CN101665758A - 体外条件下重现人体胃肠道及微生态系统的模拟装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种体外条件下重现人体胃肠道及微生态系统的模拟装置，该装置是在比利时根特大学人体肠道微生态系统模拟装置(Simulator of Human Intestinal MicrobialEcosystem，SHIME)技术的基础上，针对东方人群的生活习性进行技术改进来达到在体外条件重现人体胃肠道系统。本发明属于微生物学、环境科学、化学、营养学及药物学有机物质分析测定技术领域。

Description

体外条件下重现人体胃肠道及微生态系统的模拟装置

技术领域

本发明基于比利时根特大学人体肠道微生态系统模拟装置(Simulator of Human IntestinalMicrobial Ecosystem，SHIME)技术基础上，针对东方人群的生活习性进行技术改进来达到在体外条件重现人体胃肠道系统。本发明属于微生物学、环境科学、化学、营养学及药物学有机物质分析测定技术领域。

背景技术

利用人体胃肠道模拟技术进行体外实验最开始是应用在营养学食物中金属元素的生物有效性研究，方法也是比较简单的采用盐酸溶液模拟胃液来浸提食物中的金属元素。由于人体消化系统的生理条件相当复杂，这样的方法并不能很好的反映胃肠道的真实情况。针对人体胃肠道实际生理环境，目前国际上已经有了十多种相对较为成熟的方法，如：由英国Ruby等创建的PBET方法(基于生理条件的萃取实验，The Physiologically Based Extraction Test)，还有Rodriguez等创建的IVG方法(体外胃肠道方法，In-Vitro Gastrointestinal Method)等。这些方法在研究环境中的有机污染物、金属元素以及药物对人体的生物有效性中得到了广泛的应用。美国俄亥俄州州立大学建立的IVG方法(In-Vitro Gastrointestinal)是将土样加入到胃消化液中(含0.15mol L^-1的NaCl和1％的胃蛋白酶，pH为1.8)，并加入生面团(Dough)模拟食物成分，向胃液中充入氩气模拟厌氧条件，于37℃下以100rpm的速度搅拌消化1h后，完成胃阶段的模拟。接着用饱和的NaHCO₃溶液调整溶液的pH值至5.5，加入胆粉和胰液素，搅拌消化1h，完成小肠阶段的模拟。科罗拉多大学波尔得分校建立的SBET模型(Simplified Bioaccessibility Exaction Test)模拟的也是重金属在胃部的释放。由于这些方法更多的是研究化学物质在胃和小肠中的生物化学行为，而在大肠部分的研究相对较少，因此并不能完整反应整个消化系统的情况。由比利时根特大学研究发明的人体肠道微生态系统模拟装置(Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem，SHIME)除了胃和小肠模拟玻璃罐之外还包括结肠部分的三个玻璃罐：升结肠、横结肠、降结肠。该模型最大的优点是可以研究化学物质从进入胃部一直到排泄之间整个消化系统中的生物化学行为，并可以对肠道微生物对化学物质的代谢行为进行相关研究。

考虑到西方人群与东方人群存在人种、饮食习惯、生活习性等方面的差异，本单位对SHIME模拟装置中模拟食物液成分、各个玻璃罐消化时间等做了改进，以达到模拟东方人群人体胃肠道的生理环境，从而在体外条件下重现消化的整个过程。

就目前来看，在体外模拟这方面研究西方国家一方面起步早，受到的重视程度也比较高。因此，在这方面的研究中我们同西方国家仍然有着很大的差距。通过引进并改进SHIME模型对填补国内在体外技术研究方面有着极为重要的意义，其次在重现东方人群胃肠道环境的基础上一方面可以研究环境污染物、药物及食品中有机添加物在胃和小肠消化过程的生物有效性及其影响因素，另一方面可以研究肠道微生物对这些化学物质的代谢作用，并对这一代谢过程对人体的健康效应加以评估。

发明内容

本发明的目的是将原有的SHIME体外装置加以改进并对其各项参数加以改进，以达到在体外条件下重现东方人体胃肠道系统。

本发明，作为一种技术的改进，其特点在于在食物液进食时间、进食量，特别是微生物种群等参数加以改进或改变。

本发明是一种在体外条件下重现人体胃肠道及微生态系统的模拟实验方法，其过程和步骤如下：

A、模型的建立：SHIME模型包括胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠五个玻璃罐，每个玻璃罐由一个带夹层的玻璃罐来存储消化液，每个玻璃罐夹层由塑料管相通并连接到37℃恒温水浴以达到恒温效果；胃和肠消化蠕动通过在每个玻璃罐下用磁力搅拌器进行搅拌加以模拟。在玻璃罐上端用有机玻璃密封，在玻璃中有若干个孔用于向玻璃罐中加入或取出消化液，胃和小肠部分的胃酸及小肠液即从该处通过自动控制自动加入；基于微生物的生长条件，与胃和小肠不同，大肠中三部分pH值通过pH值控制器采用HCL(0.5M)和NaOH(0.5M)溶液自动控制，升结肠、横结肠、降结肠pH值分别在5.6-5.9、6.1-6.4、6.6-6.9之间，玻璃罐中液体体积分别为500ml、800ml、500ml。通过蠕动转移每个玻璃罐之间消化液；模型采用的食物液成分包括：阿拉伯半乳聚糖、胶质、木聚糖、淀粉、葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、粘液素、半胱氨酸；胃酸成分包括：盐酸和胃蛋白酶；小肠液成分包括：胆汁盐、胰酶和碳酸氢钠；

B、人体粪便微生物的提取及接种：样品采集来自3-5名健康寄主，年龄在20-35岁，并且在过去的一年里未食用抗生素之类的药物；取粪便40g加入到200ml接种液(巯基乙酸钠-磷酸缓冲液0.1M)的接种袋中，用匀浆机拍打3min，静置10min取上层液在离心机中以1000rpm速度下离心10min，分别取50ml上清液接种到SHIME模型升结肠、横结肠和降结肠中；在加入的前24h为微生物稳定期，期间不加任何物质，在随后的2-3个星期为微生物适应期，最后才达到稳定；

C、模型的稳定及监护：

a、模型周期性运转：胃模拟玻璃罐每天输入食物液3次，输入时间分别在6:00、12:00、18:00，时间分别为7.5、15、15min，每次输入量为100、100、200ml。胃液输入时间为每天食物液输入之后，时间为22.5、45、45min，输入完全后胃部消化液pH值在1.5左右。1h之后，用蠕动泵将胃消化液转移到小肠模拟器中同时输入小肠液，培养3个小时后全部转移到升结肠中；升结肠、横结肠、降结肠三个玻璃罐容量保持恒定，分别是500、800、500ml；整个模型通过充氮气来保持厌氧环境，每12h充氮气15min；食物添加及所有液体转移均通过恒流蠕动泵在时间控制器的控制下自动完成；

b、各项稳定参数的测定

(1)、微生物平板计数：目前本单位对SHIME模型中肠道微生物检测的种类有7种，分别是：总厌氧菌、总好氧菌、梭菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、乳酸杆菌。其中总好氧菌和总厌氧菌采用的培养基是由BD公司提供的脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)，梭菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、乳酸杆菌采用的培养基是由德国Merck KGaA公司生产的琼脂培养基，分别是：Try ptose Sulfite Cysloserine(TSC)、Mc-Conckey agar(MCC)、Emterococcusagar、Mannistol Salt Agar(MSA)、Rogosa agar；

(2)、NH₄ ⁺的测定：作为微生物的代谢产物，NH₄ ⁺测定使用的是由

公司生产的蒸馏仪B-324和Metrohm公司生产的自动电位滴定仪702SM Titriho。具体措施是取1ml模型中消化液到蒸馏管中，然后加入40ml NaOH用蒸汽蒸馏5min，用硼酸吸收后再用硫酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来计算消化液中NH₄ ⁺的含量；

(3)、短链脂肪酸(SCFA)的测定：作为微生物的另一种代谢产物，SCFA也是衡量微生物活性的重要指标，需要的仪器包括HACH公司生产的离心管(16×100MM PK/6)和Eppendorf公司生产的高速冷冻离心机5804R；具体步骤为：取分析纯H₂SO₄∶H₂O＝1∶1溶液0.5ml加入到离心管中，再加入消化液2ml，之后加入NaCl 0.4g，在加入内标2-甲基乙酸1ml。向离心管中加入2ml乙醚萃取，最后3000rpm离心5min，上清液转移到样品瓶中冰箱保存待用；

(4)、气相色谱-氢火焰离子化检测器(GC-FID)检测

色谱仪条件及检测仪条件分别如下：色谱仪条件：FFAP(30m×0.25mm i.d.，0.25μm)毛细管柱；载气为氦气，恒流，柱流量为1.5ml/min，无分流进样，进样量为0.2μl；进样口温度220℃；柱始温70℃(1min)，15℃/min升至160℃，保持6min，30℃/min升至210℃，保持5min，总运行时间18.17min；

检测器条件：检测器温度250℃，氢气流量40ml/min，空气流量45ml/min。

附图说明

图1是SHIME模型示意图。

图2是SHIME实体照片。

具体实施方式

现将本发明的具体实施例叙述于后。

实施例1：本实施例中，实验方法的过程和步骤如下：

1、模型的建立：SHIME模型包括胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠五个玻璃罐，每个玻璃罐由一个带夹层的玻璃罐来存储消化液，每个玻璃罐夹层由塑料管相通并连接到37℃恒温水浴以达到恒温效果。胃和肠消化蠕动通过在每个玻璃罐下用磁力搅拌器进行搅拌加以模拟。在玻璃罐上端用有机玻璃密封，在玻璃中有若干个孔用于向玻璃罐中加入或取出消化液，胃和小肠部分的胃酸及小肠液即从该处通过自动控制自动加入(参见图1和图2)。基于微生物的生长条件，与胃和小肠不同，大肠中三部分pH值通过pH值控制器采用HCL(0.5M)和NaOH(0.5M)溶液自动控制，升结肠、横结肠、降结肠pH值分别在5.6-5.9、6.1-6.4、6、6-6.9，玻璃罐中液体体积分别为500ml、800ml、500ml。通过蠕动转移每个玻璃罐之间消化液。模型采用的食物液成分包括：阿拉伯半乳聚糖、胶质、木聚糖、淀粉、葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、粘液素、半胱氨酸；胃酸成分包括：盐酸和胃蛋白酶；小肠液成分包括：胆汁盐、胰酶和碳酸氢钠。

2、人体粪便微生物的提取及接种：样品采集来自3-5名健康寄主，年龄在20-35岁，并且在过去的一年里未食用抗生素之类的药物。取粪便40g加入到200ml接种液(巯基乙酸钠-磷酸缓冲液0.1M)的接种袋中，用匀浆机拍打3min，静置10min取上层液在离心机中以1000rpm速度下离心10min，分别取50ml上清液接种到SHIME模型升结肠、横结肠和降结肠中。在加入的前24h为微生物稳定期，期间不加任何物质，在随后的2-3个星期为微生物适应期，最后才达到稳定。

3、模型的稳定及监护

a、每天周期性维护：胃模拟玻璃罐每天输入食物液3次，输入时间分别在6:00、12:00、18:00，时间分别为7.5、15、15min，每次输入量为100、200、200ml。胃液输入时间为每天食物液输入之后，时间为22.5、45、45min，输入完全后胃部消化液pH值在1.5左右。1h之后，用蠕动泵将胃消化液转移到小肠模拟器中同时输入小肠液，培养3个小时后全部转移到升结肠中。升结肠、横结肠、降结肠三个玻璃罐容量保持恒定，分别是500、800、500ml。整个模型通过充氮气来保持厌氧环境，每12h充氮气15min。食物添加及所有液体转移均通过恒流蠕动泵在时间控制器的控制下自动完成。

b、各项稳定参数的测定

(1)、微生物平板计数：目前本单位对SHIME模型中肠道微生物检测的种类有7种，分别是：总厌氧菌、总好氧菌、梭菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、乳酸杆菌。其中总好氧菌和总厌氧菌采用的培养基是由BD公司提供的脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)，梭菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、乳酸杆菌采用的培养基是由德国Merck KGaA公司生产的(Tryptose Sulfite Cysloserine，TSC)、(Mc-Conckey agar，MCC)、(Emterococcus agar)、(Mannistol SaltAgar，MSA)、(Rogosa agar)。

(2)、NH₄ ⁺的测定：作为微生物的代谢产物，NH₄ ⁺测定使用的是由

公司生产的蒸馏仪B-324和Metrohm公司生产的自动电位滴定仪702 SM Titriho。具体措施是取1ml模型消化液到蒸馏管中，然后加入40ml NaOH用蒸汽蒸馏5min，目的是使消化液中氨游离出来。蒸馏出的氨在管路的另一端用冷凝管冷凝，用硼酸吸收后在用硫酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来计算消化液中NH₄ ⁺的含量；

(3)、短链脂肪酸(SCFA)的测定：作为微生物的另一种代谢产物，SCFA也是衡量微生物活性的重要指标，需要的仪器包括HACH公司生产的离心管(16×100MM PK/6)和Eppendorf公司生产的高速冷冻离心机5804R。具体步骤为：取分析纯H₂SO₄∶H₂O＝1∶1溶液0.5ml加入到离心管中，在加入消化液2ml，之后加入NaCl 0.4g，在加入内标2-甲基乙酸1ml。向离心管中加入2ml乙醚萃取，最后3000rpm离心5min，上清液转移到样品瓶中冰箱保存待用。

(4)、气相色谱-氢火焰离子化检测器(GC-FID)检测

色谱仪条件及检测仪条件分别如下：色谱仪条件：FFAP(30m×0.25mm i.d.，0.25μm)毛细管柱；载气为氦气，恒流，柱流量为1.5ml/min，无分流进样，进样量为0.2μl；进样口温度220℃；柱始温70℃(1min)，15℃/min升至160℃，保持6min，30℃/min升至210℃，保持5min，总运行时间18.17min。

检测器条件：检测器温度250℃，氢气流量40ml/min，空气流量45ml/min。

本发明SHIME模型稳定后NH₄ ⁺、SCFA浓度情况参见表1。

本发明SHIME模型稳定后微生物含量情况参见表2。

表1.NH₄ ⁺、SCFA含量情况(单位：mg/ml)

表2.微生物计数情况(单位：log CFU/ml)

Claims (1)

1、一种在体外条件下重现人体胃肠道及微生态系统的模拟实验方法，其过程和步骤如下：

A、模型的建立

SHIME模型包括胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠五个玻璃罐，每个玻璃罐由一个带夹层的玻璃罐来存储消化液，每个玻璃罐夹层由塑料管相通并连接到37℃恒温水浴以达到恒温效果；胃和肠消化蠕动通过在每个玻璃罐下用磁力搅拌器进行搅拌加以模拟。在玻璃罐上端用有机玻璃密封，在玻璃中有若干个孔用于向玻璃罐中加入或取出消化液，胃和小肠部分的胃酸及小肠液即从该处通过自动控制自动加入；基于微生物的生长条件，与胃和小肠不同，大肠中三部分pH值通过pH值控制器采用HCL(0.5M)和NaOH(0.5M)溶液自动控制，升结肠、横结肠、降结肠pH值分别在5.6-5.9、6.1-6.4、6.6-6.9，玻璃罐中液体体积分别为500ml、800ml、500ml。通过蠕动转移每个玻璃罐之间消化液；模型采用的食物液成分包括：阿拉伯半乳聚糖、胶质、木聚糖、淀粉、葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、粘液素、半胱氨酸；胃酸成分包括：盐酸和胃蛋白酶；小肠液成分包括：胆汁盐、胰酶和碳酸氢钠；

B、人体粪便微生物的提取及接种

样品采集来自3-5名健康寄主，年龄在20-35岁，并且在过去的一年里未食用抗生素之类的药物；取粪便40g加入到200ml接种液(巯基乙酸钠-磷酸缓冲液0.1M)的接种袋中，用匀浆机拍打3min，静置10min取上层液在离心机中以1000rpm速度下离心10min，分别取50ml上清液接种到SHIME模型升结肠、横结肠和降结肠中；在加入的前24h为微生物稳定期，期间不加任何物质，在随后的2-3个星期为微生物适应期，最后才达到稳定；

C、模型的稳定及监护

a、模型周期性运转

胃模拟玻璃罐每天输入食物液3次，输入时间分别在6:00、12:00、18:00，时间分别为7.5、15、15min，每次输入量为100、100、200ml。胃液输入时间为每天食物液输入之后，时间为22.5、45、45min，输入完全后胃部消化液pH值在1.5左右。1h之后，用蠕动泵将胃消化液转移到小肠模拟器中同时输入小肠液，培养3个小时后全部转移到升结肠中；升结肠、横结肠、降结肠三个玻璃罐容量保持恒定，分别是500、800、500ml；整个模型通过充氮气来保持厌氧环境，每12h充氮气15min；食物添加及所有液体转移均通过恒流蠕动泵在时间控制器的控制下自动完成；

b、各项稳定参数的测定

(1)、微生物平板计数

目前本单位对SHIME模型中肠道微生物检测的种类有7种，分别是：总厌氧菌、总好氧菌、梭菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、乳酸杆菌。其中总好氧菌和总厌氧菌采用的培养基是由BD公司提供的脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)，梭菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、乳酸杆菌采用的培养基是由德国Merck KGaA公司生产的琼脂培养基，分别是：Tryptose Sulfite Cysloserine(TSC)、Mc-Conckey agar(MCC)、Emterococcus agar、Mannistol SaltAgar(MSA)、Rogosa agar；

(2)、NH₄ ⁺的测定

作为微生物的代谢产物，NH₄ ⁺测定使用的是由

公司生产的蒸馏仪B-324和Metrohm公司生产的自动电位滴定仪702SM Titriho。具体措施是取1ml模型中消化液到蒸馏管中，然后加入40ml NaOH用蒸汽蒸馏5min，用硼酸吸收后再用硫酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来计算消化液中NH₄ ⁺的含量；

(3)、短链脂肪酸(SCFA)的测定

作为微生物的另一种代谢产物，SCFA也是衡量微生物活性的重要指标，需要的仪器包括HACH公司生产的离心管(16×100MM PK/6)和Eppendorf公司生产的高速冷冻离心机5804R；具体步骤为：取分析纯H₂SO₄∶H₂O＝1∶1溶液0.5ml加入到离心管中，在加入消化液2ml，之后加入NaCl 0.4g，再加入内标2-甲基乙酸1ml。向离心管中加入2ml乙醚萃取，最后3000rpm离心5min，上清液转移到样品瓶中冰箱保存待用；

(4)、气相色谱-氢火焰离子化检测器(GC-FID)检测

色谱仪条件及检测仪条件分别如下：

色谱仪条件：FFAP(30m×0.25mm i.d.，0.25μm)毛细管柱；载气为氦气，恒流，柱流量为1.5ml/min，无分流进样，进样量为0.2μl；进样口温度220℃；柱始温70℃(1min)，15℃/min升至160℃，保持6min，30℃/min升至210℃，保持5min，总运行时间18.17min；

检测器条件：检测器温度250℃，氢气流量40ml/min，空气流量45ml/min。

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