CN108169415A - 用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于体外仿生模拟消化技术领域，具体涉及一种用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液，并进一步公开其制备方法。本发明所述的用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液，含有所需浓度的K+、Na+、Cl‑、H2PO4 ‑、HCO3 ‑、Mg2+、Ca2+离子，以及胰酶、胆盐、淀粉葡萄糖苷酶和转化酶。本发明所述小肠液明确了小肠液中无机盐离子、消化酶、胆盐等成分的浓度，与人体小肠消化液较为接近，比起以往的消化液可以显著提高碳水化合物消化为葡萄糖的比例。

Description

用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液及制备方法
技术领域
本发明属于体外仿生模拟消化技术领域，具体涉及一种用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液，并进一步公开其制备方法。
背景技术
消化是指食物在消化道内被加工处理成小分子物质进而进入体内的过程。消化的形式主要有两种：一种是通过机械作用，把食物由大块变成小块，称为物理或机械消化；另一种是在消化酶的作用下，把大分子变成小分子，称为化学消化。其中，物理消化主要发生在口腔和胃中，而化学消化绝大多数发生在小肠中。目前，对消化过程的研究主要有体内实验和体外模拟消化实验两种技术手段，体内实验受限于活体对象选择和个体差异的影响，导致其应用受到限制。体外模拟消化实验可以规避体内实验的伦理学限制、耗时长、成本高等缺点，已经成为当前研究消化的趋势。
以往的消化过程研究中，人们已经认识到碳水化和物、脂肪、蛋白质三大营养物质在小肠内经小肠液被消化成可被吸收的葡萄糖、脂肪酸和氨基酸等，而未被消化的食物残渣则会进入大肠。碳水化合物亦称糖类，是自然界最丰富的能量物质，近年来，人们认识到碳水化合物不仅是能量的主要来源，而且还参与到慢性病的预防过程中，如调节血糖、血脂、改善肠道菌群等更多的方面。食物中的碳水化合物经消化变为葡萄糖再经吸收进入血液循环是机体维持血糖平衡的最主要的途径。所以研究碳水化合物消化中葡萄糖的效率、速度等，以及预测这种食物在人体中引起葡萄糖的变化是研究食物和血糖健康的重要技术手段。
碳水化合物在小肠的消化过程中，小肠液是非常重要的媒介。小肠液是弱碱性的液体，pH约为7.0-7.6，通常小肠液里包含有胰液、胆汁、无机盐等多种离子。但是，在消化过程中，一方面不同的食物或者营养素需要的消化液并不完全相同，需要确定其最适的消化液；另一方面，在体外模拟实验中，如何配制与人体小肠消化液相接近的小肠消化液，也具有至关重要的影响。
国内外有很多研究已经关注到体外碳水化合物的消化，如我国杨月欣等采用淀粉葡萄糖苷酶(amyloglucosidase)、转化酶(invertase)、胰酶(pancreatin)、瓜尔胶溶液模拟小肠液，采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic acid，简称DNS)的方法检测碳水化合物消化后的还原糖的含量；国外Peter A.Sopade发表在 61(2009)中的研究中，也采用淀粉葡萄糖苷酶(amyloglucosidase)和胰酶(pancreatin)模拟小肠液，采用罗氏血糖仪检测消化产物中的葡萄糖的含量；国外M.Minekus发表在Food Funct(2014)中的研究中，提出一种目前被广泛使用的小肠液的配方，消化液中规范了多种无机盐离子的浓度、胰酶和胆盐的浓度等。
但是，实际的碳水化合物消化的过程中，必须在特异性酶的催化下，分解成单糖才能被吸收，食物中的淀粉和糖原需要首先经唾液中的淀粉酶初步短暂的消化后，再被胰淀粉酶作用于糖苷键，使之水解为α-糊精、麦芽寡糖、麦芽糖等再经多种酶继续分解为葡萄糖；部分二糖经二糖酶水解、部分寡糖或多糖也需进一步水解为单糖才能被吸收。胆汁虽然不含消化碳水化合物的酶，但是其对脂肪的乳化、吸收以及脂溶性维生素的吸收意义重大，而以往的研究表明脂肪或游离脂肪酸的的增加会降低血糖反应，这也意味着胆盐会间接影响碳水化合物的消化。
所以，碳水化合物消化的整个过程比较复杂，目前已知的小肠液配方无法很好的实现碳水化合物的体外消化模拟，严重影响了对于碳水化合物在人体中的消化结局的预测和研究。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液，以解决现有技术中现有体外模拟小肠液配方与人体实际小肠液差异较大的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液组合物，包括如下组分：KCl、KH2PO4、NaHCO3、NaCl、MgCl2(H2O)6、CaCl2(H2O)2、NaOH、HCL、胰酶、胆盐和淀粉葡萄糖苷酶。
优选的，所述组合物还包括转化酶。
优选的，所述的用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液组合物，包括如下组分：0.5mol/L KCl、0.5mol/L KH2PO4、1mol/LNaHCO3、2mol/LNaCl、0.15mol/L MgCl2(H2O)6、0.3mol/LCaCl2(H2O)2、2mol/LNaOH、6mol/L HCL、胰酶、淀粉葡萄糖苷酶、转化酶和胆盐。
本发明还公开了所述的小肠液组合物用于制备体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液的用途。
本发明还公开了一种用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液，由所述的小肠液组合物按照选定比例制得。
优选的，所述小肠液中包括如下浓度的组分：K+9-10mmol/L、Na+150-160mmol/L、Cl-50-60mmol/L、H2PO4 -0.5-1.5mmol/L、HCO3 -100-110mmol/L、Mg2+0.4-0.5mmol/L、Ca2+0.5-0.7mmol/L、淀粉葡萄糖苷酶5-15U/mL，胰酶150-250U/mL，胆盐8-12mM，转化酶2-4U/mL，pH中性。
更优的，所述小肠液中包括如下浓度的组分：K+9.5mmol/L、Na+154.3mmol/L、Cl-56.5mmol/L、H2PO4 -1mmol/L、HCO3 -106.3mmol/L、Mg2+0.42mmol/L、Ca2+0.6mmol/L、淀粉葡萄糖苷酶10U/mL，胰酶200U/mL，胆盐10mM，转化酶3U/mL，pH中性。
本发明还公开了一种制备所述的用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液方法，包括如下步骤：
(1)取选定量的KCl、KH2PO4、NaHCO3、NaCl、MgCl2(H2O)6、CaCl2(H2O)2、NaOH、HCL、胰酶、淀粉葡萄糖苷酶、转化酶和胆盐，备用；
(2)将上述各原料组分按照一定比例混合，制得所需离子浓度的小肠液，并以NaOH和HCL调节小肠液pH值至中性；
(3)将所得小肠液经0.22um真空过滤器过滤，即得。
本发明还公开了一种体外模拟小肠内碳水化合物消化过程的方法，包括将所述的小肠液与胃消化后的食糜进行混匀的步骤。
所述小肠液与胃消化后的食糜的质量或体积比为1：1。通常情况下，所述胃消化后的食糜为固体或半固体时，以质量比计，所述胃消化后的食糜为液体时，以体积比计。
所述方法还包括利用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法对消化过程中的葡萄糖浓度进行检测的步骤。
本发明所述的用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液，以KCl、KH2PO4、NaHCO3、NaCl、MgCl2(H2O)6、CaCl2(H2O)2、NaOH、HCL、胰酶、胆盐、淀粉葡萄糖苷酶和转化酶为制备原料，制得含有所需K+、Na+、Cl-、H2PO4 -、HCO3 -、Mg2+、Ca2+离子浓度，以及胰酶、胆盐、淀粉葡萄糖苷酶和转化酶的小肠消化液。本发明所述小肠液明确了小肠液中无机盐离子、消化酶、胆盐等成分的浓度，与人体小肠消化液较为接近，比起以往的消化液可以显著提高碳水化合物消化为葡萄糖的比例；同时，本发明中的小肠液可以广泛用于体外模拟消化的研究，一定程度减少实验活体动物的使用、提高体外模拟消化实验的精度。本发明利用所述小肠液进行体外模拟消化方法中，采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法对消化过程中的葡萄糖浓度进行检测，该方法可以特异性检测碳水化合物消化产物为葡萄糖的含量，比起DNS法具有较少受其他还原糖的影响的优点，进一步提高了消化方法的检测精度。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为面包在不同小肠液配方下的葡萄糖含量随反应时间分钟(min)的变化情况；
图2为牛奶在不同小肠液配方下的葡萄糖含量随反应时间分钟(min)的变化情况。
具体实施方式
本发明下述实施例中使用的无机盐来自市售试剂，纯度大于99％；使用的多种酶均购自Sigma，货号包括：胰酶(Sigma，P7545)、胆盐(Sigma，48305)、淀粉葡萄糖苷酶(Sigma，A7095)、转化酶(Sigma，14504)。
本发明下述实施例中所述小肠液的采用如下浓度的原料按照一定比例复配制得：0.5mol/L KCl、0.5mol/L KH2PO4、1mol/LNaHCO3、2mol/LNaCl、0.15mol/L MgCl2(H2O)6、0.3mol/LCaCl2(H2O)2、2mol/LNaOH、6mol/L HCL、胰酶、淀粉葡萄糖苷酶、转化酶和胆盐。
实施例1
本实施例所述小肠液中各组分浓度为：K+9.5mmol/L、Na+154.3mmol/L、Cl-56.5mmol/L、H2PO4 -1mmol/L、HCO3 -106.3mmol/L、Mg2+0.42mmol/L、Ca2+0.6mmol/L、胰酶200U/mL、胆盐10mM、淀粉葡萄糖苷酶10U/mL。
本实施例所述小肠液的制备包括如下步骤：
(1)分别称取37.3gKCl溶于1000ml去离子水、68gKH2PO4溶于1000ml去离子水、84gNaHCO3溶于1000ml去离子水、117gNaCl溶于1000ml去离子水、30.5gMgCl2(H2O)6溶于1000ml去离子水、44.1gCaCl2(H2O)2溶于1000ml去离子水，以及2M NaOH、6M HCL各约100ml，至上述组分充分溶解；
(2)分别取17mlKCl溶液、2ml KH2PO4溶液、106.25ml NaHCO3溶液、24mlNaCl溶液、2.75mlMgCl2(H2O)6、2ml CaCl2(H2O)2溶液，定容成1000ml即为无机盐母液；取80ml所述无机盐母液，加入0.5025g胰酶、1.21g胆盐以及4ml淀粉葡萄糖苷酶混匀，并加入20mlddH2O，调pH为7；
(3)将所得小肠液经0.22um真空过滤器过滤，即得。
实施例2
本实施例所述小肠液中各组分浓度为：K+9.5mmol/L、Na+154.3mmol/L、Cl-56.5mmol/L、H2PO4 -1mmol/L、HCO3 -106.3mmol/L、Mg2+0.42mmol/L、Ca2+0.6mmol/L、胰酶200U/mL、胆盐10mM、淀粉葡萄糖苷酶10U/mL以及转化酶3U/mL。
本实施例所述小肠液的制备包括如下步骤：
(1)分别称取37.3gKCl溶于1000ml去离子水、68gKH2PO4溶于1000ml去离子水、84gNaHCO3溶于1000ml去离子水、117gNaCl溶于1000ml去离子水、30.5gMgCl2(H2O)6溶于1000ml去离子水、44.1gCaCl2(H2O)2溶于1000ml去离子水，以及2M NaOH、6M HCL各约100ml，至上述组分充分溶解；
(2)分别取17mlKCl溶液、2ml KH2PO4溶液、106.25ml NaHCO3溶液、24mlNaCl溶液、2.75mlMgCl2(H2O)6、2ml CaCl2(H2O)2溶液，定容成1000ml即为无机盐母液；取80ml所述无机盐母液，加入0.5025g胰酶、1.21g胆盐、4ml淀粉葡萄糖苷酶、以及1mg转化酶混匀，并加入16mlddH2O，调pH为7；
(3)将所得小肠液经0.22um真空过滤器过滤，即得。
实施例3
本实施例所述小肠液中各组分浓度为：K+9mmol/L、Na+160mmol/L、Cl-50mmol/L、H2PO4 -1.5mmol/L、HCO3 -100mmol/L、Mg2+0.5mmol/L、Ca2+0.5mmol/L、胰酶250U/mL、胆盐8mM、淀粉葡萄糖苷酶15U/mL。
本实施例所述小肠液的制备方法同实施例1，其区别仅在于，通过适当调节各原料的添加比例获得所需离子浓度的小肠液。
实施例4
本实施例所述小肠液中各组分浓度为：K+10mmol/L、Na+150mmol/L、Cl-60mmol/L、H2PO4 -0.5mmol/L、HCO3 -110mmol/L、Mg2+0.4mmol/L、Ca2+0.7mmol/L、胰酶150U/mL、胆盐12mM、淀粉葡萄糖苷酶5U/mL。
本实施例所述小肠液的制备方法同实施例1，其区别仅在于，通过适当调节各原料的添加比例获得所需离子浓度的小肠液。
实施例5
本实施例所述小肠液中各组分浓度为：K+9mmol/L、Na+160mmol/L、Cl-50mmol/L、H2PO4 -1.5mmol/L、HCO3 -100mmol/L、Mg2+0.5mmol/L、Ca2+0.5mmol/L、胰酶250U/mL、胆盐8mM、淀粉葡萄糖苷酶15U/mL、转化酶2U/mL。
本实施例所述小肠液的制备方法同实施例1，其区别仅在于，通过适当调节各原料的添加比例获得所需离子浓度的小肠液。
实施例6
本实施例所述小肠液中各组分浓度为：K+10mmol/L、Na+150mmol/L、Cl-60mmol/L、H2PO4 -0.5mmol/L、HCO3 -110mmol/L、Mg2+0.4mmol/L、Ca2+0.7mmol/L、胰酶150U/mL、胆盐12mM、淀粉葡萄糖苷酶5U/mL、转化酶4U/mL。
本实施例所述小肠液的制备方法同实施例1，其区别仅在于，通过适当调节各原料的添加比例获得所需离子浓度的小肠液。
对比例1
本对比例所述小肠液中各组分浓度为：K+9.5mmol/L、Na+154.3mmol/L、Cl-56.5mmol/L、H2PO4 -1mmol/L、HCO3 -106.3mmol/L、Mg2+0.42mmol/L、Ca2+0.6mmol/L、胰酶200U/mL、胆盐10mM。
本对比例所述小肠液的制备包括如下步骤：按照实施例1中方法制得所需无机盐母液；取80ml所述无机盐母液，加入0.5025g胰酶和1.21g胆盐混匀，并加入20mlddH2O，调pH为7；将所得小肠液经0.22um真空过滤器过滤，即得。
实验例
1、面包的消化过程
分别取上述实施例1-2和对比例1中所制得小肠消化液和胃消化后的面包食糜按照质量比为1：1的比例进行混匀，进行肠消化过程的模拟，并在消化过程中通过葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法进行消化过程中的葡萄糖浓度的检测。
本实验例采用的面包中每100克含有碳水化合物约60克，实验中称取1.7克进行碳水化合物的模拟消化反应，反应时间180分钟，并以不加入消化液的过程为对照。将消化的食糜按照0、30、60、90、120、150、180分钟分别收集到1.5毫升的离心管中，迅速冰浴以终止消化反应；然后在4℃、2000转/分钟条件下离心，吸取上清液。
按照葡萄糖(Glu)测试盒说明书(南京建成生物工程研究所，货号F006)进行操作。按照酶标仪的比色法计算葡萄糖的浓度＝(样品OD值-空白OD值)/校准OD值-空白OD值*标准品浓度(5mmol/L)，计算结果记录于下表1，并绘制其消化过程曲线见附图1(精确到小数点后5位)。
表1面包在消化状态下的葡萄糖含量
如表1中数据和附图1所示，未加入肠消化液的食糜中的葡萄糖的浓度在2.6-3.5mM，而加入本发明所述小肠液进行消化后，葡萄糖的浓度显著升高为12-24mM，说明消化液显著增加了碳水化和物的消化，相对于现有小肠消化液而言，本发明所述小肠液配方对于碳水化合物的消化终点值提高效率约1.3倍，更接近于人体的真实状况。
2、牛奶的消化过程
分别取上述实施例1-2和对比例1中所制得小肠消化液和胃消化后的牛奶食糜按照体积比为1：1的比例进行混匀，进行肠消化过程的模拟，并在消化过程中通过葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法进行消化过程中的葡萄糖浓度的检测。
本实验例采用的牛奶中每100毫升含有碳水化合物约5克，实验中称取20毫升进行碳水化和物的模拟消化反应，反应时间180分钟，并以不加入消化液的过程为对照。将消化的食糜按照0、30、60、90、120、150、180分钟分别收集到1.5毫升的离心管中，迅速冰浴以终止消化反应；然后在4℃、2000转/分钟条件下离心，吸取上清液。
按照葡萄糖(Glu)测试盒说明书(南京建成生物工程研究所，货号F006)进行操作。按照酶标仪的比色法计算葡萄糖的浓度＝(样品OD值-空白OD值)/校准OD值-空白OD值*标准品浓度(5mmol/L)，计算结果记录于下表2，并绘制其消化过程曲线见附图2。
表2牛奶在消化状态下的葡萄糖含量
如表2中数据和附图2所示，未加入肠消化液的食糜中的葡萄糖的浓度在1.8-2.7mM，而加入本发明所述小肠液配方的葡萄糖的浓度显著升高为15-22mM，相比于对比例1中加入小肠液配方中葡萄糖浓度为2.92-9.50mM，其消化性能提高约2.3倍。说明本发明所述小肠液配方显著增加了碳水化合物的消化，更接近于人体的真实状况。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液组合物，其特征在于，包括如下组分：KCl、KH2PO4、NaHCO3、NaCl、MgCl2(H2O)6、CaCl2(H2O)2、NaOH、HCL、胰酶、胆盐和淀粉葡萄糖苷酶。
2.根据权利要求1所述的用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液组合物，其特征在于，所述组合物还包括转化酶。
3.权利要求1或2所述的小肠液组合物用于制备体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液的用途。
4.一种用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液，其特征在于，由权利要求1或2所述的小肠液组合物按照选定比例制得。
5.权利要求4所述的用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液，其特征在于，所述小肠液中包括如下浓度的组分：K+9-10mmol/L、Na+150-160mmol/L、Cl-50-60mmol/L、H2PO4 -0.5-1.5mmol/L、HCO3 -100-110mmol/L、Mg2+0.4-0.5mmol/L、Ca2+0.5-0.7mmol/L、淀粉葡萄糖苷酶5-15U/mL，胰酶150-250U/mL，胆盐8-12mM，转化酶2-4U/mL，pH中性。
6.权利要求4或5所述的用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液，其特征在于，所述小肠液中包括如下浓度的组分：K+9.5mmol/L、Na+154.3mmol/L、Cl-56.5mmol/L、H2PO4 -1mmol/L、HCO3 -106.3mmol/L、Mg2+0.42mmol/L、Ca2+0.6mmol/L、淀粉葡萄糖苷酶10U/mL，胰酶200U/mL，胆盐10mM，转化酶3U/mL，pH中性。
7.一种制备权利要求5或6所述的用于体外模拟小肠内碳水化合物消化的小肠液方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取选定量的KCl、KH2PO4、NaHCO3、NaCl、MgCl2(H2O)6、CaCl2(H2O)2、NaOH、HCL、胰酶、淀粉葡萄糖苷酶、转化酶和胆盐，备用；
(2)将上述各原料组分按照一定比例混合，制得所需离子浓度的小肠液，并以NaOH和HCL调节小肠液pH值至中性；
(3)将所得小肠液经0.22um真空过滤器过滤，即得。
8.一种体外模拟小肠内碳水化合物消化过程的方法，其特征在于，包括将权利要求5或6所述的小肠液与胃消化后的食糜进行混匀的步骤。
9.根据权利要求8所述的体外模拟小肠内碳水化合物消化过程的方法，其特征在于，所述小肠液与胃消化后的食糜的质量或体积比为1：1。
10.根据权利要求8或9所述的体外模拟小肠内碳水化合物消化过程的方法，其特征在于，所述方法还包括利用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法对消化过程中的葡萄糖浓度进行检测的步骤。
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