CN111004740B - 一种快速稳定体外肠道菌群的基础营养液及其应用 - Google Patents

一种快速稳定体外肠道菌群的基础营养液及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速稳定体外肠道菌群的基础营养液及其应用。所述快速稳定体外肠道菌群的基础营养液，每升培养液中含有阿拉伯半乳聚糖1～3g/L，果胶2～5g/L，木聚糖1～3g/L，淀粉3～6g/L，葡萄糖1～2.5g/L，酵母提取物2.5～5.5g/L，蛋白胨1.5～3.5g/L，半胱氨酸0.5～2.5g/L，醋酸钠1～3g/L，丙酮酸钠1～3g/L，碳酸氢钠0.4～1.6g/L，吐温80 1～3ml/L。本发明的基础营养液可提高体外培养的肠道菌群的数量，提高其短链脂肪酸的产量，在10d就能稳定体外模拟的肠道菌群，在人体胃肠道模拟技术中，具有较大的应用前景。

Description

一种快速稳定体外肠道菌群的基础营养液及其应用
技术领域
本发明涉及肠道微生物技术领域，更具体地，涉及一种快速稳定体外肠道菌群的基础营养液及其制备方法和应用。
背景技术
用人体胃肠道模拟技术进行体外实验最开始是应用在营养学中，用于研究食物中金属元素的生物有效性，方法也是比较简单的采用盐酸溶液模拟胃液来浸提这些金属元素。由于人体消化系统的生理条件相当复杂，采取这样的方法并不能很好的反映胃肠道的真实情况。经过近30年的发展，针对人体胃肠道生理环境，目前国际上已经有了十多种相对较为成熟的方法，如：生理原理提取法(the physiologically based extraction test,PBET)、Rodriguez体外胃肠法(in vitro gastrointestinal method,IVG)、生物有效性简化提取法(simplified bioaccessibility exaction test,SBET)、荷兰公共卫生与环境国家研究院法(RIVM)、质量平衡与回收土壤法(mass balance&soil recapture method,MB&SR)、德国标准研究院法(DIN)、荷兰应用科学研究院胃肠法(TNO gastrointestinalmodel)等等。
作为一个复杂的微生态系统，正常人体结肠中微生物含量高达1012个，其种类超过500种，这些微生物与肠道内容物及其胃肠组织构成了一个非常复杂的系统，对人体生理、免疫和消化有着十分重要的作用，与此同时，由于微生物与寄主的相互作用，寄主之间的差异对肠道微生物种群也有重要影响。研究发现，肠道微生物形成的代谢产物可以为人体结肠上皮细胞提供能量，提高结肠的免疫能力并抵抗外源病原体 ，还可以为人体提供维生素K和B。肠道微生物的代谢活动对人体消化也有重要影响，在经过胃和小肠消化后，未被消化的物质在肠道微生物的作用下会被发酵，部分营养物质在大肠消化过程中被吸收。此外，外源性的化学物质进入人体大肠后在微生物的作用下，其物理化学性质会发生改变，绿色植物中的化学物质(如多酚、胶质)在结肠中生物有效性会增加，并且会形成更有营养价值的代谢产物，然而一些有机有毒物质进入到大肠中会形成毒性更高的代谢产物。一些重金属在结肠中也会有类似的变化，如Diaz-Bone等人研究发现锗、砷、硒、锡、锑、汞、铅等金属在肠道微生物的作用下会发生甲基化和羟基化作用，进而形成毒性更强的代谢产物。因此，研究人体肠道微生物对人体健康有着极为重要的意义。经过多年的发展，国际上已经有多种肠道微生物模拟系统，例如TIM模型，SHIME模型，SIMGI模型等。但是无论哪种系统，模拟器中的菌群稳定需要较长的时间，一般需要15～30d。这可能是与菌群所需要的营养物质有很大的关系，因此，需要提供一种能够更快稳定肠道模拟系统中菌群的营养液。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种快速稳定体外肠道菌群的基础营养液。
本发明的另一目的在于提供所述快速稳定体外肠道菌群的基础营养液的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种快速稳定体外肠道菌群的基础营养液，每升培养液中含有阿拉伯半乳聚糖1～3g/L，果胶2～5g/L，木聚糖1～3g/L，淀粉3～6g/L，葡萄糖1～2.5g/L，酵母提取物2.5～5.5g/L，蛋白胨1.5～3.5g/L，半胱氨酸0.5～2.5g/L，醋酸钠1～ 3g/L，丙酮酸钠1～3g/L，碳酸氢钠0.4～1.6g/L，吐温80 1～3ml/L。
本发明发现，无论是哪种肠道模型系统，模拟器中的菌群稳定需要较长的时间，一般需要15～30d。本发明研究发现这可能是与菌群培养的营养物质有很大的关系；本发明通过在现有常用的肠道菌群的基础营养液的基础上，通过严格控制醋酸钠和丙酮酸钠的添加量，从而提供了一种能够更快稳定肠道模拟系统中菌群的营养液，所述营养液可以提高体外培养的肠道菌群的数量、提高其短链脂肪酸的产量，在10d就能稳定体外模拟的肠道菌群。
优选地，每升培养液中含有阿拉伯半乳聚糖1～3g/L，果胶2～5g/L，木聚糖1～3g/L，淀粉3～6g/L，葡萄糖1～2.5g/L，酵母提取物2.5～5.5g/L，蛋白胨1.5～3.5g/L，半胱氨酸0.5～2.5g/L，醋酸钠1g/L，丙酮酸钠1g/L，碳酸氢钠0.4～1.6g/L，吐温80 1～3ml/L。
优选地，每升培养液中含有阿拉伯半乳聚糖1g/L，果胶2g/L，木聚糖1g/L，淀粉3g/L，葡萄糖1g/L，酵母提取物2.5g/L，蛋白胨1.5g/L，半胱氨酸0.5g/L，醋酸钠1g/L，丙酮酸钠1g/L，碳酸氢钠0.4g/L，吐温80 1ml/L。
上述任一所述的基础营养液在快速稳定体外肠道菌群中的应用，通过使用上述任一所述的基础营养液在体外进行肠道菌群的培养，可以快速稳定肠道菌群。
具体地，为上述任一所述基础营养液在快速稳定肠道模拟系统中菌群中的应用。
优选地，所述菌群为总厌氧菌(Total anaerobes)、梭菌(Clostridia)、葡萄球菌(Staphylococci)、总好氧菌(Total aerobes)、大肠杆菌(E.coli)、肠球菌 (Enterococci)或乳酸杆菌(Lactobacilli)中的一种或多种。
优选地，所述肠道模拟系统为SHIME模型。
具体地，是将上述任一所述的基础营养液分别添加到肠道模拟系统的升结肠、横结肠和降结肠中，控制升结肠、横结肠和降结肠pH值分别在5.3～5.7、6.2～ 6.5和6.3～6.8之间变化，然后加入肠道微生物进行厌氧培养。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种快速稳定体外肠道菌群的基础营养液，在现有的基础营养液的基础上，通过控制营养液中醋酸钠和丙酮酸钠和含量，从而提供了一种能够更快稳定肠道模拟系统中菌群的营养液，所述营养液可以显著提高体外培养的肠道菌群的数量、提高其短链脂肪酸的产量，在10d就能稳定体外模拟的肠道菌群，较现有的稳定时间缩短近一半，对于人体胃肠道模拟技术中，具有较大的应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
1、基础营养液的配置
每升基础营养液中含阿拉伯半乳聚糖1.0g，果胶2.0g，木聚糖1.0g，淀粉 3.0g，葡萄糖1.0g，酵母提取物2.5g，蛋白胨1.5g，半胱氨酸0.5g，醋酸钠1.0g，丙酮酸钠1.0g，碳酸氢钠0.4g，吐温80 1mL，余量为水。
基础营养液配置方法：准备干净的1.5L蓝盖试剂瓶，用量筒加入200mL蒸馏水，然后加入阿拉伯半乳聚糖1.0g，摇匀；加入果胶2.0g，摇匀；加入木聚糖 1.0g，摇匀；然后放在具有加热功能的磁力搅拌器上，称量3.0g淀粉放入蓝盖试剂瓶中，变加热边搅拌，直到淀粉完全溶解，此时再加入200mL蒸馏水到试剂瓶中，停止加热和搅拌；然后把基础营养液配方中剩余的试剂按照需求量逐次加入，并用蒸馏水定容至1L。
2、在SHIME模型中测试上述基础营养液对肠道菌群的稳定效果
SHIME模型包括胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠五个反应器，每个反应器由一个带夹层的玻璃罐存储消化液，反应器之间夹层由硅胶管连接，并与 37℃恒温水浴连通。每8h向模型胃消化反应器中投加200mL食物液，在胃和小肠反应器消化过程中分别加入胃酸和小肠液，用磁力搅拌器搅拌模拟人体肠道的蠕动。胃反应器中食物液和胃酸完全混合后pH值为1.5±0.1。胃中消化2h 之后，用蠕动泵将胃中液体转移到小肠中，在1h内加入小肠液100mL，完全混合后pH值为7.0±0.1，混合消化3h转移到结肠。基于微生物的生长条件，结肠中pH值采用控制器通过自动添加HCl(0.5mol/L)或NaOH(0.5mol/L) 溶液控制，升结肠、横结肠和降结肠pH值分别在5.3～5.7、6.2～6.5和6.3～6.8 之间变化，三个反应器中基础培养液体体积分别控制在500mL、800mL和500 mL。各个反应器之间消化液通过蠕动泵转移，每天向反应器通2次氮气，每次 15min以维持厌氧环境。
肠道微生物采自3名健康寄主，年龄在25～30岁，并且在过去的一年里未食用抗生素类药物。将3名寄主粪便等量混合，取40g加入到200mL巯基乙酸钠–磷酸缓冲液(0.1mol/L)，用匀浆机拍打匀浆3min，静置10min取上层液以1000rpm速度下离心10min，分别取50mL上层液接种到SHIME模型升结肠、横结肠和降结肠中。仪器定时自动添加食物液、胃液和小肠液，建立可以随时提取人体大肠微生物的微生态系统。24h后启动SHIME模型并定期加入食物液，每隔5天取样一次，以菌群的计数和脂肪酸的产量来衡量效果，1个月后，结束本批次实验，三次重复。
同时，以下述基础营养液配方作为对照1：每升基础营养液中含阿拉伯半乳聚糖1.0g，果胶2.0g，木聚糖1.0g，淀粉3.0g，葡萄糖1.0g，酵母提取物2.5g，蛋白胨1.5g，半胱氨酸0.5g，醋酸钠0.5g，丙酮酸钠0.6g,碳酸氢钠0.4g，吐温 80 1ml，余量为水。配置方法同上。
(1)微生物平板计数
微生物生长培养基均购自BD公司或Merck KGaA公司。本发明所分析的微生物共有7类：总厌氧菌(Total anaerobes)、梭菌(Clostridia)、葡萄球菌 (Staphylococci)、总好氧菌(Total aerobes)、大肠杆菌(E.coli)、肠球菌 (Enterococci)、乳酸杆菌(Lactobacilli)。
微生物培养：从SHIME模型(升结肠、横结肠、降结肠)各取样品1mL，用经高压灭菌后的生理盐水(NaCl 8.3g/L)逐级稀释，每次稀释10倍。在3种稀释倍数中各取0.1mL接种到培养基中，其中好氧微生物采用涂布法接种；厌氧微生物采用稀释倒平面法，具体方法为：将菌液加入培养皿中，再倒入培养基 (约占培养皿体积的2/5)，按8字形将菌液振荡混匀，培养基冷却、凝固后将培养皿倒扣置于厌氧罐中，将厌氧罐用有机玻璃板密封后再用充氮除氧装置排除厌氧罐中氧气，所有微生物均在恒温培养箱37℃避光培养。检测的微生物和使用的培养基如下：总厌氧菌检测使用脑心浸液培养基；梭菌检测使用胰蛋白亚硫酸盐环丝氨酸琼脂；大肠杆菌检测使用马康奇氏培养基；肠球菌检测使用叠氮钠琼脂M；葡萄球菌检测使用甘露糖琼脂；乳酸杆菌检测使用乳酸菌选择琼脂培养基。
不同培养天数下，升结肠、横结肠、降结肠中肠道菌群的生长状况如表1～表3所示：
表1不同培养天数下升结肠中肠道菌群的生长状况(CFU/ml，三次重复)
Figure BDA0002297237040000051
Figure BDA0002297237040000061
表2不同培养天数下降结肠中肠道菌群的生长状况(三次重复)
Figure BDA0002297237040000071
Figure BDA0002297237040000081
表3不同培养天数下横结肠中肠道菌群的生长状况(三次重复)
Figure BDA0002297237040000082
Figure BDA0002297237040000091
(2)脂肪酸的产量计算
短链脂肪酸(Short chain fat acid,SCFA)的测定方法：取H2SO4(分析纯)： H2O＝1：1(v/v)溶液0.5mL加入到离心管中，再加入2mL结肠消化液样品，之后加入0.4g NaCl，完全溶解后再加入1mL内标化合物2-甲基乙酸(0.685 mg/mL)。用2mL乙醚萃取，最后以3000rpm离心5min，上清液转移到样品瓶中冰箱保存待用。Agilent气相色谱－氢火焰离子化检测器(GC-FID)检测。检测条件：FFAP(30m×0.25mm i.d.,0.25μm；Agilent)毛细管柱；载气为氦气，恒流，柱流量为1.5mL/min；无分流进样，进样量为0.2μL；进样口温度220℃；柱始温70℃(1min)，15℃/min升至160℃，保持6min，30℃/min升至210℃，保持5min。
不同培养天数下，升结肠、横结肠、降结肠中肠道菌群的短链脂肪酸的产量如表4～表6所示：
表4不同培养天数下，升结肠中肠道菌群的短链脂肪酸产量(μg/ml，三次重复)
Figure BDA0002297237040000101
Figure BDA0002297237040000111
表5不同培养天数下，横结肠中肠道菌群的短链脂肪酸产量(μg/ml，三次重复)
Figure BDA0002297237040000112
表6不同培养天数下，降结肠中肠道菌群的短链脂肪酸产量(μg/ml，三次重复)
Figure BDA0002297237040000113
Figure BDA0002297237040000121
从表1～3，表4～6所述结果可以看出，实施例1的基础营养液较现有的基础营养液，菌群数量(升结肠>横结肠>降结肠)和短链脂肪酸产量显著增加，在 10d就能稳定体外模拟的肠道菌群，较现有的基础营养液缩短近一半时间。
实施例2
1、基础营养液的配置
每升基础营养液中含阿拉伯半乳聚糖3.0g，果胶5.0g，木聚糖3.0g，淀粉 6.0g，葡萄糖2.5g，酵母提取物5.5g，蛋白胨3.5g，半胱氨酸2.5g，醋酸钠3.0g，丙酮酸钠3.0g，碳酸氢钠1.6g，吐温80 3mL，余量为水。配置方法同实施例1
2、在SHIME模型中测试上述基础营养液对肠道菌群的稳定效果
方法同实施例1。
结果显示，实施例2的基础营养液较现有的基础营养液，菌群数量和短链脂肪酸产量显著增加，在10d就能稳定体外模拟的肠道菌群，较现有的基础营养液缩短近一半时间。
实施例3
1、基础营养液的配置
每升基础营养液中含阿拉伯半乳聚糖2.0g，果胶3.5g，木聚糖2.0g，淀粉 4.5g，葡萄糖1.75g，酵母提取物4.0g，蛋白胨2.5g，半胱氨酸1.5g，醋酸钠2.0g，丙酮酸钠2.0g，碳酸氢钠0.8g，吐温80 2mL，余量为水。配置方法同实施例1
2、在SHIME模型中测试上述基础营养液对肠道菌群的稳定效果
方法同实施例1。
结果显示，实施例2的基础营养液较现有的基础营养液，菌群数量和短链脂肪酸产量显著增加，在10d就能稳定体外模拟的肠道菌群，较现有的基础营养液缩短近一半时间。
对照例
对照2：每升基础营养液中含阿拉伯半乳聚糖1.0g，果胶2.0g，木聚糖1.0g，淀粉3.0g，葡萄糖1.0g，酵母提取物2.5g，蛋白胨1.5g，半胱氨酸0.5g，醋酸钠 1.0g，醋酸钠1.0g，碳酸氢钠0.4g，吐温80 1ml。
对照3：每升基础营养液中含阿拉伯半乳聚糖1.0g，果胶2.0g，木聚糖1.0g，淀粉3.0g，葡萄糖1.0g，酵母提取物2.5g，蛋白胨1.5g，半胱氨酸0.5g，丙酮酸钠1.0g,碳酸氢钠0.4g，吐温80 1ml。
在SHIME模型中测试上述对照例2和对照例3所述基础营养液对肠道菌群的稳定效果，试验方法同实施例1。不同培养天数下肠道菌群的生长状况如表7～ 9所示；不同培养天数下，肠道菌群的短链脂肪酸产量如表10～12。
升结肠
表7不同培养天数下升结肠中肠道菌群的生长状况(CFU/ml，三次重复)
Figure BDA0002297237040000131
Figure BDA0002297237040000141
Figure BDA0002297237040000151
表8不同培养天数下降结肠中肠道菌群的生长状况(CFU/ml，三次重复)
Figure BDA0002297237040000152
Figure BDA0002297237040000161
表9不同培养天数下横结肠中肠道菌群的生长状况(CFU/ml，三次重复)
Figure BDA0002297237040000162
Figure BDA0002297237040000171
Figure BDA0002297237040000181
表10不同培养天数下，升结肠中肠道菌群的短链脂肪酸产量(μg/ml，三次重复)
Figure BDA0002297237040000182
表11不同培养天数下，横结肠中肠道菌群的短链脂肪酸产量(μg/ml，三次重复)
Figure BDA0002297237040000191
表12不同培养天数下，降结肠中肠道菌群的短链脂肪酸产量(μg/ml，三次重复)
Figure BDA0002297237040000192
Figure BDA0002297237040000201
从表7～9，表10～12可以看出，经对照2和对照3营养液培养处理后的肠道菌群数量和短链脂肪酸产量较实施例1都显著降低，且较对照例1也显著降低，表明醋酸钠和丙酮酸钠的添加含量对于快速稳定体外肠道菌群具有重要作用。综上，本发明通过控制营养液中醋酸钠和丙酮酸钠和含量，从而提供了一种能够更快稳定肠道模拟系统中菌群的营养液，所述营养液可以提高体外培养的肠道菌群的数量、提高其短链脂肪酸的产量，在10d就能稳定体外模拟的肠道菌群，较现有的稳定时间缩短近一半，对于人体胃肠道模拟技术中，具有较大的应用前景。

Claims (7)

1.一种快速稳定体外肠道菌群的基础营养液，其特征在于，每升培养液由以下组分组成：阿拉伯半乳聚糖1～3g/L，果胶2～5g/L，木聚糖1～3g/L，淀粉3～6g/L，葡萄糖1～2.5g/L，酵母提取物2.5～5.5g/L，蛋白胨1.5～3.5g/L，半胱氨酸0.5～2.5g/L，醋酸钠1g/L，丙酮酸钠1g/L，碳酸氢钠0.4～1.6g/L，吐温80 1～3ml/L。
2.根据权利要求1所述的基础营养液，其特征在于，每升培养液由以下组分组成：阿拉伯半乳聚糖1 g/L，果胶2 g/L，木聚糖1 g/L，淀粉3 g/L，葡萄糖1 g/L，酵母提取物2.5 g/L，蛋白胨1.5 g/L，半胱氨酸0.5 g/L，醋酸钠1 g/L，丙酮酸钠1 g/L，碳酸氢钠0.4 g/L，吐温80 1 ml/L。
3.权利要求1或2所述的基础营养液在快速稳定体外肠道菌群中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，为在快速稳定肠道模拟系统中菌群中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述菌群为总厌氧菌和/或总好氧菌，其中包括：梭菌、葡萄球菌、大肠杆菌、肠球菌或乳酸杆菌中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肠道模拟系统为SHIME模型。
7.根据权利要求4或6所述的应用，其特征在于，将基础营养液分别添加到肠道模拟系统的升结肠、横结肠和降结肠中，然后加入肠道微生物进行培养。
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