、数据库条目、专利申请或专利明确且单独地以引用的方式并入一般。

I.定义

除非上下文另外明确指示，否则“活化”、“刺激”和“治疗”在其应用于细胞或受体时可具有相同含义，例如用配体活化、刺激或治疗细胞或受体。“配体”涵盖天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白质及来源于抗体的结合组合物。“配体”还涵盖小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可指如由内部机制以及外部或环境因素调控的细胞活化。例如细胞、组织、器官或生物体的“反应”涵盖生物化学或生理学行为(例如，生理隔室内的浓度、密度、粘着或迁移、基因表达率或分化状态)的变化，其中该变化与活化、刺激或治疗或诸如基因程序设计的内部机制相关联。

分子的“活性”可描述或指分子与配体或受体的结合；催化活性；刺激基因表达或细胞信号转导、分化或成熟的能力；抗原活性；对其他分子活性的调节等。分子的”活性”还可指调节或保持细胞-细胞相互作用(例如，粘着)的活性或保持细胞结构(例如，细胞膜或细胞骨架)的活性。”活性”还可指比活性(例如[催化活性]/[蛋白质毫克数]或[免疫活性]/[蛋白质毫克数])、生物代谢区中的浓度等。“增殖活性”涵盖促进(例如)正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育不良、细胞转化、转移及血管生成所需的活性或与它们特定相关的活性。

“给药(给予)(administration)”和“治疗(处理)(treatment)”在其应用于动物、人、实验个体、细胞、组织、器官或生物流体时指外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、个体、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给药(给予)”和“治疗(处理)”可指：例如，治疗性的、药物动力学的、诊断的、研究和实验性方法。细胞的处理涵盖试剂与细胞的接触以及试剂与流体的接触，其中该流体与细胞接触。“给药(给予)”和“治疗(处理)”还指通过试剂、诊断、结合组合物或另一细胞对(例如)细胞的体外和离体治疗(处理)。“治疗”在其应用于人个体、兽医学个体或研究个体时指治疗性治疗、预防性或防止性措施，还指研究及诊断应用。“治疗(处理)”在其应用于人个体、兽医学个体或研究个体或细胞、组织或器官时涵盖IL-23或IL-23R拮抗剂与人或动物个体、细胞、组织、生理隔室或生理流体的接触。“细胞的处理”还涵盖(例如)在流体相或胶体相中IL-23或IL-23R拮抗剂与IL-23R复合体(IL-23R/IL-12Rβ1异二聚体)接触的情形，但也涵盖拮抗剂不与细胞或接受者接触的情形。

“结合组合物”指能够与靶标结合的分子、小分子、大分子、抗体、其片段或类似物或可溶性受体。“结合组合物”还可指能够与标靶结合的分子复合体(例如，非共价复合体)、离子化分子及经共价或非共价修饰的分子(例如，经磷酸化、酰化、交联、环化或限制性裂解修饰)。“结合组合物”还可指能够与标靶结合的与稳定剂、赋形剂、盐、缓冲剂、溶剂或添加剂组合的分子。“结合”可定义为结合组合物与标靶的缔合(association)，其中在结合组合物可以溶解或悬浮于溶液中的情况下，缔合会导致结合组合物的正常布朗运动(Brownian motion)减少。

本发明的结合化合物可以包括双特异性抗体。如本文所用的术语“双特异性抗体”指对至少两种不同抗原表位具有结合特异性的抗体，通常为单克隆抗体。在一个实施方式中，表位来自相同抗原。在另一个实施方式中，表位来自两种不同抗原。用于制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。举例而言，可使用两种免疫球蛋白重链/轻链对的共同表达来重组产生双特异性抗体。参见例如Milstein等人(1983)Nature 305：537-39。或者，可使用化学键联来制备双特异性抗体。参见例如Brennan等人(1985)Science 229：81。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见例如Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48，Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。

“典型TH1型T细胞”为表达干扰素-γ(IFNγ)程度比表达IL-4、IL-5或IL-13中的每一种大的T细胞，而“典型TH2型T细胞”为表达IL-4、IL-5或IL-13每一种的程度比表达IFNγ大的T细胞。“程度”通常为典型TH2型细胞的4倍或更大，更通常8倍或更大，且最通常16倍或更大。

如本文所定义的“记忆T细胞”为之前暴露于给定抗原的长命(long-lived)T细胞的亚群。记忆T细胞可存在于生物体中多年，以允许对随后相同抗原的激发作出快速反应。小鼠记忆T细胞的表型定义为CD4+^高CD45RB^低。人记忆T细胞的表型定义为CD45RA^阴性/低CD45R0^高。对这些记忆T细胞的IL-23处理导致IL-17的增殖及表达。除非另外指示，否则如本文所用的“IL-17”指IL-17A。参见例如Moseley等人(2003)Cytokine & Growth Factor Rev.14：155。

“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于具体的核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下指基本上相同的核酸序列。由于遗传密码的简并性，所以大量功能相同的核酸可编码任何给定的蛋白。

关于氨基酸序列，本领域技术人员应认识到所编码的序列中氨基酸或小部分氨基酸经保守氨基酸取代的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的改变为“保守修饰的变体。提供功能类似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。保守取代的实例为以下一组中的氨基酸换为同一组的另一种氨基酸(授予Lee等人的美国专利No.5,767,063；Kyte和Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157：105-132)：

(1)疏水性：正亮胺酸、Ile、Val、Leu、Phe、Cys或Met；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe；

(7)小氨基酸：Gly、Ala、Ser。

“有效量”涵盖足以改善或预防医学病状的症状或体征的量。有效量还指足以允许或利于诊断的量。对特定患者或兽医个体而言的有效量可视下列因素而变：诸如所治疗的病状、患者的整体健康状况、给药的方法途径和剂量、以及副作用严重程度。参见例如美国专利No.5,888,530。有效量可为避免显著副作用或毒性效应的最大剂量或给药方案。该效应将使得诊断检测或参数改善至少5％，通常至少10％，更通常至少20％，最通常至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，最优选至少60％，理想地至少70％，更理想地至少80％，且最理想地至少90％，其中100％定义为正常个体所显示的诊断参数。参见例如Maynard等人(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice，Interpharm Press，Boca Raton，FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice，UrchPubl.，London，UK。

“外源”指视上下文而定在生物体、细胞或人体外部产生的物质。“内源”指视上下文而定在细胞、生物体或人体内部产生的物质。

“感染性疾病”指生物体、器官、组织或细胞的微生物(例如，细菌、病毒和/或真菌)感染。

“产IL-17细胞”指不为典型TH1型T细胞或典型TH2型T细胞的T细胞。“产IL-17细胞”还指表达基因或多肽(例如，有丝分裂原反应性P-蛋白；趋化因子配体2；白介素-17(IL-17)；转录因子ROR-γT相关的；细胞因子信号转导抑制剂3等)的T细胞，其中经IL-23激动剂处理的表达大于经IL-12激动剂处理的表达，其中“大于”定义如下。在IL-23激动剂下的表达通常比在IL-12处理下大至少5倍，通常大至少10倍，更通常大至少15倍，最通常大至少20倍，优选大至少25倍，且最优选大至少30倍。可检测(例如)在处理基本上纯的产IL-17细胞群体的情况下的表达。

此外，“产IL-17细胞”包括在细胞发育或细胞分化的途径中分化成如上定义的产IL-17细胞的祖细胞或前体细胞。产IL-17细胞的祖细胞或前体细胞可见于引流淋巴结(DLN)中。此外，“产IL-17细胞”涵盖已(例如)通过佛波醇酯(phorbolester)、离子载体(ionophore)和/或致癌剂(例如)活化，进一步分化、储存、冷冻、干燥、灭活，(例如)通过细胞凋亡、蛋白水解或脂质氧化部分降解或(例如)通过重组技术修饰的如上定义的产IL-17细胞。

“抑制剂”“拮抗剂”指抑制(例如)配体、受体、辅因子、基因、细胞、组织或器官的抑制分子。基因、受体、配体或细胞的调节剂是改变基因、受体、配体或细胞的活性的分子，其中调节特性方面的活性可被活化、抑制或改变。调节剂可单独作用，或其可使用辅因子，例如蛋白质、金属离子或小分子。抑制剂是降低、阻断、阻止、延迟活化、灭活、脱敏或下调(例如)基因、蛋白、配体、受体或细胞的化合物。活化剂为增加、活化、促进、增强活化、敏化或上调(例如)基因、蛋白、配体、受体或细胞的化合物。抑制剂还可定义为降低、阻断或灭活组成性活性的组合物。“拮抗剂”为对抗激动剂作用的化合物。拮抗剂阻止、降低、抑制或中和激动剂活性。拮抗剂还可在甚至不存在确定的激动剂情况下阻止、抑制或降低靶标(例如，靶受体)的组成性活性。

IL-23的拮抗剂(例如)包括破坏IL-23的生物活性(诸如，如下文更详细描述的Th17细胞的扩增及存活)的任何药剂。IL-23受体和IL-23R的拮抗剂为IL-23拮抗剂的亚类，因为它们用以通过阻断IL-23信号转导来阻断IL-23活性。

为检测抑制程度，举例而言，用潜在活化剂或抑制剂处理包含给定蛋白、基因、细胞或生物体的样品或检测，将它们与无抑制剂的对照样品比较。指定对照样品(即，未经拮抗剂处理)具有100％的相对活性值。当相对于对照的活性值为约90％或更小，通常85％或更小，更通常80％或更小，最通常75％或更小，一般70％或更小，更一般65％或更小，最一般60％或更小，通常55％或更小，通常50％或更小，更通常45％或更小，最通常40％或更小，优选35％或更小，更优选30％或更小，更优选25％或更小且最优选小于25％时，实现抑制。当相对于对照的活性值为约110％，一般至少120％，更一般至少140％，更一般至少160％，通常至少180％，更通常至少2倍，最通常至少2.5倍，通常至少5倍，更通常至少10倍，优选至少20倍，更优选至少40倍，且最优选超过40倍时，实现活化。

活化或抑制的终点可如下监测。可通过终点来监测(例如)细胞、生理流体、组织、器官和动物或人个体的活化、抑制及对治疗的反应。终点可包括(例如))的细菌负荷、致癌性、或细胞脱粒或分泌(如细胞因子、有毒氧或蛋白酶的释放)的标记降低预定的量或百分比。终点可包含(例如)预定量的离子流或输送；细胞迁移；细胞粘附；细胞增殖；转移的可能性；细胞分化；及表型变化(例如与炎症、凋亡、转化、细胞周期或转移有关的基因表达的变化)。参见例如Knight(2000)Ann.Clin.Lab.Sci.30：145-158；Hood及Cheresh(2002)NatureRev.Cancer 2：91-100；Timme等人(2003)Curr.Drug Targets 4：251-261；Robbins及Itzkowitz(2002)Med.Clin.North Am.86：1467-1495；Grady及Markowitz(2002)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.3：101-128；Bauer等人(2001)Glia 36：235-243；Stanimirovic及Satoh(2000)Brain Pathol.10：113-126。

抑制终点一般为对照的75％或更少，优选为对照的50％或更少，更优选为对照的25％或更少，且最优选为对照的10％或更少。一般而言，活化终点为对照的至少150％，优选为至少对照的2倍，更优选为至少对照的四倍且最优选为至少对照的10倍。

“敲除”(KO)指部分或完全降低由(例如)编码IL-23或IL-23受体的亚基的基因编码的至少一部分多肽的表达，其中该基因对哺乳动物的单一细胞、所选细胞或所有细胞为内源的。KO还涵盖其中生物学功能降低但表达未必降低的实施方式，例如含有插入的灭活肽的多肽。敲除技术涵盖编码序列或调控序列的破坏。细胞或哺乳动物可为“杂合敲除”，其中内源基因的一个等位基因被破坏。或者，细胞或哺乳动物可为“纯合敲除”，其中内源基因的两个等位基因都被破坏。“纯合敲除”不欲将两个等位基因的破坏限于相同技术或基因组的相同结果。

通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、同位素或化学方法可直接或间接检测经“标记”的组合物。举例而言，可用的标记包括³²P、³³P、³⁵S、¹⁴C、³H、¹²⁵I、稳定同位素、荧光染料、电子致密试剂(electron-dense reagent)、底物、表位标签、或酶(例如，如用于酶联免疫检测)或仿氟(fluorette)。例如参见Rozinov及Nolan(1998)Chem.Biol.5：713-728。

“配体”″指(例如))可充当受体的激动剂或拮抗剂的小分子、肽、多肽及膜缔合或膜结合分子或其复合体。“配体”还涵盖并非激动剂或拮抗剂但可与受体结合的药剂。此外，“配体”包括已(例如)通过化学或重组方法改变的膜结合配体、该膜结合配体的可溶性形式。通常在配体经膜结合于第一细胞上的情况下，受体通常存在于第二细胞上。第二细胞可具有与第一细胞相同或不同的特性。配体或受体可完全在细胞内，即，其可存在于细胞液、核或一些其它胞内隔室中。配体或受体可改变其位置，例如自胞内隔室至质膜的外表面。配体与受体的复合体称为“配体受体复合体”。在配体及受体参与信号转导途径中的情况下，配体存在于信号转导途径的上游位置且受体存在于信号转导路径的下游位置。

“标记”涉及细胞、组织、器官、动物(例如，产IL-17细胞)的表型。标记用以(例如)在细胞纯化、定量、转移、活化、成熟或发育期间检测细胞，可用于体外及体内研究。活化标记为与细胞活化有关的标记。

“经纯化的细胞”涵盖基本上不含其它类型细胞(例如，无其它类型T细胞污染)的(例如)一种或多种“产IL-17细胞”。纯度可通过使用由几何坐标或包括(例如)烧瓶、管或小瓶的隔室界定的体积来评估。“经纯化的产IL-17细胞”可通过(例如)隔室定义，其中“产IL-17细胞”通常占所有细胞的至少20％，更通常所有细胞的至少30％，最通常所有细胞的至少40％，一般所有细胞的至少50％，更一般所有细胞的至少60％，最一般所有细胞的至少70％，优选所有细胞的至少80％，更优选所有细胞的至少90％；且最优选所有细胞的至少95％。

“小分子”定义为分子量小于10kD，通常小于2kD且优选小于1kD的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含有无机组份的有机分子、包含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物及抗体模拟物。作为治疗剂，与大分子相比，小分子更可透过细胞，较不易降解且较不易于引起免疫反应。诸如抗体和细胞因子的肽模拟物的小分子以及小分子毒素在本领域中已知。参见例如Casset等人(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.307：198-205；Muyldermans(2001)J.Biotechnol.74：277-302；Li(2000)Nat.Biotechnol.18：1251-1256；Apostolopoulos等人(2002)Curr.Med.Chem.9：411-420；Monfardini等人(2002)Curr.Pharm.Des.8：2185-2199；Domingues等人(1999)Nat.Struct.Biol.6：652-656；Sato及Sone(2003)Biochem.J.371：603-608；美国专利No.6,326,482。

当涉及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”或“选择性”结合指示决定蛋白质在异源群体的蛋白质和其它生物制品中的存在的结合反应。因此，在指定条件下，指定配体与特定受体结合且不以显著量与样品中存在的其它蛋白质结合。所预期方法的抗体或来源于抗体的抗原结合位点的结合组合物与其抗原或其变体或突变蛋白质结合的亲和力比与任何其它抗体或来源于其的结合组合物的亲和力大至少2倍，优选大至少10倍，更优选大至少20倍且最优选大至少100倍。在一个优选实施方式中，抗体对所需靶标的亲和力大于约109升/摩尔(如(例如)由Scatchard分析所测定)。Munsen等人(1980)Analyt.Biochem.107：220-239。

与IL-23或IL-23受体“特异性结合”的抗体不与不包含IL-23衍生的序列的蛋白质结合，即本文所用的“特异性”涉及IL-23特异性，而非任何其它可能存在于所讨论蛋白质中的序列。举例而言，如本文所用，与IL-23“特异性结合”的抗体通常结合包含IL-23及FLAG

肽标签的融合蛋白质FLAG-hIL-23，，但不结合单独的FLAG肽标签或与非IL-23的蛋白质融合的FLAG

肽标签。依据本文，对IL-23的特异性还可指与IL-23(或其受体)结合而不与其它蛋白质诸如IL-12(或其受体)结合的能力。

II.概述

虽然IL-23及IL-12为具有共同亚基及共同受体亚基的异二聚体细胞因子，但近来的结果表明它们在炎症及宿主防御中的作用更为拮抗的而非重叠的。白介素-23(IL-23)为由两个亚基(即p19和p40)组成的异二聚体细胞因子。p19亚基在结构上与IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及IL-12的p35亚基相关。p40亚基为细胞因子IL-12的一部分，IL-12由p35和p40组成。异二聚体IL-12通常称为IL-12p70。IL-23通过结合由IL-23R和IL-12Rβ1组成的异二聚体受体来介导信号转导。IL-12Rβ1亚基为IL-12受体所具有的，IL-12受体由IL-12Rβ1和IL-12Rβ2组成。IL-23及IL-23受体及其各自的IL-23特异性亚基公开于WO 99/05280、WO01/18051、WO 00/73451及WO 01/85790中。

IL-12的大量早期研究涉及p40的遗传缺失(p40敲除小鼠；p40KO小鼠)，但随后由IL-23的发现认识到这些小鼠的IL-12及IL-23两者均有缺失。Oppmann等人(2000)Immunity 13：715-725；Wiekowski等人(2001)J.Immunol.166：7563-7570；Parham等人(2002)J.Immunol.168：5699-708；Frucht(2002)SciSTKE 2002，E1-E3；Elkins等人(2002)Infection Immunity 70：1936-1948。这些结果改变了最初认为与IL-12及Th1反应有关的许多早期观测的解释。

近来的研究表明CD4+T细胞效应物库(effector repertoire)的种类比Th1/Th2范例所涵盖更多。目前认为Th17细胞为效应Th细胞的单独谱系，该效应Th细胞参与先前归因于Th1谱系的免疫病理学。虽然导致Th17分化的通路尚未清楚(Dong(2006)Nat Rev Immunol 6：329)，但IL-23为产生及维持此谱系的关键细胞因子(Trinchieri等人(2003)Immunity 19：641)。虽然IL-12及IL-23都可诱导CD4+T细胞表达IFN-γ，但仅IL-23促进Th细胞产生促炎症细胞因子IL-17。

尽管有许多类似之处，但日益增加的证据表明IL-12及IL-23启动不同免疫通路。IL-17致敏的细胞(Th17细胞)引起多种器官相关的自体免疫疾病(Harrington等人(2006)Curr.Opin.Immunol.18：349)，包括实验性自体免疫脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)(Langrish等人(2005)J.Exp.Med.201：233)、关节炎(Murphy等人(2003)J.Exp.Med.198：1951)、结肠炎(Yen等人(2006)J.Clin.Invest.116：1310)及自体免疫心肌炎(Sonderegger等人(2006)Eur.J.Immunol.36：2844)。此外，虽然不太明确，但高含量IL-23/IL-17的产生比IL-12/IFN-γ与各种感染中疾病的严重程度及免疫病理学关联更密切。Hunter(2005)Nat.Rev.Immunol.5：521；Rutitzky(2005)J.Immunol.175：3920。其它研究表明IL-12和IL-23在抵抗肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)(Happel等人(2005)J.Exp.Med.202：761)和啮齿动物柠檬酸杆菌(Citrobacterrodentium)(Mangan等人(2006)Nature 441：231)的宿主防御中具有不同作用。这些研究表明IL-12和IL-23对体内促进抗微生物免疫反应和疾病具有不同作用。

IL-12及IL-23在炎症及宿主防御中的不同作用对慢性感染(诸如，慢性真菌感染)具有重要意义。虽然炎症为迅速控制真菌感染所需，但为保持感染和相关疾病的保护与免疫病理学之间的平衡需要消退炎症。Han和Ulevitch(2005)Nat.Immunol.6：1198。长期炎症为多种慢性疾病及自体免疫性的标志。Han及Ulevitch(2005)。对于念珠菌，无法消退炎症与真菌清除缺陷有关。未消退的念珠菌感染导致了慢性皮肤粘膜念珠菌病(CMC)。CMC与自体免疫性多内分泌病-念珠菌病-外胚层营养不良(polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermaldystrophy)(功能异常T细胞活性的病状)有关。Ryan等人(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：1158。CMC还涵盖多种免疫发病机理未知的临床病症。Lilic(2002)Curr.Opin.Infect.Dis.15：143。对于曲霉菌，伴随难治的感染的持久性炎症在同种异体造血干细胞移植后的非中性白细胞减少症患者(Ortega等人(2006)BoneMarrow Transplant 37：499)以及过敏性真菌疾病(Schubert(2006)Clin.Rev.Allergy Immunol.30：205)中常见。近二十年来，主要根据如受不同类型调节T细胞(T reg)的组合影响的Th1/Th2平衡解释真菌感染和相关炎症疾病的免疫发病机理。Romani(2004)Nat.Rev.Immunol.4：1；Romani及Puccetti(2006)TrendsMicrobiol.14：183。

虽然炎症为对真菌的保护性反应的基本组份，但其调节异常可能显著恶化真菌疾病。如本文所公开，IL-23和IL-17负性调节IL-12/Th1介导的对真菌的免疫抗性，且具有先前归因于不受控制的Th1细胞反应的炎症作用。已知IL-23促进Th17细胞(它产生IL-17且引起炎症)的存活，拮抗IL-12介导的Th1反应(这涉及干扰素-γ(IFN-γ)的产生)。Langrish等人(2004)Immunol.Rev.202：96。如本文所证实，IL-12产生及Th1反应的IL-23相反调节导致不受控制的炎症及两种主要人类真菌病原体白色念珠菌及烟曲霉的生长。IL-23和IL-17均破坏炎症程序及嗜中性粒细胞的抗真菌活性，导致与感染有关的严重组织炎症病理学。总之，IL-23启动的炎症促进感染，削弱抗真菌免疫抗性。还参见Zelante等人(2007)Eur.J.Immunol.37：2695及Cooper(2007)Eur.J.Immunol.37：2680的相关评论。通过IL-23的拮抗作用调节炎症反应代表了一种刺激对真菌的保护性免疫反应的有前途的策略。

本发明提供用于治疗感染(诸如，慢性感染)的组合物和方法，其通过阻断IL-23和/或IL-17的活性以减少Th17细胞的影响，使得发生稳固的Th1反应并消除受感染细胞或生物体来实现。在最优选状况下，结果为感染完全消退的无菌治疗(即，治疗可停止而不会再发生感染)。

关于Th17细胞在保持起反作用的炎症状态中的作用的相同论证适用于慢性病毒及细菌感染(诸如，结核病(TB))的状况。细胞因子为免疫细胞的可溶性调节子。以下细胞因子已在感染TB的患者的胸膜或支气管肺泡灌洗(BAL)流体中检测到：IL-1β、TNFα、IFNγ、TGFβ及IL-12。参见例如Crystal等人(编辑)(1997)The Lung：Scientific Foundations，Lippincott-Raven，New York，NY，第2381-2394页。已显示示IFN-γ和TNFα在分枝杆菌感染的控制中具有重要作用。参见例如Cooper等人(1993)J.Exp.Med.178：2243；Flynn等人(1993)J.Exp.Med.178：2249；Kindler等人(1989)Cell 56：731；Cheuse等人(1994)Am.J.Pathol.145：1105。在IL-23促进Th17细胞存活，减少IL-12启动的IFN-γ产生的程度上，可期望IL-23活性的拮抗作用增强细菌感染的消退。

文献表明)在(例如自体免疫病症或慢性感染的治疗中用IL-23拮抗剂治疗可比用IL-12拮抗剂治疗安全。Chackerian等人描述其中经由抗体中和作用或在p19^-/-敲除(KO)小鼠中基因消除来消除IL-23活性并不损害对分枝杆菌(BCG)感染的免疫性的实验。Chackerian等人(2006)J.Exp.Med.74：6092。IL-23p19 KO小鼠中的感染过程与野生型小鼠中的感染过程难以区别，且经抗IL-23p19处理的小鼠中细菌菌落形成单位数目与经同种型对照处理的小鼠中的数目并无不同。相比之下，IL-12缺陷型KO小鼠无法控制BCG的生长，IL-12的抗体阻断与脾、肝及肺中CFU数比经同种型对照处理的小鼠显著更高相关联。这些结果表明在IL-12存在下，IL-23在抵抗分枝杆菌的宿主防御中不具有重要作用，因此对IL-23的选择性抑制可比涉及IL-12中和作用(同时具有或不具有IL-23中和作用)的治疗安全。本文所提供的结果将这些结果扩展以表明IL-23拮抗剂不仅因为不损害宿主防御而安全，而且还在实际上可有利于帮助消退由IL-23/IL-17炎症的调节异常所引起的慢性感染。

Chackerian等人(2006)中的实验并没用设计来解决阻断IL-23是否能增强先前存在的慢性分枝杆菌感染的清除的问题。对照小鼠(WT小鼠，未经处理或仅经同种型对照抗体处理)能够有效清除感染而非发展慢性感染。在Chackerian等人(2006)的KO小鼠及抗体阻断实验中，将IL-23活性在静脉内感染BCG之前而非感染之后消除。本文所述的实验涉及真菌感染而非分枝杆菌感染。此外，本文实施例4和5中所述的实验包括使用胃内和鼻内给药真菌病原体而非静脉内给药的实验。与静脉内递送相比，这些真菌病原体直接递送至肺及胃提供生理上更相关的疾病模型。已提出在本文所述的实验中感染真菌病原体的组织作为其中Th17反应可具有最重要生理作用的组织(即，肺及肠的粘膜屏障)。Cua及Kastelein(2006)Nature Immunol.7：557。此外，在本文所公开的实验中抗IL-23p19和抗IL-17抗体在感染5小时后给药而非感染之前给药。

III.真菌感染中的实验结果

长期炎症为多种慢性疾病及自体免疫性的标志。Han和Ulevitch(2005)。在发现IL-23以及近来证实的其在自体免疫炎症中的作用(Cua等人(2003)Nature421：744；Langrish等人(2005)J.Exp.Med.201：233)之前，认为IL-12通过引发和维持Th1反应而引起反应过度的免疫及自体免疫病症。这对真菌感染及疾病也成立，其中证明免疫调节为微调炎症和不受控制的Th1/Th2抗真菌反应性所必需。Ryan等人(2005)；Romani(2004)；Romani及Puccetti(2006)。

本发明的研究结果证明IL-23/IL-17轴而非不受控制的Th1反应与缺陷病原体清除、无法消退炎症及引发对念珠菌和曲霉菌的保护性免疫反应有关。因此，新发现可用以调和慢性炎症反应与难治形式的真菌感染(其中真菌持续存在于进行中的炎症表面上)的自相矛盾的关联。

IL-23及IL-17甚至在IFN-γ存在下也都能削弱PMN的抗真菌效应活性，发现结果表明Th17效应通路优于Th1通路。此外，通过消除吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)的IFN-γ依赖性活化(已知其限制PMN的抗真菌炎症状况)(Bozza等人(2005)J.Immunol.174：2910)以及通过诱导MMP9及MPO的释放(可能为与Th17细胞活化有关的高度炎症病理及组织破坏的原因)，两种细胞因子活化PMN的炎症程序。

对IDO的作用受到了关注。IDO在白色念珠菌中表达，它参与色胺酸营养缺陷型依赖性的真菌发酵抑制。Bozza等人(2005)。类似于IDO阻断且与IFN-γ相反(Kalo-Klein等人(1990)Infect.Immun.58：260)，IL-17促进真菌发酵(数据未展示)，发现结果表明了对真菌IDO(对来自哺乳动物宿主免疫系统的信号具有高度反应性的酶)的作用。Mellor及Munn(2004)Nat.Rev.Immunol.4：762。因此，Th17通路的功能除了促进炎症和破坏抗微生物免疫性的能力，如已针对其它感染所述(McKenzie等人(2006)Trends Immunol.27：17)，还包括对真菌形态和毒性的作用。这可以同时引起IL-4+Th2细胞活化(已知IL-4+Th2细胞活化严格依赖高度真菌生长(Mencacci等人(1996)Infect.Immun.64：4907))进一步阻止Th1起作用。

如已针对其它感染所述(Cruz等人(2006)J.Immunol.177：1416；Park等人(2005)Nat.Immunol.6：1133)，Th1或Th17通路在两种真菌感染中相互调节。这个发现表明响应真菌反应的任一通路的存在处于严格环境控制之下。调节可发生在不同阶段。一个明显调节水平由IFN-γ代表，已知它调节Th17细胞诱导。Cruz等人(2006)；Park等人(2005)。实际上IL-23/IL-17轴在两种感染中IFN-γ缺乏的情况下是加强的，而且产生IFN-γ的细胞数目在IL-17中和之后增加。这些数据与患有念珠菌病的小鼠中IL-12反应需要IFN-γ的观点一致。Cenci等人(1998)J.Immunol.161：3543。

更重要地，IL-12的产生在p19^-/-DC中较高，IL-23的产生在p35^-/-DC中较高，且两种细胞因子在WT DC中交叉调节。这些发现表明这些细胞因子在DC产生水平上相互调节。Becker等人(2006)J.Immunol.177：2760。然而，因为对真菌反应而产生IL-23的炎性DC似乎多于耐受性DC，所以这暗示Th1/Th17平衡还视不同身体部位的DC亚群之间的相互调节而定。

IL-23在高度威胁性炎症情况下对真菌反应而产生(通过炎症DC经由TLR-/MyD88通路对高酵母数目反应产生)这一发现具有重要含意。他不仅指出了IL-23为炎症过程与真菌毒性之间的重要分子连接点，而且还建立了恶性循环可运转的情形。因为p19^-/-小鼠产生较少IL-17并且据显示TGF-β在抵抗真菌的Th17活化和/或维持中并非必要，所以可设想IL-23充当着IL-17的邻近调节子。在此情形中，不受控制的真菌生长可维持病原性Th17细胞的活化，这表明了伴随有非保护性Th2细胞的活化。

在此研究中一个有趣的观测结果为虽然微生物刺激物可能为IL-23分泌的主要诱导物，但获得性免疫过程也可以调节其产生。为支持此观测结果，我们已提供DC的IL-23分泌在T细胞存在下显著增加的证据，发现结果表明经活化的T细胞可为进一步诱导IL-23提供正反馈回路。

以上考虑因素可有助于调适在免疫动态平衡及其调节异常中内共生或普遍存在的真菌。若经由IL-23/IL-17轴的活化破坏炎症程序的能力可能最终导致免疫调节异常，则其活化T reg细胞(针对念珠菌或曲霉菌的保护性免疫的整体和基本组份(Romani及Puccetti(2006))的能力可代表防止免疫调节异常的机制。在此方面，已描述了Th17与T reg细胞之间的功能拮抗作用(Bettelli及Kuchroo(2005)J.Exp.Med.201：169)，包括IL-10在产IL-17细胞在体内发育过程中的抑制作用。Kullberg等人(2006)J.Exp.Med.203：2485。因此，有可能的是产生Th17和T reg细胞的交互(reciprocal)通路还可能在真菌感染中出现。我们未发现有证据表明p35^-/-小鼠中CD4+CD25+T reg细胞在感染后活化，发现结果表明Th17和T reg细胞互相排斥。在p19^-/-小鼠中观测到CD4+CD25+T reg细胞，不过IL-10产生显著降低，这与IL-23上调T细胞产生IL-10的能力相符。Vanden Eijnden等人(2005)Eur.J.Immunol.35：469-475。

本发明的研究的另一个重要观测结果为IL-23/IL-17依赖性通路可在IFN-γ缺乏的条件下通过p35依赖性通路提供一些抗真菌抗性。已经在下列疾病中报道了IL-23可以在IL-12缺乏的条件下起保护性作用：慢性隐球菌病(Kleinschek等人(2006)J.Immunol.176：1098)、分枝杆菌感染(Khader等人(2005)J.Immunol.175：788)及急性肺部肺炎克雷伯氏杆菌感染(Happel等人(2005)Infect.Immun.73：5782)，其中该保护作用与IL-23活化抗原特异性产IFN-γCD4+T细胞(不依赖IL-12p70)和募集PMN介导病原体清除的能力相关。Happel等人(2005)J.Exp.Med.202：761。事实上，在实验性肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus)诱导的结肠炎中，已清楚显示了IL-23启动产IFN-γ细胞和产IL-17细胞。Kullberg等人(2006)。我们的结果似乎表明感染中Th1与Th17路径之间的交叉调节的另一水平，这表明在IL-23的作用中存在p35依赖性通路。最终，IL-23在受IL-12依赖性轴支配的适当免疫效应功能开始之前处理最初炎症危险信号的能力(McKenzie等人(2006))与拮抗剂以及此对细胞因子之间的协作活性相符。

总而言之，此研究中所呈现的数据证明IL-23依赖性Th17谱系在真菌感染中的作用，该作用之前并不明确，这对宿主防御、免疫动态平衡及对真菌的免疫性的机制具有重要含意。此外，它们证明了无法消退炎症与缺少抗真菌免疫抗性之间的分子关联。目前结果表明用于免疫治疗真菌感染的策略，这些策略尝试限制炎症以刺激有效免疫反应。

IV.IL-23拮抗剂

IL-23拮抗剂包括能够抑制IL-23的一种或多种生物活性的任何物质或方法。这些活性包括与IL-23(包括p 19和p40亚基)、IL-23受体(包括IL-23R和IL-12Rβ1亚基)结合；和促进和维持Th17细胞。拮抗剂可包括(例如)小分子、抗体或抗体片段、肽模拟物、适体(例如，如美国专利申请公开No.2006-0193821中所公开的)、来源于IL-23受体的亚基的胞外区的可溶性受体、及核酸基拮抗剂。

IL-23的核酸基拮抗剂包括针对IL-23p19基因或IL-23R基因的反义核酸和siRNA。对于通用siRNA方法，参见WO 2006/06060598。还参见Arenz和Schepers(2003)Naturwissenschaften 90：345；Sazani和Kole(2003)J.Clin.Invest.112：481；Pirollo等人(2003)Pharmacol.Therapeutics 99：55；Wang等人(2003)AntisenseNucl.Acid Drug Devel.13：169。基于人IL-23p 19和IL-23R mRNA的已知序列，可设计反义和siRNA分子。人IL-23p19的mRNA和氨基酸序列分别`见于GenBank登录号NM_016584及NP_057668。人IL-23R的cDNA和氨基酸序列分别见于GenBank登录号AF461422及AAM44229。本发明还提供用于RNA干扰的组合物。

产生及使用siRNA的方法公开于(例如)美国专利No.6,506,559(WO99/32619)、No.6,673,611(WO 99/054459)、No.7,078,196(WO 01/75164)、No.7,071,311和PCT公开WO 03/70914、WO 03/70918、WO 03/70966、WO03/74654、WO 04/14312、WO 04/13280、WO 04/13355、WO 04/58940、WO04/93788、WO 05/19453、WO 05/44981、WO 03/78097中。列出了美国专利和相关PCT公开。在基因沉默和治疗性治疗中使用siRNA的例示性方法公开于PCT公开WO 02/096927(VEGF和VEGF受体)、WO 03/70742(端粒酶)、WO03/70886(IVA型蛋白质酪胺酸磷酸酶(Prl3))、WO 03/70888(Chk1)、WO 03/70895和WO 05/03350(阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease))、WO 03/70983(蛋白质激酶Cα)、WO 03/72590(Map激酶)、WO 03/72705(细胞周期素D)、WO 05/45034(帕金森氏症，Parkinson′s disease)中。关于siRNA的治疗性用途的例示性实验还公开于Zender等人(2003)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)100：7797；Paddison等人(2002)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)99：1443；以及Sah(2006)Life Sci.79：1773中。siRNA分子还用于(例如)慢性骨髓白血病(chronic myeloid leukemia，CML)(ClinicalTrials.gov标识符：NCT00257647)及老年性黄斑退化(age-relatedmacular degeneration，AMD)(ClinicalTrials.gov标识符：NCT00363714)的临床试验中。

虽然术语″siRNA″在本文中用以指用于通过RNA干扰途径诱导基因沉默的分子(Fire等人(1998)Nature 391：806)，但这些siRNA分子无需严格为聚核糖核苷酸，而是可以含有一种或多种对核酸的修饰以改善其作为治疗剂的性质。对于短的干扰核酸，这些药剂有时称为″siNA″。虽然这些改变可在形式上使该分子排除至″核糖″核苷酸定义之外，但这些分子在本文中仍称为″siRNA″分子。用于通过RNA干扰途径诱导基因沉默的核酸的其它变体包括短发夹RNA(″shRNA″)，例如，在美国专利申请公开No.20060115453中所公开。核酸基抑制剂可以(例如)通过用重组载体(如质体或病毒，例如，如裸DNA)转化或通过利用任何已知基因疗法载体(例如，腺关联病毒(AAV)、腺病毒、逆转录病毒或慢病毒)的基因疗法来递送。核酸可通过转化、电穿孔、生物弹轰击(biolisticbombardment)或本领域中已知的其它方法来递送。

用于本发明的组合物和方法中的IL-23的抗体拮抗剂包括IL-23的抗体及IL-23受体的抗体。IL-23的例示性拮抗剂抗体包括抗人IL-23p19抗体及其片段，如共同转让的美国临时专利申请No.60/891,409及No.60/891,413(均在2007年2月23日提交)、美国专利申请公开物No.2007-0009526和No.2007-0048315及国际专利出版物No.WO 2007/076524、WO 2007/024846和WO 2007/147019中所公开。IL-23的抗体拮抗剂还包括当IL-12p40亚基与IL-23p19结合时但并非在其与IL-12p35结合时与IL-12p40亚基结合的抗体。参见例如美国专利申请公开物No.2005-0137385及美国专利No.7,252,971。IL-23的例示性拮抗剂抗体包括抗人IL-23受体抗体(例如，抗IL-23R抗体)及其片段。IL-23R的例示性拮抗剂抗体公开于共同转让的美国临时专利申请No.60/892,104(2007年2月28日提交)和No.60/945,183(2007年6月20日公开)中。IL-23的拮抗剂还包括双特异性抗体。

高抗原性区域可用于抗体产生。人p19的高抗原性区域存在于(例如)GenBank AAQ89442(gi：37183284)的氨基酸16-28、57-87、110-114、136-154及182-186。人IL-23R的具有增加的抗原性的区域存在于(例如)GenBankAAM44229(gi：21239252)的氨基酸22-33、57-63、68-74、101-112、117-133、164-177、244-264、294-302、315-326、347-354、444-473、510-530以及554-558。通过Parker曲线图使用Vector NTI

Suite(Informax，Inc.，Bethesda，MD)进行分析。本发明还提供为可溶性受体的IL-23拮抗剂，即包括IL-23R的胞外区(例如，GenBankAAM44229的氨基酸1-353)或其片段，其中胞外区或其片段与IL-23特异性结合。小鼠IL-23R为GenBank NP_653131(gi：21362353)。还涵盖突变蛋白和变体，例如聚乙二醇化或突变诱导以移除或置换脱酰胺基的Asn残基。

用于本发明的方法和组合物的拮抗IL-23活性的其它可能方法包括给药丝状血球凝集素(filamentous hemagglutinin，FHA)(WO 2006/109195)和疫苗接种以产生抵抗IL-23的免疫反应(WO 2005/058349)。

在一个实施方式中，产IL-17(Th17)细胞的拮抗剂涵盖特异性调节Th17细胞活性，而不影响例如初始T细胞Th1型T细胞、TH2型T细胞、上皮细胞和/或内皮细胞活性的试剂。试剂可调节(例如)产IL-17细胞的转录因子(例如，RORγt)或粘附蛋白的表达或活性。此外，IL-23、TGF-β或IL-6的拮抗剂可以降低Th17细胞的产生和存活，IL-17的拮抗剂可以降低这些细胞的炎症作用(例如，嗜中性粒细胞募集)。

可制备单克隆抗体、多克隆抗体和人源化抗体(参见例如Sheperd和Dean(编辑)(2000)Monoclonal Antibodies，Oxford Univ.Press，New York，NY；Kontermann及Dubel(编辑)(2001)Antibody Engineering，Springer-Verlag，NewYork；Harlow及Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第139-243页；Carpenter等人(2000)J.Immunol.165：6205；He等人(1998)J.Immunol.160：1029；Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274：27371；Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272：10678；Chothia等人(1989)Nature 342：877；Foote及Winter(1992)J.Mol.Biol.224：487；美国专利No.6,329,511)。还可制备完全人抗体，其中全部抗体序列来源于人种系序列。这些完全人抗体可以由经工程化以表达人免疫球蛋白基因的转基因动物或通过诸如噬菌体展示等方法制备。参见例如Lonberg(2005)Nature Biotechnol.23：1117；Vaughan等人(1998)Nature Biotechnol.16：535。抗体片段包括Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、单链Fv(scFv)、F(ab′)₂及双功能抗体。Pluckthun(1994)THEPHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES，第113卷，Rosenburg及Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页；Holliger及Hudson(2005)Nature Biotechnol.23：1126-1136。

本发明的抗体还包括具有经修饰(或阻断)的Fc区以提供改变的效应功能的抗体。参见例如美国专利No.5,624,821、WO 2003/086310、WO 2005/120571、WO 2006/0057702、Presta(2006)Adv.Drug Delivery Rev.58：640-656。这种修饰可用于增强或抑制免疫系统的各种反应，对诊断及治疗可能具有有利的作用。Fc区的改变包括氨基酸改变(取代、缺失及插入)、糖基化或去糖基化、以及添加多个Fc。对Fc的改变还可以改变治疗抗体中抗体的半衰期，较长半衰期会使得给药频率较低，随之增加便利性并物质的使用。可通过将特异性突变引入IgG1的Fc部分，例如通过将Asn297改变为(例如)Ala或Gln(N297A或N297Q)实现效应功能改变。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731，734-35。效应功能还可通过选择不同恒定结构域来改变。举例而言，若本发明的抗体(或片段)的特定预期用途需要改变的效应功能，则可使用非IgG1的重链恒定结构域。虽然IgG1抗体提供长半衰期和效应功能，诸如补体活化及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，但这些活性可能并非为所有抗体用途所需要。在这些情况下，可以使用如IgG4恒定域之类的物质。在IL-23受体(例如，IL-23R)抗体的状况下，改变的效应功能尤其恰当，这是因为在一个实施方式(非唯一的实施方式)中，目标并非诱导杀死表达IL-23受体的细胞，而是仅仅阻断这些细胞中的IL-23信号转导。在此实施方式中，目标为将Th细胞由Th17谱系转为Th1谱系，在该状况下杀死细胞无益。

抗原纯化对抗体产生而言并非必需。免疫可通过DNA载体免疫来进行，参见例如Wang等人(1997)Virology 228：278。或者，可用具有相关抗原的细胞使动物免疫。接着可将脾细胞自经免疫的动物分离，这些脾细胞可与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤细胞(Meyaard等人(1997)Immunity 7：283；Wright等人(2000)Immunity 13：233；Preston等人(1997)Eur.J.Immunol.27：1911)。通过功能检测或生物检测可针对所需抗体的产生筛检所得杂交瘤细胞，即检测不依赖于经纯化的抗原有无。对于抗体产生而言，据证明细胞免疫可能优于经纯化的抗原的免疫(Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163：5157)。

抗体与抗原及配体与受体的结合性质可以(例如)通过表面等离子共振(Karlsson等人(1991)J.Immunol.Methods 145：229；Neri等人(1997)Nat.Biotechnol.15：1271；Jonsson等人(1991)Biotechniques 11：620)或通过竞争ELISA(Friguet等人(1985)J.Immunol.Methods 77：305；Hubble(1997)Immunol.Today 18：305)来检测。抗体可用于亲和力纯化以分离抗体的靶抗原及相关结合蛋白质。参见例如Wilchek等人(1984)Meth.Enzymol.104：3。

抗体通常以至少约10^-6M、通常至少10^-7M、更通常至少10^-8M、优选至少约10^-9M，更优选至少10^-10M，最优选至少10^-11M的K_D结合。参见例如Presta等人(2001)Thromb.Haemost.85：379；Yang等人(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.38：17；Carnahan等人(2003)Clin.Cancer Res.(增刊)9：3982s。

包含IL-23R的胞外结构域的可溶性受体可用于本发明的组合物和方法中。可根据标准方法制备及使用可溶性受体。参见例如Jones等人(2002)Biochim.Biophys.Acta 1592：251；Prudhomme等人(2001)Expert Opinion Biol.Ther.1：359；Fernandez-Botran(1999)Crit.Rev.Clin.Lab Sci.36：165-224。

在一个实施方式中，本发明的组合物和方法需要IL-23的拮抗作用且不需要IL-12的拮抗作用。目前存在若干正在研制中的可能治疗剂，它们靶向IL-12和IL-23的IL-12p40亚基，阻断IL-23及IL-12的活性。这些药剂不适用于本发明的组合物和方法的此实施方式，因为它们抑制本发明要促进的稳固的IL-12介导的Th1反应。虽然原则上研制仅在IL-23情况下而不在IL-12情况下结合IL-12p40的药剂是可能的(参见美国专利申请公开No.2005-0137385及美国专利No.7,252,971)，但可能大部分靶向IL-12p40的药剂抑制IL-12，因此不适于本发明。相同论点适用于IL-23和IL-12的共有受体亚基IL-12Rβ1。虽然原则上研制仅在IL-23情况下而不在IL-12受体情况下结合IL-12Rβ1的药剂是可能的，但可能大部分靶向IL-12Rβ1的药剂抑制IL-12受体，因此不适于本发明。相比之下，结合且拮抗对IL-23或其受体(即，分别为p19和IL-23R)特异性的亚基的药剂可能为IL-23而非IL-12的特异性抑制剂，因此更适用于本发明的组合物及方法中。

潜在治疗剂是否特异性抑制IL-23而非IL-12可通过本领域中已知的任何方法来测定。举例而言，可测试潜在IL-23特异性拮抗剂阻断IL-23与其受体或IL-12与其受体结合的能力。这些阻断检测可在溶液中(例如，通过荧光活化细胞分类术)或在固体载体上(例如，通过酶联免疫吸附检测-ELISA)进行。IL-23及IL-12受体阻断还可在生物检测中检测，诸如Ba/F3细胞增殖检测。参见例如Ho等人(1995)Mol.Cell.Biol.(1995)15：5043。在这些结合检测中，潜在IL-23拮抗剂的效力和特异性可表示为IC50，或在给定组的检测条件下实现IL-23结合(或依赖于结合的生物活性)减少50％所需的潜在拮抗剂浓度。较低IC50表明更有效的拮抗剂。潜在拮抗剂的IL-23特异性可表示为抑制IL-12与其受体结合的IC50与抑制IL-23与其受体结合的IC50的比率(IC50_IL-12/IC50_IL-23)。在各种实施方式中，若此比率(IC50_IL-12/IC50_IL-23)为1.5、2、3、4、5、7、10、15、20、50、100或更大，则认为潜在IL-23特异性拮抗剂具有IL-23特异性。在优选实施方式中，调整抑制检测中所用的IL-23和IL-12的含量以确保IL-23和IL-12检测中的至少一个。优选两者都在线性剂量反应浓度范围内进行。

IL-23和IL-12还具有不同生物学功能，这些生物学功能可用以测定拮抗作用的特异性。与IL-12相比，如与初始T细胞群体相反，在人和小鼠中IL-23均优先刺激记忆。IL-23活化大量细胞内细胞信号转导分子，例如Jak2、Tyk2、Stat1、Stat2、Stat3及Stat4。IL-12活化同一组分子，但Stat4对IL-23的反应相对较弱，而Stat4对IL-12的反应强。Oppmann等人(2000)；Parham等人(2002)J.Immunol.168：5699。

还可测试潜在IL-23特异性拮抗剂抑制IL-12和IL-23使Th1及Th17细胞扩增和存活的能力。IL-23特异性拮抗剂优先抑制IL-23介导的Th17细胞的扩增及存活，而非IL-12介导的Th1细胞的扩增和存活。Th17细胞特征性分泌IL-17，而Th1细胞特征性分泌IFN-γ。来自例示性Th1/Th17检测的数据见于Langrish等人(2005)J.Exp.Med.201：233的图2，它证实IL-23促进产IL-17的CD4⁺T细胞的扩增和存活，而IL-12促进产IFN-γ的CD4⁺T细胞的扩增和存活。在本发明的一个实施方式中，当药剂能够抑制IL-23介导的Th17细胞的扩增和存活而不抑制IL-12介导的Th1细胞的扩增和存活时，认为该药剂为“IL-23特异性”拮抗剂(相对于IL-12)。Th17/Th1细胞增殖的抑制可表示为IC50，或在给定组的检测条件下实现促进产IL-17或IFN-γ的特定T细胞亚群扩增和存活的IL-23活性减少50％所需的药剂浓度。例示性检测在实施例13提供。在如实施例13中所述的生物检测的生物检测中，IL-23拮抗剂的效力可表示为IC50_IL-23，即，将IL-23的活性降至其未受抑制的值的50％所需的拮抗剂浓度。类似IC50_IL-12可针对IL-12及其促进产IFN-γ细胞产生的活性来测定。因此拮抗剂的IL-23特异性可表示为比率IC50_IL-12/IC50_IL-23。在各种实施方式中，经验证的IL-23特异性拮抗剂的IC50_IL-12/IC50_IL-23比率为1.5、2、3、4、5、7、10、15、20、50、100或更大。

基本上如Langrish等人(2005)中所述，可通过细胞内细胞因子流式细胞术通过荧光活化细胞分类术(FACS

分析)使用与细胞因子结合的荧光试剂来检测IL-17A及IFN-γ的产生。重要的是对认为是“产IL-17”或“产IFN-γ”的细胞界定活的CD4⁺T细胞中IL-17A或IFN-γ的临界(threshold)含量。在一个实施方式中，临界含量定义为在未经处理细胞的对照样品中5％的活CD4⁺T细胞“产IL-17”或“产IFN-γ”的含量。例示性未经处理的细胞包括从在蛋白脂质蛋白(PLP)存在下培养的经PLP免疫的SJL小鼠中分离的引流淋巴结(DLN)细胞(TheJackson Laboratories，Bar Harbor，Maine，USA)。

V.组合物及方法

为制备包含IL-23拮抗剂的医药或无菌组合物，将拮抗剂与药学上可接受的载体或赋形剂混合，参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences和U.S.Pharmacopeia：National Formulary，Mack Publishing Company，Easton，PA(1984)。治疗剂的制剂可通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合以(例如)冻干粉、浆料、水溶液或悬浮液的形式来制备(参见例如Hardman等人(2001)Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，NY；Gennaro(2000)Remington：The Science andPractice of Pharmacy，Lippincott，Williams，and Wilkins，New York，NY；Avis等人(编辑)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications，MarcelDekker，NY；Lieberman等人(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman等人(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)ExcipientToxicity and Safety，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY)。

给药途径为：通过(例如)局部或皮肤涂敷；通过静脉内、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、动脉内、脑脊髓内、病灶内或肺部途径注射或输液；或通过缓释系统或植入物。已描述将基因转移载体注射至中枢神经系统中。参见例如Cua等人(2001)J.Immunol.166：602；Sidman等人(1983)Biopolymers 22：547；Langer等人(1981)J.Biomed.Mater.Res.15：167；Langer(1982)Chem.Tech.12：98；Epstein等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688；Hwang等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030；美国专利No.6,350,466及No.6,316,024。

选择治疗剂的给药方案视若干因素而定，包括药剂的血清或组织药剂清除率、症状程度、药剂的免疫原性及生物基质中标靶细胞的可接近性。给药方案优选在伴有可接受程度的副作用的条件下将最大量的治疗剂递送至患者的量。因此，所递送的药剂的量部分视特定实体及所治疗病状的严重程度而定。可获得选择适当剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南。参见例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy，Bios Scientific Pub.Ltd，Oxfordshire，UK；Kresina(编辑)(1991)Monoclonal Antibodies，Cytokines and Arthritis，Marcel Dekker，New York，NY；Bach(编辑)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy inAutoimmune Diseases，Marcel Dekker，New York，NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348：601；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341：1966；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344：783；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342：613；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348：24；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343：1594。

抗体、抗体片段和细胞因子可通过连续输液或通过相隔(例如)一天、一周或每周1-7次给药来提供。可静脉内、皮下、局部、经口、经鼻、直肠、肌肉内、脑内、脊髓内或通过吸入来提供剂量。在各种实施方式中，根据主要感染所在位置(例如，肺或胃肠道)来选择给药模式。

优选给药方案包括避免显著不良副作用的最大剂量或给药频率。每周总剂量一般为至少约0.05μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.2mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、或50mg/kg。参见例如Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349：427；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346：1692；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451；Portielji等人(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：133。小分子治疗剂(例如，肽模拟物、天然产物或有机化学药品)的所需剂量与抗体或多肽的剂量大致相同，以摩尔/千克计。

针对特定患者的有效量可视下列因素而改变：诸如所治疗的病状、患者的整体健康状况、方法途径及给药剂量及副作用严重程度，参见例如Maynard等人(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice，Interpharm Press，BocaRaton，FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice，Urch Publ.，London，UK。

典型兽医学、实验或研究个体包括猴、犬、猫、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、马和人。

由临床医师(例如)使用本领域中已知或怀疑会影响治疗或预计会影响治疗的参数或因素进行适当剂量的确定。一般而言，剂量以略小于最优选剂量的量开始，然后以小的增量增加直至相对于任何负面副作用实现所需或最优选的效果。重要诊断检测包括(例如)对感染或感染程度的症状的检测。优选地，待使用的生物制品来源于与治疗所靶向的动物相同的物种，或经修饰以模拟来源于相同物种的蛋白质(例如，人源化抗体)，由此将对试剂的体液反应减至最小。

用于与第二治疗剂(例如，细胞因子、类固醇、化疗剂、抗生素或辐射)共同给药或治疗的方法在本领域中是熟知的。参见例如Hardman等人(编辑)(2001)Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill，New  York，NY；Poole及Peterson(编辑)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A Practical Approach，Lippincott，Williams & Wilkins，Phila.，PA；Chabner及Longo(编辑)(2001)CancerChemotherapy and Biotherapy，Lippincott，Williams & Wilkins，Phila.，PA。有效量的治疗剂将症状通常减少至少10％，通常至少20％，优选至少约30％，更优选至少40％，最优选至少50％。

本发明进一步提供IL-23或IL-23R拮抗剂或两者在制备用于治疗包括但不限于选自下列的感染性疾病的药物中的用途：真菌感染、持久性真菌感染、念珠菌病、CMC、曲菌病、隐球菌病、病毒感染、持久性病毒感染、HIV感染、HBV感染、HCV感染、细菌感染、分枝杆菌感染、结核分枝杆菌感染、牛分枝杆菌感染及麻风分枝杆菌感染。在一些实施方式中，药物可包含一种或多种其它治疗剂。在其它实施方式中，本发明的药物可与一种或多种其它治疗剂结合使用。

VI.抗个体基因型(Anti-idiotypic)抗体

本发明进一步提供涉及本发明的治疗性抗IL-23或抗IL-23R抗体的抗个体基因型抗体。抗个体基因型抗体为识别一般与另一抗体的抗原结合区结合的独特决定簇的抗体。可通过用抗IL-23抗体或其含CDR区免疫与原始抗IL-23抗体的来源相同的物种和遗传类型(例如，小鼠株系)的动物来制备抗个体基因型抗体。接着经免疫的动物产生针对免疫抗体的个体基因型决定簇的抗体，以产生抗个体基因型抗体。抗个体基因型抗体还可用作免疫原以在另一动物中诱导免疫反应，产生所谓的“抗-抗-Id抗体”。

抗个体基因型抗体可用于(例如)测定个体中，例如经历抗IL-23治疗的个体的体液(例如，血液)中的治疗性抗IL-23(或抗IL-23R)抗体的含量。个体中抗IL-23(或抗IL-23R)抗体的含量的测定可用于保持个体中抗IL-23抗体的所需含量，这是因为给药可根据这些测定加以改变。给药可增加或减少(在频率和/或每次给药的量方面)以获得在所需数值范围内的抗IL-23抗体的循环含量。所需范围可由开业医师通过本领域中典型的方法来确定，可以视抗IL-23(或抗IL-23R)抗体或其片段的治疗指数而定。

抗个体基因型抗体可以适于容易检测的形式提供，包括具有多肽标签(例如，FLAG

标签)或与染料、同位素、酶及金属偶合的抗体。参见例如Le Doussal等人(1991)New Engl.J.Med.146：169；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160：3891；Hsing及Bishop(1999)New Engl.J.Med.162：2804；Everts等人(2002)New Engl.J.Med.168：883。存在各种检测形式，诸如放射免疫测定(RIA)、ELISA及芯片实验室(lab on a chip)。美国专利No.6,176,962及No.6,517,234。

VII.药盒

本发明还提供在药盒中的IL-23拮抗剂以用于治疗罹患感染(诸如，慢性细菌感染、分枝杆菌感染、病毒感染及真菌感染)的个体(人或非人类)。在一个实施方式中，药盒包括用于容纳IL-23拮抗剂的隔室、IL-23拮抗剂自身(诸如，抗体)、以及任选的使用说明书、一种或多种其它治疗剂及一种或多种用于给药的医学装置(例如，注射器或一次性注射器，诸如Redipen^TM注射器装置)。IL-23拮抗剂可为本文所述药剂中的任一种，包括但不限于抗p19抗体或其p19结合片段、抗IL-23R抗体或其IL-23R结合片段或可溶性IL-23R片段。

一种或多种其它治疗剂包括但不限于非类固醇抗炎药(NSAID)、类固醇、IL-12或其激动剂、及诸如IL-17A、IL-17F、TGF-β、IL-6的细胞因子或其各自的受体的拮抗剂。细胞因子的拮抗剂包括与细胞因子、其亚基或其受体结合的抗体。虽然并非所有结合细胞因子或其受体的抗体必需为拮抗剂，但这种拮抗剂活性可易于通过本领域中通常已知的技术(诸如，生物检测或受体结合检测)来评估。已知各种(人)细胞因子和受体的核酸和氨基酸序列，包括IL-17A(NM_002190、NP_002181)、IL-17F(NM_052872、NP_443104)、IL-17RA(NM_014339、NP_055154)、IL-17RC(转录物变体NM_153461、NM_153460、NM_032732、和其各自的翻译产物)。

本发明进一步提供包括针对本发明的治疗性抗IL-23(或抗IL-23R)抗体的抗个体基因型抗体的药盒。在一个实施方式中，该药盒包括用于容纳抗个体基因型抗体的隔室、抗个体基因型抗体自身、以及任选的使用说明书、一种或多种检测试剂、一种或多种用于检测抗个体基因型抗体的装置(诸如微量滴定板)、以及一个或多个待检测的抗IL-23抗体的样品(或其它阳性对照)。

VIII.用途

在结核病发展之前通常存在一个长期无症状的临床前时期。因此，可在分析各种TB诊断标记后开始IL-23和IL-23R拮抗剂治疗。与正常未感染患者相比，表现阳性结核菌素测试或曼托测试(参见例如Dale和Federman(2002))的患者可给药IL-23或IL-23R拮抗剂治疗，以防止分枝杆菌进一步生长或清除已存在的非病理性感染。在生物样品(例如BAL)中具有高含量分枝杆菌的患者还可受益于IL-23和IL-23R拮抗剂治疗，以防止分枝杆菌进一步生长，清除肺中的细菌负荷。类似治疗可用于临床样品中具有高分枝杆菌DNA或RNA含量或培养物中阳性烟碱酸(niacin)测试的患者。还设想IL-23及IL-23R拮抗剂与病理学症状性TB感染结合使用以减轻或清除细菌负荷。

可使用本发明的方法和组合物治疗的细菌感染包括(但不限于)由以下细菌引起的那些：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)；化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)；肠球菌属(Enterococcus spp.)；炭疽杆菌(Bacillus anthracis)；蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)；双岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)；乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)；单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)；奴卡菌属(Nocardia spp.)；马红球菌(Rhodococcus equi)(球杆菌(coccobacillus))；红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)；白喉棒杆菌(Corynebacterium diptheriae)；疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)；放线菌属(Actinomyces spp.)；肉毒梭菌(Clostridium botulinum)；艰难梭菌(Clostridium difficile)；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)；破伤风梭菌(Clostridium tetani)；动弯杆菌属(Mobiluncus spp.)；消化链球菌属(Peptostreptococcus spp.)；淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)；脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)；粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)；韦荣球菌属(Veillonella spp.)；放线共生放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)；鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)；百日咳杆菌(Bordetellapertussis)；布鲁氏菌属(Brucella spp.)；弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)；二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga spp.)；人心杆菌(Cardiobacterium hominis)；啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)；土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)；杜克嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；金格杆菌(Kingella kingae)；嗜肺性军团杆菌(Legionellapneumophila)；多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)；肉芽肿克雷白氏杆菌(Klebsiella granulomatis)；柠檬酸细菌属(Citrobacter spp.)；肠杆菌属(Enterobacter spp.)；大肠杆菌(Escherichia coli)；肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)；变形菌属(Proteus spp.)；肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)；伤寒沙门菌(Salmonella typhi)；志贺菌属(Shigella spp.)；粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)；小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)；鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)；气单胞菌属(Aeromonas spp.)；类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)；致伤弧菌(Vibrio vulnificuS)；不动杆菌属(Acinetobacter spp.)；黄杆菌属(Flavobacterium spp.)；绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa)；洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)；类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)；嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)或嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophila)；脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)；类杆菌属(Bacteroides spp.)；普雷沃氏菌属(Prevotella spp.)；梭杆菌属(Fusobacterium spp.)；小螺菌(Spirillumminus)；博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；回归热包柔氏螺旋体菌(Borreliarecurrentis)；汉赛巴尔通体菌(Bartonella henselae)；沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)；肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)；鹦鹉热嗜性衣原体(Chlamydophila psittaci)；伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)；查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)；嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)；军团菌属(Legionella spp.)；钩端螺旋体属(Leptospira spp.)；立氏立克次体(Rickettsiarickettsii)；恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)；苍白密螺旋体(Treponemapallidum)。

可使用本发明的方法和组合物治疗的分枝杆菌感染包括但不限于由以下分枝杆菌引起的那些：脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、亚洲分支杆菌(M.asiaticum)、鸟分枝杆菌复合物(Mycobacterium avium complex，MAC)、副结核鸟分枝杆菌(M.avium paratuberculosis)、牛分枝杆菌、龟分枝杆菌(M.chelonae)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、戈氏分枝杆菌(M.gordonae)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、豆状分枝杆菌(M.lentiflavum)、麻风分枝杆菌、立夫分枝杆菌(M.liflandii)、马尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、海分枝杆菌(M.marinum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、草分枝杆菌(M.phlei)、假弹丸状分枝杆菌(M.pseudoshottsii)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、弹丸状分枝杆菌(M.shottsii)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、三重分枝杆菌(M.triplex)、结核分枝杆菌、溃疡分支杆菌(M.ulcerans)、优夫分枝杆菌(M.uvium)及蟾分枝杆(M.xenopi)。

本发明的方法和组合物还可用以治疗真菌病状，包括但不限于组织胞浆菌病(histoplasmosis)、球孢子菌病(coccidioidomycosis)、芽生菌病(blastomycosis)、曲菌病、青霉病(penicilliosis)、念珠菌病及隐球菌病。霉菌病的危险因素包括血液及骨髓移植、实体器官移植、大外科手术(尤其胃肠道外科手术)、AIDS、肿瘤性性疾病(neoplastic disease)、老年、免疫抑制疗法及婴儿早产。

可使用本发明的方法和组合物治疗的引起感染(及临床综合症)的真菌病原体包括(但不限于)白色念珠菌(鹅口疮、阴道念珠菌病(vaginal candidiasis)、食道念珠菌病(esophageal candidiasis))、新型隐球菌(脑膜炎)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)(伴随发热及体重减轻的散播性感染)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)(弥漫性及病灶性肺病)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)(局部肺病及散播性感染，包括脑膜炎)、烟曲霉(伴随发热、咳嗽及咳血的肺病)及马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)(仅发热或伴随肺浸润(pulmonary infiltrate)、淋巴结病(lymphadenopathy)或皮肤病变)。本发明的方法和组合物还可用以治疗念珠菌物种光滑念珠菌(C.glabrata)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、热带念珠菌(C.tropicalis)、克鲁斯念珠菌(C.krusei)、葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)、季也蒙念珠菌(C.guilliermondii)及皱褶念珠菌(C.rugosa)的感染。前述真菌病原体(及临床综合症)通常与HIV感染有关。

本发明的方法和组合物还可用以治疗诸如光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克鲁斯念珠菌、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌及皱褶念珠菌的念珠菌物种的感染。本发明的方法和组合物还可用以治疗诸如黄曲霉菌(A.flavus)、黑曲霉菌(A.nigeer)、焦曲霉菌(A.ustus)及土曲霉菌(A.terreus)的曲霉菌物种的感染。其它真菌病原体包括镰孢菌物种(Fusarium species)(例如，串珠镰孢菌(F.moniliforme)、腐皮镰孢菌(F.solani)、尖镰孢菌(F.oxysporum))及足放线病菌物种(Scedosporium species)(例如，尖端赛多孢(S.apiosperum)、多育赛多孢(S.prolificans))。其它真菌疾病包括由酒曲菌(Rhizopus)物种(例如，米根霉(R.oryzae)、少根根霉(R.arrhizus))、根毛霉(Rhizomucor)、犁头霉(Absidia)、小克银汉霉(Cunninghamella)所引起的蝇疫霉病(zygomycoses)。

IL-23及IL-23R的拮抗剂可单独使用或与旨在增强Th1反应的药剂(例如，IL-12或其激动剂)或抑制Th17反应的药剂(例如，TGF-β拮抗剂；IL-6拮抗剂；IL-17A和/或IL-17F拮抗剂)或两者结合使用。还可使用这些细胞因子受体的激动剂和拮抗剂。这些药剂可包括抗体及其抗原结合片段、小分子、siRNA及反义核酸。IL-23和IL-23R的拮抗剂还可与抗炎药(诸如皮质类固醇(corticosteroid)，例如泼尼松(prednisone))结合使用。

IL-17拮抗剂可以通过直接或间接与IL-17A、IL-17F、IL-17RA或IL-17RC中的一种或多种相互作用防止功能性配体-受体相互作用来抑制这些多肽的表达或抑制IL-17信号转导。在一些优选实施方式中，IL-17拮抗剂为与IL-17A、IL-17F、IL-17RA或IL-17RC中的任一种结合且抑制其活性的抗体或抗体片段。在一个尤其优选实施方式中，IL-17拮抗剂为与IL-17A特异性结合的单克隆抗体。IL-17A的例示性拮抗剂抗体包括公开于共同转让的美国专利申请No.11/836,318(2007年8月9日提交)、WO 2006/013107以及WO 2006/054059中的抗人IL-17A抗体及其片段。在另一个实施方式中，IL-17拮抗剂包括双特异性抗体。

在一个实施方式中，IL-23拮抗剂包括与IL-23结合且抑制其活性的双特异性抗体。这些双特异性抗体可与IL-23p19或IL-23R结合，并且还可与IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC结合。在其它实施方式中，IL-23拮抗剂为与IL-23p19及IL-17结合且抑制其活性的双特异性抗体。参见例如WO 2007/147019。或者，IL-23及IL-17拮抗剂双特异性抗体可分别与IL-23受体(例如，IL-23R)或IL-17受体(IL-17RA或IL-17RC)结合，只要它们是拮抗剂抗体即可。拮抗IL-17和IL-23活性二者的双特异性抗体可通过本领域中已知的任何技术制备。举例而言，可使用两种免疫球蛋白重链/轻链对共同表达来重组制备双特异性抗体。参见例如Milstein等人(1983)Nature 305：537-39。或者，可使用化学键联来制备双特异性抗体。参见例如Brennan等人(1985)Science 229：81。还可以如下制备双功能抗体：通过二硫化物交换、产生杂合-杂交瘤细胞(四体瘤(quadromas))，通过转录和翻译产生实现双特异性抗体的单一多肽链，或转录和翻译产生一个以上可共价结合以产生双特异性抗体的多肽链。所预期的双特异性抗体还可完全通过化学合成来制备。双特异性抗体可包含两个不同可变区、两个不同恒定区、可变区和恒定区或其它变化形式。

IL-23及IL-23R的拮抗剂可单独使用或与已知的抗菌剂(诸如异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、环丙沙星及氧氟沙星)共同给药。其它抗菌剂包括(但不限于)阿拉曲沙星(alatrofloxacin)、阿奇霉素(azithromycin)、巴氯芬(baclofen)、苄星青霉素(benzathine penicillin)、西诺沙星(cinoxacin)、克拉霉素(clarithromycin)、氯法齐明(clofazimine)、氯唑西林(cloxacillin)、地美环素(demeclocycline)、地红霉素(dirithromycin)、多西环素(doxycycline)、红霉素(erythromycin)、乙硫异烟胺(ethionamide)、呋喃唑酮(furazolidone)、格帕沙星(grepafloxacin)、亚胺培南(imipenem)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lorefloxacin)、盐酸莫西沙星(moxifloxacin HCl)、萘啶酸(nalidixic acid)、硝化呋喃妥因(nitrofurantoin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星、利福布汀(rifabutin)、利福喷丁(rifapentine)、司帕沙星(sparfloxacin)、螺旋霉素(spiramycin)、苯甲酰磺胺(sulphabenzamide)、长效磺胺(sulphadoxine)、磺胺甲基嘧啶(sulphamerazine)、磺乙酰胺(Sulphacetamide)、磺胺嘧啶(sulphadiazine)、磺胺异噁唑(sulphafurazole)、磺胺甲噁唑(sulphamethoxazole)、磺胺吡啶(sulphapyridine)、四环素(tetracycline)、甲氧苄啶(trimethoprim)、曲伐沙星(trovafloxacin)以及万古霉素。

本发明的方法和组合物可用以治疗持久性病毒感染，包括(但不限于)由HBV、HCV、HIV、人乳头瘤病毒(HPV)引起的感染。这些慢性感染表示免疫反应无法根除感染。IL-23及IL-23R的拮抗剂可单独使用或与包括(但不限于)以下各物的其它抗病毒剂结合使用：阿巴卡韦、阿昔洛韦、金刚烷胺、安普那韦、地拉韦啶、去羟肌苷、依发韦仑、泛昔洛韦、茚地那韦、干扰素α、利巴韦林、拉米夫定、奈非那韦、奈韦拉平、奥司他韦、喷昔洛韦、利巴韦林、利托那韦、沙奎那韦、司他夫定、万乃洛韦、扎西他滨、扎那米韦、齐多夫定(叠氮脱氧胸苷，AZT)。优选的干扰素α药剂包括聚乙二醇化干扰素α2a和聚乙二醇化干扰素2b。干扰素α的例示性形式论述于美国专利No.6,923,966中。IL-23拮抗剂还可与病毒特异性药剂组合使用，诸如用于慢性HCV感染的HCV蛋白酶或HCV聚合酶抑制剂、和用于慢性HIV感染的CCR5拮抗剂。

IL-23及IL-23R的拮抗剂还可与治疗性疫苗(例如，用于HIV感染的gp120缺失的整体灭活病毒、用于HCV感染的重组E1蛋白以及用于HPV感染的病毒E6及E7致癌蛋白)结合使用。参见Berzofsky等人(2004)。这些治疗性疫苗包括DNA疫苗或病毒载体，任选以其中DNA疫苗之后跟随病毒载体疫苗的异源初免(priming)和加强方案给药。Berzofsky等人(2004)。

IL-23及IL-23R的拮抗剂可单独使用或与其它抗真菌剂结合使用，包括但不限于：泊沙康唑、氟康唑(美国专利第4,404,216号)、伏立康唑、伊曲康唑(美国专利第4,267,179号)、酮康唑(美国专利第4,144,346号及第4,223,036号)、利阿唑、伊替马唑、克霉唑、咪康唑、益康唑、布康唑、奥昔康唑、硫康唑、噻康唑及特康唑、经取代的噻唑、噻二唑、噁二唑、卡泊芬净、两性霉素B、制霉菌素、匹马菌素、氟胞嘧啶(5-氟胞嘧啶)、萘替芬、特比萘芬、布替萘芬、硫代碳酸酯托萘酯、灰黄霉素、胺碘酮、环吡司、舒苯汀、阿莫罗芬、氯碘羟喹、龙胆紫、碘化钾、硫代硫酸钠、石炭酸-品红溶液及棘白菌素(例如，乙酸卡泊芬净、米卡芬净及阿尼芬净)。

本发明的IL-23和IL-23R拮抗剂可与标准抗真菌剂以其在用作单一药剂时常用的剂量组合使用，或在药物一起使用时若存在任何功效上的协同增强作用则以较低剂量组合使用。氟康唑可(例如)以400-800毫克/天给药。伏立康唑可以4mg/kg每日两次给药。伊曲康唑可以200-600毫克/天给药。脱氧胆酸两性霉素B(Amphotericin B desoxycholate，D-AmB)可以每天0.5-1mg/kg给药。关于可与本发明的组合物和方法组合的药剂类型及治疗方案的通用指南可见于由InfectiousDiseases Society of America(IDSA)公布的在Pappas等人(2004)Clin.Infect.Dis.38：161(念珠菌病)和Stevens等人(2000)Clin.Infect.Dis.30：696(曲菌病)中的实施准则。用于治疗结核病的实施准则见于2006年3月22日公布的且由IDSA认可的International Standards for Tuberculosis Care中。

在本发明的一些实施方式中，患有感染或怀疑患有感染的个体先前已使用其它方法或组合物(即，非本发明的方法或组合物)治疗感染。先前治疗以可包括用本文所公开的抗微生物剂、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂中的任一种或任何其它治疗方法或组合物治疗。

在一些实施方式中，个体将进行正式感染诊断，任选同时鉴别病原体，但在其它实施方式中，个体可以不进行正式诊断或可以进行限定但不充分鉴别病原体的部分诊断。在其它实施方式中，仅怀疑个体患有感染。在其它实施方式中，个体处于患有或获得感染的风险中，例如，正经历免疫抑制疗法的个体处于由于AIDS等而获得真菌感染的风险中。在一些实施方式中，患有感染或怀疑患有感染或处于患有或获得感染的风险中的个体(例如)由于AIDS、化疗、移植、老年而免疫受损。

如对于本领域技术人员所显而易见的，在不悖离本发明的精神及范畴的情况下，可对本发明进行许多修改及变更。本文所述的具体实施方式仅以实例的方式提供，且本发明将受随附权利要求书的范畴以及这些权利要求的等同物的全部范畴的限制；且本发明不受在本文中以实例的方式提供的具体实施方式限制。

实施例1

通用方法

标准分子生物学方法已经有所描述(Maniatis等人(1982)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，Academic Press，San Diego，CA)。标准方法还出现于Ausbel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第1-4卷，John Wiley and Sons，Inc.NewYork，NY，它描述细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞及酵母中的克隆(第2卷)、复合糖(glycoconjugate)和蛋白表达(第3卷)、以及生物信息学(第4卷)。

用于蛋白质纯化的方法已有所描述，其包括免疫沉淀法、层析法、电泳法、离心法和结晶法。Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York。化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白质的产生、蛋白质糖基化也已有所描述。例如参见Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science，第2卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York；Ausubel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第3卷，John Wileyand Sons，Inc.，NY，NY，第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich，Co.(2001)Productsfor Life Science Research，St.Louis，MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)Bio Directory，Piscataway，N.J.，第384-391页)。还描述了多克隆抗体和单克隆抗体的产生、纯化和片段化。Coligan等人(2001)Current Protcols inImmunology，第1卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York；Harlow和Lane(1999)Using Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Harlow和Lane(1998)。可以利用用于鉴定配体/受体相互作用的标准技术。参见例如Coligan等人(2001)Current Protcols in Immunology，第4卷，John Wiley，Inc.，New York。

可以利用用于流式细胞术的方法，包括荧光活化细胞分类术(FACS)(参见例如Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ；Givan(2001)Flow Cytometry，第2版；Wiley-Liss，Hoboken，NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry，John Wileyand Sons，Hoboken，NJ)。可以利用适于修饰用作(例如)诊断试剂的核酸(包括核酸引物及探针)、多肽、以及抗体的荧光试剂(Molecular Probes(2003)Catalogue，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR；Sigma-Aldrich(2003) Catalogue，St.Louis，MO)。

免疫系统的标准组织学方法已有所描述。参见例如Muller-Harmelink(编辑)(1986)Human Thymus：Histopathology and Pathology，Springer Verlag，New York，NY；Hiatt等人(2000)Color Atlas of Histology，Lippincott，Williams，and Wilkins，Phila，PA；Louis等人(2002)Basic Histology：Text and Atlas，McGraw-Hill，NewYork，NY。

可以利用用于测定(例如)抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点及序列比对的软件包和数据库。参见例如GenBank，Vector NTI

Suite(Informax，Inc，Bethesda，MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys，Inc.，SanDiego，CA)；DeCypher

(TimeLogic Corp.，Crystal Bay，Nevada)；Menne等人(2000)Bioinformatics 16：741-742；Menne等人(2000)Bioinformatics ApplicationsNote 16：741；Wren等人(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68：177；vonHeijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14：4683。

实施例2

真菌感染模型

如下获得用于研究真菌感染的小鼠株系。8-10周龄的雌性C57BL/6和BALB/c小鼠自Charles River(Calco，Italy)购得。在佩鲁贾大学(PerugiaUniversity，Perugia，Italy)的动物培养中心(Animal Facility)()在特定无病原体的条件下繁殖以C57BL/6为背景的纯和的IL-12p35、IL-23p19或IL-12p40缺陷型小鼠(下文分别称为p35^-/-、p19^-/-和p40^-/-)、TLR-2、TLR-4、MyD88或TRIF缺陷型小鼠(下文称为TLR-2^-/-、TLR-4^-/-、MyD88^-/-或TRIF^-/-)的小鼠。以BALB/c为背景的IFN-γ^-/-/p35^-/-小鼠繁殖对由M.Colombo博士(Istituto Tumori，Milan Italy)提供。以BALB/c为背景的IFN-γ^-/-和IL-4^-/-小鼠也在佩鲁贾大学动物培养中心繁殖。根据意大利许可动物福利保障法案A-3143-01(Italian Approved Animal WelfareAssurance A-3143-01)进行实验。

如下研究真菌感染及其治疗。已描述了用于此研究的白色念珠菌株的来源和特征。Bacci等人(2002)J.Immunol.168：2904。对于胃肠感染，经胃内注射10⁸个念珠菌细胞，真菌生长的量化表示为每个器官的CFU(平均值±SE)，如Bacci等人(2002)所述。对于静脉内感染，小鼠经静脉内接收0.5ml内不同量的真菌。烟曲霉菌株和培养条件如Montagnoli等人((2006)J.Immunol.176：1712)所述。小鼠经鼻内接收两次剂量的2×10⁷曲霉菌休眠分生孢子。如由鲎变形细胞溶解物(Limulus amebocyte lysate，LAL)方法所测定，将真菌以小于1.0EU/ml悬浮于无内毒素的溶液(Detoxi-gel，Pierce，Rockford，IL)中。通过几丁质检测定量真菌生长，其中结果表示为葡糖胺微克数/器官。对于组织学，将组织切除，立即于福尔马林(formalin)中固定，将石蜡包埋组织的部分(3-4μm)用过碘酸-希夫氏试剂(periodic acid-Schiff reagent)染色并检查。Bacci等人(2002)；Montagnoli等人(2006)。用的200μg p19中和Ab(Belladonna等人(2006)Cytokine 34：161)或IL-17A中和mAb(TC11-18H10，PharMingen，San Diego，CA)治疗经感染的动物，在感染5小时后腹膜内给药。在感染后5h及24h腹膜内给药总共1mg经纯化的抗TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3mAb(2G7)(Lucas等人(1990)J.Immunol.145：1415)。用PBS注射对照小鼠，因为在PBS处理与同种型对照处理(各处理)的动物(每组n＞6)之间未观测到差异。

如下纯化细胞。通过磁性活化分类术使用Ly-6G MicroBead和MidiMac(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，Germany)自小鼠的腹膜腔分离Gr-1+CD11b+多形核白血球嗜中性粒细胞(PMN，根据FACS分析纯度大于98％)。通过磁性活化分类术使用CD4MicroBead和MidiMac(Miltenyi Biotech)自肠膜淋巴结(MLN)、胸淋巴结(TLN)及脾纯化CD4⁺T细胞。DC由骨髓细胞获得，将骨髓细胞在伊氏改良培养基(Iscove′s modified medium)中在150U/ml小鼠rGM-CSF(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和75U/ml rIL-4(R&D Systems，Minneapolis，MN)存在下培养7天以获得CD11b+DC或在200ng/ml FLT3-L(R&D Systems)存在下培养9天以获得FL-DC。Romani等人(2006)Blood 108：2265。通过磁性活化分类术使用CD11c MicroBead和MidiMac(Miltenyi Biotech)纯化由90-95％CD8-、5-10％CD8+和1-5％B220+细胞组成的脾DC(＞99％的CD11c+和0.1％的CD3+)。如Bellocchio等人((2004)J.Immunol.173：7406)所述使用来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，10μg/ml，Sigma-Aldrich)的酵母聚糖、来自明尼苏达沙氏杆菌(Salmonella minnesota)Re 595的超纯LPS(10μg/ml，Labogen，Rho，Milan，Italy)以及CpG寡核苷酸2006(CpGODN，0.06μM)。。

将DC细胞如下脉冲和培养。如Bacci等人(2002)；Montagnoli等人(2006)所述，以1∶1细胞∶真菌比率将DC暴露于具有和没有10ng/ml细胞因子(来自R&DSystems；Space Import-Export srl，Milan，Italy；及BD Biosciences-PharMingen，SanDiego，CA)或中和抗体(10μg/ml)的活的未经调理的真菌。。在培养的12h时收获细胞以供RT-PCR，通过ELISA评估上清液的细胞因子含量。在培养物上清液中进行细胞因子定量之前，在存在和不存在中和抗体(10μg/ml)的情况下，将脾CD4+T细胞(10⁶/ml)在平底96孔板中在5×10⁵念珠菌脉冲的脾DC存在下培养5天。如所述将未经分级分离的MLN或TLN细胞用灭活真菌培养(Montagnoli等人(2006)；Montagnoli等人(2002)J.Immunol.169：6298)，接着5天后在培养物上清液中进行细胞因子测定。

实施例3

抗真菌活性检测

如Bellocchio等人(2004)所述，进行未经调理的念珠菌酵母或曲霉菌分生孢子的PMN噬菌作用和杀真菌活性的检测。。结果表示为CFU抑制百分比(平均值±SE)。将PMN暴露于不同浓度的IL-17或IL-23或50ng/ml IFN-γ±IL-23/IL-17(100ng/ml)中历时12h，接着针对IDO进行Western印迹法，或暴露历时60min，接着添加真菌，再过60min，以进行杀真菌活性的研究及MMP9/MPO(小鼠髓过氧化物酶)测定。如Bellocchio等人(2004)所述进行明胶酶谱法(zymography)。通过扫描72kD区的裂解条带，测定基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase，MMP9)的溶胶活性。对于MPO测定，使用兔抗人MPO多克隆Ab(Calbiochem，San Diego，CA)探测样品，使用电致化学发光(ECL)(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)观测。

如Bozza等人(2005)所述通过用兔IDO特异性多克隆抗体进行免疫印迹来检测吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)。阳性对照由表达IDO的MC24转染子组成且阴性对照为空白转染(mock-transfected)的MC22细胞。

如下通过实时RT-PCR、ELISA及ELISPOT检测定量细胞因子。使用iCycleriQ

检测系统(Bio-Rad，Hercules，CA)和SYBR

Green chemistry(Finnzymes Oy，Espoo，Finland)进行实时RT-PCR。裂解细胞，使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGENS.p.A.，Milano，Italy)提取总RNA，根据制造商说明用Sensiscript逆转录酶(QIAGEN)进行逆转录。PCR引物自Invitrogen(Carlsbad，CA)获得。所用PCR引物为：

针对小鼠IL-12p35，正向引物5′-CACCCTTGCCCTCCTAAACC(SEQ IDNO：1)和

反向引物5′-CAAGGCACAGGGTCATCATC(SEQ ID NO：2)；

针对小鼠IL-23p 19，正向引物5′-CCAGCAGCTCTCTCGGAATC(SEQ IDNO：3)，和

反向引物5′-TCATATGTCCCGCTGGTGC(SEQ ID NO：4)；

针对IL-12Rβ2，正向引物5′-CTTCTTAACAGCACGTCCTGG(SEQ ID NO：5)，及

反向引物5′-GGTCTCAGATCTCGCAGGTCA(SEQ ID NO：6)；

针对IL-23R，正向引物5′-TGAAAGAGACCCTACATCCCTTGA(SEQ IDNO：7)及

反向引物5′-CAGAAAATTGGAAGTTGGGATATGTT(SEQ ID NO：8)；

针对小鼠γ-肌动蛋白，正向引物5′-CGCAAAGACCTGTATGCCAAT(SEQID NO：9)，及

反向引物5′-GGGCTGTGATCTCCTTCTGC(SEQ ID NO：10)。

根据制造商说明(Applied Biosystems，Foster City，CA)对各样品(三份重复)进行持家γ-肌动蛋白基因(housekeepingγ-actin gene)的PCR扩增以作为样品加样的对照，允许在样品之间标准化。包括了水对照以确保特异性。SYBR

绿色实时PCR的条件为：在95℃下3min，接着为4下列步骤的40次循环：在95℃下进行变性15s，在60℃下进行1min退火/延伸步骤。通过分析扩增曲线图来检查各数据点的完整性。mRNA标准化的数据表示为与空白感染细胞的细胞因子mRNA相比经处理的细胞中相对的细胞因子mRNA。通过酶联免疫吸附检测(R&D Systems及针对IL-23，eBioscience，SocietàItaliana Chimici，Rome，Italy)评估培养细胞的组织匀浆或上清液细胞因子含量。检测的检出限(pg/ml)对于IL-12p70小于16，对于IL-23小于30，对于IFN-γ小于10，对于IL-10小于3，对于IL-17小于10，及对于TGF-β1小于4.6。对与念珠菌脉冲的DC共同培养3天的经纯化的MLN CD4+T细胞使用AID EliSpot检测试剂盒(Amplimedical，ButtiglieraAlta，Turin，Italy)以对产细胞因子细胞进行计数。

如下进行数据的统计分析。时序检验(log-rank test)用于Kaplan-Meier存活曲线的成对数据分析。使用斯氏t检验(Student′s t-test)或方差分析(ANOVA)和Bonferroni检验(Bonferroni′s test)确定器官清除率与体外检测的差异的统计显著性。显著性定义为p＜0.05。所报导的数据来自3个独立实验中的一个代表性实验或自3至5个实验汇集。体内组由每组6-8只小鼠组成。

实施例4

IL-23/IL-17在对念珠菌病的易感性中的作用

为评估IL-23/IL-17通路对白色念珠菌感染的作用，我们根据存活率、真菌生长及组织病理学，比较p19^-/-、p35^-/-、p40^-/-和57BL/6小鼠对胃肠感染的易感性以及炎症和获得性Th1/Th17免疫性的参数。结果(图1A-E)显示对念珠菌病的抗性在p35^-/-小鼠中严重削弱，50％以上p35^-/-小鼠死于此感染(图1A)，其中胃中真菌生长升高(图1B)。相比之下，在感染3天和10天后，如与C57BL/6小鼠相比，p19^-/-小鼠中限制真菌生长的能力大为增加。显著地，缺乏IL-12和IL-23两者的p40^-/-小鼠比p35^-/-小鼠对念珠菌病的易感性较低，且比p19^-/-小鼠对念珠菌病的易感性较高，这强调IL-12对控制念珠菌的不同作用。Mencacci等人(1998)J.Immunol.161：6228。在静脉内感染p35^-/-和p19^-/-小鼠后观测到类似结果，其中平均存活时间(MST)分别为6±2天对20±3天(5×10⁵个真菌细胞接种体)和4±2天对15±3天(10⁶个真菌细胞接种体)。胃的组织病理学检查揭示在C57BL/6、p19^-/-或p40^-/-小鼠中存在角化不全症、棘皮症及有限的炎症反应，不过p40^-/-小鼠尤其p19^-/-小鼠展示单核细胞浸润。相比之下，大量真菌菌丝存在于p35^-/-小鼠胃中的角质化层中，这与PMN大量浸润、上皮坏死体征以及显著棘皮症相关。这些结果表明IL-23及IL-12通路在念珠菌病中具有相异作用。

为使这些发现结果与IL-12/Th1及IL-23/Th17免疫反应相关联，在感染1天或3天后评估小鼠的MLN中p35、p19、IL-12Rβ2以及IL-23R mRNA表达(图1C)，在感染后第7天评估MLN中产IFN-γ、IL-4或IL-17的CD4+细胞的频率(图1D)。我们发现与C57BL/6小鼠相比，在p19^-/-小鼠中p35和IL-12Rβ2含量以基IFN-γ+细胞数量增加，这证明在不存在IL-23的情况下IL-12/Th1反应增加。相比之下，在缺乏IL-12的小鼠(p35^-/-)中p19和IL-23R的含量以及产IL-17细胞的数量增加。不出所料，p35^-/-小鼠中产IL-4的细胞的数量也显著增加。这些数据证明在野生型C57BL/6小鼠中主要的Th1反应受到IL-12促进且受到IL-23限制。IL-12抑制IL-23和IL-17产生，且反过来IL-23抑制IL-12和IFN-γ产生，这表明IL-23/Th17与IL-12/Th1通路交叉调节。这些数据表明升高的IL-23/Th17反应使小鼠对念珠菌病具有高度易感性。

实施例5

IL-23/IL-17在对曲菌病的易感性中的作用

为确定是否与念珠菌病类似，IL-23/IL-17通路的活化与对曲菌病的易感性相关联，评估p19^-/-、p35^-/-、p40^-/-或C57BL/6小鼠对肺曲菌病的易感性以及炎症和获得性Th1/Th17免疫性的参数。结果(图2A)显示真菌负荷在p35^-/-小鼠中降低，在p19^-/-小鼠中降低程度甚至更大，这表明IL-12尤其IL-23抑制对曲霉菌感染的控制(即，促进曲霉菌感染)。肺的组织病理学检查揭示在C57BL/6、p40^-/-或p19^-/-小鼠中存在轻度炎症病理学，特征为分散在另外完整的肺实质中的炎症单核细胞的少量浸润。虽然p19^-/-小鼠中浸润单核细胞的数目较高，但未观测到实质破坏的体征。相比之下，PMN的大量浸润(Gr1+CD11c-PMN增加约8-10倍)存在于与大范围间质性肺炎体征相关的p35-/-小鼠的肺中。类似于念珠菌感染，IL-12及IL-23与其各自的受体的表达受到交叉调节，其中与C57BL/6小鼠相比，p19^-/-小鼠的TLN中p35和IL-12Rβ2上调，p35^-/-小鼠的TLN中p19和IL-23R上调(图2B)。相比之下，p40^-/-小鼠中IL-12和IL-23二者的不存在未显著改变p35和p19或其受体IL-12Rβ2和IL-23R的表达。此外，在感染后第7天，产IFN-γ+和产IL-17+的CD4+T细胞的数目分别在p19^-/-及p35^-/-小鼠中增加(数据未展示)。在肺中，p19^-/-小鼠中IL-12p70含量(554±44pg/ml)比C57BL/6小鼠中(68±8pg/ml)高得多，且IL-23仅可在p35^-/-小鼠中检测到(79±11)。与C57BL/6小鼠(37±7pg/ml)相比，p35^-/-小鼠中IL-17增加(246±17pg/ml)。这些数据表明加强的IL-23/IL-17依赖性炎症反应还与对曲菌病的易感性有关。

实施例6

TGF-β在IL-23/IL-17介导的对真菌感染的易感性中的作用

为研究IL-17在对真菌感染的易感性中的作用，在真菌感染后不久用抗IL-17中和抗体处理小鼠。如通过相关靶器官中真菌生长的减少(图3A)、组织炎症和PMN浸润(数据未展示)所判断，IL-17的阻断极大地增加对白色念珠菌和烟曲霉两者的抗性。抗性与IFN-γ+Th1细胞的频率增加和Th17细胞的频率降低有关，这使得MLN细胞分泌的IL-17的量降低(图3B)。类似地，抗体对IL-23的中和作用增加对真菌感染和Th1发育的抗性，这证实了我们在p19^-/-小鼠中获得的数据(图3B)。这些结果清楚证明IL-23/IL-17通路通过抑制保护性Th1免疫性赋予对真菌感染的易感性。

近来的结果表明TGF-β与IL-6一起促进Th17发育。Bettelli和Kuchroo(2005)J.Exp.Med.201：169；Mangan等人(2006)Nature 441：231；Veldhoen等人(2006)Immunity 24：179。我们通过用TGF-β中和抗体处理来评估小鼠中TGF-β对Th细胞发育和真菌控制的作用。显著地，在白色念珠菌和烟曲霉感染期间，TGF-β抑制都不影响产IL-17细胞的发育(图3B)，仅在具有曲霉菌但不具有念珠菌的小鼠中观测到真菌负荷轻微但明显的减少(图3A)，但在两种感染中CD4+Th17细胞的活化均未受处理所影响。因为TGF-β中和作用有效降低感染中的TGF-β产生(胃中46至24pg/ml，肺中36至15pg/ml)，所以我们推断TGF-β在Th17介导的对真菌感染的易感性中起次要作用。

实施例7

在IL-12不存在的情况下IL-23/IL-17在真菌感染中的作用

以上数据表明IL-23/IL-17轴决定对真菌感染的易感性的一种可能机制在于抑制保护性Th1反应的相对能力。为正式对其加以证明，在加强(IL-4^-/-小鼠)或缺乏(IFN-γ^-/-小鼠)Th1反应性的条件下，对IL-23进行阻断。使小鼠经胃内感染白色念珠菌，通过中和抗体进行IL-23阻断。与先公开物(Romani等人(1992)J.Exp.Med.176：19；Cenci等人(1998)J.Immunol.161：3543)一致，与BALB/c小鼠相比，IL-4^-/-小鼠中真菌负荷较低，IFN-γ^-/-小鼠中真菌负荷较高，这证明了IFN-γ对感染控制的重要性。类似于WT小鼠，IL-23的阻断大大减少IL-4^-/-小鼠胃中的真菌负荷(图3C)，同时增加MLN中的IL-12p70/IFN-γ产生(数据未展示)，这表明Th2和IL-23/Th17通路两者均加性拮抗保护性抗真菌反应。意外地，IFN-γ^-/-小鼠中升高的真菌负荷在中和IL-23后进一步增加(图3C)，这导致经抗IL-23处理的小鼠中IL-23产生减少(229对21pg/ml)，IL-17产生减少(279对95pg/ml)。因此，在IFN-γ不存在的情况下，IL-23在真菌感染中可具有保护性作用。然而，如通过p35^-/-或双重缺陷的IFN-γ^-/-/p35^-/-的小鼠中中和IL-23后真菌负荷降低所证明，IL-23在IL-12p70不存在的情况下或在IL-12p70和IFN-γ两者都不存在的情况下具有相反作用(图3C)。这些数据表明在IFN-γ不存在的情况下IL-23的保护性作用由IL-12p70所介导。显著地，还在结核病中观测到在IL-12p70不存在的情况下IL-23的中度的保护性作用，其中在产IFN-γ的保护性CD4+T细胞诱导下IL-23部分替代IL-12p70。Khader等人(2005)。

实施例8

树突状细胞响应真菌感染产生IL-23和IL-12

已显示IL-23是由人DC响应体外曲霉菌而产生。Gafa等人(2006)Infect.Immun.74：1480。此处我们评估IL-23是否由DC相应白色念珠菌而产生以及其与IL-12和IL-10(基本上为诱导对真菌的保护性耐受性所需的两种细胞因子)的产生如何相关。Romani和Puccetti(2006)。

为达成此目的，我们在GM-CSF(GM-DC)或Flt3-L(FL-DC)存在下制备源自骨髓的DC，它们分别具有脊髓DC和浆细胞样DC的特征。虽然FL-DC涵盖与新鲜收集的脾CD8+、CD8-和B220+LyC6+浆细胞样DC的混合物等效的群体(Naik等人(2005)J.Immunol.174：6592)，但我们近来证明FL-DC的功能活性存在于浆细胞样DC中或CD8-与CD8+DC的组合中。Romani等人(2006)Blood 108：2265。在体外用酵母或真菌菌丝刺激DC且评估其中的细胞因子mRNA表达和产生。酵母聚糖和LPS用作GM-DC的阳性对照，CpG-ODN用作FL-DC的阳性对照。

结果显示DC亚群的两个亚群相应对真菌反应而表达和产生细胞因子的分歧性(dichotomy)。RT-PCR分析揭示p19mRNA表达仅在GM-DC中增加，对酵母的反应强于菌丝；p35mRNA表达在对酵母反应的GM-DC中略微增加，但类似于IL-10，在暴露于菌丝的FL-DC中极大增加(图4A)。培养物上清液中实际细胞因子产生的检测证实IL-23由GM-DC对酵母(尤其在高真菌：DC比率下)以及酵母聚糖或LPS反应产生(图4B)。IL-23产生的最大含量在培育第12h时观测到(图4B)，此后下降(数据未展示)。相反的，IL-12p70和IL-10两者主要由用念珠菌菌丝、LPS或CpG-ODN刺激12h的FL-DC产生(图4B)，而且此后继续升高(数据未展示)。综合而言，这些数据表明IL-23由脊髓DC对真菌反应(尤其在高水平真菌生长的条件下)且早于其它指示性细胞因子产生。因此，不同DC亚群对念珠菌反应产生指示性细胞因子的能力可调节其在体内的抗真菌免疫性。实际上，如已针对曲霉菌所示(Romani等人(2006)Blood 108：2265)，在获得性(adoptive)转移至患有念珠菌病的受体小鼠中后，念珠菌脉冲的FL-DC赋予保护作用且念珠菌脉冲的GM-DC加重感染。

实施例9

IL-23与IL-12的交叉调节

为证实IL-12p70与IL-23产生在对真菌反应时是否受到交叉调节，我们检测来自p19^-/-、p35^-/-和C57BL/6对照小鼠的脾DC在暴露于IL-12p70或IL-23或相应中和抗体后的IL-12p70和IL-23分泌。图4C显示示IL-12p70和IL-23确实受到交叉调节，因为如与WT DC相比，IL-12p70的产生在p19^-/-DC中较高，IL-23的产生在p35^-/-DC中较高。此外，暴露于IL-12p70或IL-23分别显著减少WT DC的IL-23或IL-12p70分泌，在IL-12或IL-23中和的条件下相反情况成立(图4D)。因为RT-PCR揭示未经刺激的DC表达两种细胞因子受体(数据未展示)，所以这些数据表明存在旁分泌环路，通过该旁分泌环路DC的IL-12p70和IL-23产生受到相互调节。

实施例10

TLR在树突状细胞产生IL-23中的作用

为确定对真菌反应产生IL-23TLR依赖性的可能性，我们检测自TLR-2^-/-或TLR-4^-/-小鼠以及自MyD88^-/-和TRIF^-/-小鼠产生的GM-DC对酵母或分生孢子反应所发生的IL-23产生。Akira和Takeda(2004)Nat.Rev.Immunol.4：499。图5A显示TLR2和TLR4对于由通过MyD88而非TRIF的信号转导产生IL-23都是必需的。显著地，甚至在TRIF不存在的情况下似乎也能促进IL-23。因此，传统的DC对真菌反应经由TLR/MyD88依赖性炎症通路产生IL-23。

为确定T细胞是否还可调节IL-23产生，我们评估与CD4+T细胞一起培养的DC的上清液中产生的IL-23含量。结果清楚证明IL-23产生在经念珠菌脉冲的DC刺激的T细胞培养物中受到上调(组3对组6，图5B)，其中经念珠菌脉冲的DC来自C57BL/6(尤其p35^-/-)小鼠，发现结果表明经活化的T细胞可对IL-23产生的扩增提供正反馈回路。此外，交叉实验的结果证实产生IL-23的DC为活化产IL-17细胞所必需和足够的(组7及8)。此外，添加至DC与T细胞的共培养物中的mAb对IL-23的中和能抑制IL-17产生(组4对组5，图5C)，而TGF-β中和作用影响IFN-γ产生(组1对组3)而不影响IL-17产生(组4对组6)。

实施例11

IL-23和IL-17对多形核嗜中性粒细胞的抗真菌效应功能的作用

PMN在对真菌反应的的急性炎症的起始和进行中是必需的。Romani(2004)。发现PMN大量募集至感染部位，这与p35^-/-小鼠中早期真菌生长一起导致我们的假设：IL-23/IL-17依赖性通路可能不利地影响PMN的抗真菌效应功能。

因此，我们评估了在IFN-γ不存在或存在的情况下用重组IL-23或IL-17培养的来自p19^-/-或p35^-/-小鼠及来自WT小鼠的PMN的杀真菌活性。与C57BL/6 PMN相比，杀伤活性在p19^-/-PMN中显著增加，在p35^-/-小鼠中降低(图6A)。在将PMN暴露于这些细胞因子前，我们验证了是否类似于IL-17R(Yao等人(1995)Immunity 3：811-821)，IL-23R还在鼠PMN上表达。定量RT-PCR揭示了未经刺激的PMN表达IL-23R，其表达在经LPS刺激后进一步增加(数据未展示)，该发现表明PMN还对IL-23反应。

在IFN-γ不存在和存在的情况下(图6C)暴露于任一细胞因子均以剂量依赖性方式削弱WT PMN的杀伤活性(图6B)。因此，IL-23及IL-17负性调节PMN的抗真菌效应功能，这可是为何p35^-/-小鼠无法有效限制真菌生长的原因。因此，虽然IL-17为PMN的有效化学引诱剂(Ye等人(2001)J.Exp.Med.194：519)使得外周PMN流入受感染器官减少说明IL-17AR缺陷型小鼠对念珠菌病的高度易感性(Huang等人(2004)J.Infect.Dis.190：624)，但我们的结果还指出了IL-17对PMN功能的不利影响。

实施例12

IL-23和IL-17对多形核嗜中性粒细胞的IDO依赖性抗炎程序的作用

我们已证明IFN-γ介导的IDO活化负性调节PMN抵抗念珠菌的炎症程序，使得IDO阻断导致促进PMN的炎症状态。Bozza等人(2005)。MMP-9和MPO为所提出的由IL-17活化的典型炎症标记。Kolls和Linden(2004)Immunity 21：467。因此，我们评估了IL-23和IL-17两者对白色念珠菌诱导的MMP-9、MPO，以及IFN-γ介导的IDO产生的作用。IL-23且尤其IL-17显著增加MMP-9和MPO(图6D)。WTPMN的IDO表达和炎症反应。相比之下，两种细胞因子完全拮抗IFN-γ对IDO的诱导(图6E)。有趣地，凋亡PMN的数目在暴露于IL-23及IL-17两者之后都显著减少(数据未展示)，这表明这些细胞因子还增强PMN存活力。这可为Th17通路维持炎症的另一机制。因此，破坏PMN炎症程序的能力以及炎症组织中网状蛋白水解负载增加可解释真菌感染中与Th17细胞活化有关的炎症病理学。

实施例13

基于IL-17产生的IL-23特异性拮抗剂的检测

如通过荧光活化细胞分类术(FACS

)分析所测定，使用鼠引流淋巴结(DLN)细胞的体外研究已证明消除IL-23能抑制或消除产IL-17细胞，而增加IL-23产生或刺激IL-17分泌。参见WO 2004/071517，Langrish等人(2005)J.Exp.Med.201：233。还参见Aggarwal等人(2003)J.Biol.Chem.278：1910。在这些实验中，用细胞因子或抗体处理DLN细胞5天。将细胞自抗原初免的正常野生型小鼠分离，在rIL-12或rIL-23存在下培养。对DLN培养物中CD4⁺T细胞的分析证明IL-12促进产IFN-γ细胞的发育，同时产IL-17的群体丧失。相比之下，IL-23促进产IL-17细胞发育，同时产生IFN-γ的群体丧失。抗p19抗体降低IL-17产生但不影响IFN-γ含量，而抗p35抗体不改变IL-17产生。总之，这些结果证明IL-23选择性促进产IL-17CD4⁺T细胞的发育。

如下，使用IL-23和IL-12的生物活性的这种差异来评估相对于IL-12，潜在IL-23拮抗剂的效力和特异性。

如下获得在潜在IL-23特异性拮抗剂不存在的情况下关于IL-23及IL-12活性的基线数据。(皮下)用在完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant)中乳化的蛋白脂质肽(PLP)及用(静脉内)百日咳毒素免疫正常野生型SJL小鼠。在免疫后第9天移除引流淋巴结，立刻评估单核细胞的细胞内IFN-γ和IL-17产生(如下所述)，或将单核细胞分离且在PLP加rIL-12或rIL-23的存在下培养5天。在Golgi-plug存在下用PMA(50ng/ml)/离子霉素(ionomycin)(500ng/ml)刺激细胞3小时，接着针对CD4进行表面染色，渗透，且针对IFN-γ及IL-17进行细胞内染色。流式细胞仪曲线图以活CD4⁺T细胞为门区(gate)。

相对于未经细胞因子处理的对照细胞评估IL-23和IL-12的作用。通常，经IL-23处理的细胞表现出产IL-17细胞百分比增加，而产IFN-γ细胞不增加，而经IL-12处理的细胞表现出产IFN-γ细胞百分比增加，而产IL-12细胞不增加(或甚至减少)。

通过在拮抗剂存在下或优选在一系列浓度拮抗剂存在下进行相同实验，测定潜在IL-23特异性拮抗剂的效力和特异性。IL-23特异性拮抗剂抑制IL-23的活性(即，该拮抗剂减少另外由IL-23诱导的产IL-17细胞的百分比)，但并不实质上降低IL-12的活性。抑制IL-12或IL-12与IL-23两者的活性的药剂并非IL-23特异性拮抗剂。

任选，可包括其中使用已知抗p19拮抗剂抗体来特异性抑制IL-23活性的阳性对照。

实施例14

分枝杆菌感染

提供一种证明本发明的组合物和方法在治疗分枝杆菌感染中的功效的方法。如下将C57BL/6小鼠用分枝杆菌感染。如制造商所建议，将Theracys-BCGLive(Aventis Pasteur，Inc.，Swiftwater，PA)(卡介苗(Bacille Calmette and Guerin)的Connaught菌株与牛分枝杆菌的减毒菌株的冻干制剂)复溶。在10％甘油盐水中使经复溶的细菌达到约6×10⁷cfu/mL的浓度。在注射至小鼠之前，在0.02％Tween-80/0.9％盐水中将等分试样稀释至适当浓度。

经由侧尾静脉将6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠用约3.5×10⁵cfu的BCG静脉内感染。在分枝杆菌感染前1天且再次在分枝杆菌感染后1-2周，皮下给药小鼠1mg于0.9％盐水中的适当单克隆抗体(例如，同种型对照、抗IL-23p19、或抗IL-23R)。在感染后适当时间点通过CO₂麻醉处死小鼠。

如下分析处死的经BCG感染的小鼠。通过在切断下腔静脉后经由心脏的右心室灌注RPMI 1640，将血液自肺清除。无菌移除左肺、下右肝叶和一半的脾。使用Mini-Bead Beater-8匀化器(BioSpec Products，Bartlesville，OK)将组织在0.9％NaCl/0.02％Tween 80中均化。通过将10倍连续稀释的器官匀浆涂于7H10Middlebrook琼脂板(Becton Dickinson，Sparks，MD)上来定量存活的分枝杆菌。在37℃下孵育两周后人工计数菌落形成单位(CFU)。与对照小鼠(例如，同种型对照)相比，在经抗IL-23抗体(例如，抗IL-23p19抗体或抗IL-23R抗体)处理的动物中细菌负荷在统计学上显著减少(如通过CFU所检测)，这证明能有效治疗分枝杆菌感染。

Claims (26)

1.IL-23拮抗剂在用于制备治疗慢性真菌感染或预防性治疗怀疑患有慢性真菌感染或有获得慢性真菌感染风险的个体的药物中的用途，其中该IL-23拮抗剂包括：

a)特异性结合IL-23p19的拮抗剂抗体或其抗原结合片段；

b)特异性结合IL-23R的拮抗剂抗体或其抗原结合片段；

c)来源于IL-23R的胞外结构域的可溶性受体；

d)针对IL-23p19的反义核酸；

e)针对IL-23p19的siRNA；

f)针对IL-23R的反义核酸；或

g)针对IL-23R的siRNA。

2.权利要求1的用途，其中真菌感染选自念珠菌病、曲菌病、隐球菌病和甲真菌病感染。

3.权利要求1的用途，其中真菌感染为念珠菌病。

4.权利要求1的用途，其中所述真菌感染为慢性皮肤粘膜念珠菌病(CMC)。

5.权利要求1的用途，其中所述治疗包括给予待治疗的个体有效量的IL-23拮抗剂，和进一步包括将一种或多种选自下列的抗真菌剂给予所述个体：泊沙康唑、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、酮康唑、利阿唑、伊替马唑、克霉唑、咪康唑、益康唑、布康唑、奥昔康唑、硫康唑、噻康唑、和特康唑、噻二唑、

二唑、卡泊芬净、两性霉素B、制霉菌素、匹马菌素、氟胞嘧啶(5-氟胞嘧啶)、萘替芬、特比萘芬、布替萘芬、硫代碳酸托萘酯、灰黄霉素、胺碘酮、环吡司、舒苯汀、阿莫罗芬、氯碘羟喹、龙胆紫、碘化钾、硫代硫酸钠、石炭酸-品红溶液、乙酸卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。

6.权利要求5的用途，其中所述一种或多种抗真菌剂为两性霉素B、氟胞嘧啶、伊曲康唑、伏立康唑、氟康唑或泊沙康唑。

7.权利要求1的用途，其中所述治疗包括将有效量的IL-23拮抗剂给予待治疗的个体和进一步包括给予IL-17A拮抗剂。

8.权利要求1的用途，其中所述治疗包括将有效量的IL-23拮抗剂给予待治疗的个体和进一步包括给予IL-6拮抗剂。

9.权利要求1的用途，其中所述治疗包括将有效量的IL-23拮抗剂给予待治疗的个体和进一步包括给予TGF-β拮抗剂。

10.权利要求1的用途，其中所述治疗包括将有效量的IL-23拮抗剂给予待治疗的个体和进一步给予IL-12或IL-12激动剂。

11.权利要求1的用途，其中IL-23拮抗剂为结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段。

12.权利要求1的用途，其中IL-23拮抗剂为结合IL-23R的抗体或其抗原结合片段。

13.权利要求11或12的用途，其中抑制IL-12与其受体结合的IC50与抑制IL-23与其受体结合的IC50的比率(IC50_IL-12/IC50_IL-23)经ELISA测量为5或更大。

14.权利要求11或12的用途，其中IL-23拮抗剂为选自下列的抗体片段：Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)₂和双功能抗体。

15.权利要求11或12的用途，其中抗体是人源化的抗体。

16.权利要求11或12的用途，其中抗体是完全人抗体。

17.权利要求11或12的用途，其中抗体是单链抗体。

18.权利要求11或12的用途，其中所述抗体具有降低补体活化、ADCC或两者的改变的效应功能。

19.权利要求1的用途，其中IL-23的拮抗剂为来源于IL-23R的可溶性受体片段。

20.权利要求1的用途，其中IL-23的拮抗剂为针对IL-23p19的siRNA。

21.权利要求1的用途，其中IL-23的拮抗剂为针对IL-23p19的反义核酸。

22.权利要求1的用途，其中所述治疗是患有慢性真菌感染的个体，和其中所述患有慢性真菌感染的个体先前已使用其它方法或组合物治疗所述感染。

23.权利要求1的用途，其中所述治疗是患有慢性真菌感染的个体，和其中所述患有感染的个体免疫受损。

24.权利要求1的用途，其中IL-23拮抗剂增强Th1免疫反应。

25.权利要求24的用途，其中所述增强的Th1免疫反应包括表达IFN-γ的CD4⁺T细胞的百分比与给予所述IL-23拮抗剂之前表达IFN-γ的CD4⁺T细胞的百分比相比增加2倍或更多。

26.权利要求24的用途，其中所述增强的Th1免疫反应包括表达IL-17的CD4⁺T细胞的百分比与给予所述IL-23拮抗剂之前表达IL-17的CD4⁺T细胞的百分比相比减少2倍或更多。

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