一种人体胃-小肠道消化模拟方法及装置
技术领域
本发明属于仿生学技术领域,涉及一种人体胃肠道消化模拟装置及基于该装置的模拟实验方法,具体涉及一种离体条件下模拟人体胃肠道环境条件和食物消化过程及基于该系统模拟消化的方法。
背景技术
食物和药物在人体胃肠道的消化是一个复杂的过程,涉及化学、酶和机械作用。消化过程决定食物的可利用性、饱腹感产生、药物释放效率、微生物存活性或灭活,以及食源有毒物质转化和释放。因此,食品和药物的消化过程评价在营养学、食品科学、微生物学、药理、毒理和生物技术领域的基础研究和产品开发中具有广泛应用价值。但是,复杂消化过程的研究在技术上十分困难,费用很高,也受到严格伦理限制。替代研究方法包括动物模型和人工消化系统。在目前已有的动物模型中,猪被认为是模拟人体上消化道(胃和小肠)的最佳动物。通常通过两种方式研究食物在猪胃肠道内的消化过程,一种是在摄食后的特定时间将猪宰杀,另一种则是在猪身上安插针头和导管。尽管动物与人体存在生理相关性,但受限于伦理、技术及个体差异性,体内试验不能持续进行。同时,模型动物消化系统与人体存在差异。例如在研究婴儿消化时,裂齿类动物消化系统发育程度类似于人体早产儿,而仔猪消化系统远比足月儿发达,影响其研究结果在人体中的应用。此外,发达国家限制动物研究应用,随着我国动物伦理体系的逐渐完善,动物模型在消化研究方面的应用也将逐渐受到限制。与体内研究相比,体外技术省时、省力、灵活、成本低、重复性好、无个体差异影响,因此近年来得到了广泛关注和应用。
目前,体外静态系统已广泛应用于食品的消化研究中。这些模型由1个或多个生物反应器构成,模拟了消化道不同区段的环境。在每个反应器(口、胃、十二指肠等)内,pH值、离子强度和消化酶浓度都是固定的,如科学家Porter等人在2007年开发出的pH-stat法就是通过在反应过程中不断用碱液中和释放出的脂肪酸的方法,保证整个反应体系pH的稳定,进而尽可能的接近食物在小肠内的消化环境。虽然这类静态模型非常简单,也方便使用,但是并没有考虑肠道理化条件的动态变化以及食物在不同消化道间的流动。因此,科学家们又陆续开发了几种不同的体外动态消化系统,比如由荷兰组织(TNO)开发的TIM系统,该系统可以实现食物摄入、消化液分泌,食物蠕动和排空以及温度和pH值的实时调控。另外一种系统是肠道微生态模拟器(SHIME)。这两种模拟装置非常有用,但这种系统的胃和小肠部分也是静态消化模型,没有考虑胃和小肠消化过程内容物的动态转运和消化液动态释放,同时,其价格非常昂贵,难以在一般实验室普及。
综上,现有的涉及人体消化模拟的相关研究仍存在一些局限性:1)未考虑肠道理化条件的动态变化,尤其是胃部pH的实时动态变化;2)未考虑食物在不同消化道之间的实时流动,包括胃排空和肠转运过程;3)未根据人群特点进行对应参数的调整,包括早产儿、足月儿、成人和老人等各类人群。因此,仍需要一套简单的、易清洗的、能动态运作的体外消化模拟模型。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊,而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述现有人体胃-小肠道消化模拟方法及装置存在的问题,提出了本发明。
因此,作为本发明的一个方面,本发明目的是提供一种人体胃-小肠道消化模拟方法。
为解决上述技术问题,本发明提供如下技术方案:一种人体胃-小肠道消化模拟方法,其包括,
模拟排空滞留阶段:保持模拟胃消化室和模拟小肠消化室温度在36~38℃,模拟胃初始pH值,模拟空腹胃,模拟小肠消化室的pH值,模拟空腹小肠,在模拟胃消化室中加入待消化物,搅拌混合,向所述模拟胃消化室添加人工胃液,同时通过实时控制pH值模拟不同人群胃内容物的pH值,所述不同人群包括婴儿、成人及老人;
模拟胃排空阶段:控制所述模拟胃消化室的剩余内容物的体积符合Elashoff模型,公式为:
其中,t为从消化起始到计算时的时间,T1/2为一半食物被排空所需的时间,f为t时刻模拟胃中剩余的食物量,β为Elashoff曲线的形状系数;
模拟小肠转运阶段:向所述模拟小肠消化室加入人工胰液,同时加入人工胆汁,同时,控制所述模拟小肠消化室的剩余内容物体积符合Elashoff模型,从而实现模拟小肠转运过程。
作为本发明所述人体胃-小肠道消化模拟方法的一种优选方案,其中,所述模拟排空滞留阶段,所述通过pH值控制模拟不同人群胃内容物的pH值,为使所述pH值符合拟合公式,其中,所述拟合公式,婴儿为pH=0.1464t+3.52,成人为pH=0.0005t2-0.079t+4.47,老人为pH=0.1t+5.7,所述t为从消化起始到计算时的时间,所述添加人工胃液的添加速度为0~2mL/min。
作为本发明所述人体胃-小肠道消化模拟方法的一种优选方案,其中,所述模拟排空滞留阶段的时间为0~100min,所述模拟胃初始pH值,为调节模拟胃初始pH值为1.5~6.5,所述模拟空腹胃的内容物体积为1~200mL,所述模拟小肠消化室的pH值为5.5~6.5,所述模拟空腹小肠的内容物体积为5~200mL,所述加入待消化物,所述待消化物为一次性加入或在所述模拟排空滞留阶段逐渐加入。
作为本发明所述人体胃-小肠道消化模拟方法的一种优选方案,其中,所述人体胃-小肠道消化模拟方法,其中,模拟一餐消化时间待消化物的总滞留时间为1~8h;所述Elashoff模型,其中,所述T1/2为20~100min,所述β值为0.1~2.0。
作为本发明所述人体胃-小肠道消化模拟方法的一种优选方案,其中,所述模拟小肠转运阶段,其中,所述加入人工胰液,加液速度为0~1mL/min,所述加入人工胆汁,其中,模拟婴儿时,加液速度为0~1mL/min,模拟成人和老人时,加液速度为0~1mL/min或使加液速度分双阶段控制,第一阶段加液速度为0~2mL/min,第二阶段为0~0.5mL/min。
作为本发明所述人体胃-小肠道消化模拟方法的一种优选方案,其中,所述人工胃液的组成为:KCl为0~5g/L,KH2PO4为0~1g/L,NaHCO3为0~2g/L,NaCl为0~5g/L,MgCl2为0~1g/L,NH4Cl为0~1g/L,尿素为0~1g/L,浓HCl为6ml/L,猪胃粘膜胃蛋白酶为1000~2,000,000U/L,兔胃脂酶/角质酶为1000~100,000U/L,pH值为0.1~3;
所述人工胰液的组成为:KCl为0~1g/L,KH2PO4为0~1g/L,NaHCO3为0~10g/L,NaCl为0~5g/L,MgCl2为0~1g/L,尿素为0~1g/L,胰蛋白酶为100~100,000U/L,糜蛋白酶为100~100,000U/L,胰脂肪酶为100~100,000U/L,pH值为7~8.5;
所述人工胆汁的组成为:KCl为0~1g/L,KH2PO4为0~5g/L,NaHCO3为0~5g/L,NaCl为0~5g/L,MgCl2为0~1g/L,NaH2PO4为0~10g/L,尿素为0~1g/L,甘氨脱氧胆酸盐为0~10g/L,牛磺胆酸钠为0~10g/L,pH为7~8.5。
作为本发明的一个方面,本发明目的是提供一种人体胃-小肠道消化的模拟装置。
为解决上述技术问题,本发明提供如下技术方案:一种人体胃-小肠道消化的模拟装置,其包括,胃消化模拟单元:包括胃液模拟区及胃消化及蠕动模拟区,所述胃液模拟区与所述胃消化及蠕动模拟区连接;小肠消化模拟单元:包括小肠消化液模拟区及小肠消化及蠕动模拟区,所述胃消化及蠕动模拟区与所述小肠消化液模拟区连接,所述小肠消化液模拟区与所述小肠消化及蠕动模拟区连接;系统控制单元:所述系统控制单元与所述胃消化模拟单元及小肠消化模拟单元连接,能够实现pH的实时调节及控制模拟胃液或小肠消化液的流速,从而模拟胃液、胰液和胆汁的分泌,胃排空以及肠转运过程。
作为本发明所述人体胃-小肠道消化模拟装置的一种优选方案,其中,所述胃液模拟区包括胃液试剂瓶,盐酸试剂瓶及氢氧化钠试剂瓶,所述胃消化及蠕动模拟区包括模拟胃消化室,磁力搅拌器,pH计以及恒温循环水浴锅,所述胃液试剂瓶,盐酸试剂瓶及氢氧化钠试剂瓶通过蠕动泵及硅胶管与所述模拟胃消化室连接;所述小肠消化液模拟区包括胰液试剂瓶,胆汁试剂瓶,盐酸试剂瓶及氢氧化钠试剂瓶,所述小肠消化及蠕动模拟区包括模拟小肠消化室,磁力搅拌器,pH计以及恒温循环水浴锅,所述胰液试剂瓶,胆汁试剂瓶,盐酸试剂瓶及氢氧化钠试剂瓶通过蠕动泵以及硅胶管与所述模拟小肠消化室连接;所述胃消化室通过蠕动泵及硅胶管与所述模拟小肠消化室连接,所述系统控制单元通过数据线连接所述胃消化模拟单元及小肠消化模拟单元,能够实现pH的实时调节及控制模拟胃液或小肠消化液的流速,所述系统控制单元能够输出pH的实时动态曲线;所述模拟胃消化室及模拟小肠消化室均为玻璃夹层罐,夹层为水浴层,夹层外侧的进出接口通过硅胶管与循环水浴锅连接,实现对胃肠温度环境的模拟,夹层罐上方设有开口,开口处安插pH计及硅胶管,所述模拟胃消化室及模拟小肠消化室内投放磁力搅拌转子,通过磁力搅拌器,不断旋转,带动消化液流动,实现对胃肠蠕动的模拟。
作为本发明所述人体胃-小肠道消化模拟装置的一种优选方案,其中,还包括,废液收集及清洗系统,所述废液收集及清洗系统包括蠕动泵及收集瓶,所述收集瓶通过蠕动泵及硅胶管与所述模拟小肠消化室,所述系统控制单元通过数据线控制废液的收集及清洗。
本发明的有益效果:本发明实现了对胃及小肠消化室pH值的实时动态调控,同时能够输出pH动态曲线;通过实时调控胃排空和肠转运的速度,实现了食物在不同消化道之间的实时流动;更真实、全面的模拟了人胃-小肠道的消化状态和环境;本发明能够实现对不同人群体外消化过程的模拟,包括早产儿、足月儿、成人和老人等各类人群;本发明在人工胃液中使用兔胃脂酶或角质酶,更真实的模拟人胃脂酶。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。其中:
图1为早产儿体外消化过程中胃和小肠内内容物体积变化情况图。
图2为早产儿母乳中初始酯化脂肪酸组成及体外胃肠道消化过程中释放的游离脂肪酸组成图。
图3为β-乳球蛋白、α-乳白蛋白及乳铁蛋白在老人体外动态消化过程中消化物的SDS-PAGE的分析结果图。
图4为β-乳球蛋白、α-乳白蛋白及乳铁蛋白在成人体外动态消化过程中消化物的SDS-PAGE的分析结果图。
图5为牛乳脂在静态和动态胃部模型消化过程中的水解情况图。
图6为人体胃-小肠道消化模拟装置的示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广,因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次,此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1:早产儿消化母乳甘油三酯的动态分析
溶液配制:
人工胃液:称取酶活为8,600U兔胃脂肪酶和酶活为120,000U猪胃粘膜胃蛋白酶加入到100mL胃电解质溶液中,胃电解质溶液的配制:称取6.9gNaCl、0.73gKCl、0.12gMgCl2(H2O)6、0.05gNH4Cl、0.01g尿素和0.1gCaCl2(H2O)2,溶于800mL去离子水中,用0.15M HCl调节pH至6.5,最后定容至1L。4℃冰箱存放。
人工胰液:称取一定量猪胰酶(含胰蛋白酶、糜蛋白酶和胰脂肪酶),使其中酶活为5900U猪胰脂肪酶加入100mL小肠电解质溶液中,小肠电解质溶液的配制:称取8.2gNaCl、4.6gCaCl2、0.3gKCl、0.06g0.12gMgCl2·6H2O、0.11g尿素和0.2gCaCl2(H2O)2,溶于800ml去离子水中,用0.15M HCl调节pH至6.2,最后定容至1L。4℃冰箱存放。
人工胆汁液:称取0.66g脱氧胆酸钠和0.86g牛磺胆酸钠加入100mL小肠电解质溶液中,加入0.33gNaH2PO4(H2O)2和1.1gCaCl2(H2O)2,用0.15M HCl和5M NaOH调节pH到6.2。
模拟婴幼儿胃肠道消化过程:
模拟过程采用本发明的人体胃-小肠道消化的模拟装置,胃液试剂瓶101a-1、盐酸试剂瓶101a-2及氢氧化钠试剂瓶101a-3通过蠕动泵101b-1~101b-4及硅胶管与模拟胃消化室102a连接;胰液试剂瓶201a-1,胆汁试剂瓶201a-2,盐酸试剂瓶101a-2及氢氧化钠试剂瓶101a-3通过蠕动泵201b-1~201b-4以及硅胶管与模拟小肠消化室202a连接;胃消化室102a通过蠕动泵101b-4及硅胶管与模拟小肠消化室202a连接;系统控制单元300通过数据线连接胃消化模拟单元100及小肠消化模拟单元200,实现pH的实时调节及控制模拟胃液或小肠消化液的流速,系统控制单元100输出pH的实时动态曲线;模拟胃消化室102a及模拟小肠消化室202a均为玻璃夹层罐,夹层为水浴层,夹层外侧的进出接口通过硅胶管与循环水浴锅102c连接,实现对胃肠温度环境的模拟,夹层罐上方设有开口,开口处安插pH计102d,202d及硅胶管,模拟胃消化室102a及模拟小肠消化室202a内投放磁力搅拌转子,通过磁力搅拌器102b,202b不断旋转,带动消化液流动,实现对胃肠蠕动的模拟;废液收集瓶402通过蠕动泵401及硅胶管与模拟小肠消化室202a,系统控制单元300通过数据线控制废液的收集及清洗。
开启恒温水浴锅102c,调节温度至37℃,开启蠕动泵,使模拟胃消化室102a和模拟小肠消化室202a温度恒定在37℃;在两个消化室中加入磁搅拌转子,调节磁力搅拌器102b,202b为间歇模式,转速100rpm;在模拟胃消化室102a中一次性加入100mL早产儿母乳,进入10min的排空滞留阶段,开启蠕动泵,控制模拟胃消化室102a的pH实时变化,符合拟合公式,pH=0.1464t+3.52,控制所述模拟胃消化室的剩余内容物的体积符合Elashoff模型,将模拟小肠消化室202a的pH维持在6.2,开启胃液蠕动泵,控制流体速度分别为1mL/min;进入排空运行阶段,调节胃液泵的加液速度至0.5mL/min,开启盐酸试剂瓶101a-2及氢氧化钠试剂瓶101a-3,使加液速度分别保持在0.25mL/min和0.5mL/min,开启胃排空和肠转运蠕动泵101b-4,模拟胃排空和肠转运过程;整个消化过程持续3h。获取模拟胃消化室102a分别在15、30、60、90min的消化物样本,获取模拟小肠消化室202a在15、30、60、90、120min的消化物样本,取出样本后第一时间加入6M的浓盐酸灭酶,并通过氨水-乙醇法提取脂质,于-20℃存放直至进一步分析。通过薄层色谱法分类游离脂肪酸,将获得的游离脂肪酸采用硫酸-甲醇法进行甲酯化,并采用GC-FID进行检测。
图1显示了早产儿体外消化过程中胃和小肠内里理论和实际内容物体积变化情况,由结果可知,本发明能够准确地模拟早产儿消化食物时的胃排空和肠转运过程。
图2显示了早产儿母乳初始酯化脂肪酸组成及体外消化过程中释放出的脂肪酸组成的对比情况。该研究采用母乳的主要脂肪酸为C18:1c9,C16:0,C18:2c9,c12,C18:0和C14:0。在胃和肠道两个消化阶段,脂解的主要产物是C18:1c9和C16:0,其次是C18:0和C18:2c9,c12。
实施例2:老人消化蛋白质的动态分析
溶液配制:
人工胃液:称取酶活为8,400U兔胃脂肪酶和酶活为75,000U猪胃粘膜胃蛋白酶加入到100mL胃电解质溶液中,胃电解质溶液的配制:称取6.9gNaCl、0.73gKCl、0.12gMgCl2(H2O)6、0.05gNH4Cl、0.01g尿素和0.1g CaCl2(H2O)2,溶于800mL去离子水中,用0.15M HCl调节pH至6.5,最后定容至1L。4℃冰箱存放。
人工胰液:称取一定量猪胰酶(含胰蛋白酶为、糜蛋白酶和胰脂肪酶),使其中酶活为4600U胰蛋白酶加入100mL小肠电解质溶液中,小肠电解质溶液的配制:称取8.2gNaCl、4.6gCaCl2、0.3gKCl、0.06g0.12gMgCl2·6H2O、0.11g尿素和0.2gCaCl2(H2O)2,溶于800ml去离子水中,用0.15M HCl调节pH至6.2,最后定容至1L。4℃冰箱存放。
人工胆汁液:称取0.13g甘氨脱氧胆酸钠和0.14g牛磺胆酸钠加入100mL小肠电解质溶液中,加入0.33gNaH2PO4(H2O)2和1.1g CaCl2(H2O)2,用0.15M HCl和5MNaOH调节pH到6.5。
配制蛋白溶液:使用双蒸馏水制备2.5%的蛋白质溶液(pH7.0),包括乳铁蛋白、β-乳球蛋白和乳白蛋白。
模拟老人胃肠道消化过程:
模拟过程采用本发明的人体胃-小肠道消化的模拟装置,胃液试剂瓶101a-1、盐酸试剂瓶101a-2及氢氧化钠试剂瓶101a-3通过蠕动泵101b-1~101b-4及硅胶管与模拟胃消化室102a连接;胰液试剂瓶201a-1,胆汁试剂瓶201a-2,盐酸试剂瓶101a-2及氢氧化钠试剂瓶101a-3通过蠕动泵201b-1~201b-4以及硅胶管与模拟小肠消化室202a连接;胃消化室102a通过蠕动泵101b-4及硅胶管与模拟小肠消化室202a连接;系统控制单元300通过数据线连接胃消化模拟单元100及小肠消化模拟单元200,实现pH的实时调节及控制模拟胃液或小肠消化液的流速,系统控制单元100输出pH的实时动态曲线;模拟胃消化室102a及模拟小肠消化室202a均为玻璃夹层罐,夹层为水浴层,夹层外侧的进出接口通过硅胶管与循环水浴锅102c连接,实现对胃肠温度环境的模拟,夹层罐上方设有开口,开口处安插pH计102d,202d及硅胶管,模拟胃消化室102a及模拟小肠消化室202a内投放磁力搅拌转子,通过磁力搅拌器102b,202b不断旋转,带动消化液流动,实现对胃肠蠕动的模拟;废液收集瓶402通过蠕动泵401及硅胶管与模拟小肠消化室202a,系统控制单元300通过数据线控制废液的收集及清洗。
开启恒温水浴锅102c,调节温度至37℃,开启蠕动泵,使模拟胃消化室102a和模拟小肠消化室202a温度恒定在37℃;在两个消化室中加入磁搅拌转子,调节磁力搅拌器102b,202b为间歇模式,转速100rpm;在模拟胃消化室102a中加入40mL牛奶和60mL人工胃液,在模拟小肠消化室202a中加入10mL人工胰液和3.35mL人工胆汁液,进入5min的排空滞留阶段,开启蠕动泵,控制模拟胃消化室102a的pH实时变化,符合拟合公式,pH=0.1t+5.7,控制所述模拟胃消化室的剩余内容物的体积符合Elashoff模型,将模拟小肠消化室202a的pH维持在6.5,开启胆汁泵,控制流体速度为0.67mL/min;进入排空运行阶段,调节胆汁泵速度为0.0087mL/min,开启胃排空蠕动泵101b-4,整个消化过程持续3h。获取胃消化室0,6,10,30,60,120min,180min的消化物样本,小肠消化室15,30,60,120,180min的消化物样本,于-20℃存放直至进一步分析。通过SDS-PAGE对消化物样本中的蛋白质降解和肽谱进行定性评价。
在老年人体外消化过程中,胃部对β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和乳铁蛋白的水解作用较弱,而肠道对这三种蛋白质的水解作用较强,尤其,β-乳球蛋白较其他两种蛋白质更易被消化。此外,胃消化物和十二指肠消化物中出现了高分子量条带(分子量>70kDa)。这些蛋白条带可能是某些蛋白质的聚合物,因为胃部的初始pH值为5.9,与β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的PI(4.5<pH<5.5)接近。对于乳铁蛋白,这种聚集可能是离子强度和pH值共同作用的结果,这种环境将乳铁蛋白的PI调整到6.0。对应地,随着十二指肠(pH恒定在6.5)消化的进行,蛋白质聚集体形成的高分子量带逐渐变淡。由图3结果可见,老年人体外消化过程与理论上接近,本发明成功模拟了老人体外消化过程。
实施例3:动态(本发明方法)和静态(现有技术方法)模型模拟牛乳脂胃部消化的对比
模拟过程采用本发明的人体胃-小肠道消化的模拟装置,胃液试剂瓶101a-1、盐酸试剂瓶101a-2及氢氧化钠试剂瓶101a-3通过蠕动泵101b-1~101b-4及硅胶管与模拟胃消化室102a连接;胰液试剂瓶201a-1,胆汁试剂瓶201a-2,盐酸试剂瓶101a-2及氢氧化钠试剂瓶101a-3通过蠕动泵201b-1~201b-4以及硅胶管与模拟小肠消化室202a连接;胃消化室102a通过蠕动泵101b-4及硅胶管与模拟小肠消化室202a连接;系统控制单元300通过数据线连接胃消化模拟单元100及小肠消化模拟单元200,实现pH的实时调节及控制模拟胃液或小肠消化液的流速,系统控制单元100输出pH的实时动态曲线;模拟胃消化室102a及模拟小肠消化室202a均为玻璃夹层罐,夹层为水浴层,夹层外侧的进出接口通过硅胶管与循环水浴锅102c连接,实现对胃肠温度环境的模拟,夹层罐上方设有开口,开口处安插pH计102d,202d及硅胶管,模拟胃消化室102a及模拟小肠消化室202a内投放磁力搅拌转子,通过磁力搅拌器102b,202b不断旋转,带动消化液流动,实现对胃肠蠕动的模拟;废液收集瓶402通过蠕动泵401及硅胶管与模拟小肠消化室202a,系统控制单元300通过数据线控制废液的收集及清洗。
溶液配制:
胃电解质溶液:称取6.9gNaCl、0.73gKCl、0.12gMgCl2(H2O)6、0.05gNH4Cl、0.01g尿素和0.1gCaCl2(H2O)2,溶于800mL去离子水中,用0.15M HCl调节pH至6.5,最后定容至1L。4℃冰箱存放。
人工胃液:称取156mg兔胃脂肪酶加入到100mL胃电解质溶液中,使胃脂肪酶的酶活保持在8.6U/mL,4℃冰箱存放。
现有技术方法(静态)消化牛乳脂肪:量取100mL牛乳与50mL胃电解质溶液,混合后放入250mL酶反应器中,将pH调节至6.0,在37℃保持10min,加入兔胃脂肪酶反应1h,用0.2mol/L的NaOH滴定使体系的pH保持在6.0,定期取出一部分样品以备后期分析。
本发明方法(动态)消化牛乳脂肪:开启恒温水浴锅102c,调节温度至37℃,开启蠕动泵,使模拟胃消化室102a和模拟小肠消化室202a温度恒定在37℃;在两个消化室中加入磁搅拌转子,调节磁力搅拌器102b,202b为间歇模式,转速100rpm;在模拟胃消化室102a中一次性加入100mL牛乳,进入10min的排空滞留阶段,开启蠕动泵,控制模拟胃消化室102a的pH实时变化,符合拟合公式,pH=0.1464t+3.52,控制所述模拟胃消化室的剩余内容物的体积符合Elashoff模型,开启胃液蠕动泵,控制流体速度分别为1mL/min;进入排空运行阶段,调节胃液蠕动泵的加液速度至0.5mL/min,开启胃排空泵和肠转运泵,模拟胃排空和肠转运;整个消化过程持续1h。
消化过程中脂肪酸的水解程度通过碱甲酯化和酸甲酯化的差异性得出。酸甲基化:将内标C11:0甲酯,2mL甲醇,2mL甲醇-盐酸溶液及450μl正己烷加到450μl脂质溶液中。将试管剧烈旋涡震荡1min,放入80℃保温60min。取出冷却至室温后加入2mL水,旋涡震荡2min,离心,吸取上清液进行GC分析;碱甲基化:将脂质溶液N2吹干后加入内标C11:0甲酯,200μl 2M KOH-CH3OH溶液,旋涡震荡1min,加入400μl 1MHCL溶液,震荡。加入正己烷旋震2min,离心,收集上清液进GC。
如图4所示为牛乳脂肪在足月婴儿静态和动态胃部模型消化过程中的水解情况,由图可见,静态和动态模型最终实现的消化率近似,但是静态模型释放游离脂肪酸的过程更快,而动态模型则为逐步升高的过程。因此,本发明方法相对于现有技术能够更真实地模拟人体消化过程。
实施例4:成人消化蛋白质的动态分析
溶液配制:
人工胃液:称取酶活为100,000U猪胃粘膜胃蛋白酶加入到100mL胃电解质溶液中,胃电解质溶液的配制:称取6.9gNaCl、0.73gKCl、0.12gMgCl2(H2O)6、0.05g NH4Cl、0.01g尿素和0.1g CaCl2(H2O)2,溶于800mL去离子水中,用0.15M HCl调节pH至6.5,最后定容至1L。4℃冰箱存放。
人工胰液:称取一定量猪胰酶(含胰蛋白酶、糜蛋白酶和胰脂肪酶),使10,000U胰蛋白酶加入100mL小肠电解质溶液中,小肠电解质溶液的配制:称取8.2gNaCl、4.6gCaCl2、0.3gKCl、0.06g0.12gMgCl2·6H2O、0.11g尿素和0.2gCaCl2(H2O)2,溶于800ml去离子水中,用0.15M HCl调节pH至6.2,最后定容至1L。4℃冰箱存放。
人工胆汁液:称取0.13g甘氨脱氧胆酸钠和0.14g牛磺胆酸钠加入100mL小肠电解质溶液中,加入0.33gNaH2PO4(H2O)2和1.1gCaCl2(H2O)2,用0.15M HCl和5MNaOH调节pH到6.1。
配制蛋白溶液:使用双蒸馏水制备2.5%的蛋白质溶液(pH7.0),包括乳铁蛋白、β-乳球蛋白和乳白蛋白。
模拟成人胃肠道消化过程:
模拟过程采用本发明的人体胃-小肠道消化的模拟装置,胃液试剂瓶101a-1、盐酸试剂瓶101a-2及氢氧化钠试剂瓶101a-3通过蠕动泵101b-1~101b-4及硅胶管与模拟胃消化室102a连接;胰液试剂瓶201a-1,胆汁试剂瓶201a-2,盐酸试剂瓶101a-2及氢氧化钠试剂瓶101a-3通过蠕动泵201b-1~201b-4以及硅胶管与模拟小肠消化室202a连接;胃消化室102a通过蠕动泵101b-4及硅胶管与模拟小肠消化室202a连接;系统控制单元300通过数据线连接胃消化模拟单元100及小肠消化模拟单元200,实现pH的实时调节及控制模拟胃液或小肠消化液的流速,系统控制单元100输出pH的实时动态曲线;模拟胃消化室102a及模拟小肠消化室202a均为玻璃夹层罐,夹层为水浴层,夹层外侧的进出接口通过硅胶管与循环水浴锅102c连接,实现对胃肠温度环境的模拟,夹层罐上方设有开口,开口处安插pH计102d,202d及硅胶管,模拟胃消化室102a及模拟小肠消化室202a内投放磁力搅拌转子,通过磁力搅拌器102b,202b不断旋转,带动消化液流动,实现对胃肠蠕动的模拟;废液收集瓶402通过蠕动泵401及硅胶管与模拟小肠消化室202a,系统控制单元300通过数据线控制废液的收集及清洗。
开启恒温水浴锅102c,调节温度至37℃,开启蠕动泵,使模拟胃消化室102a和模拟小肠消化室202a温度恒定在37℃;在两个消化室中加入磁搅拌转子,调节磁力搅拌器102b,202b为间歇模式,转速100rpm;在模拟胃消化室102a中加入40mL牛奶和60mL人工胃液,在模拟小肠消化室202a中加入10mL人工胰液和3.35mL人工胆汁液,进入5min的排空滞留阶段,开启蠕动泵,控制模拟胃消化室102a的pH实时变化,符合拟合公式,pH=0.0005t2-0.079t+4.47,控制所述模拟胃消化室的剩余内容物的体积符合Elashoff模型,将模拟小肠消化室202a的pH维持在6.1,开启胆汁泵,控制流体速度为0.67mL/min;进入排空运行阶段,调节胆汁泵速度为0.022mL/min,开启胃排空蠕动泵101b-4,整个消化过程持续3h。获取胃消化室0,6,10,30,60,120min,180min的消化物样本,小肠消化室15,30,60,120,180min的消化物样本,于-20℃存放直至进一步分析。通过SDS-PAGE对消化物样本中的蛋白质降解和肽谱进行定性评价,测量结果见图4。可见在成人模式中,α-乳白蛋白和乳铁蛋白消化速度快于β乳球蛋白。β乳球蛋白在成人胃很少降解,在成人十二指肠才开始被明显降解。
本发明实现了对胃及小肠消化室pH值的实时动态调控,同时能够输出pH动态曲线;通过实时调控胃排空和肠转运的速度,实现了食物在不同消化道之间的实时流动;更真实、全面的模拟了人胃-小肠道的消化状态和环境;本发明能够实现对不同人群体外消化过程的模拟,包括早产儿、足月儿、成人和老人等各类人群;本发明在人工胃液中使用兔胃脂酶或角质酶,更真实的模拟人胃脂酶。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。